Contaminazione Microbiologica e Metodi Rapidi

Contaminazione Microbiologica e
Metodi Rapidi
Presentazione Linea Guida
Autori:
Commissione Qualità AFI:
Gruppo di Microbiologia di Roma
Coordinatore: Francesco Antonetti
52° Simposio AFI 2012 – Rimini, 30-31 Maggio – 1 Giugno 2012
SCOPO DELLA LINEA GUIDA
Scopo della presente LINEA GUIDA è di facilitare gli
utenti all’implementazione dei Metodi Rapidi in
Microbiologia, conducendoli ad un buona conoscenza
delle tecnologie e coadiuvandoli nella dimostrazione
della loro equivalenza ai metodi tradizionali, che li renda
accettabili dalle agenzie regolatorie.
La guida ha inoltre lo scopo di descrivere le principali
tecnologie riguardanti i RMM, dettagliando per ogni
strumento o tecnologia la descrizione, il principio di
funzionamento, le procedure operative, la validazione, i
campi d’applicazione ed i vantaggi e svantaggi.
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INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN
MICROBIOLOGIA (RMM)
Molte delle tecniche microbiologiche oggi in uso sono
antiche e si basano principalmente sulla crescita di
microrganismi su terreni di coltura (Metodi Tradizionali).
Tali metodi prevedono la crescita di colonie, che si
rendono stimabili non prima di 48 o 72 ore dalla semina,
o l’intorbidamento di terreni liquidi, generalmente non
visibile prima di 5-7 giorni.
Questo fa sì che con le tecniche tradizionali non si
possano ottenere risposte, circa il grado d’inquinamento
di un prodotto, prima di 3 giorni per un controllo di carica
batterica e di 5-7 giorni per un controllo rapido di
sterilità.
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INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN
MICROBIOLOGIA (RMM)
Durante la preparazione di un principio attivo o di un
prodotto finito esistono diversi stadi di processo che è
necessario controllare per prevenire possibili
inquinamenti che, se non evitati, danneggerebbero
irrimediabilmente il prodotto o peggio minerebbero la
sicurezza e salute dei pazienti utilizzatori.
In molti casi, i vari stadi di processo sono consequenziali,
richiedono tempi d’esecuzione rapidi e quindi non è
possibile fermare il processo per attendere la risposta di
presenza/assenza o quantificazione di un eventuale
inquinante batterico.
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INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN
MICROBIOLOGIA (RMM)
La possibile soluzione agli inconvenienti sopra descritti è
quella di utilizzare gli RMM per la determinazione
quantitativa e qualitativa dei microrganismi .
Queste tecniche permettono di rilevare la presenza e
consentono la quantificazione di microrganismi in tempi
molto brevi, da real time ad alcune ore, in dipendenza
dalla tecnica.
L’applicabilità di tali metodi copre i test più comunemente
effettuati, quali test di carica batterica, test di sterilità, test
dell’efficacia dei batteriostatici, monitoraggio delle “clean
rooms”, vari controlli ambientali incluso le acque di
produzione e ricerca endotossine.
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MICROBIOLOGICAL ASPECT OF THE
BIOTECH
p r o c e s s PROCESS
0 .2 2 filtr a tio n
CL
C la im N o n S te r ile
USP
C la im S te r ile
C ap tu re
P ro du c t is ste rile
N o n sterile
ID S
S to p fo r r e le a se
DSP
D S F illin g
N o n sterile pro d uc t
N o n S te r
S e cu r e
1 4 da ys
R e d u ce tim e to r elea se
A c ce ler a te in v estig a tio n
E n v ir o n n e m e n ta l M o n ito r in g
E q u ip e m e n t c le a n in g (w a te r r in sin g )
S ec u re
R a w m a te r ia l (M e d ia in U S P , B u ffe r in D S P , W a te r a s c o m p o n e n t fo r D P )
S ec u re
W a te r L o o p
O fficial S terility
B io b urd en : P a ss / F a iled (avo id re le ase at risk)
U n official S te rility
B io b urd en fo r In ve stigatio n o r rap id q u alifica tion a fte r m a in te na n ce
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DP
S terile
INTRODUZIONE AI METODI RAPIDI IN
MICROBIOLOGIA (RMM)
I metodi rapidi si avvalgono di diverse tecnologie
quali la:
Bioluminescenza
Citometria a flusso
Amplificazione di acidi nucleici
Tecnologia ottica
Colorimetria
Rilevazione diretta della fluorescenza
Identificazione fenotipica e genotipica
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RMM e BIOLUMINESCENZA
La bioluminescenza è un fenomeno
che consente ad organismi viventi di
emettere luce attraverso particolari
reazioni enzimatiche, nel corso delle
quali l'energia chimica è convertita in
energia luminosa.
