L`attivita` di ricerca prevista è stata orientata sulla realizzazione di

L’attivita’ di ricerca prevista è stata orientata sulla realizzazione di supporti nanostrutturati
idonei per misure di « biosensing » e caratterizzazione magneto-plasmonica.
Il piano di lavoro nell’ambito del programma è consistito in :







Sintesi di due tipi di nanoparticlle di Oro con diversa forma e dimensione aventi un
intorno chimico differente: Nanoparticelle Hybride
Caratterizzazione UV Visibile delle nanoparticelle in fase liquida e Microscopia
Eletronica (TEM) al fine di valutare la forma e dimensione e lo spettro di
assorbimento della banda plasmonica caratteristica
Caratterizzazione PM-IRRAS , XPS , XRD delle nanoparticelle sintetizzate per
valutare
la presenza dei gruppi funzionali che sono serviti da “intorno chimico
delle nanoparticelle”
Preparazione di Substrati di Quarzo e funzionalizzazione chimica dei due tipi di
Nanoparticelle : Nanostrutturazione
Caratterizzazione Spettroscopica UV –VIS in trasmittanza su strato solido
Misure di biosensing e Magnetoplasmonica
Conclusioni e Prospettive Future
1.Sintesi di Nanoparticelle Hybride :
1.1. Sintesi di Nanoparticelle di oro pegilate ( AuPEG)
La sintesi di nanoparticelle di oro « hybride » è stata condotta a temperatura ambiente e sotto
agitazione magnetica, attraverso sintesi chimica a un solo stadio (one step) che prevede la
riduzione di un sale di oro di acido tetracloroaurico(HAuCl4) in presenza di un agente
riducente forte di Boroidrato di Sodio ( NaBH4) , utilizzando come surfattante molecole di
Polietilenglicole dicarbossilato (PEG-COOH). Le molecole di polimero hanno la particolarità
di essere biocompatibili e biomobili, pertanto possono essere usate in campo biomedico e
biosensoristico per l’assenza di tossicità e per l’eliminazione di adsorbimenti aspecifici da
parte di altre biomolecole. La reazione chimica prevede la partecipazione di molecole di
Polimero carbossilico in presenza di Sali di oro e riducente in maniera tale da intervenire nella
crescita della nanoparticella ( schema 1)
O
HO
O
O
OH
HAuCl4
+
O
NaBH4
HO
O
O
O
O
n
OH
Schema 1 : schema di sintesi delle nanoparticelle di Oro pegilate
Dopo circa 4h dalla rduzione dei Sali di oro, con cambiamento di colore da giallo paglierino a
rosso corallo, la suluzione colloidale è stata analizzata per spettroscopia UV Visibile in
assorbanza , osservando il caratteristico picco a 530 nm ( figura 1a) caratteristico di
nanoparticelle sferiche la cui forma e dimensione è stata confermmata per microscopia
elettronica (TEM) ( figura 1b). L’analisi microscopica mostra delle nanoparticelle omogenee
e uniformi con una distribuzioe di sezione 7 nm (figura 1c).
2.0
1.8
a)
b)
Absorbance
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
200
400
600
800
Wavelength (nm)
30
d 7 nm
Percentage (%)
25
c)
20
15
10
5
0
5
6
7
8
9
10
11
12
Size (nm)
Figura.1 (a) Spettro UV VIsibile delle nanoparticelle di oro aventi un picco di assorbanza a 530 nm (b)
Microscopia elettronica (TEM) (c) Distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle di oro
Al fine di caratterizzare il comportamento ibrido delle nanoparticelle pegilate, abbiamo
eseguito un’analisi XRD della sospensione colloidale estratta sottovuoto che ha evidenziato la
presenza di picchi di oro e Polimero all’interno delle faccette cristallografiche dell’oro (figura
2) ; L’analisi XPS ha confermato la presenza delle bande caratteristiche dell’oro e della
funzionalità carbossilica all’interno della nanoparticella
Figura.2 : Analisi XRD delle Nanoparticelle di oro Pegilate (AuPEG)
PM-IRRAS e caratterizzazione microscopica (SEM) di PEG Au NPs su un substrato di
oro previa funzionalizzazione chimica :
Le nanoparticelle di Oro-PEG sono state funzionalizzate su un supporto di oro previamente
funzionalizzato da cisteamina ( schema 2) e caratterizzate per spettroscopia infrarossa ( PMIRRAS) , e microscopia elettronica su supporto solido (SEM). La microscopia in fase solida
(SEM) ( figura 3) ha confermato la natura nonodispersa e omogenea della nanoparticelle
anche dopo funzionalizzazione chimica, indicando uno strato sottile e ordinato delle stesse.
