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estrazione acidi nucleici

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estrazione acidi nucleici
ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI
Isolamento di DNA ed RNA da un tessuto o da cellule
eucariotiche o procariotiche
E’ quindi possibile estrarre acidi nucleici da varie fonti
- Procarioti
- Eucarioti (tessuti animali, tessuti vegetali)
- Virus
- Organelli (mitocondri e cloroplasti),
- Liquidi biologici
ISOLAMENTO ACIDI NUCLEICI
-Organo intero, tessuto, colture cellulari, sangue
- foglie, radici, semi
Tipo di acido nucleico:
ssDNA, ds DNA, RNA totale, mRNA rRNA, tRNA
Risultato desiderato:
quantità, purezza, tempo richiesto
Applicazione:
- Digestione con ER
- Clonaggio,
- Marcatura
- Ibridazione
- PCR ecc
METODO DI ESTRAZIONE TRADIZIONALE
CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE
Inizialmente tutte le particelle
dell’omogenato sono distribuite
uniformemente nel tubo da
centrifuga
Centrifughe successive,
variando i tempi e velocità di
centrifugazione si possono
separare particelle che
differiscono in dimensione e
densità
separazione sovranatante
da pellet
L’estrazione di acidi nucleici dai vari materiali
biologici procede in diverse fasi
1- Rottura e lisi cellulare
2- Allontanamento delle membrane
3- Allontanamento lipidi, proteine e carboidrati (Estrazione
fenolica)
4- Estrazione eterea (per allontanare il fenolo)
5- Allontanamento e distruzione di DNA o RNA (facoltativo)
6- Precipitazione alcoolica e purificazione A.N.
7- Dosaggio.
1- ROTTURA DELLE CELLULE
Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter).
Vibrazioni ultrasoniche
Congelamento/scongelamento
Scoppio delle cellule per shock osmotico
Agenti litici responsabili della lisi cellulare
Metodi di lisi cellulare
Tecnica
Applicazione
Metodi non meccanici
Shock osmotico
Tessuti animali molli, alcune cellule
vegetali
Congelamento/scongelamento
Tessuti animali molli, alcuni batteri
Enzimi litici
Cellule animali e vegetali
Metodi meccanici
Pestello e mortaio
Tessuti resistenti
Sfere di vetro
Batteri e funghi
Omogenizzatore a motore
Tessuti vegetali e animali
Omogenizzatore a mano
Tessuti molli delicati
Ultrasonicazione
Microorganismi
La LISI CELLULARE può avvenire in due modalità:
1- Lisi blanda
Triton e lisozima ( piccoli pori nella membrana).
Isolamento DNA plasmidiale mentre il DNA
cromosomiale rimane attaccato alla membrana interna;
2- Lisi spinta
Detergenti anionici quali SDS (membrane
Frantumate). Isolamento acidi nucleici totali (DNA
cromosomiale, mRNA, rRNA, tRNA ecc) .
2. ALLONTANAMENTO DELLE MEMBRANE
centrifugazione che permette la Separazione di due fasi
- una superiore (sopranatante) che contiene gli acidi nucleici in
soluzione
- una inferiore (pellet) che comprende membrane e frammenti
cellulari.
3. ALLONTANAMENTO PROTEINE
Sodio Dodecil Solfato (SDS).
Detergente anionico che si lega alle proteine alterandone la struttura
secondaria e, se costituite da subunità, si dissociano
Enzimi proteolitici: pronasi e proteinasi K.
PRONASI: miscela di almeno 4 enzimi proteolitici, di cui due
endopeptidasi (serina- e metallo-proteasi) e due esopeptidasi
(carbossi e ammino-petidasi).
PROTEINASI K: endopeptidasi aspecifica molto attiva.
Cloroformio-alcool isoamilico.
Le proteine formeranno un gel all’interfase cloroformio-acqua, mentre
gli acidi nucleici rimangono in soluzione
3. ALLONTANAMENTO PROTEINE
FENOLO
IL FENOLO si lega al core delle
proteine causando denaturazione
-  DNA si usa fenolo a pH basico (che inibisce le DNAsi).
- RNA si utilizza fenolo a pH acido (che inibisce le RNAsi) .