La reazione avviene in presenza di uno
specifico enzima, chiamato luciferasi, il
substrato luciferina e la molecola ATP.
L’ATP è presente in tutte le cellule
metabolicamente attive, sia di origine
procariotica che eucariotica, ed è la
molecola utilizzata dalle cellule per
accumulare energia. La bioluminescenza è
una tecnologia consolidata ed approvata e
rappresenta un valido strumento analitico
per la valutazione della contaminazione
microbica in ambiente farmaceutico.
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RMM e BIOLUMINESCENZA
Il Rapid Microbiology System Pallchek® di Pall
consente di effettuare una determinazione
qualitativa e quantitativa di microrganismi vitali,
colturabili e non, in campioni filtrabili o
solubilizzabili.
Il sistema consente anche il monitoraggio degli
ambienti e delle superfici, mediante l’utilizzo di
appositi sistemi di campionamento.
I risultati sono espressi in Relative Light Units
(RLU).
Il limite di rilevazione è pari ad 1 UFC per
Il sistema Milliflex Rapid® di Merck Millipore permette di campione. Test di sterilità in 48 ore
effettuare una determinazione quantitativa di
microrganismi vitali e colturabili, sia in campioni filtrabili
sia in campioni non filtrabili, ma che possono essere resi
solubili, sia in campioni ambientali (superfici o aria),
purché prelevati con metodologie che consentano la
successiva dispersione dei microrganismi in fase liquida.
I risultati sono espressi in Unità Formanti Colonia (UFC).
Il limite di rilevazione è pari a 1 UFC per volume filtrato.
Tempi d’analisi ridotti da 4 a 8 volte
rispetto al metodo tradizionale.
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RMM e CITOMETRIA
La CITOMETRIA A FLUSSO è una tecnica che permette la misurazione e la
caratterizzazione di cellule vive sospese in mezzo fluido. Tali cellule sono state
precedentemente marcate da un fluorocromo, che viene scelto in base alle
caratteristiche fisiche e morfologiche della cellula.
Il BactiFlow ALS è un sistema in
grado di leggere, ad una determinata
lunghezza d’onda, la fluorescenza
emessa dai microrganismi (e/o
particelle). Tutto il procedimento viene
diviso in 3 passaggi principali.
• Marcatura automatica e sequenziale
delle cellule di microrganismi.
• Eccitazione laser.
• Analisi e discriminazione automatica
del sistema.
Numerazione carica batterica entro 20 minuti - Test di presenza/assenza entro 24 ore.
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RMM e CITOMETRIA
La CITOMETRIA A SCANSIONE LASER in fase solida (Solid Phase Citometry)
permette la rilevazione e la conta di cellule vive quali microrganismi, lieviti, funghi e
spore le quali vengono marcate e successivamente rilevate mediante scansione su
membrana (fase solida).
Il ChemScan RDI è un sistema con alto livello di
sensibilità che permette il rilevamento diretto di
singole cellule ed elimina la necessità della
crescita e moltiplicazione cellulare. Il principio di
funzionamento è basato sulla marcatura diretta
di microrganismi vivi che vengono riconosciuti da
una scansione laser ultrasensibile. è un sistema
che permette il rilevamento e la conta di
microrganismi nei prodotti filtrabili.
