Diapositiva 1 - Università degli Studi "G. d`Annunzio"

C.L. Medicina e Chirurgia
Università di Chieti-Pescara
Anno Accademico 2015-2016
Tecniche per la valutazione della
attività in vitro degli antibiotici:
Antibiogramma
Giovanni DI BONAVENTURA, PhD
Dipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche
Scuola di Medicina e Scienze della Salute
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
Tests di antibiotico-sensibilità
Obiettivi
I tests di sensibilità agli antibiotici permettono la valutazione del profilo di sensibilità di
un ceppo microbico, presunta causa della malattia, verso uno o più antibiotici.
I tests vengono eseguiti in vitro, ossia in condizioni standardizzate per garantire la
riproducibilità e la accuratezza dei risultati.
I risultati di questi tests debbono essere adeguatamente interpretati per guidare la scelta
dell’antibiotico da adottare. A tal fine contribuiscono, ovviamente, anche le
informazioni cliniche e l’esperienza professionale.
Obiettivi:
- INDIVIDUALE: predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica
mirata.
- EPIDEMIOLOGICO: monitorare la evoluzione della antibiotico-resistenza, per la
definizione della terapia empirica, per l’aggiornamento dello spettro di azione
clinico della molecola, per l’adozione di adeguate misure di controllo e/o per
verificarne l’efficienza.
Tests di antibiotico-sensibilità
Standardizzazione
•
•
•
La intrinseca variabilità biologica della sensibilità microbica agli antibiotici
rappresenta la principale limitazione dei tests di sensibilità.
E’ dunque necessario controllare tutti i fattori tecnici mediante rigorosa
standardizzazione di tutte le fasi analitiche e post-analitiche (purezza e
concentrazione dell’inoculo batterico, composizione del terreno, reattivi,
condizioni di incubazione, metodi di lettura e di interpretazione dei risultati).
Informazioni dettagliate ed aggiornate al riguardo della esecuzione dei tests di
sensibilità e della interpretazione dei risultati vengono fornite dalla CLSI (Clinical
Laboratory Standards Institute), già NCCLS (National Committee for Clinical
Laboratory Standards), e dall’EUCAST (European Committee for Antimicrobial
Susceptibility Testing).
Tecniche per la determinazione in vitro della
antibiotico-sensibilita’
Le metodiche che possono essere utilizzate dal Microbiologo Clinico per valutare la
sensibilità microbica agli antibiotici sono:
• FENOTIPICHE (basate sulla attività antimicrobica ed utilizzo dei breakpoints)
QUANTITATIVE (determinazione di MIC)
- Microdiluizione in brodo (gold standard)
• Manuale od automatizzato
- Agar diluizione (gold standard)
- Epsilometer test (E-test) (manuale)
QUALITATIVE (classe di sensibilità)
- Kirby-Bauer o diffusione in agar (manuale)
•
GENOTIPICHE (basate sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto)
– mecA, blaZ, vanA, vanB, … PBP2a, …
Verranno trattate soltanto alcune tra le tecniche fenotipiche. Per le altre, si rimanda al C.I. «Medicina di Laboratorio»
Tecniche per la determinazione in vitro della
antibiotico-sensibilità
Condizione essenziale per l’esecuzione di un antibiogramma accurato ed attendibile è l’impiego
di una coltura PURA, ossia derivata da una singola colonia (popolazione clonale).
Una coltura pura di un microrganismo potrà essere ottenuta a seguito di sub-coltura della
crescita primaria (ossia quella ottenuta dalla semina del campione clinico) mediante tecnica
di semina per isolamento.
Coltura PURA (monomicrobica)
Coltura non PURA (polimicrobica)
Tecnica di semina per isolamento
Kirby-Bauer
Esecuzione
1.
2.
3.
4.
5.
Allestimento di una sospensione batterica standardizzata (1 x 108 CFU/ml)
da una coltura pura
Semina della sospensione alla superficie di un terreno standardizzato
Apposizione di dischetti antibiotizzati
Incubazione (37°C, 18-24h)
Lettura (misurazione degli aloni di inibizione) ed interpretazione (S, I, R)
dei risultati
Kirby-Bauer
Principio
 A seguito della applicazione del dischetto, la molecola antibiotica
diffonde nell’agar in direzione centrifuga, creando un gradiente
dinamico di concentrazioni antibiotiche. Il microrganismo inizia a
dividersi e cresce verso una massa critica.