Si aggiunge un egual volume di fenolo al sopranatante che diventa
lattescente dopo agitazione. Quindi si centrifuga.
Dopo centrifugazione si ottengono tre fasi:
1)  superiore che contiene la soluzione di acidi nucleici;
2) interfase di proteine denaturate;
3) inferiore fase fenolica contenente lipidi e proteine ricche
di aminoacidi idrofobici
4. ESTRAZIONE ETEREA
Trattamento surnatante con etere per allontanare
eventuali residui di fenolo
Dopo centrifugazione l'etere localizzato nella parte
superiore del tubo viene allontanato.
La soluzione risultante costituisce la miscela di acidi nucleici.
5. ALLONTANAMENTO DI DNA O RNA
E' possibile a questo punto eliminare uno dei due componenti:
RNA previo trattamento con ribonucleasi (RNAsi)
DNA con l'uso di desossiribonucleasi (DNAsi)
La RNAsi viene usata per eliminare l’RNA in preparazioni di DNA;
la DNAsi viene usata per eliminare il DNA che contamina le
preparazioni di RNA
6. PURIFICAZIONE A.N.
La fase finale dell'estrazione è costituita dalla precipitazione alcolica
DNA è miscelato con 2 volumi di etanolo assoluto, in presenza di
cationi monovalenti e viene lasciata precipitare a –80°C.
Tale precipitazione è fortemente dipendente dal raggiungimento di una
massa critica. Per soluzioni a concentrazioni <10µg/ml è opportuno
aggiungere un carrier: t-RNA di lievito.
LAVAGGIO DEL PELLET
Dopo centrifugazione, i pellet di DNA vanno lavati in etanolo 70°
e ricentrifugati. Tale lavaggio allontana i sali, insolubili in tale
solvente, ma non è in grado di allontanare il cloruro di sodio
RISOSPENSIONE DELL’A.N
Il pellet dopo essiccazione, viene risospeso in un tampone a
bassa forza ionica, in genere TE (Tris-EDTA) a pH 7.6 - 8.0
DOSAGGIO DELL’A.N
L'acido nucleico può quindi essere dosato ed essere
utilizzato per ulteriori procedure quali digestione con
endonucleasi di restrizione, marcatura
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’
• Questa tecnica sfrutta un
gradiente di densità del mezzo per
separare le particelle :
• ZONALE (centrifugazione in
base alle dimensioni delle
particelle es: ribosomi)
• ISOPICNICA (centrifugazione
in base alla densità delle particelle
es:DNA)
• Il gradiente di densità del mezzo
aumenta dall'alto verso il fondo
del tubo.
• Substrati maggiormente
utilizzati sono il Saccarosio o
metalli pesanti (Cloruro di cesio o
di litio)
TIPI DI GRADIENTE
• DISCONTINUI la densità del
mezzo cresce dall’alto verso il
basso in maniera discontinua
attraverso una serie di soluzioni di
differente densità che vengono
stratificate l’una sull’altra.
• CONTINUI quando la
densità del mezzo cresce
continuamente lungo il tubo
da centrifuga
UTILIZZO DEI KIT
(in soluzione o su colonna di silice)
Sistemi di Isolamento e separazione degli acidi
nucleici disponibili in commercio
•  I Kit per l’estrazione degli acidi nucleici hanno il vantaggio di
fornire reagenti standardizzati e di qualità garantita dando così un
elevato grado di affidabilità
•  L’Estrazione automatizzata mediante strumenti consente di
estrarre il DNA senza alcun intervento manuale (circa 45’)
KIT DI PURIFICAZIONE
Molti prodotti commerciali garantiscono facilità d’uso
riproducibilità ed elevato livello di purificazione. Si basano
essenzialmente sull’utilizzo di
.Kit per estrazione in soluzione
•Resine a scambio ionico (scambiatori anionici come la DEAE cellulosa)
•Matrici silicee
•Gel filtration
•Ultrafiltrazione
+
R 4 N ........Cl
scambiatore
−
controione
+
OOCR'
molecola da scambiare
+
R 4 N .... OOCR'
+
ione molecolare legato
Cl −
ione scambiato
Matrici silicee
Legame acidi nucleici e particelle della matrice in presenza di
sali caotropici, (tiocianato della guanidina GuSCN) .
