Estrazione delle proteine

Laboratorio Integrato 4
Lezione n.1
Estrazione delle proteine
Dott.ssa Francesca Zazzeroni
La Biologia Moderna
Progetti Genoma:
Perchè?
La determinazione e la conoscenza dell’intera
sequenza genomica sembrano essere la condizione
necessaria per comprendere la completa biologia
di un determinato organismo
In che modo?
Sequenziamento del DNA significa determinazione
della sequenza lineare delle basi che lo
compongono, cioè A, T, C e G.
Il DNA umano è composto da 3.12 miliardi di
paia di basi
La Biologia Moderna:
i Progetti Genoma
Un requisito essenziale alla comprensione della biologia
completa di un organismo è la determinazione della
sequenza del suo intero genoma
“A prerequisite to understanding the complete biology
of an organism is the determination of its entire
genome sequence” Fleischmann et al. 1995
2000-2001
Il Genoma Umano completamente sequenziato e assemblato
ERA GENOMICA
La sequenza completa del genoma
sarà NECESSARIA a comprendere
le funzioni (e disfunzioni)
biologiche del nostro organismo
ERA POST-GENOMICA
La sola sequenza, anche se
completa, del genoma sarà
SUFFICIENTE a comprendere le
funzioni (e disfunzioni) biologiche
del nostro organismo?
Le
proteine, sono il prodotto dei geni: sono le
proteine che servono a “fabbricare” un organismo, a
farlo funzionare e, quando sono difettose, si rendono
responsabili di malattie. Ed è proprio attraverso lo
studio del funzionamento delle proteine che si
potrebbe arrivare alla costruzione di nuovi farmaci….
COMPLESSITA’ BIOLOGICA
Gene
mRNA
30.000?
(30.000-100.000)
Splicing alternativo
precursore proteico
??
150.000??
Taglio della eventuale
sequenza segnale
Eventuali
modificazioni
post-traduzionali
proteina matura
(FUNZIONE)
Interazioni proteina-proteina
Network complessi
??
N.B.
Il delicato equilibrio di
un organismo dipende
da una moltitudine di
funzioni finemente
organizzate e regolate
da una moltitudine di
proteine diverse che
interagiscono tra loro in
network complessi di
interazioni reversibili
Le proteine
Purificazione delle proteine:
La purificazione di una proteina costituisce
il primo passaggio nello studio delle sue
proprietà.
Una proteina, per poter essere purificata,
deve dapprima essere estratta dalla sua
matrice biologica e poi allontanata
selettivamente dalle altre proteine.
La strategia adottata dipende da una serie di
fattori:
1- Caratteristiche
d’interesse;
chimico-fisiche
della
proteina
2- Qualità: il tipo di studio che si vuole eseguire
detta i limiti di purezza che è necessario ottenere;
3- Quantità: si utilizzano metodi di estrazione diversi
in base alla resa necessaria;
4- Costi: materiali costosi, come resine di affinità o a
scambio ionico possono essere fattori limitanti.
Classificazione delle proteine in base alle
loro caratteristiche strutturali
Caratteristiche strutturali
Proteine Monomeriche
Proteine Oligomeriche
-Subunità Identiche
-Subunità Diverse
Esempi
Lisozima, ormone della crescita
GAPDH, catalasi, alcool
deidrogenasi
Aspartato carbamoyltransferasi
Proteine associate
alla Membrana
-periferiche
-integrali
-coniugate
Fosfatasi alcalina, ATPasi mitocondriale
Porine, citocromo P450, recettore
dell’insulina
Glicoproteine, lipoproteine,
nucleoproteine
Proteine extracellulari secrete nel
terreno di coltura o nel siero possono
essere rimosse dal materiale insolubile
per semplice centrifugazione.
Proteine intracellulari possono essere
recuperate dopo rottura delle cellule.
La procedura adottata per ottenere un
estratto grezzo (estratto contenente
tutte le proteine cellulari solubili nel
tampone di estrazione utilizzato) dipende
dalla
localizzazione
cellulare
della
proteina di interesse.
I metodi utilizzati per la rottura delle
cellule dipendono in gran parte dalla
fragilità delle cellule.