 Si formerà un alone di inibizione dovuto alla inibizione della crescita
batterica indotta dall’antibiotico fino a che (“testa” dell’alone) la
densità cellulare sarà tale da assorbire la molecola nelle immediate
vicinanze, in tal modo mantenendone le concentrazioni a livelli subinibenti e, quindi, permissivi per la crescita batterica.
Kirby-Bauer
Lettura dei risultati
 La lettura del risultato consiste nella misurazione del
diametro del’alone di inibizione formatosi attorno al dischetto.
 Considerando il gradient di concentrazione formatosi (tende a
diminuire in direzione centrifuga), la sensibilità del ceppo
batterico alla molecola saggiata sarà diretta funzione del
diametro misurato: S = k · d
Saggi fenotipici – Kirby Bauer
Pros & Cons
- Semplicità di esecuzione, non richiede
strumentazione accessoria
- Fornisce un risultato (classi di sensibilità), facilmente
interpretabile dal Clinico
- flessibilità, nella selezione delle molecole da saggiare
- Economico (il meno costoso tra i tests di sensibilità)
- Non automatizzabile
- Non consente la crescita di tutti i microrganismi
“esigenti”
Microdiluizione in brodo
Esecuzione e lettura risultati
128 64 32 16 8
L’antibiotico (a concentrazioni scalari 2-fold) viene solubilizzato
in brodo di crescita.
A seguito di semina dell’inoculo standardizzato, il sistema viene
incubato a 37°C per 16-20 h, quindi viene letta la MIC.
MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura
quantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinato
batterio. Definita come la più bassa concentrazione di
antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.
Si esprime in µg/ml (mg/L).
4
2
1
0.5 0.25 +
-
Agar diluzione
Esecuzione e lettura risultati
L’antibiotico (diluizioni scalri 2-fold) viene incluso in agar.
MIC: minima concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita microbica visibile (colonie).
Saggi fenotipici – tests di brodo/agar diluizione
Pros & Cons
- Elevata riproducibilità (“gold standard”)
- Quantitativa: genera valori di MICs (anche MBC nel
caso della diulizione in brodo)
- economica (reagenti, strumentazione)
- Consente di verificare la accuratezza di sistemi
automatizzati in caso di risultati discordanti
- Laborioso (tempi)
- Richiede elevato “know-how”
- Tecnica manuale, possibili errori in fase
pre-analitica (es. preparazione diluizioni seriali di
antibiotico)
Sistemi automatizzati
•
•
•
•
Fino agli anni ‘70 i tests di antibiotico-sensibilità venivano condotti esclusivamente
mediante metodiche manuali.
La possibilità di automatizzare tali tests: i) riduce significativamente i tempi di
esecuzione dell’indagine e, quindi, il tempo richiesto per la refertazione dei
risultati; ii) minimizza gli errori legati all’operatore; iii) aumenta la sensibilità di
lettura.
Nel 1974 venne per la prima volta introdotto un Sistema automatizzato (Autobac I;
Pfizer Diagnostics).
Attualmente, la maggior parte dei laboratori clinici utilizza un sistema
automatizzato per la valutazione della attività antimicrobica degli antibiotici.
Sistemi automatizzati
Esecuzione
In questo sistema non è possibile testare, per ciascuna molecola, un
range di concentrazioni ma soltanto i valori bkp-S e bkp-R.
Pertanto, il risultato indicherà soltanto la posizione del valore di MIC
rispetto ai bkps (MIC<bkpS; bkpS<MIC<bkpR; MIC>bkpR), ma non il
valore esatto di MIC.
Phenotypic tests – Sistemi automatizzati
Pros & Cons
- Riduzione del lavoro
- Rapida refertazione dei risultati, tempestivo
avvio della terapia antibiotica
- Possibilità di organizzare i risultati in databases,
utili per la consultazione retrospettica dei trends
di isolamento e di resistenza.
