TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE IN PROCARIOTI ED

TERMINAZIONE DELLA TRASCRIZIONE IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI Concetti generali sulla trascrizione batterica
-  Allo stesso modo dell’inizio della trascrizione, la terminazione non e’
un fenomeno passivo, ma e’ un modo per controllare la trascrizione
-  L’RNA polimerasi sintetizza l’RNA finche’ non trova delle sequenze
chiamate TERMINATORI, a quel punto smette di aggiungere
nucleotidi, si rompono I legami idrogeni RNA-DNA e l’mRNA si stacca
dal template
-  Come studiare I siti di terminazione:
-  In vivo e’ difficile perche’ non si e’ sicuri se l’mRNA sia stato
tagliato o meno
-  In vitro e’ difficile perche’ l’attivita’ dell’RNA polimerasi dipende
molto dalla forza ionica e dalle altre condizioni chimico-fisiche
 Quindi informazioni attendibili sui siti di terminazione arrivano da
siti in cui la sequenza al 3’ dell’mRNA e’ uguale in vitro ed in vivo
Concetti generali sulla trascrizione batterica
-  Tutte le sequenze richieste per la terminazione risiedono PRIMA
dell’ultima base trascritta (quindi al 5’ dell’ultima base), quindi non ci
sono sequenze conservate successive all’mRNA che indichino la
presenza di terminatori
  La responsabilita’ della terminazione risiede nell’mRNA appena
trascritto
-  La maggior parte delle volte le informazioni per la terminazione
risiedono nella STRUTTURA SECONDARIA dell’mRNA, quindi non
basta analizzare la sequenza di DNA per capirne la presenza
-  Ci sono due classi di terminatori a seconda che l’RNA Polimerasi
richieda o no altri cofattori per terminare la trascrizione:
1.  Terminatori instrinseci: non hanno bisogno di cofattori, si basano
unicamente sulla sequenza dell’mRNA
2.  Terminatori Rho-dipendenti: richiedono un fattore proteico
chiamato rho
I terminatori intrinseci non richiedono nessun cofattore
per la terminazione
I terminatori intrinseci hanno tre caratteristiche:
1.  Formano un hairpin al 3’ dell’mRNA, questo
causa un rallentamento della polimerasi ed
e’ un prerequisito per la terminazione
2.  Presenza di una stringa di U al 3’
dell’mRNA. L’ibrido rU:dA ha dei legami
idrogeno molto deboli che richiedono poca
energia per essere rotti.
3.  Sequenza ricca in CG vicino al poliU
-  Entrambi sono necessari ma non sufficienti per avere terminazione, cioe’
se e’ presente 1. ma non 2., ma polimerasi rallenta ma l’mRNA non si
stacca dal DNA stampo
-  Queste caratteristiche sono importanti anche per la terminazione in
eucarioti
I terminatori intrinseci non richiedono nessun cofattore
per la terminazione
3 2 1 Terminatori Rho-dipendenti
- 
Rho e’ un’elicasi con diminio ATPasico che
funziona come esamero
- 
Le sequenze per una terminazione Rhodipendente richiedono una sequenza di 50-90bp
(rut sequence) upstream alla terminazione (quindi
al suo 5’) che solitamente e’ ricca in C e povera in
G
- 
Rho e’ una elicasi RNA dipendente che richiede
uno stretch di 50basi di RNA per funzionare quindi
il modello e’ che leghi la rut sequence, scorra
lungo l’mRNA fino a raggiungere l’RNA polimerasi
e poi la stacchi.
- 
Questo richiede che la polimerasi rallenti,
probabilmente a causa di sequenze che formano
strutture secondarie (vedi prima)
- 
Rho termina la tx con due meccanismi:
1. Attivita’ elicasica
2. crea contatti con la polimerasi che la staccano
Terminatori Rho-dipendenti
Nei batteri trascrizione e traduzione sono spesso accoppiate, cosa succede
alla terminazione Rho-dipendente se l’mRNA e’ gia’ occupato dai ribosomi?
  Rho non puo’ funzionare
Spesso molti geni coinvolti nella stessa pathway sono trascritti come unico
mRNA nei batteri. Se ci fosse una mutazione non senso in uno di questi
geni, avrebbe senso trascrivere gli altri?
Se non ho traduzione di un mRNA trascritto, ha senso continuare a
trascriverlo?