L’analisi infrarossa ha mostrato i gruppi funzionali caratteristici del PEG COOH con picco a
1100 cm-1 caratteristico della catena legame C-O-C, il picco a 1251 cm-1 è caratteristico del
gruppo carbonilico e il picco a 1735 cm-1 conferma l’esterificazione in seguito all’attivazione
del gruppo carbossilico del polimero.(figura 3a)
Schema 2 : Funzionalizzazione chimica delle AuPEG NPs su un substrato di oro previa attivazione di
cisteamina
1,6
20 nm
1,4
1,2
Figura 3 : SEM di nanoparticelle di oro dopo funzionalizzazione chimica
1,0
0,6
NaBH4
O
1139 cm
+ HAuCl4
0,4
OH
0,2
O
HO
n
HO
O
O
0,0
O
HO
O
O
O
OH
O
OH
O
nO
O
OH
-0,2
2000
1800
1600
1400
1200
1000
Wavenumber (cm-1)
O
HO
O
n
n
O
1251
OH
O
1465
O
1640
O
1735
O
HO
-1
0,8
O
Figura 3a :Caratterizzazione Infrarossa PM-IRRAS delle nanoparticelle pegilate dopo
funzionalizzazione chimica
XPS ( X-Ray Photoelectron spectroscopy)Analisi :
L’analisi XPS è stata eseguita dopo nanostrutturazione delle nanoparticelle funzionalizzate
con PEG su un substrato di oro previa funzionalizzazione chimica con cysteamina . La
presenza del PEG molecolare è stata messa in evidenza dal picco C1s a 286 eV, caratteristico
del legame C-O. Il picco a piu’ bassa intensita’ (289eV) è dovuto al carbonio del gruppo
carbossilico terminale del PEG ( Figure 4 a1).Il singolo picco a 533 eV , è dovuto all’ossigeno
O1s nel legame C-O-C del PEG (Figure 4 a1). Il forte abbassamento del picco di azoto e la
contribuzione del picco dello zolfo è ascrivibile alla formazione del layer ordinate di
nanoparticelle di circa 10 nm sul substrato di oro.
Au4f
S2p
N1s
PEG-CE-Au
PEG-CE-Au
2 kcps
2 kcps
100 kcps
PEG-CE-Au
CE-Au
CE-Au
CE-Au
172
170
168
166
164
162
160
92
90
88
Binding energy, eV
86
84
80 410
82
408
406
Binding energy, eV
C1s
402
400
398
396
394
392
Binding energy, eV
20 kcps
20 kcps
O1s
PEG-CE-Au
PEG-CE-Au
CE-Au
CE-Au
294
404
292
290
288
286
284
282
280
540
538
536
Binding energy, eV
534
532
530
528
526
524
Binding energy, eV
Figure 4: Analisi XPS di un substrato di oro funzionalizzato con cysteamina prima e dopo
immobilizzazione con nanoparticelle di oro.