Tutto il procedimento viene diviso in tre passaggi principali:
- Filtrazione su membrana
- Marcatura delle cellule
- Scansione laser
Risultato rapido in circa 3 ore
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RMM e TECNOLOGIE DI
AMPLIFICAZIONE ACIDI NUCLEICI (NAT)
Comprendono reazioni a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o non
(PCR); più recentemente è stata sviluppata la reazione di amplificazione
mediata da trascrizione (TMA) con tecnologia di riduzione del background
(BRT).
Generalmente hanno come target il DNA genomico o in alcuni casi (i.e
Micoplasmi) il DNA ribosomale (rDNA) o l’RNA ribosomale (rRNA).
Sono generalmente molto rapide (3-8 ore) e rappresentano quindi
un’attraente alternativa ai metodi basati sulla coltivazione e crescita dei
microrganismi.
CAMPI DI APPLICAZIONE nell’ industria Farmaceutica per la rilevazioni di
Micoplasmi e altri microrganismi in:
- Produzioni farmaceutiche (prodotti grezzi o finiti)
- Acqua Purificata e WFI, monitoraggio ambientale
- Verifica del “Clean-in-Place” (CIP)
- Rilevazione e prevenzione di Biofilm, Colture Cellulari
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RMM e TECNOLOGIE DI
AMPLIFICAZIONE ACIDI NUCLEICI (NAT)
MERCK_MILLIPORE MilliPROBE®: un sistema
per la rilevazione “real-time” di contaminanti nelle
produzioni farmaceutiche basato su
Amplificazione Real Time Mediata da Trascrizione
(TMA) e Tecnologia di Riduzione del Background
(BRT)
Tempi d’analisi ridotti fino a 4 ore.
LifeTechnologies MycoSEQ®
permette di evidenziare l’eventuale
contaminazione di Mycoplasmi.
Il metodo si basa su una PCR in Real Time
Risultato rapido (4 - 5 ore)
PALL GeneDisc® :
sistema basato su Real time qPCR, permette la
determinazione e la quantificazione di Microrganismi
Specifici eventualmente presenti nel campione
Risultato rapido (7-8 ore)
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RMM e TECNOLOGIA OTTICA
La IMD-A (Istantaneous Microbial
Detector of Air ) è una tecnologia ottica
in grado di determinare
simultaneamente la quantità e la
dimensione delle particelle presenti in
aria, permettendo inoltre di distinguere
se ciascuna particella sia viable o nonviable, il tutto in tempo reale.
Laser
Path
Air
Path
Le cellule, batteriche o fungine, in
forma vegetativa o sporale, non
necessitano di marcatura, essendo
discriminate quali unità viventi per
eccitazione tramite raggi laser di
metaboliti auto-fluorescenti (NADH e
Riboflavina per forme vegetative, acido
dipicolinico per le forme sporali).
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RMM e TECNOLOGIA OTTICA
AzbilBiovigilant®Inc.
La metodologia del sistema IMD-A non si basa
sulla crescita cellulare per effettuare una conta dei
microrganismi, ma sfrutta i principi dell’ottica e
della fluorescenza, non richiedendo quindi la
coltivazione degli stessi.
La capacità dello strumento IMD-A nel fornire una
rilevazione microbiologica istantanea permette:
- un monitoraggio continuo ed una valutazione in tempo reale dell’andamento della
contaminazione nell’ambiente produttivo farmaceutico;
- di intraprendere azioni correttive in tempi rapidi per correggere eventuali fuori
specifica;
- di storicizzare i dati di contaminazione particellare e microbiologica dei punti
critici;
- di aumentare il livello qualitativo e di assicurazione di qualità del prodotto
farmaceutico.
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RMM e COLORIMETRIA
La colorimetria è la disciplina che si occupa
della standardizzazione della misura del colore
attraverso lo studio dei modelli di colore.
La colorimetria può essere applicata alla
misurazione della produzione o del consumo di
gas.
La moltiplicazione degli organismi presenti in
un ambiente limitato, fa in modo che, grazie al
loro metabolismo ed al consumo di appropriati
substrati di sviluppo, vengano prodotti
metaboliti o scartati nutrienti specifici.
Tra i vari cambiamenti che avvengono, la modifica della composizione
gassosa dello spazio di testa può essere monitorata in colture chiuse
misurando la produzione di gas (CO2) o il consumo di gas (O2).