NO legame a sostanze
contaminanti
ESTRAZIONE E
PURIFICAZIONE
Lavaggi ed eluizione degli acidi nucleici con
tamponi a basso contenuto in sali
Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi
principali dell’estrazione di DNA da cellule o tessuti
DNA
Omegenizzazione di
cellule/tessuti 4°C
Lisi cellulare:detergenti/lisozima
Agenti chelanti: EDTA/citrato
Lisi
parete
Agenti proteinasici:proteinasi K
Purificazione
Estrazione con fenolo e
fenolo/cloroformio
Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 %
Risospensione del DNA: Tampone TE (Tris -EDTA pH 8)
Conservazione del DNA: 4 / -20 / -80 °C
ESTRAZIONE DELL’RNA
Vincere la battaglia con le RNasi
DNasi (ioni metallici) sono termolabili, facilmente inattivate da
agenti chelanti e dalla sterilizzazione in autoclave
RNasi (no cofattori) resistono a trattamenti drastici
(ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono
attive entro un ampio range di pH.
Fonti di RNasi in laboratorio
Tamponi e soluzioni di uso comune
Presenza di batteri o altri microrganismi che rilasciano i loro enzimi;
autoclavarli NON inattiva le RNasi, anzi può introdurle nei reagenti.
lavorare senza guanti può introdurre nelle soluzioni RNasi batteriche e
cellulari
batteri veicolati dall’aria possono sedimentare sulla superficie delle
soluzioni, portando con sè RNasi
Pipette Mai utilizzare le stesse pipette che hanno già dispensato soluzioni
di RNasi
E’ importante quindi
Dividere le soluzioni in piccole aliquote
Utilizzare plastica garantita RNasi-free
Trattare la vetreria per almeno 4 ore a 200°C
Indossare sempre guanti e cambiarli spesso
Mantenere un’area di
lavoro separata, dedicata
all’RNA
Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi
Potenti agenti denaturanti
•  Sali di guanidinio (guanidinio cloruro, guanidinio tiocianato)
•  2-mercaptoetanolo
•  Temperatura (Ghiaccio)
Sostanze deproteineizzanti
fenolo, cloroformio, SDS, proteinasi K
RNase inhibitor
Proteine che legano covalentemente le RNasi inibendo il 90%
dell’attività. Legame reversibile (inibitore mantenuto attivo)
EVITARE
soluzioni contenenti agenti fortemente denaturanti, come SDS o urea,
mantenendo un ambiente riducente e la temperatura < 65°C.
Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi
DEPC (dietilpirocarbonato):
Inattivazione RNasi alla
conc. dello 0,1%
agente alchilante che reagisce con le
proteine attaccando gli azoti imidazolici
dei residui istidinici, con perdita
dell’attività enzimatica
INATTIVAZIONE IN AUTOCLAVE
Composti contenenti gruppi amminici primari, come il Tris
reagiscono con il DEPC; di conseguenza, le soluzioni devono
essere preparate sciogliendo il Tris in acqua DEPC già
trattata ed autoclavata.
ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE
Metodo del fenolo acido-guanidina tiocianato
PRINCIPIO
il DNA passa nella fase organica se il fenolo è tamponato
con una soluzione a pH acido 5-6, mentre l’RNA rimane
nella fase acquosa
Si procede quindi alla
precipitazione alcolica
in presenza di cloruro
di litio, ammonio
acetato o sodio acetato
ISOLAMENTO DELL’mRNA
mRNA eucariotici presentano la coda di poliA all’estremità 3’.
Ibridazione con sequenze
sintetiche di oligo(dT)
metodo non adatto per gli mRNA batterici
ISOLAMENTO DELL’mRNA
• La preparazione di RNA totale è
fatta passare attraverso una
colonna costituita da un polimero
ricoperto con oligo(dT).
• Solo l’mRNA polidanilato ibriderà
con l’oligo(dT), mentre le altre
specie verranno eliminate mediante
lavaggi con tamponi a bassa
concentrazione salina.
• L’eluato finale sarà costituito dalla
miscela di tutte le specie di mRNA
presenti nella cellula al momento
dell’estrazione.
Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi
principali dell’estrazione di RNA da cellule o tessuti
RNA
Trattamento dei reagenti con inibitori
delle RNAsi (DEPC DietilPiroCarbonato)
Omegenizzazione di cellule/tessuti 4°C
Lisi cellulare: detergenti/lisozima
Lisi
parete
Agenti proteinasici:proteinasi K Solventi per RNA: Guanidina tiocianato
Purificazione
Estrazione con fenolo e
fenolo/cloroformio
Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 %
Risospensione e conservazione dell’RNA a -80°C
Dosaggio degli acidi nucleici
E' possibile dosare gli acidi nucleici con:
1)  Metodo Spettrofotometrico (spettroscopia nell’ultravioletto)
2) Metodo Fluorimetrico
3) Metodo Colorimetrico (spettroscopia nel visibile)
METODO SPETTROFOTOMETRICO
acidi nucleici assorbono la luce UV con un massimo alla lunghezza
d'onda di 260 nm.
Tale assorbimento è determinato dalle basi azotate, per cui è
caratteristico del DNA a doppio e singolo filamento e dell’RNA.
LEGGE DI LAMBERT-BEER
la frazione della luce incidente che viene assorbita da una soluzione ad
una determinata λ è proporzionale a:
-concentrazione della specie assorbente
-spessore della soluzione (cammino ottico)
determinazione assoluta, che si basa sulla relazione esistente tra
concentrazione e assorbanza.
Log I0/I = ε c λ
I0 è l’intensità della luce incidente
I : intensità della luce trasmessa
ε :coefficiente di estinzione molare (l’assorbanza di una soluzione 1M
della sostanza in esame quando viene letta in una cuvetta con percorso
ottico uguale ad 1 cm, ad una determinata lunghezza d’onda)
c : concentrazione della specie assorbente (moli/l)
λ : percorso ottico (cm)
L’espressione Log I0/I viene detta assorbanza (A) o densità ottica (OD).
L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione
del soluto che sta assorbendo la luce
c = A/ ε λ
Se λ = 1 cm
c = A /ε
Il coefficiente di estinzione molare ε dipende da:
-la natura chimica del composto
-il solvente
-la lunghezza d’onda
Il coefficiente di estinzione molare ε rappresenta l’assorbanza di una
soluzione a concentrazione 1M e a cammino ottico unitario
Coefficiente di estinzione specifico K, anziché il coefficiente di
estinzione molare
K esprime l’assorbanza di una soluzione a concentrazione 1mg/ml
alla λ di 260 nm
K = 21 per il DNA nativo a doppio filamento
K = 23 per il DNA denaturato a singolo filamento
K = 25 per l’RNA
Quindi: C (mg/ml) = A / K
oppure
Il coefficiente di estinzione molare degli acidi nucleici è la somma dei
coefficienti di estinzione molare di ciascun nucleotide.
È impossibile calcolare questa somma per tutti i nucleotidi, quindi è usato
un coefficiente di estinzione molare medio che è:
50 (µg/ml)-1 cm-1 per il DNA a doppio filamento
40 (µg/ml)-1 cm-1 per l’ RNA
Quindi:
1 A260 di DNA a doppio filamento = 50 µg/ml
1 A260 di RNA = 40 µg/ml
DETERMINAZIONE DELLA PUREZZA
Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza della
preparazione degli acidi nucleici
Preparazioni pure di DNA hanno valori di A260/A280 uguali a 1,8
Preparazioni pure di RNA hanno valori di A260/A280 uguali 2
Assorbanza a 230 nm
contaminazione del campione
dovuta a carboidrati, fenoli,
peptidi o composti aromatici
Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2
METODO FLUORIMETRICO
Concentrazione acidi nucleici stimata in base alla
fluorescenza emessa dall’ Etidio Bromuro.
Il dosaggio fluorimetrico è un dosaggio di tipo RELATIVO.
• Quantità crescenti e a concentrazione
nota di acido nucleico vengono caricate
su un gel accanto al campione a
concentrazione incognita.