Cellule Animali
-Cellule fragili
(eritrociti)
-Cellule che
contengono
materiale fibroso
(c. muscolari)
Cellule Vegetali
Più difficili da
rompere perchè
contengono
cellulosa
Microorganismi
-Batteri che si
lisano facilmente
-Batteri con pareti
più resistenti
La rottura delle cellule può essere ottenuta mediante:
-Digestione enzimatica della parete o della membrana plasmatica
mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi e proteasi
(tripsina, collagenasi, ialuronidasi);
-Shock osmotico;
-Successivi cicli di congelamento/scongelamento;
Generalmente devono però essere applicati metodi più energici,
che sottopongono le cellule a stress meccanici. I metodi di
rottura meccanici sono fondamentalmente di due tipi:
-mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido;
-mediante forze frizionali in sospensione di cellule.
Metodi frizionali in mezzo solido
La rottura meccanica in presenza di abrasivi può essere esguita
nell’agitatore di Mickle, che agita vigorosamente le sospensioni
cellulari (da 300 a 3000 rotazioni al minuto) in presenza di
microsfere di vetro del diametro di 0,5 mm. Questa tecnica
può dar luogo alla rottura degli organuli cellulari.
Si ottiene invece una rottura più controllata nella Hughes Press
dove un pistone forza le cellule, insieme all’abrasivo, a passare
attraverso una stretta apertura di 0,25 mm di diametro
presente nella camera in cui si esercita la pressione.
Metodi frizionali in mezzo liquido
Nelle sospensioni cellulari la rottura può essere ottenuta sia
mediante frullatori che omogeneizzatori.
I frullatori sono costituiti da lame d’acciaio
che ruotano ad alta velocità. Le singole lame
hanno un’inclinazione diversa in modo da
ottenere un efficace miscelamento del
materiale da trattare e ruotano in uno
speciale contenitore d’acciaio inossidabile le
cui pareti sono incurvate per garantire la
massima turbolenza della soluzione.
I frullatori sono di solito impiegati per pochi
secondi, ad alta velocità, per minimizzare il
surriscaldamento del campione.
Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di vetro e da un
pestello mosso a mano (Dounce o Tenbrock) o elettronicamente
(Potter-Elvejham). Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello
viene fatto ruotare per generare le forze frizionali, le quali sono
più elevate alla superficie del pestello e minime lungo la parete
del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la parete del tubo è
mantenuta entro dimensioni precise in quanto l’attrito sviluppato
dipende dal raggio del pestello e del tubo di vetro e dalla velocità
di rotazione del pestello stesso.
Le forze frizionali sono troppo deboli per poter distruggere
cellule vegetali e microbiche. In questi casi, si possono utilizzare
metodi basati sull’applicazione di una elevata pressione o
sull’utilizzo di ultrasuoni.
French Press: presenta una camera d’acciaio inox che si apre
all’esterno per mezzo di una valvola a spillo. La sospensione
cellulare viene inserita nella camera mantenendo la valvola a spillo
chiusa. Dopo aver capovolto la camera, la valvola viene aperta e
mediante un pistone si fa fuoriuscire l’aria. Si chiude la valvola,
la camera viene rimessa nella posizione iniziale, e una pressa
idraulica esercita sul pistone la pressione richiesta. Raggiunta la
pressione richiesta, la valvola viene aperta di poco in modo da far
diminuire leggermente la pressione; le cellule scoppiano nel
momento in cui cominciano ad espandersi.
Sonicatore: è uno strumento che presenta una sonda capace di
produrre ultrasuoni. Gli ultrasuoni ad alta frequenza possono
essere impiegati efficacemente per rompere le cellule, in quanto
gli ultrasuoni generano ondate pressorie elevate. Lo svantaggio di
questa tecnica è che si genera un notevole surriscaldamento. Per
mantenere il controllo della temperatura si usano contenitori di
vetro a sezione speciale, e la sospensione viene forzata a
circolare lungo la parete esterna del contenitore che viene
immerso nel ghiaccio.