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RMM e COLORIMETRIA
BioMérieux Bact/ALERT®: sistema
che ricerca in modo automatico e non
distruttivo la presenza di
microrganismi nel campione in analisi.
La tecnologia utilizzata si basa sulla
presenza di un sensore colorimetrico
posto all’interno del flacone di coltura
BacT/ALERT®.
In caso di crescita batterica l’aumento
della concentrazione di CO2 disciolta
nel brodo di coltura provoca una
variazione del pH che viene rilevato
dal sensore.
Il Bact/ALERT® è da considerarsi un metodo alternativo per effettuare la verifica
della sterilità di un prodotto farmaceutico o biotecnologico, come indicato dalla
EP 5.1.6, EP 2.6.27 e USP <1223>.
Tempi di conferma sterilità ridotti da 14 giorni a 7 giorni o meno.
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RMM e RILEVAZIONE DIRETTA
FLUORESCENZA
La fluorescenza è la proprietà di assorbire radiazioni elettromagnetiche e di
riemetterle nel visibile ad una lunghezza d’onda più elevata.
In campo farmaceutico sono stati di recente sviluppati sistemi innovativi basati
sulla rilevazione diretta della fluorescenza per il monitoraggio rapido della
contaminazione microbica.
CAMPI DI APPLICAZIONE: per la rilevazioni di contaminazioni
microbiologiche in materie prime, produzioni farmaceutiche (prodotti grezzi o
finiti), in acqua Purificata e WFI, aria e superfici e bioreattori.
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RMM e RILEVAZIONE DIRETTA
FLUORESCENZA
MERCK_MILLIPORE Milliflex® Quantum :
permette la rapida rilevazione ed enumerazione in
unità formanti colonia (ufc) di batteri, lieviti e muffe
presenti su campioni filtrabili. La rilevazione
avviene dopo breve incubazione grazie alla
marcatura fluorescente delle microcolonie presenti
sulla membrana. Il sistema consente la successiva
identificazione dei contaminanti.
Risultati in 24/48 ore per analisi convenzionali
RAPID MICRO BIOSYSTEMS Growth DirectTM :
permette di contare colonie di microrganismi in fase di
crescita su terreni nutritivi. La tecnologia permette di
rilevare le colonie molte generazioni prima che
diventino visibili all’occhio umano attraverso una
camera CCD sensibile all’auto-fluorescenza emessa
dai microrganismi. Il sistema consente la successiva
identificazione dei contaminanti.
Rileva la presenza di contaminanti in meno di 7 giorni per test sterilità.
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RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE
FENOTIPICA
L’identificazione fenotipica in microbiologia si basa sulle capacità dei singoli
microrganismi di utilizzare per la crescita, o modificare, un substrato biochimico
nel quale sono in sospensione a determinate concentrazioni.
Ogni classe, famiglia e specie microbica presenta particolari reazioni
biochimiche nei confronti di specifici substrati. L’identificazione microbica si
ottiene confrontando il profilo di reazione ottenuto per il microrganismo in
esame con un profilo standard specie-specifico presente in database.
CAMPI DI APPLICAZIONE: Le metodologie di identificazione fenotipica sono
utilizzate prevalentemente a scopo diagnostico umano, per identificare i
microrganismi di natura ambientale o per monitorare la flora contaminante i
farmaci e la contaminazione delle aree destinate alla produzione farmaceutica.
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RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE
FENOTIPICA
BIOLOG OMNILOG®: Il sistema è in
grado di utilizzare ed interpretare le
diverse risposte dei microrganismi alla
presenza di fonti energetiche (azoto e
carbonio) al fine di produrre una
identificazione o caratterizzazione.
SPETROMETRIA DI MASSA MALDI-TOF:
L’analisi di cellule batteriche mediante
MALDI-TOF consente di ottenere uno
spettro di massa che rappresenta un
fingerprint specifico specifico della specie
batterica analizzata. Ricerche in banche
dati dedicate consentano di identificare
campioni incogniti in pochi minuti.