- Scarsa flessibilità: possibilità di saggiare pannelli
“standardizzati” (commercializzati) di antibiotici
- Difficoltà di analisi per microrganismi a lenta
crescita
- Risultato non sempre “dettagliato”: frequente
valutazione della attività mediante l’utilizzo dei
soli valori di concentrazione corrispondenti ai
breakpoints
Tests di antibiotico-sensibilità
KB
BD
ETest
Sistema
automatizzato
Semplicità
+++
+
+++
+++
Risultati
S/I/R
MIC
MIC
MIC
Accuratezza
+
+++
++
++
Flessibilità
+++
+++
+++
+
Tempi
+
+++
+
+
Automazione
+
+
+
+++
Costo/test
+
+
+++
+++
Interpretazione dei risultati: breakpoints
• I risultati ottenuti in vitro (endpoints) - diametri degli aloni di inibizione (Kirby-Bauer), valori di
MIC (brodo/agar diluizione, E-test) - debbono essere interpretati mediante valutazione
comparativa con “valori soglia” o breakpoints.
• I breakpoints vengono stabiliti, per ciascuna combinazione “specie-antibiotico”, da Comitati
Nazionali od Internazionali quali CLSI ed EUCAST.
• Attraverso il confronto con i breakpoints, l’endpoint può essere tradotto in una delle cosiddette
“categorie terapeutiche”:
–
–
–
S (sensibilità)
I (sensibilità intermedia)
R (resistenza)
S
I
bkp1
R
bkp2
• I breakpoints sono fissati in funzione di un complesso insieme di parametri:
–
–
–
microbiologici (es. distribuzione dei valori di MIC o degli aloni di inibizione dei ceppi selvaggi, cioè
privi di meccanismi di resistenza acquisiti; cut-off epidemiologici, introdotti da EUCAST);
farmacologici (es. dosaggio terapeutico del farmaco, concentrazioni sieriche ottenibili);
clinici (es. studi di efficacia clinica per stabilire la correlazione tra risultati in vitro ed outcome clinico).
EUCAST breakpoints
Kirby-Bauer
Brodo-diluizione
Agar-diluzione
Microdiluizione in brodo / E-test
Interpretazione dei risultati
Categorie terapeutiche: definizioni
Per un dato antibiotico, in accordo con le linee guida CLSI/EUCAST, un ceppo batterico verrà refertato
quale sensibile, intermedio o resistente:
Sensibile
Il ceppo viene inibito nella crescita od ucciso da concentrazioni di antibiotico raggiungibili in vivo
(sieriche, tessutali)*. Un’infezione sostenuta da un ceppo batterico isolato può essere trattata
appropriatamente con il dosaggio usuale dell’antibiotico testato e raccomandato per il tipo di
infezione clinica. Indica una elevata probabilità di successo terapeutico.
Intermedio (a sensibilità intermedia)
Il ceppo mostra una MIC borderline rispetto ai livelli raggiungibili in vivo (sierici e tessutali) di
antibiotico* la cui efficacia potrebbe dunque essere minore di quella registrata per gli isolati sensibili.
Tuttavia, questa categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici sono
fisiologicamente concentrati (chinolonici e -lattamici nelle urine) o quando l’antibiotico può essere
utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali in assenza di significativi effetti collaterali (lattamici). Rappresenta una “buffer zone” (zona cuscinetto) che dovrebbe evitare/ridurre rilevanti
errori interpretativi (falsa sensibilità) a seguito di errori di natura tecnica, soprattutto nel caso di
molecole con un ristretto margine di farmacotossicità. Indica un effetto terapeutico incerto.
Resistente
Il ceppo non viene inibito/ucciso dalle concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo (sieriche, tessutali)
dall’antibiotico*. Questa categoria predice una elevata probabilità di fallimento terapeutico.
* a seguito di somministrazione di una dose terapeutica «usuale»
Interpretazione critica dell’antibiogramma:
Attività battericida
E’ necessario considerare la attività battericida di un antibiotico, SOPRATTUTTO in questi
casi particolari:
• infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi, meningiti, polmoniti
• focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente accessibili
all’antibiotico
Concentrazione Minima Battericida (MBC): la più bassa concentrazione di antibiotico in
grado di uccidere almeno il 99.9% (1 germe su 1.000 elude l’azione antibiotica) delle
cellule formanti la popolazione iniziale.