Vanilla planifolia l’Océan Indien et de ses espèces apparentées : aspects génétiques,

Diversité de Vanilla planifolia dans
l’Océan Indien
et de ses espèces apparentées :
aspects génétiques,
cytogénétiques et épigénétiques
Séverine BORY
Thèse de Doctorat
Spécialité : Génétique
17 décembre 2007
UMR Peuplements Végétaux et Bio-Agresseurs en Milieu Tropical
Introduction
Modèle d’étude et problématique
Le genre Vanilla Plumier ex Miller
9 Orchidaceae > Vanilloidae > Vanilleae > Vanillinae
9 90-110 espèces
9 Répartition inter-tropicale
52
17
31
7
3
(Portères 1954)
Les vanilliers cultivés
9 18-35 espèces aromatiques
9 2 espèces principalement cultivées
y V. planifolia G. Jackson (95%) ‘Vanille Bourbon’
y V. tahitensis J.W. Moore (< 5%) ‘Vanille de Tahiti’
9 Quelques autres espèces utilisées localement sans
importance économique (V. pompona Schiede, V.
odorata C. Presl.…)
Morphologie de V. planifolia
Dissémination de V. planifolia
18-19e s.
1492
C. Colomb
1841
E. Albius
Production mondiale
9 Epice mondialement appréciée comme arôme/parfum
y Industrie agro-alimentaire
y Parfumerie, cosmétique
9 1300 t en 2005, Madagascar > 50%
9 Intérêt de la vanille naturelle
y Arôme complexe, inimitable
y Culture respectueuse de l’environnement
y Source d’emploi
9 Amélioration de la production
y Conditions de culture et de transformation
y Meilleure connaissance des espèces (pools génétiques)
Pools génétiques
9 Pool de gènes primaire de V. planifolia (cultivée et
sauvage) fortement menacé (Mexique)
9 Pool de gènes secondaire (espèces proches de V.
planifolia)
> Source de caractères agronomiques et aromatiques
Préservation des ressources génétiques
9 Conservation in situ non viable (forte pression
humaine)
9 Conservation ex situ : meilleure stratégie
> Efforts de conservation mondiaux
Pools génétiques
9 Collection des ressources génétiques du vanillier CIRAD
La Réunion (2003)
y Matériel CIRAD
y Prospections
y Échanges
9 581 accessions (35 espèces)
322
259
9 Caractériser – sauvegarder – améliorer - diffuser
Description de la diversité génétique
Modèle V. planifolia de La Réunion
Objectif de la thèse
Expliquer les variations phénotypiques
chez les V. planifolia de La Réunion
‘Mexique’
‘Classique’
‘Variegata’
‘Aiguille’
‘Stérile’
‘Grosse
Vanille’
• reproduction végétative quasi-exclusive
• absence de pollinisateurs naturels
Diversité phénotypique à La Réunion
‘Classique’
Diversité phénotypique à La Réunion
‘Mexique’
Diversité phénotypique à La Réunion
‘Aiguille’
Diversité phénotypique à La Réunion
‘Stérile’
Gousses issues
d’allo-fécondation
Avortement d’une
fleur auto-fécondée
Diversité phénotypique à La Réunion
‘Grosse Vanille’
Diversité phénotypique à La Réunion
‘Variegata’
Reproduction de V. planifolia
Multiplication végétative prédominante
9 En conditions naturelles (zone d’origine) :
y Allogamie / autogamie
y Pollinisateurs supposés : Eulaema, Euglossa
y Hybridations naturelles inter-spécifiques
y Reproduction sexuée naturelle rarement observée :
1-3%
y Reproduction végétative : 1 individu > 0.2 ha
9 Dans les zones d’introduction :
y Pollinisateurs absents
y Fécondation manuelle indispensable
Objectif de la thèse
Processus à l’origine des variations phénotypiques
chez les V. planifolia de La Réunion sachant que la
reproduction végétative est quasi-exclusive
‘Mexique’
‘Classique’
‘Variegata
’
‘Aiguille’
‘Stérile’
‘Grosse
Vanille’
> Etude comparative avec V. tahitensis (cultivée) et V.
pompona, V. bahiana Hoehne (spontanées)
Hypothèses de travail
9 H1 : Introductions de matériels différents ?
Origine de la culture réunionnaise
Paris
Martinique
Mexique
Manille
Cayenne
1875
1819
1820
1822
1793 ?