Per 30 campioni risultati in 3 ore
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RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE
FENOTIPICA
BIOMERIEUX VITEK2®: sistema
altamente automatico che usando i reattivi
VITEK® 2 (chiamati per comodità Card)
permette l’identificazione biochimica di
batteri e lieviti impiegando test di
acidificazione/utilizzo dei carboidrati e test
enzimatici prealiquotati in micropozzetti.
Time to results ridotto dalle 2 alle 18 ore a seconda del parametro.
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RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE
GENOTIPICA
Le tecniche di caratterizzazione genotipica si basano sulla determinazione di
differenze presenti nel DNA cromosomico o in elementi genetici extra
cromosomiali.
L’identificazione microbica si ottiene confrontando il profilo genetico con i profili
presenti nei database.
Le tecniche di amplificazione degli acidi nucleici si basano sulla reiterazione
della polimerizzazione del DNA, che aumenta esponenzialmente un frammento
di acido nucleico, utilizzando la reazione a catena della polimerasi (PCR).
CAMPI DI APPLICAZIONE: Le metodologie di identificazione genotipica sono
utilizzate prevalentemente per identificare i microrganismi di natura ambientale o
per monitorare la flora contaminante i farmaci e la contaminazione delle aree
destinate alla produzione farmaceutica.
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RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE
GENOTIPICA
Il BIOMERIEUX DIVERSILAB®: è un
sistema modulare basato su tecnologia
molecolare che esegue la
genotipizzazione automatica tramite REP
PCR dei ceppi batterici, funghi e lieviti, a
partire da colture pure. Risultati in 4 ore
LIFETECHNOLOGIES MICROSEQ®:
è un sistema che amplifica porzioni del
DNA batterico ribosomiale (16S per
batteri e R2D per muffe e lieviti) e
previa sequenziazione le confronta con
una banca dati validata.
Risultati in 2 - 6 ore
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RMM e METODI DI IDENTIFICAZIONE
GENOTIPICA
RiboPrinter® Microbial
Characterization System (DuPontQualicon) consente di effettuare la
tipizzazione genotipica degli isolati
mediante un processo di ribotipizzazione
automatizzata, altrimenti noto come
'riboprinting'.
Si tratta di un'ulteriore evoluzione
rispetto alle metodiche di
ribotipizzazione manuale
Risultati in 4-8 ore.
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RMM e PIROGENI ED ENDOTOSSINE
BATTERICHE
I Pirogeni costituiscono un gruppo eterogeneo composto da contaminanti di
origine microbica e non. Tra i pirogeni più noti vi sono le endotossine (LPS =
Lipopolisaccaridi), prodotte da batteri gram-negativi, altre sostanze microbiche
derivate da batteri gram-positivi come l'Acido Lipoteicoico (LTA) e particelle
derivate da lieviti e virus. I metodi utilizzati per la rilevazione dei pirogeni sono:
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RMM e PIROGENI ED ENDOTOSSINE
BATTERICHE
PTS è un sistema portatile per la determinazione
quantitativa delle endotossine batteriche direttamente
sul punto di raccolta dei campioni. Si basa su metodo
cinetico–cromogenico.
Il campione da analizzare viene miscelato con un
reagente LAL/substrato e in presenza di endotossine
si sviluppa un colore giallo. Un fotometro termostatato
misura la reazione. La concentrazione di endotossine
viene calcolata dallo strumento utilizzando una curva
standard di riferimento (l’entità del colore sviluppata
dalla reazione è proporzionale alla concentrazione
delle endotossine).
Risultato rapido in circa 15 minuti.
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RMM e PIROGENI ED ENDOTOSSINE
BATTERICHE
Monocyte Activation Test (MAT) è il terzo
metodo ufficiale per la determinazione dei
pirogeni.
ELISA Test
Cryoblut
Incubation
Il principio del metodo prevede la rilevazione
della produzione di citochine rilasciate quale
risposta immunitaria in presenza di sostanze
pirogene.
Pyrogen in
solution
Monocytes in
cryoblut
Interleukin 1β
(IL1-β)
ELISA Test
ELISA Reader
Nella procedura sono utilizzati monociti
umani posti a contatto con il materiale da
esaminare. La risposta anticorpale prevede
la produzione di citochine in presenza di
pirogeni.