Tecnica
Esempio
Principio
Lisi cellulare
Eritrociti
Distruzione della membrana
cellulare per shock osmotico
Digestione
enzimatica
Trattamento dei
batteri con lisozima
Parete batterica viene
digerita, permettendo la lisi
osmotica della membrana
Solubilizzazione
chimica
Estrazione con
toluene (lieviti)
La parete cellulare viene
solubilizzata chimicamente
Omogeneizzatore
Tessuto epatico
Cellule vengono rotte perchè
forzate tra un pestello ed un
tubo di vetro
Frullatore
Tessuto muscolare,
cellule vegetali
Cellule vengono rotte
dall’azione di lame d’acciaio
Hughes Press e
French Press
Batteri, cellule
vegetali
Cellule vengono forzate in
una stretta apertura o in
condizioni di alta pressione
Sonicazione
Sospensioni cellulari
Onde pressorie elevate
causano rottura delle
cellule
Agitarore di Mickle
Sospensioni cellulari
Agitazione in presenza di
microsfere di vetro
Le procedure utilizzate per ottenere un estratto
proteico grezzo sono estremamente semplici e
richiedono:
- la rottura delle cellule in uno specifico buffer;
- la centrifugazione del campione pe rimuovere i
residui insolubili.
BUFFERS DI ESTRAZIONE
Le cellule contengono molti Sali e molti costituenti cellulari hanno
una carica, come ad es. le proteine, I fosfolipidi, gli acidi nucleici.
La forza ionica nel citoplasma è tipicamente tra 0.15-0.20 M. In
queste condizioni le proteine sono solubili. Se si omogeneizza
utilizzando 2-3 vol di acqua, la forza ionica dell’omogeneizzato
sarà 0.05 o meno. In queste condizioni le proteine, soprattutto
quelle basiche, rimangono associate al materiale particolato.
Per assicurare che tutte le proteine solubili siano estratte, si
utilizzano buffers 20-50 mM fosfato, pH 7-7.5; 0.1M Tris-Cl,
pH 7.5; 0.1 M KCl.
Inoltre, I buffers possono contenere detergenti (Triton X, NP40), EDTA (agente chelante), b-mercaptoetanolo (agente
riducente), inibitori delle proteasi, inibitori delle fosfatasi.
Inibitore
Attivo nei confronti di:
Inattivo nei confronti di:
Aprotinina
Tripsina, chimotripsina,
plasmina
Papaina
Leupeptina
Plasmina, tripsina,
papaina, catepsinaB
Chimotripsina, pepsina,
catepsina A e D
Tripsina, plasmina,
chimotripsina, elastasi,
termolisina
Plasmina, chimotripsina,
pepsina
Pepstatina A
Pepsina, catepsinaD
Antipaina
Catepsina A e B,
papaina,tripsina
PMSF (phenylmethyl
sulphonyl fluoride)
Chimotripsina,
tripsina
TLCK (tosyllysine
chloromethyl
ketone
Tripsina
Chimotripsina
TPCK (tosylphenylalanine
chloromethyl ketone)
Chimotripsina
Tripsina
EDTA
Metalloproteasi
BUFFERS DI ESTRAZIONE
Generalmente si utilizzano due-tre volumi di buffer rispetto al
volume del pellet cellulare. Infatti, dopo aver omogeneizzato il
campione, lo si centrifuga per eliminare I componenti cellulari
insolubili. Il pellet trattiene sempre un po’ di liquido, e la perdita
di proteine che si ha a causa del liquido trattenuto nel sedimento
dipende dal vol tot di buffer utilizzato. Maggiore è il volume del
buffer minore sarà la % di proteine perse nel pellet. D’altro
canto, non si possono neanche utilizzare volumi eccessivi perchè si
otterrebbero concentrazioni finali di proteine troppo basse.
Nei processi di estrazione e purificazione
delle proteine, a differenza di quanto
avviene per il DNA, non occorre prestare
attenzione alla sterilità ma bisogna evitare
la denaturazione dei campioni (elevate
temperature, detergenti, valori estremi di
pH possono denaturare facilmente le
proteine).
Inoltre, è importante procedere
all’estrazione delle proteine il più
velocemente possibile, per evitare i
processi degradativi.
Se si rende necessario conservare I
campioni da cui si dovranno estrarre le
proteine questi vanno congelati rapidamente
utilizzando azoto liquido (-140°C) e
conservandoli in un congelatore -80 °.
Anche gli estratti proteici vanno conservati
a temperature molto basse (-80°) e vanno
evitati ripetuti cicli di congelamentoscongelamento.