Hypothèses de travail
9 H1 : Introductions de matériels différents ?
9 H2 : Rôle possible de la reproduction sexuée ?
9 H3 : Accumulation de mutations somatiques ?
ANALYSE GÉNÉTIQUE
9 H4 : Polyploïdisation ?
ANALYSE CYTOGÉNÉTIQUE
9 H5 : Variations de méthylation ?
ANALYSE ÉPIGÉNÉTIQUE
Diversité génétique
Processus génétiques à l’origine de
la diversification
des vanilliers
Objectifs
9 Analyse des schémas d’introduction et de
diversification de V. planifolia à La Réunion
9 Comparaison avec les schémas
d’introduction des autres aires de culture
(Océan Indien, Polynésie, Antilles)
9 Comparaison avec les niveaux de diversité
des espèces américaines cultivée (V.
tahitensis) et spontanées (V. pompona, V.
bahiana)
Matériel et méthodes
V. planifolia 289
V. pompona
V. bahiana
16
V. tahitensis 11
V. odorata
1
V. sp.
31
V. hybrides
TOTAL
21
6
375
Matériel et méthodes
V. planifolia 289
V. pompona
V. bahiana
16
V. tahitensis 11
V. odorata
1
V. sp.
31
V. hybrides
TOTAL
21
6
375
9 AFLP
• Analyse intra-spécifique
• Analyse inter-spécifique (espèces proches)
• Neutres, dominants
• Large couverture du génome
• Nombreux marqueurs révélés
Diversité inter-spécifique
SP
V. bahiana
D max
0.161
D max
0.220
V. tahitensis
D max
0.164
SP
SP
(PLxTA)xPO
SP
V. planifolia
PLxTA
V. pompona
(PLxPO)xPL
SP
V. odorata
D max
0.340
SP
SP
SP
SP
0
375 accessions, 942 marqueurs AFLP, Indice Sokal et Michener, NJ
0.1
Diversité intra-spécifique V. planifolia
Réunion
Mexique
D max = 0.126
D max = 0.174
Semis
d’autofécondation
‘Classique’
‘Aiguille’
284 accessions =
101 génotypes
D max = 0.106
D mean = 0.011
19 accessions
D max = 0.190
D mean = 0.105
0
303 accessions, 436 marqueurs AFLP, Indice Sokal et Michener, NJ
0.1
Diversité intra-spécifique V. planifolia
0.4
0.6
101 génotypes
11 génotypes (semis
d’autofécondation)
% de bandes polymorphes
% de bandes polymorphes
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.3
0.2
0.1
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
% de génotypes
Allèles rares majoritaires
Mutations ponctuelles
Reproduction végétative
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
% de génotypes
Disparition des allèles rares
Ségrégation des allèles
Reproduction sexuée
1.0
Diversité intra-spécifique V. pompona
Polynésie française
Brésil
A
Guadeloupe
B
Jardins
botaniques
Jardins
botaniques
Guyane
27 accessions
D max = 0.34
Guyane
Guadeloupe
Guyane
463 marqueurs AFLP, Indice Sokal et Michener, NJ
Réunion / Comores
0
0.1
Diversité intra-spécifique V. pompona
V. planifolia
25 génotypes
0.4
0.6
0.2
0.5
% de bandes polymorphes
% de bandes polymorphes
0.3
% de bandes polymorphes
0.4
0.3
0.15
0.2
0.2
0.1
0.1
0
0.1
0
0.0
0.2
0.4
0.6
% de génotypes
0.8
1.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
% de génotypes
ségrégation
¾¼
0.05
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
% de génotypes
Allèles rares et allèles en ségrégation
Combinaison des reproductions végétative et sexuée
Diversité intra-spécifique V. pompona
9 Deux groupes phénotypiques
B
A B
A
A
B
Conclusions
9 Origine clonale des V. planifolia introduites dans les
îles de l’Océan Indien, du Pacifique et des Antilles
(‘Mansa’) > nombre d’introductions ?