La quantità fluorescenza
emessa da ciascuna banda
osservata, è proporzionale alla
massa del DNA presente nella
banda stessa,
• Dopo la corsa elettroforetica il gel viene
immerso in una soluzione di Etidio
Bromuro che si intercala tra le basi
dell'acido nucleico rendendolo
fluorescente alla luce UV.
la quantità di DNA nella banda
del campione è stimata
confrontando la fluorescenza
delle bande della serie standard
METODO COLORIMETRICO
Formazione di complessi colorati di particolari sostanze con il
ribosio o con il deossiribosio dello scheletro degli acidi nucleici
Valuta esattamente la quantità di DNA o RNA presenti in soluzione, anche
se la soluzione contiene entrambi gli acidi nucleici.
Orcinolo per l’RNA
Difenilammina per il DNA
L’intenso colore verde-azzurro, che si produce al termine della
reazione, consente il dosaggio colorimetrico dell’RNA a 660 nm.
Per il dosaggio, è necessario costruire una retta di taratura con
soluzioni di RNA a concentrazione nota e crescente.
Saggio con l’orcinolo per il dosaggio dell’RNA
Si basa sul dosaggio del ribosio attraverso la liberazione del furfurale che
si ottiene per riscaldamento del ribosio in ambiente contenente acido
cloridrico concentrato
L’RNA in HCl concentrato, subisce dapprima depurinazione e
successivamente i ribosi fosfati ottenuti defosforilati e deidratati per
produrre furfurale. Quest’ultimo si condensa con l’orcinolo dando origine
ad un complesso stabile e colorato.
Saggio con la difenilammina per il dosaggio del DNA
Si basa sul dosaggio del deossiribosio che, resosi libero in ambiente
acido, viene convertito in ω−idrossilevulinilaldeide che con la
difenilammina dà luogo ad una colorazione blu.
Campioni contenenti DNA vengono incubati in acido perclorico. In
queste condizioni il DNA è depurinato, viene rilasciato deossiribosio e
convertito a ω- idrossilevulinilaldeide.
Si legge l’Assorbanza a 750 nm e a 595nm.
595 nm = max assorbanza del complesso
750 nm si leggono le impurezze, per cui tale lettura va sottratta a
quella a 595 nm.
Analisi acidi nucleici
Elettroforesi su gel (qualitativa,
semiquantitativa)
Analisi di acidi nucleici
Elettroforesi: separazione di molecole di RNA/DNA in
base alla dimensione
• Elettroforesi su gel di agarosio
• Elettroforesi su gel di poliacrilammide
• Elettroforesi su gel a campo pulsato o PFGE (Pulsedfield Gel Electrophoresis)
Elettroforesi su gel di agarosio
Apparato elettroforetico
Elettroforesi su gel di agarosio
Effetto setaccio del gel di agarosio
L’agarosio è un polisaccaride
costituito da residui alternati
di D-galattosio e 3,6-anidro-L
galattosio.
PREPARAZIONE GEL DI
AGAROSIO
Consente la separazioni di molecole di grandi dimensioni: 0.1 - 20 kb
Concentrazione
di agarosio
0.8% : 0.5 – 20 kb
2% : 0.1 – 3 kb
Risoluzione
Come si prepara un gel d’agarosio
Etidio Bromuro (EtBr):
colorante fluorescente
assorbe la luce UV a 300 nm
dando colore giallo-arancio
E’ utile sia per visualizzare,
sia per quantificare il
campione: l’intensità della
fluorescenza è, infatti,
proporzionale alla quantità
del campione
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel.
Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano
nel gel a velocità diversa.
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO
Per frammenti lineari di DNA e/
o RNA la distanza di migrazione
è inversamente proporzionale
alle dimensioni della molecola
(ovvero alla sua lunghezza in
basi)
Fattori che influenzano la migrazione
•  Peso molecolare
•  Concentrazione di agarosio
•  Conformazione DNA
•  Voltaggio applicato
•  Intercalanti
•  Tampone di elettroforesi
Marcatori di peso molecolare
λ HindIII
ELETTROFORESI IN CONDIZIONI
DENATURANTI
Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA) tendono a formare
complesse strutture secondarie, pertanto la loro “corsa
elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano
DENATURAZIONE
RNA
Agenti denaturanti comunemente usati:
ü  calore,
ü  formaldeide,
ü  formammide,
ü  urea
SEPARAZIONE IN GEL D’AGAROSIO DI MOLECOLE DI RNA
IN CONDIZIONI DENATURANTI
La denaturazione si ottiene “scottando” (90-95°C) il campione e
aggiungendo formaldeide al gel.
Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene
formaldeide e formammide
ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE
(PAGE)
Ø Separazione di frammenti minori di 1 kb
Ø Permette di separare frammenti che differiscono di una
sola base (determinazione della sequenza del DNA)
Ø La PAGE in presenza di SDS (buffer) è il metodo di più
largo impiego per l’analisi qualitativa di miscele di proteine
Formazione di un gel di poliacrilammide
ELETTROFORESI IN GEL DI
POLIACRILAMMIDE (PAGE)
Spessore del gel
0,4-1,5 mm
Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un
rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore
dei pori. Esso inoltre contiene urea che funziona da
denaturante
acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea
Risoluzione: 20 - 1000 nucleotidi
SDS-PAGE
Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico)
prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE)
§ Le molecole di SDS si legano alle proteine
§ Le proteine perdono la loro normale forma
§ Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa
§ Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle
loro dimensioni
Carica Massa
+3
30kD
-4
42kD
SDS
Carica Massa
-300
30kD
-420
42kD
SDS-PAGE
SDS (Sodio Dodecil Solfato)
• Solubilizza e denatura le proteine
CH3
CH2
• Aggiunge cariche negative alle
proteine
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
O
-
O
S
SDS
O
O
Proteina Nativa
Carica netta: -4
Proteina trattata con SDS
Carica netta: Molto (-)
SDS-PAGE
acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%
Colorazione con Blu di Coomassie
ü Proteine vengono caricate, viene
applicata una corrente elettrica
•  Inclusione di un marker di peso molecolare colorato
•  10-50ug di estratto proteico totale
•  0.1-1ug di proteina purificata
ü Ioni Cloruro (-) / Proteina/Glicina(+)
ü Si muovono verso il gel separatore
(“resolving”)
–
Stacking
pH 6,8
Resolving
pH 8,8
•  Differenze di pH causano la ionizzazione
della glicina, permettendo alle proteine di
migrare nel gel separatore
+
VISUALIZZAZIONE DELLE PROTEINE NEL GEL
I due metodi piu’ usati sono:
Colorazione con il Coomassie Brilliant
Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere
visualizzato ~1ng di proteina per banda)
Coomassie staining
Silver staining
ENZIMI DI RESTRIZIONE
ED ANALISI RFLP
ENZIMI DI RESTRIZIONE
enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza
di specifiche sequenze:
1.  Le esonucleasi (estremità libere)
2. Le endonucleasi (legami interni)
Endonucleasi
Esonucleasi
Ne esistono molti tipi diversi, ognuno dei quali
riconosce una sequenza particolare.
ENZIMI DI RESTRIZIONE
•  Enzimi batterici capaci di tagliare molecole di DNA in posizioni specifiche
•  Fenomeno della restrizione-modificazione controllata dalla cellula ospite
ANNI ’50: preparazione di
batteriofagi cresciuta in E.coli non
pienamente infettante per E.coli di un
altro ceppo
ANNI ’65: si scopre che il DNA fagico
preparato in E.coli (c) è degradato una
volta entrato nel ceppo K che restringe i
fagi prodotti in E.coli (c).
10 anni dopo: nel fago resistente alla
degradazione presenza di basi metilate
La degradazione del DNA del fago è dovuta all’esistenza di un
sistema di restrizione modificazione controllato dalla cellula ospite
per proteggersi dall’introduzione di sequenze di DNA esogeno
SISTEMA DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE
Contengono due componenti:
-ENDONUCLEASI di restrizione: taglia il DNA a livello di una
specifica sequenza (no metilazione).
-DNA metilasi: modifica mediante metilazione specifiche basi nella
sequenza riconosciuta dall’endonucleasi di restrizione
Taglio in siti specifici
E. coli degrada DNA esogeno
SISTEMA
MODIFICAZIONE
Metilazione DNA endogeno
NO TAGLIO
ENZIMI DI RESTRIZIONE
1970
Isolamento enzima restrizione dal ceppo Rd del batterio
Haemophilus influenziae (HindII)
5’- GT(T/C) (G/A)AC -3’
3’- CA(A/G) (C/T)TG -5’
L’enzima non era in grado di tagliare il genoma di H. influenziae ma era
capace di tagliare in oltre 40 punti il genoma del fago T7.