Esperienza di laboratorio:
ESTRAZIONE DI PROTEINE DA
CELLULE EUCARIOTICHE MEDIANTE
RIPA BUFFER
RIPA BUFFER
1x Phosphate buffered saline
1% Nonidet P-40 (NP-40) oppure
Igepal CA-630
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
10 mg/ml PMSF
50 KIU/ml Aprotinin
100 mM sodium orthovanadate
PROTOCOLLO
1-Staccare le cellule dalla piastra utilizzando uno scraper e
lavorando in ghiaccio
PROTOCOLLO
1-Staccare le cellule dalla piastra utilizzando uno scraper e
lavorando in ghiaccio
2-Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml
PROTOCOLLO
1-Staccare le cellule dalla piastra utilizzando uno scraper e
lavorando in ghiaccio
2-Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml
3-Lavare la piastra con 5 ml di PBS freddo e trasferire nel
tubo da 50 ml
PROTOCOLLO
1-Staccare le cellule dalla piastra utilizzando uno scraper e
lavorando in ghiaccio
2-Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml
3-Lavare la piastra con 5 ml di PBS freddo e trasferire nel
tubo da 50 ml
4-Centrifugare la cellule a 1200 rpm per 10 min a 4°C
PROTOCOLLO
1-Staccare le cellule dalla piastra utilizzando uno scraper e
lavorando in ghiaccio
2-Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml
3-Lavare la piastra con 5 ml di PBS freddo e trasferire nel
tubo da 50 ml
4-Centrifugare la cellule a 1200 rpm per 10 min a 4°C
5-Decantare il surnatante (o aspirare con una pompa da vuoto,
o rimuovere con una pipetta), risospendere le cellule in 1ml di
PBS freddo. Trasferire in un tubo eppendorf da 1.5 ml
PROTOCOLLO
1-Staccare le cellule dalla piastra utilizzando uno scraper e
lavorando in ghiaccio
2-Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml
3-Lavare la piastra con 5 ml di PBS freddo e trasferire nel
tubo da 50 ml
4-Centrifugare la cellule a 1200 rpm per 10 min a 4°C
5-Decantare il surnatante (o aspirare con una pompa da vuoto,
o rimuovere con una pipetta), risospendere le cellule in 1ml di
PBS freddo. Trasferire in un tubo eppendorf da 1.5 ml
6-Centrifugare in una microfuge refrigerata a 3000 rpm per 510 min a 4°C
PROTOCOLLO
1-Staccare le cellule dalla piastra utilizzando uno scraper e
lavorando in ghiaccio
2-Raccogliere le cellule in un tubo da 50 ml
3-Lavare la piastra con 5 ml di PBS freddo e trasferire nel
tubo da 50 ml
4-Centrifugare la cellule a 1200 rpm per 10 min a 4°C
5-Decantare il surnatante (o aspirare con una pompa da vuoto,
o rimuovere con una pipetta), risospendere le cellule in 1ml di
PBS freddo. Trasferire in un tubo eppendorf da 1.5 ml
6-Centrifugare in una microfuge refrigerata a 3000 rpm per 510 min a 4°C
7-Aspirare il surnatante completamente
8-Risospendere in 2-3 vol di RIPA buffer (generalmente da 1
piastra da 10cm, si utilizzano 200-300 ml di buffer)
PROTOCOLLO
8-Risospendere in 2-3 vol di RIPA buffer (generalmente da 1
piastra da 10cm, si utilizzano 200-300 ml di buffer)
9-Incubare 10 min in ghiaccio
10-Per una lisi completa, passare le cellule attraverso una
siringa da insulina per ~10 volte
PROTOCOLLO
8-Risospendere in 2-3 vol di RIPA buffer (generalmente da 1
piastra da 10cm, si utilizzano 200-300 ml di buffer)
9-Incubare 10 min in ghiaccio
10-Per una lisi completa, passare le cellule attraverso una
siringa da insulina per ~10 volte
11-Incubare 15 min in ghiaccio
12-Centrifugare 30 min a 14,000 rpm a 4ºC
13-Recuperare il surnatante e trasferirlo in un tubo pulito
14-Eseguire il dosaggio delle proteine per determinarne la
concentrazione.