La rilevazione citochine avviene mediante
metodica ELISA e la concentrazione di
pirogeni viene calcolata utilizzando una
curva standard di riferimento.
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AUTORI
FASCICOLO 1
METODI RAPIDI IN MICROBIOLOGIA
(RMM): PARTE INTRODUTTIVA
Roberto Alesci (MERCK MILLIPORE)
Francesco Antonetti (CONSULENTE)
Gilberto Dalmaso (A&lco INDUSTRIES)
Marco Sanvito (PALL)
FASCICOLO 2
BIOLUMINESCENZA
Roberto Alesci (MERCK MILLIPORE)
Paola Barzi (MERCK SERONO)
Francesco Cenci (SANOFI)
Andrea Conti (Sanofi)
Alessio De Santis (PALL)
Ornella Finocchiaro (MERCK SERONO)
Valeria Giannelli (PFIZER)
Marco Sanvito (PALL)
Case Study 1
Alessio Fantuzzi (CHIESI)
Case Study 2
Serenella Bruschi (ANGELINI)
Annarita Zacchilli (ANGELINI)
FASCICOLO 3
CITOMETRIA
Filippo Trionfera (BSP)
Monika Fadione (CORDEN PHARMA)
Veronica Bracaglia
Gaia Malpocher (A&lco INDUSTRIES)
Case Study 1
Manuel Selvaggio (PFIZER)
FASCICOLO 4
TECNOLOGIE DI AMPLIFICAZIONE
DEGLI ACIDI NUCLEICI (NAT)
Roberto Alesci (MERCK MILLIPORE)
Daniele Quaratino (MERCK MILLIPORE)
Mauro Anglana (MERCK MILLIPORE)
Emiliano Toso (MERCK SERONO)
Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES)
Marco Sanvito (PALL)
FASCICOLO 5
TECNOLOGIA OTTICA
Matteo Bisceglia (GSK)
Elena Salsi (GSK)
Manuela Bini (GLAXO)
Case Study
Gaia Malpocher (A&lco INDUSTRIES)
FASCICOLO 6
COLORIMETRIA
Annalisa Milanesi (BIOMERIEUX)
Luciano Ninu (BIOMERIEUX)
FASCICOLO 7
RILEVAZIONE DIRETTA DELLA
FLUORESCENZA
Mauro Anglana (MERCK MILLIPORE)
Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES)
Case Study
Valentina Nunziati (MOLTENI)
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FASCICOLO 8
IDENTIFICAZIONE FENOTIPICA
Veronica Bracaglia (Consulente)
Monica Fadione (CORDEN PHARMA)
Annalisa Milanesi (BIOMERIEUX)
Patrizia Muscas (ELI-LILLY)
Luciano Ninu (BIOMERIEUX)
Cherubina Santoro (ELI-LILLY)
Rosa Siciliano (CNR)
Filippo Trionfera (BSP)
Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES)
Maria Fiorella Mazzeo (CNR)
FASCICOLO 9
IDENTIFICAZIONE GENOTIPICA
Federico Biella (LIFE TECHNOLOGIES)
Veronica Bracaglia (Consulente)
Monica Fadione (CORDEN PHARMA)
Annalisa Milanesi (BIOMERIEUX)
Patrizia Muscas (ELI-LILLY)
Cherubina Santoro (ELI-LILLY)
Luciano Ninu (BIOMERIEUX)
FASCICOLO 10
I PIROGENI E LE ENDOTOSSINE
BATTERICHE
Andrea Di Vora (MERK MILLIPORE)
Stefano Ceccanti (ABIOGEN)
Filippo Trionfera (BSP)
Massimiliano Frasca (BSP)
Patrizia Battirossi (MSD)
Bodo Holtkamp (MERK MILLIPORE)
Gabriele Schmitz (MERK MILLIPORE)
RINGRAZIAMENTI
Si ringrazia la Dott.sa Valeria Giannelli per
la collaborazione nella revisione dei testi
della Linea Guida e della presentazione.
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