9 Faible niveau de diversité génétique chez V. planifolia
à La Réunion
9 Evolution des phénotypes : accumulation de mutations
somatiques à travers la reproduction végétative
Phénotype ‘Aiguille’ issu de reproduction sexuée
Particularités des types ‘Mexique’, ‘Stérile’,
‘Grosse Vanille’, ‘Variegata’ par rapport au type
‘Classique’ > non expliquées
Approche cytogénétique
Rôle de la polyploïdie dans la
diversification des
vanilliers
Objectifs et questions
9 Polyploïdie : rôle important dans évolution
des plantes
9 Nombreux impacts : cellule, génome,
reproduction, physiologie et développement,
distribution géographique
9 Deux niveaux de ploïdie (2x et 4x) chez V.
tahitensis (Tonier 1951; Duval 2006)
9 Existe–t–il de la polyploïdie ?
y Chez V. planifolia
y Chez V. pompona
Méthodes
9 Cytométrie en flux
- Quantité d’ADN nucléaire
- Niveau de ploïdie
9 Microdensitométrie de Feulgen
- Confirmation des données de cytométrie
9 Comptages chromosomiques
y Cellules des racines aériennes
- Vérifier les niveaux de ploïdie
y Cellules du pollen en formation
- Evaluer le nombre chromosomique de base
9 Mesures de longueurs de stomates
- Impact de la ploïdie sur la morphologie
Matériel végétal
V. planifolia
V. pompona
50
Cytométrie en flux
18
3
Microdensitométrie
0
6
Comptages chromosomiques
8
12
Longueurs de stomates
12
9 Types morphologiques
9 Origines géographiques
9 Origines géographiques
9 Groupes génétiques
9 Groupes génétiques
A
B
Une forte endoréplication dans les feuilles
Nombre de noyaux
Blé
2C=30.9 pg
9 3 à 5 pics par
histogramme
Vanille
8C
2C
4C
9 noyaux 2C 4C 8C 16C
et 32C
16C
9 1er pic = noyau 2C
32C
Quantité relative d’ADN nucléaire
Histogramme de V. planifolia (‘Mexique’ PLm0001)
Polyploïdie chez V. planifolia
9 Cytométrie en flux et microdensitométrie
10
C
‘Grosse vanille’
10.00 pg
Tétraploïde
4x
‘Stérile’
7.67 Bpg
Triploïde 3x
Quantité d'ADN 2C(pg)
9
8
7
6
‘Classique’ ‘Mexique’
‘Aiguille’ ‘Variegata’
A
5
Accessions
5.03 pg
Diploïde 2x
Polyploïdie chez V. planifolia
9 Comptages chromosomiques sur racines
‘Grosse Vanille’
54 chromosomes
‘Aiguille’
26 chromosomes
‘Stérile’
32 chromosomes
Polyploïdie chez V. planifolia
9 Comptages chromosomiques sur racines
20
23.7
15
‘Aiguille’ 5 pg ‘Classique’
22.1
10
5
9 Forte
variation
(aneuploïdie)
Nombre de cellules
0
28.4
20
26.6
‘Stérile’
7.7 pg
15
10
mean = 26.6
median = 28
9 Nombre
chromosomique
(2n=2x=32) ?
5
0
33.7
20
30.2
‘Grosse Vanille’
10 pg
15
10
5
0
10
20
30
40
50
60
10
20
30
Nombre de chromosomes
40
50
60
Que nous apprend la bibliographie ?