Il fattore Rho permette di terminare la tx di sequenze non tradotte o errate
grazie alla presenza di sequence terminatrici all’interno degli mRNA, la
polimerasi rallenta e, in assenza di ribosomi, Rho raggiunge la polimerasi.
Questo fenomeno e’ detto polarita’.
Perche’ ci sono terminatori criptici negli mRNA? O si sono evoluti
appositamente o si formando grazie al ripiegamento in 2D di sequenze.
tRNA e rRNA non sono soggetti a polarita’ perche formano strutture
secondarie che impediscono il legame di Rho
Terminatori Rho-dipendenti
La terminazione batterica puo’ essere modulata
Antiterminatori = Specifiche proteine che consentono alla
RNA polimerasi di continuare la trascrizione attraverso il sito
di terminazione
Attenuatori = terminatori intrinseci localizzati all’inizio di
un’unita’ trascrizionale
Antiterminazione: l’esempio del fago λ
Una caratteristica comune della strategia dei fagi e’ che
pochi dei geni fagici sono trascritti dall’RNA polimerasi del
batterio infettato.
Tra questi geni ci sono delle proteine che promuovono la
trascrizione dei rimanenti geni fagici con diverse strategie:
1.  Sintesi di nuovi fattori sigma che riconoscano I promotori
del fago
2.  Sintesi di nuova RNA polimerasi fagica in grado di
riconoscere I promotori fagici senza altri cofattori
3.  Sintesi di antiterminatori che consentano di continuare a
trascrivere geni successivi a quelli trascritti per primi. In
questo modo tutti I geni saranno controllati dai promotori
iniziali
Il caso del fago lambda: Cascata di geni
Infezione e aAvazione del genoma di Lambda Geni precocissimi Geni precoci Geni tardivi Uno dei geni precocissimi (N) codifica per un anIterminatore che consente alla polimerasi di procedere oltre, trascrivendo cioe’
anche i geni precoci N e Cro = geni precocissimi NB: entrambi terminatori Rho-­‐
dipendenI (sono I terminatori dai quali Rho e’ stata scoperta L ’ e v e n t o d i
antiterminazione non e’
determinato dai
terminatori tR e tL, I siti
di riconoscimento per
l’antiterminatore N, sono
detti nutR e nutL e sono
upstream all’mRNA.
Quindi l’antiterminatore
non lega I terminatori,
ma permette all’RNA
polimerasi di ignorarli.
Attenuazione: l’esempio dell’operone triptofano
L’operone triptofano (trp) codifica per cinque geni strutturali
disposti l’uno di seguito all’altro, codificanti per tre enzimi
che convertono l’acido corismico in triptofano (un
amminoacido). L’operone e’ sotto il controllo di due
meccanismi che evitano la produzione degli enzimi in caso
di abbondanza di triptofano:
1.  Repressione dell’espressione attraverso un repressore
che lega la sequenza operatore
2.  Attenuazione: indipendente dalla repressione, regola
l’espressione dopo che la polimerasi ha lasciato il
promotore.
L’operone trp e’ costituito da una regione leader (che codifica per un
piccolo peptide ricco in triptofano di 14aa) e da trpE che codifica per un
enzima della sintesi del triptofano. Le due regioni sono separate da un
ATTENUATORE, un terminatore intrinseco che costituisce una barriera
per Ia RNA polimerasi solo in caso di abbondanza di trp
La traduzione della sequenza leader e’ il
sensore della presenza del triptofano.
In assenza di triptofano, il ribosoma si ferma
sui codoni che richiedono il tRNA per il
triptofano, questo impedisce il folding
dell’attenuatore a formare la forcina del
terminatore intrinseco.
In presenza di triptofano, il ribosoma puo’
procedere e questo consente la formazione
della forcina che funge da terminatore
intrinseco. Come conseguenza, l’RNA
polimerasi si stacca e la trascrizione
dell’operone si interrompe.
In assenza del triptofano il
trp-tRNA non puo’ essere
caricato sui ribosomi. Di
conseguenza i ribosomi si
bloccano sulla regione
leader impedendo il corretto
ripiegamento dell’RNA
Presenza di trp Assenza di trp L’attenuatore e’ costituito da 4 sequenze che possono assumere
strutture secondarie alternative che fungono da terminatore intrinseco o
meno.
