I farmaci antitubercolari - E

I farmaci antitubercolari
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ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida
moltiplicazione; probabilmente inibisce la sintesi degli ac.
micolici
STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri
extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica
ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida
moltiplicazione; probabilmente inibisce la sintesi della parete
RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida
moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata;
inibisce la sintesi proteica
PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide),
a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione
sconosciuto
Le resistenze del M. tuberculosis
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sono dovute esclusivamente a mutazioni cromosomiche
mutazioni responsabili di resistenze si verificano
spontaneamente con frequenza variabile, a seconda dei
farmaci, fra 1/106 e 1/108
la resistenza è il risultato della selezione dei mutanti
resistenti, a seguito di mono-terapie o per difetto di
compliance
l’uso di almeno due farmaci abbassa la probabilità di
comparsa di resistenze a livelli inferiori al numero di bacilli
normalmente presenti in una singola lesione (108-1010 UFC)
una resistenza si definisce primaria quando è già presente nel
ceppo responsabile dell’infezione
una resistenza si definisce secondaria quando insorge
durante la terapia
Mutazioni e resistenze
 sono
state trovate una o più mutazioni
associate alla resistenza nei confronti
dei singoli farmaci antitubercolari
 per nessun farmaco esiste una
mutazione associata al 100% delle
resistenze
 in molti casi il meccanismo di resistenza
rimane oscuro
M. tuberculosis multiresistente
 si
parla di multiresistenza quando un
ceppo di M. tuberculosis è resistente
almeno ad isoniazide e rifampicina
 non esiste una mutazione
responsabile della multiresistenza che
è invece il risultato della somma di
mutazioni singole
Isoniazide I
è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazideresistenti, l’attività catalasica è ridotta o assente
 tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato
di delezione o di mutazioni nel gene katG (gene
della catalasi-perossidasi)
 circa il 60% dei ceppi isoniazide-resistenti
presentano alterazioni nel gene katG
 è stato ipotizzato che l’attività battericida
dell’isoniazide si manifesti soltanto in seguito
all’attivazione del farmaco operata dell’enzima
catalasi-perossidasi
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Isoniazide II
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circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il
gene katG mutato hanno mutazioni anche nel gene ahpC
codificante per una alchil-idroperossido reduttasi
circa il 20% dei ceppi isoniazide-resistenti (ma anche la
maggioranza dei ceppi etionamide-resistenti) presentano
mutazioni nel gene inhA che codifica per un enzima
probabilmente coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il
prodotto del gene inhA potrebbe essere il bersaglio
dell’isoniazide
altri ipotizzano che il bersaglio dell’isoniazide sia la proteina,
codificata dal gene kasA, che regola l’allungamento degli acidi
grassi; mutazioni di tale gene sono presenti nel 15% dei ceppi
isoniazide-resistenti
Streptomicina
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alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano
mutazioni nel gene rpsL che codifica per la proteina
ribosomiale S12
altri ceppi streptomicina-resistenti presentano
mutazioni nel gene rrs che codifica per il rRNA 16S
le suddette mutazioni, che si ritrovano
complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti,
impediscono il legame dell’antibiotico al 16S rRNA e
bloccano quindi il meccanismo con cui la
streptomicina inibisce la sintesi proteica
nessuna mutazione risulta per il momento associata al
rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistenti
Rifampicina
 oltre
il 97% dei ceppi resistenti alla
rifampicina presentano mutazioni missense
nel gene rpoB codificante per la subunità 
della RNA-polimerasi
 le alterazioni nella RNA-polimerasi,
conseguenti alle mutazioni, non consentono il
legame della rifampicina che non può quindi