9 La majorité des publications indique
y V. planifolia 2n = 32
9 D’autres références indiquent un nombre variable selon
les cellules
y 2n = 13-32 jusqu’à 53 (Hurel-Py 1938)
30
35
(Hoffmann 1929, 1930 ; Heim 1954 ; Chardard 1963 ; Martin 1963)
• associations somatiques
pendant la mitose (Nair et
25
Moyenne = 27.3
15
20
Ravindran 1994)
0
5
10
Rechercher le nombre
chromosomique de
base
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
Polyploïdie chez V. planifolia
9 Comptages chromosomiques sur pollen
9 Correspondance entre stades de développement
des boutons floraux et stades de formation des grains
de pollen
Polyploïdie chez V. planifolia
9 Comptages chromosomiques sur pollen
V. planifolia ‘Classique’ 5 pg : n = 16
Polyploïdie chez V. planifolia
9 Corrélations entre les variables
34
10
32
r²=0.939
r²=0.844
31
Quantité d'ADN 2C(pg)
Nombre de chromosomes
33
30
29
28
27
26
25
24
9
8
7
6
23
5
22
5
6
7
8
9
10
Quantité d'ADN 2C (pg)
38
40
42
44
46
48
Longueur du stomate (µm)
9 Fortes corrélations positives
9 Stomates bons indicateurs de la ploïdie
9 Auto-polyploïdisation récente (Bennett et Leitch, 2004)
« Contraction génomique »
9 Genome downsizing (Bennett & Leitch, 2004)
Plant DNA C-values Database
Valeur 1C quantité ADN (pg)
> Relation quantité d’ADN pg / niveau de ploïdie
Attendu
Observé
Ploïdie (x)
• Polyploïdes récents
> corrélation attendue
Conclusions sur V. planifolia
9 Auto-polyploïdisation récente de V. planifolia à La
Réunion
y 3 niveaux de ploïdie (2x, 3x, 4x)
y Peu d’individus découverts
9 Origine des ‘Grosse Vanille’ > tétraploïdes
y Doublement des chromosomes > endopolyploïdie
- Endomitose
- Endoréplication
9 Origine des ‘Stérile’ > triploïdes
y Croisement diploïde x tétraploïde
y Production de gamètes non réduits à la méiose
suivie d’une auto-pollinisation
‘Mexique’, ‘Variegata’ ??
Polyploïdie chez V. pompona
9 Cytométrie en flux
Quantité d'ADN 2C (pg)
11
A
9 8.18 pg –
10.72 pg 2C
9 Pas de
groupes distincts
10
9A>B
9
B
8
Accessions
9 Même ordre
de grandeur que
3x et 4x chez V.
planifolia
Polyploïdie chez V. pompona
9 Comptages chromosomiques sur racines
18
40
20
A
30
20
10
Nombre de cellules
0
26
40
30
B
30
20
9 Groupe A :
petit nombre de
chromosomes
10
0
32
40
32
30
20
9 Nombre
chromosomique ?
10
0
32
40
9 Forte variation
dans les racines
(aneuploïdie)
36
30
20
10
0
10
20
30
40
50
60
70
10
20
30
Nombre de chromosomes
40
50
60
70
Polyploïdie chez V. pompona
9 Comptages chromosomiques sur pollen
V. pompona groupe B : n = 32 > tétraploïde
Conclusions sur V. pompona
36
35
9 V. pompona est
tétraploïde (groupe B)
34
33
Nombre de chromosomes
32
9 Comportements
différents V. planifolia - V.
pompona
31
30
29
28
27
26
• Contraction génomique
B
25
« Genome downsizing »
(Bennett et Leitch 2004)
24
23
22
A
21
20
19
18
5
6
7
8
9
Quantité d'ADN 2C (pg)
10
11
« Contraction génomique »
9 Genome downsizing (Bennett & Leitch, 2004)
Plant DNA C-values Database
Valeur 1C quantité ADN (pg)
> Relation quantité d’ADN pg / niveau de ploïdie
Attendu
Observé
Ploïdie (x)
• Polyploïdes récents
> corrélation attendue
• Polyploïdes anciens
> perte d’ADN suivant la
polyploïdisation
Conclusions sur V. pompona
36
35
9 V. pompona est
tétraploïde (groupe B)
34
33
Nombre de chromosomes
32
9 Comportements
différents V. planifolia - V.