1972 Isolamento enzima di restrizione EcoRI dal ceppo RY13 di E. coli,
5’- GAATTC -3’
3’- CTTAAG -5’
SISTEMA DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE EcoRI
Sistemi di restrizione-modificazione
enzimi di
classe I:
Restrizione e metilazione casuale nella stessa
molecola lontano dai siti di riconoscimento
enzimi di
classe II:
Restrizione e metilazione su molecole distinte, elevata
specificità di taglio a livello o vicino al sito di
riconoscimento
enzimi di
classe III
Restrizione e metilazione condividono una subunità
comune, tagliano lontano dal sito di riconoscimento
(a 24-26 pb rispetto al sito di riconoscimento)
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II
•Sequenza di taglio se ruotata è simmetrica (palindromo)
5’- GAATTC -3’
3’- CTTAAG -5’
•Il sito palindromico puo’ essere continuo o interrotto (es. BstII
taglia la sequenza 5’GGNACC 3’).
•Sequenze lunghe 4, 6 o 8 pb
•Nomenclatura: genere e specie del batterio dal cui è isolato
l’enzima di restrizione:
EcoRI da Escherichia coli, ceppo R
Hind III da Haemophilus influentiae ceppo Rd
ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II
Gli enzimi di restrizione di tipo II riconoscono sequenze
specifiche che tagliano con tre diverse modalità :
•  Generando estremità piatte (blunt)
•  Generando estremità sporgenti al 5' (5' protuding)
•  Generando estremità sporgenti al 3' (3' protuding)
Le estremità sporgenti al 5' e al 3’ sono definite estremità
coesive o appiccicose (sticky) perché potranno legarsi con
sequenze di basi complementari (estremità compatibili)
Taglio degli Enzimi di restrizione di tipo II
Estremità appiccicose
ISOSCHIZOMERI
Enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza e
tagliano allo stesso modo
MboI e Sau3A
5’-GATC-3’
NEOSCHIZOMERI
Enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza ma
tagliano in modo diverso
XmaI e SmaI
5’-CCCGGG-3’
Enzimi di restrizione compatibili
Enzimi che pur riconoscendo sequenze diverse, producono
estremità appiccicose compatibili:
BamHI
5’- GGATCC - 3’
5’- G - 3’
3’- CCTAGG - 5’
3’- CCTAG - 5’
5’- GATCC - 3’
3’ - G - 5’
BglII
5’- AGATCT - 3’
5’- A - 3’
3’- TCTAGA - 5’
3’- TCTAG - 5’
5’- GATCT- 3’
3’- A - 5’
Ligazione estremità BamHI+BglII:
5’- GGATCT - 3’
3’- CCTAGA - 5’
Modificazioni delle estremità coesive
Frequenza di taglio degli enzimi di restrizione
La lunghezza della sequenza di taglio determina la frequenza media di
taglio di una molecola di DNA
Assumendo che la frequenza delle quattro basi nel DNA sia la stessa
e che la distribuzione delle 4 basi che compongono il DNA sia casuale
in ogni posizione del DNA ci sarà 1 probabilità
su 4 di trovare una delle quattro basi.
La frequenza di taglio è uguale a 1/(4)n (n = al numero di
nucleotidi del sito di riconoscimento)
Es.
AluI: AGCT
EcoRI: GAATTC
frequenza = 1/44 = 1/256 pb
frequenza = 1/46 = 1/4096 pb
ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)
.
Estremità blunt
+
Estremità blunt
differenti
NO complementarietà
SVANTAGGIO:
Ligasi meno efficiente
CCC/GGG
GGG/CCC
GAT/ATC
CTA/TAG
EcoRV
SmaI
CCC ATC
GGG TAG
la sequenza ibrida che si forma non e’ riconosciuta da nessuno dei
due enzimi
Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici
L’Analisi di restrizione di frammenti o RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Enzimi di restrizione
singoli o in combinazione
frammenti di DNA di
dimensioni diverse
mappa dell’acido nucleico
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