La scelta tra una delle due conformazioni e’ dettata dalla POSIZIONE
DEL RIBOSOMA
In presenza di triptofano il
ribosoma puo’ tradurre la
sequenza leader e continuare
fino alla sequenza UGA (tra 1 e
2). Cosi’ facendo copre la
sequenza 2 e le impedisce di
appaiarsi con 3 che quindi si puo’
appaiare con 4, formando un
terminatore.
In assenza di trp, il ribosoma di
ferma ai codoni Trp nella regione
1, coprendola. 1 non puo’ legare
2 che quindi si puo’ appaiare con
la sequenza 3. Se la sequenza 3
e’ occupata, non potra’ formare il
terminatore con la sequenza 4 e
la RNA polimerasi potra’
procedere.
Ovviamente questo tipo di controllo richiede un controllo temporale
finissimo: la traduzione del leader deve avvenire allo stesso tempo in cui
l’RNA polimerasi raggiunge il sito terminatore.
https://www.youtube.com/watch?v=42RqqAYs8Fk
https://www.youtube.com/watch?v=YAr18UR2dos
Terminazione della trascrizione in eucarioti
-  Molto meno conosciuta della terminazione in procarioti
-  I meccanismi di terminazione dipendono dalla RNA Polimerasi in
analisi
1.  RNA Polimerasi I:
•  La terminazione avviene a piu’ di 1000 bp downstream al 3’
maturo, che quindi e’ generato da un taglio e rappresenta le
ultime basi prima della terminazione
•  Richiede una sequenza di 18bp e una DNA-binding protein
(quindi non come Rho, che e’ RNA-binding protein)
2.  RNA Polimerasi III:
•  Ha delle similitudini con
la terminazione
intrinseca dei batteri
perche’ richiede degli
stretch di U, non richiede
strutture secondarie e
loop nell’mRNA, ma un
intorno ricco in GC
Terminazione della trascrizione in eucarioti
3.  RNA Polimerasi II: non ha terminatori, la terminazione e’
strettamente correlata ai processi di maturazione dell’mRNA e puo’
avvenire 0.5-2 Kb a valle del sito di poliadenilazione
La maggior parte degli mRNA eucariotici (tutti tranne quelli degli istoni),
sono processati (modificati) nel nucleo. Queste modificazioni
determinano:
1.  La stabilita’ dell’mRNA
2.  La sua capacita’ di essere legato e quindi tradotto dai ribosomi
3.  Il distacco dell’RNA Polimerasi II dal DNA e la terminazione della
trascrizione
Gli mRNA dei Batteri
vengono tradotti durante il
processo trascrizionale, e
vengono degradati subito
dopo
L’attacco dei ribosomi
all’mRNA avviene grazie
ad una specifica sequenza
posta nel 5’UTR: la
sequenza di ShineDalgarno
L’mRNA eucariotico subisce:
1.  CAPPING
2.  POLIADENILAZIONE
1
2
L’mRNA eucariotico codifica per una sola proteina: non ci sono
operoni
L’mRNA e’ modificato alle due estremita’: cap e poliA
Dopo che l’mRNA nascente ha raggiunto una lunghezza di 25-30nt,
una 7-metil-guanosina e’ aggiunta al suo 5’.
Questo processo e’ mediato da un complesso enzimatico che si lega al
dominio C-terminale (CTD) della RNA Polimerasi II.
Esso quindi non avviene per gli RNA trascritti da RNA Polimerasi I e III.
I primi studi a riguardo dimostravano che i
trascritti primari si estendevano ben oltre il sito
di poliadenilazione.
Si e’ capito quindi che il trascritto primario e’
tagliato e cio’ che sta a valle del taglio e’
degradato rapidamente.
Quasi tutti gli mRNA contengono la sequenza
AAUAAA 10-35nt prima della coda di poli(A). I
mutanti di questo sito vengono degradati
rapidamente.
Il processamento al 3’ puo’ essere diviso in due fasi:
1.  Trascrizione della sequenza AAUAA, seguita dallo stallo della RNA Polimerasi II
e taglio endoribonucleolitico del trascritto. Questo processo inizia quando la
sequenza del sito di poliadenilazione e’ riconosciuta da fattori associati alla PolII,
l’efficienza di terminazione dipende quindi dalla forza del sito di poliadenilazione
2.  Il prodotto del taglio a monte viene poliadenilato, mentre il prodotto a valle e’
degradato.