pompona
31
30
29
28
27
26
• Contraction génomique
B
25
« Genome downsizing »
(Bennett et Leitch 2004)
24
23
V. pompona polyploïde
ancien
22
A
21
20
19
18
5
6
7
8
9
Quantité d'ADN 2C (pg)
10
11
• Fusions
chromosomiques
Polyploïdie chez V. pompona
9 Comptages chromosomiques sur racines
A
22 chromosomes
24 chromosomes
B
32 chromosomes
42 chromosomes
9 Accessions du
groupe A ont des
chromosomes plus
gros que celles du
groupe B
Conclusions
Perspectives
Rappel : objectif de la thèse
Expliquer les variations phénotypiques chez les
V. planifolia de La Réunion sachant que la
reproduction végétative est quasi-exclusive
‘Mexique’
‘Classique’
‘Variegata’
‘Aiguille’
‘Stérile’
‘Grosse
Vanille’
Conclusions et perspectives
‘Mexique’
‘Classique’
‘Variegata’
‘Aiguille’
‘Stérile’
‘Grosse Vanille’
Conclusions et perspectives
‘Mexique’
‘Mexique’
‘Classique’
‘Classique’
‘Variegata’
‘Variegata’
?
Introduction
du cv.
mexicain
‘Mansa’
?
‘Aiguille’
‘Stérile’
‘Stérile’
‘Grosse Vanille’
Vanille’
Reproduction
sexuée
Triploïdie
Autotétraploïdie
> Stérilité
Conclusions et perspectives
‘Mexique’
‘Mexique’
9 Variation
épigénétique ?
> pas MSAP
?
9 Mutation
dominante à
effet
pléiotropique ?
‘Classique’
‘Classique’
Introduction
du cv.
mexicain
‘Mansa’
‘Variegata’
‘Variegata’
9 Variation
épigénétique ?
> pas MSAP
?
9 Mutation
chloroplastique ?
9 Eléments
transposables ?
‘Aiguille’
‘Stérile’
‘Stérile’
‘Grosse Vanille’
Vanille’
Reproduction
sexuée
Triploïdie
Autotétraploïdie
> Stérilité
9 Comparaison processus La Réunion vs. Mexique
‘Oreja de Burro’ / ‘Stérile’
Conclusions et perspectives
9 V. planifolia : base génétique étroite
y Vulnérabilité aux aléas environnementaux
9 Accroître la variabilité génétique
y Autofécondation
y Polyploïdie
y Hybridations inter-spécifiques
> amélioration résistance, productivité …
9 Gestion des ressources génétiques (doublons, futures
prospections)
9 Préciser les processus de diversification à l’échelle du
genre > phylogénie et taxonomie
Publications
Biodiversity and preservation of vanilla: present state of knowledge
S Bory, M Grisoni, M-F Duval, P Besse (2007) Genetic Resources and Crop Evolution
doi:10.1007/s10722-10007-19260-10723 (acceptée mai 2007)
Development of microsatellite markers in cultivated Vanilla:
polymorphism and transferability to other Vanilla species
S Bory, D Da Silva, A-M Risterucci, M Grisoni, P Besse, M-F Duval (2007)
Scientia Horticulturae doi:10.1016/j.scienta.2007.10.020 (acceptée octobre 2007)
Patterns of introduction and diversification of Vanilla planifolia
(Orchidaceae) in Reunion Island (Indian Ocean)
S Bory, P Lubinsky, A-M Risterucci, J-L Noyer, M Grisoni, M-F Duval, P Besse
(soumise) American Journal of Botany
Natural polyploidy in Vanilla planifolia (Orchidaceae)
S Bory, O Catrice, SC Brown, IJ Leitch, R Gigant, F Chiroleu, M Grisoni, M-F Duval,
P Besse (soumise) Annals of Botany
Vanilla pompona (Orchidaceae) is an ancient polyploid species
S Bory, O Catrice, SC Brown, IJ Leitch, R Gigant, F Chiroleu, M Grisoni, M-F Duval,
P Besse (en préparation) Annals of Botany
Merci à tous
et particulièrement…
• les financeurs
(Région Réunion, Union Européenne, BRG, MOM)
• les labos d’accueil
(UMR PVBMT, ISV CNRS Gif / Yvette et IBP Orsay,
Jodrell Laboratory Kew)
• la Vanilla Dreamteam
(Pascale, Michel et Marie-France,
Katia et Jean-Bernard, Marion et Karin,
Anthony, Rodolphe et Louis)
• et tous les partenaires ayant
fourni le matériel végétal…