2. Sintesi di Nanoparticelle ibride di diversa dimensione
2.1. Sintesi di Nanoparticelle di Oro-Protoporfirina :
Un altro metodo per ottenere nanoparticelle di diversa forma e dimensione è il metodo « seed
mediated synthesis » che consiste in un processo chimico di reazione a due stadi ( two step)
nel quale c’è una prima fase di sintesi di germi di oro ( seed) e una seconda fase di
accrescimento dei germi di oro ( growth ) in base al quale, il rapporto dei reagenti e dei
riducenti di reazione, influenza la forma e la dimensione finale delle nanoparticelle. Abbiamo
realizzato la sintesi di nanoparticelle di oro ibride con protoporfirina nelle quali la
protoporfirina è una macromolecola utilizzata in terapia fotodinamica e come strato attivo, per
le sue proprietà ottiche e di fluorescenza, gioca un ruolo fondamentale nei processi di
« binding » di biomolecole. Nel processo di formazione delle nanoparticelle di oro, la
protoporfirina forma un complesso con le molecole di surfattante (CTAB) (schema 3) e tale
complesso partecipa attivamente al processo di riduzione dei sali di oro in presenza di NaBH4.
CH CH2
CH3
CH3
NH
N
H
CH CH2
NH
HN
CH3
CH2
C O
O
O
O C
CH2
H2C
N
CH2
N
C O
O
CH2
O
O C
H2C
CH2
H3C
H3C
NH
H
H
HN
CH
H2C HC
CH2
H2C
H2C
H3C
H3C
CH2
C O
O
H3C
H
HN
CH3
O
O C
H3C
NH
N
H2C
C O
O
O
O C
H2C
H
CH3
CH2
H2C
N
H
CH3
H2C
CH3
CH3
H
N
H2C
CH CH2
CH CH2
N
N
H
HN
H3C
H2C HC
H3C
H2C HC
Schema 3 : Rappresentazione del complesso fra protoporfirina e micella di CTAB
In figura 5 sono rappresentate le caratterizzazioni spettroscopiche e microscopiche di germi di
oro semplici ( figura 5a) e germi di oro con protoporfirina ( figura 5 b) ; è possibile osservare
la netta differenza tra i due tipi di micrografia dovuta alla complessazione della protoporfirina
nella nanoparticella di oro durante la formazione dei germi di oro. La presenza della
protoporrfirina all’interno della nanoparticella di oro in fase « seed » conferisce proprietà
spettroscopiche differenti. In figura 5c vengono riportati gli spettri UV VIS della
protoporfirina libera (figura 5c linea nera) nella quale sono caratteristici i 4 picchi
corrispondenti alle bande Q1-Q4 e la banda tipica di Soret
a 400 nm. La curva blu
rappresenta i germi di oro complessati con protoporfirina nei quali sono evidenti la banda di
soret e le bande Q shiftate nella regione blu Uv VIS e la zona a 420 nm corrispondente al
plasmone dell’oro che indica l’avvenuta formazione di nanoparticelle ibride. La curva rossa in
fura 5c indica il plasmone di riferimento relativo ai germi di oro senza porfirina.
Figura 5: TEM di germi di oro prima ( 5a) e dopo complessazione con protoporfirina ( 5b); UV VIS delle
soluzoni di protoporfirina libera (curva nera) protoporfirina complessata ai germi di oro (curva blu);
germi .di oro senza protoporfirina ( curva rossa)
2.2. Sintesi e Caratterizzazione di nanoparticelle di Protoporfirina a forma di stella
La sintesi delle nanostar a base di porfirina è stata eseguita facendo reagire i germi di oro
complessati con protoporfirina, con la soluzione «growth » di accrescimento in presenza della
macromolecola in oggetto. Il risultato di questa sintesi è stata la realizzazione di particolari e
originali nanostrutture a forma di stella ( Nanostar) ( figura 6 a-b). Queste nanostrutture hanno
una dimensione di 50 nm e sono polidisperse. Lo spettro UV VIS conferma la presenza della
protoporfirina all’interno della struttura poliedrica, dalla banda di soret a 400 nm e i 4 picchi
(Qband) nella zona del blu. Inoltre il plasmone dovuto alle nanostar cade nell’intorno 600-700
nm confermando l’avvenuta sintesi della nanoparticella ibrida ( figura 6 c)
Figura 6 : TEM di Nanostar con protoporfirina ( a-b) e spettro UV VIS della Nanostar in soluzione
3. Preparazione di Substrati di Quarzo e funzionalizzazione chimica dei due tipi di
Nanoparticelle : Nanostrutturazione
La Nanostrutturazione dei due tipi di nanoparticelle è stata effettuata secondo due metodi :
Metodo chimico e Metodo di Adsorbimento elettrostatico attraverso polimeri di diversa carica
elettrostatica. Per ambedue i metodi, i substrati di Quarzo sono stati lavati con una soluzione
di Acqua ossigenata ( H2O2), Ammoniaca ( NH3) al 30% e acqua milli Q e in una seconda
fase con etanolo e acqua millli Q per rimuovere i restanti residui organici.