NB: il sito di poliadenilazione non e’ solamente la sequenza AAUAA, ma
comprende anche molte altre sequenze accessorie, e poco caratterizzate, che
fanno si che alcuni siti siano piu’ efficienti di altri nel terminare la trascrizione
Il corretto processamento del 3’ richiede un
complesso proteico formato da:
-  Endonucleasi (componenti CFI e CFII) per
tagliare l’mRNA
-  Poly(A)Polimerasi (PAP) che sintetizza la
coda di poli(A)
-  Il componente di specificita’ (CPSF) che
riconosce la sequenza AAUAA
-  CSTF che riconosce le sequenze accessorie
G/U
La PAP ha attivita’ catalitica non specifica, quindi
potrebbe attaccare basi di A a tutti gli RNA che
incontra, ma dopo l’associazione con gli altri
componenti del complesso, attacca A solo in
RNA che contengono la sequenza AAUAA.
Funziona in 2 fasi:
1.  Aggiunta lenta di circa 10 A
2.  Associazione con PABP (PoliA Binding
Protein) e aggiunta di circa 200 A
https://www.youtube.com/watch?v=DoSRu15VtdM
Il meccanismo di poliadenilazione e’ funzionale
alla terminazione
La proteina CPSF non lega da subito AAUAA, ma e’ associata al corpo della RNA
Poli.
Quando si sposta dalla PolII alla sequenza, causa lo stallo della RNA Poli ed il suo
distacco.
Terminazione della trascrizione: il caso dell’HIV
La trascrizione del genoma di HIV e’ regolata
dall’antiterminatore Tat
The TAR element in the HIV transcript contains sequences recognized by
Tat and the cellular protein cyclin T. Cyclin T activates and helps position
Cdk9, a protein kinase, near its substrate, the CTD of RNA polymerase II.
Thus, TAR is an antiterminator, without it there wouldn’t be transcription
of genes downstream of the LTR (promoter).
Il cap serve per l’attacco ai ribosomi
Cap e poliA sono fondamentali per l’inizio della
traduzione
Il cap viene legato dal fattore di inizio della traduzione eIF4F
che contatta anche il poliA tramite PABP
Cap e poliA proteggono gli mRNA dalle esonucleasi
La stabilita’ degli mRNA e’ un meccanismo di regolazione dell’espressione
genica. Quindi ci sono dei meccanismi di degradazione, ma non sono
costitutivi, bensi’ sono regolati da proteine e vie si segnale.
Nell’mRNA ci sono sequenze e strutture secondarie o modificazioni che ne
determinano la stabilita’.
Le vie di degradazione dell’mRNA
1.  Deadenilazione-dipendente
2.  Deadenilazione-indipendenti:
a.  Via endoribonucleolitica
b.  Non-sense mediated decay (NMD)
1.
Vie endoribonucleolitiche
There are a few messenger RNAs that degrade by a minor
pathway known as endoribonucleolytic decay. Endoribonucleases
recognize specific sequence elements within the transcript and
cleave the mRNA internally. The cleavage event generates free 3'
and 5' ends that are easily accessible to exonucleases and the
products of the cleavage reaction are therefore rapidly degraded.
In contrast, stabilizer protein may block the binding of
endoribonuclease.
Non sense-mediated decay (NMD)
Un forte link tra stabilita’ dell’mRNA e traduzione e’ fornito
dall’NMD, un meccanismo che garantisce che gli mRNA con codoni
di stop prematuri (dovuti a non sense mutations) non vengano
tradotti. In questo modo si evita l’accumulo di trascritti aberranti e
proteine tronche.
Questa via di degradazione colpisce mRNA con codoni non sense,
ma anche mRNA che contengono introni non spliced.
Regolazione della traduzione del messaggero:
il caso del metabolismo del ferro
La Transferrina serve per far
entrare il ferro nelle cellule
Spazio extracellulare citoplasma Membrana cellulare La Ferritina serve per bloccare
l’eccesso di ferro nelle cellule
Transferrina e Ferritina agiscono in modo opposto sulla
concentrazione di Ferro intracellulare
Il ferro citoplasmatico regola la traduzione degli mRNA per Transferrina
e Ferritina attraverso la regolazione del legame di una proteina che lega
strutture secondare dell’mRNA di ferritina e transferrina.