interferire nella trascrizione del rRNA
Etambutolo
 il
70% circa dei ceppi resistenti all’etambutolo
presentano mutazioni nel gene embB, uno dei
geni del locus emb che codifica per varie
arabinosil-transferasi
 le arabinosil-transferasi, che consentono la
polimerizzazione dell’arabinano nei
polisaccaridi della parete, potrebbero
costituire il bersaglio dell’etambutolo
Pirazinamide
 la
pirazinamide viene trasformata, dalla
pirazinamidasi, in acido pirazinoico che
ne costituisce il principio attivo; la
maggior parte dei ceppi resistenti alla
pirazinamide mancano di pirazinamidasi
 oltre l’80% dei ceppi pirazinamideresistenti presentano mutazioni nel gene
pncA codificante per la pirazinamidasi
Metodi genotipici di ricerca
delle resistenze
 ricerca
delle mutazioni associate con le
resistenze
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sequenziamento genico
Single Strand Conformation Polymorphism
Restriction Fragment Lenght Polymorphism
ibridizzazione in fase solida
formazione di eteroduplex
 tutte
le tecniche richiedono la preventiva
amplificazione delle sequenze in cui si
ricercano le mutazioni
SSCP
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denaturazione termica della sequenza
precedentemente amplificata
i filamenti a catena singola si ripiegano
spontaneamente assumendo una conformazione (e
conseguentemente una mobilità elettroforetica)
variabile in conseguenza della presenza di mutazioni
separazione elettroforetica e identificazione delle
mutazioni in base alla posizione delle bande
la tecnica è stata messa a punto, anche in
automazione, per la ricerca della resistenza alla
rifampicina ma è utilizzabile anche per altri farmaci
INNO-LiPA Rif-TB
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amplificazione del gene rpoB del M. tuberculosis, codificante per la
subunità  della RNA polimerasi
ibridizzazione dell'eventuale amplificato con sonde, immobilizzate su
una striscia di nitrocellulosa, specifiche per:
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il gene rpoB
le 5 subunità, di tale gene, più frequentemente sedi delle mutazioni che
determinano la comparsa di resistenze alla rifampicina
4 subunità presentanti mutazioni, causa di rifampicino-resistenza
rilevamento dell'eventuale ibridizzazione mediante aggiunta di
avidina-fosfatasi e substrato cromogeno (i primer utilizzati per
l'amplificazione sono marcati con biotina)
riconoscimento del M. tuberculosis dalla presenza della banda
corrispondente al gene rpoB
riconoscimento della resistenza alla rifampicina dalla mancanza di una
delle bande corrispondenti alle subunità del gene non mutato e/o
dalla presenza di una banda corrispondente ad una mutazione
RFLP
 la
comparsa di una mutazione può
determinare la perdita (o l’insorgenza) di un
sito di restrizione
 sottoponendo la sequenza preventivamente
amplificata, all’azione di uno specifico
enzima di restrizione si ottengono pattern
diversi a seconda che in essa siano o meno
presenti mutazioni
RFLP
Formazione di eteroduplex
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amplificazione di una sequenza al cui interno si ricercano le
mutazioni
combinazione del prodotto di amplificazione con quello
ottenuto da un ceppo sensibile
denaturazione termica
formazione spontanea di DNA a doppia elica
separazione elettroforetica
la presenza di più bande è indice di mutazione, infatti gli
ibridi formati da filamenti provenienti da un ceppo sensibile
ed uno resistente (eteroduplex), hanno mobilità
elettroforetica diversa da quella delle doppie eliche
omogenee (sensibile-sensibile e resistente-resistente)
Conclusioni
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i metodi genotipici sono rapidi, permettono infatti di
eliminare i passaggi della coltura e del test di sensibilità
 la negatività di un test genotipico non permette di escludere
la resistenza, sono infatti ancora numerose le resistenze
fenotipiche per le quali non è nota l’associazione ad alcuna
mutazione; la conferma con il test di sensibilità in vitro è
quindi indispensabile
 la corrispondenza, ad una singola resistenza fenotipica, di
più meccanismi genetici rende estremamente complessa
l’esecuzione dei test genotipici
 l’esecuzione dei test genetici direttamente sul materiale
clinico richiede solitamente una doppia amplificazione (PCR
nested)