3.1. Metodo Chimico :
La nanostrutturazione di nanoparticelle per via chimica è stata eseguita su subtrato di quarzo
previa silanizzazione con APTES (trimetossietilsilano) e acidificazione con HCl al 37% .
L’ancoraggio delle nanoparticelle e delle biomolecole è stato eseguito dopo trattamento della
superfice silanizzata con PDITC (p-fenildiisotiocianato) (schema 4).
Anticorpo: Ab
Schema 4 : Processo di funzionalizzazione di substrati di Quarzo per via chimica.
Dopo la deposizione, i substrati nanostrutturati sono stati analizzati attraverso Tecnica di
Risonanza Plasmonica di Superfice (SPR) allo stato solido e Tecnica Magneto Pasmonica
(MO) in diversi punti del campione. In figura 7-8, sono schematizzati gli spettri SPR relativi a
campioni di nanoparticele pegilate di 10 nm (AuPEG-NH2) e Gold Nanostar con
protoporfirina di 50 nm di dimensione immobilizzte su substrati vetro corning.
Transmittance (%)
80
70
60
Peg2 bis1
Peg2
Peg2 bis
50
40
500
600
700
wavelength (nm)
70
R(%) PEG2 v62DT1s max5549
0.0004
DR/R mod
0.0003
0.0002
0.0001
50
0.0000
-0.0001
40
R/R
Reflectance (%)
60
-0.0002
-0.0003
30
-0.0004
20
450
500
550
600
wavelength (nm)
80
R(%) PEG2 v62DT1s max5549
70
R
Reflectance (%)
0.00008
60
50
0.00000
40
30
-0.00008
20
450
500
550
600
wavelength (nm)
Figura 7 : Spettri di MO e SPR relativi a substrati di Quarzo funzionalizzati con dots di Au PEG NH2
80
R(%) Pc3_v62_DT300ms_max5081 pol30
0.0003
DR/R
75
0.0002
70
70
60
0.0001
65
0.0000
60
55
-0.0001
R/R
Reflectance (%)
Transmittance (%)
80
50
-0.0002
45
-0.0003
40
50
450
500
550
600
650
35
450
700
500
550
600
650
700
wavelength (nm)
wavelength (nm)
R(%) Pc3_v62_DT300ms_max5081 pol30
80
0.00012
75
0.00009
70
60
0.00003
55
0.00000
R
Reflectance (%)
0.00006
65
50
-0.00003
45
-0.00006
40
35
450
500
550
600
650
-0.00009
700
wavelength (nm)
Figura 8 : Spettri di MO e SPR relativi a substrati di Quarzo funzionalizzati con Nanostar di OroProtoporfirina.
3.2. Metodo Adsorbimento Elettrostatico (LBL) per la deposizione e immobilizzazione
di nanoparticelle su substrati di vetro :
Il metodo di adsorbimento elettrostatico, è stato eseguito su substrati di quarzi previamente
lavati e trattati con HCl 37% per un’ora. E’ stata preparata una soluzione di polimeri carichi
positivamante e negaivamente alla concntrazione 1% in acqua in modo da formare un doppio
strato carico elettrostaticamente sul quale eseguire una funzionalizzazione di p-amminothiofenolo per 2h e successivamente deposizione delle nanoparticelle pegilate (AuPEG NH2) e
Nanostar tramite goccia oppure per immersione per 24h ( schema 5).
NH2
H2 N
NH2
NH2
n O
H2N
NH2
NH2
O
O
n
n
O
O
NH2
NH2
O
O
O
n
H2 N
H2N
O
O
n
H2 N
O
NH2
n
n
O
O
O
NH2
O
n
NH2
n O
H2N
NH2
H2 N
O
n
O
NH2
O
O
n
n O
NH2
H2 N
O
O
NH2
-
H2 N
O
NH2
POLIMERO CARICO NEGATIVAMENTE
+
POLIMERO CARICO POSITIVAMENTE
Schema 5 : Nanostrutturazione per Metodo di adsorbimento Elettrostatico
In Figura 9, vengono riportati gli spettri di assorbimento UV VIS in fase solida, dei substrati
nanostrutturati ottenuti in seguito a deposizione con goccia (spettro a)) o dopo immersione
delle nanoparticelle per 24h (spettro b).
B
0.13
0.12
Absorbance
0.11
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
300
400
500
600
wavelength (nm)
700
800
B
0.17
0.16
B (Abs)
0.15
0.14
0.13
0.12
0.11
0.10
300
400
500
600
700
800
sample 4a immers (Wavelength (nm))
Figura 9:Spettro UV VIS in fase solida di AuPEG NH2 nanostrutturate per via chimica
Su questi ultimi substrati nanostruttutati sono state eseguite delle prove di biosensing
immobilizzando un anticorpo AntiIgG biotinilato e monitorando l’interazione con IgG
complementare previa attivazione con Carbodiimide ( EDC /NHS)a pH 7,2. Lo spettro UV
VISin figura 10 mostra la curva del plasmone delle nanoparticelle strutturate prima ( curva
neraa) e dopo ( curva rossa) immobilizzazione dell’anticorpo. L’innalzamento della curva di
assorbanza e lo schift della curva conferma l’avvenuta immobilizzazione.
0.20
before Ab immobilization
after Ab immobilization
Absorbance
0.15
0.10
0.05
300
400
500
600
700
800
wavelength (nm)
Figura 10. Spettro UV VISibile relativo all’immobilizzazione di Anticorpo AntiIgG su substrato
nanostrutturato di AuPEGNH2
Analoghi spettri di nanostrutturazione per via elettrostatica sono stati eseguiti con Nanostar ;
In figura 12 si puo’ osservare lo spettro UV Vis in statica delle nanoparticelle dopo
nanostrutturazione; sono evidenti I picchi a 400 nm e le bande Q caratteristiche della porfirina
shiftate dalla banda del plasmone dell’oro in seguito alla loro incorporazione all’interno delle
nanoparticle. Questi risultati preliminari confermano il successo della nanostrutturazione .
B
0.30
0.28
0.26
0.24
absorbance
0.22
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
300
400
500
600
700
800
wavelength (nm)
Figura 12: Spettri UV VS I due punti diversi di Nanostar con protoporfirina dopo nanostrutturazione
Conclusioni e Prospettive:
In conclusione, durante questo periodo di attività di ricerca, sono state sintetizzate e
caratterizzate nuove particelle nanostrutturate idonee per applicazioni nel biosensing. Ci si
propone di ottimizzare le misure di magnetoplasmonica utilizzando blend di nanoparticelle di
oro pegilate e nanostar al fine di studiare il diverso comportamento ottico e
magnetoplasmonico dopo miscelazione delle stesse e nanostrutturazione per via polimerica in
adsorbimento elettrostatico. Ci proponiamo inoltre di eseguire misure di biosensing in
dinamica monitorando l’interazione tra Anticorpo e Antigene oppure DNA:DNA a diverse
concentrazioni e controllando i parametri di temperature e pressione. Si prevede di pubblicare
nei prossimi mesi i risultati ottenuti su riviste scientifiche specifiche di fattore di impatto
adeguto.