Implicaciones del Purinoma en la Biología y Patología del Epitelio Biliar

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Implicaciones del Purinoma en la Biología y Patología del Epitelio Biliar

Implicaciones del Purinoma en la Biología y
Patología del Epitelio Biliar
Valeria Godoy Torres
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Implicaciones del Purinoma en la Biologı́a y
Patologı́a del Epitelio Biliar
Valeria Godoy Torres
Memoria presentada por la Licenciada en Farmacia
para optar al grado de Doctor por la Universidad de Barcelona
Programa de Biomedicina
Director de Tesis
Dr. Marçal Pastor Anglada
Catedrático de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular
Departamento de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular
Facultad de Biologı́a
Universidad de Barcelona
Implicaciones del Purinoma en la Biologı́a y Patologı́a del Epitelio
Biliar
c
Copyright �2012.
Valeria Godoy Torres, Barcelona, España.
Todos los derechos reservados.
Director
Dr. Marçal Pastor Anglada
Catedrático de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular
Universidad de Barcelona, Barcelona, España
Instituto de Biomedicina de la Universidad de Barcelona -IBUB
Centro de Investigaciones Biomédicas en Red de Enfermedades
Hepáticas y Digestivas - CIBER EHD
Tribunal:
Prof. Francesc Villarroya G.
Dra. Mireia Martı́n S.
Dr. Jesús M. Bañales A.
Universidad de Barcelona, Barcelona-España
Universidad de Barcelona, Barcelona-España
Universidad del Paı́s Vasco, San Sebastián-España
Este trabajo fue llevado a cabo en el Laboratorio de Molecular
Pharmacology and Experimental Therapeutics (MPET) en el Departamento de Bioquı́mica y Biologı́a Molecular de la Facultad de Biologı́a
de la Universidad de Barcelona, IBUB y CIBER EHD. BarcelonaEspaña. La investigación que ha conducido a esta tesis doctoral ha
recibido la financiación de la Beca de Doctorado por Gestión Propia de la Comisión de Ciencia y Tecnologı́a del Gobierno de Chile.
CONICYT- Chile. Además de la financiación a través de los proyectos SAF 2008-00577 y 2011-23660 del Ministerio de Ciencia e Innovación del Ministerio de Economı́a y Competitividad del Gobierno de
España, de los proyectos SGR00315 y SGR624 de la Generalitat de
Catalunya, y del CIBERhed y Acción Transversal en Cáncer del Instituto de Salud Carlos III del Ministerio de Ciencia e Innovación y
Ministerio de Sanidad y Consumo del Gobierno de España.
Para mi gran y hermosa familia
por ser la puerta a todos mis sueños.
Abstract/Resumen
Abstract The purinoma is the molecular network that mediates the
final eﬀects of the extracellular adenosine and its metabolites (ATP,
ADP and AMP).
The components of this complex act synergistically to initiate,
maintain and terminate the purinergic signal. This network is conform
by: P1 purinergic receptors for adenosine, P2 purinergic receptors for
ATP/ADP, the ATP/ADPasas (nucleotidases) which are responsible
for extracellular degradation of ATP and ADP, and equilibrative nucleoside transporters (ENTs) and concentrativos (CNTs) responsible
for the recycling of adenosine.
Cholangiocytes are epithelial that form the intra and extrahepatic biliary tract. They are distributed in a three dimensional network
of interconnected ducts. Their main function is to sense and modify
the composition of bile from the bile canaliculi. Additionally, they are
involved, together with hepatocytes, in the detoxification of xenobiotics. Although the main mechanisms that trigger these functions are
directly related to extracellular ATP and P2 receptor activation, little
has been described for other components of purinoma.
In recent years, interest in the study of the physiology of cholangiocytes has increased significantly due to the progressive increment
in the incidence of cholestatic liver diseases and biliary tract cancer
worldwide. Cholangiocarcinoma (CC) from the neoplastic transformation of cholangiocytes, is the main bile duct cancer. Because cancer is
not detected at early stages, the main treatment option is chemotherapy.
Among the most studied chemotherapeutic agents for use in monotherapy are uracil derivatives as 5-fluorouracil (5-FU) or nucleoside
derivatives as cytidine (gemcitabine) or uridine (capecitabine), other
agents are also used such as cisplatin. These drugs are also used in
combination to increase the eﬀectiveness of the therapy.
i
Although other human epithelial models have shown that the
transport of chemotherapeutic agents, nucleoside analogues, into the
cell is done by means of the nucleoside transporters, at the moment
no evidence of the uptake mechanisms, nor the proteins that mediate
these processes, are available in CC or in non-tumor models of the
biliary epithelia.
ii
Resumen El purinoma esta formado por la red de proteı́nas de
membrana que median el efecto final de la adenosina (Ado) extracelular y sus metabolitos (ATP, ADP y AMP). Sus componentes actúan
de forma sinérgica y concertada para iniciar, mantener y terminar la
senal purinérgica.
Los elementos que conforman esta red son: los receptores purinérgicos P1 de adenosina, los receptores purinérgicos P2 para ATP y
ADP, las ATP/ADPasas (nucleotidasas) responsables de la degradación extracelular del ATP y ADP, y los transportadores de nucleósidos
equilibrativos (ENTs) y concentrativos (CNTs) encargados del reciclaje de la adenosina.
Los colangiocitos son células epiteliales que conforman el tracto
biliar intra y extrahepático y se distribuyen en una red tridimensional
de ductos interconectados. Su principal función es la de sensar y modificar la composición de la bilis proveniente de los canalı́culos biliares.
Pero también participan junto a los hepatocitos en la detoxificación
de xenobioticos. Aún cuando los principales mecanismos efectores de
estas funciones están directamente relacionados con el ATP extracelular y activación de los receptores P2, nada ha sido descrito para el
resto de los componentes del purinoma.
En los últimos anos, el interés en el estudio de la fisiologı́a de los
colangiocitos ha aumentado significativamente debido al incremento
progresivo en la incidencia de las enfermedades hepáticas colestásicas
y del cáncer de tracto biliar a nivel mundial. El colangiocarcinoma
(CC) proveniente de la transformación neoplásica de los colangiocitos, es el principal cáncer de conducto biliar. Debido a que es un
cáncer de detección tardı́a, la principal opción para el tratamiento es
la quimioterapia. Entre los agentes quimioterapéuticos más estudiados
para su uso en monoterapia se encuentran derivados de uracilo como
el 5-fluoruracilo (5-FU), o derivados de nucleósidos como la citidina (gemcitabina), o de la uridina (capecitabina); también se utilizan
agentes como el Cisplatino. Estos fármacos se utilizan también en
combinaciones para aumentar la efectividad de la terapia.
A pesar de que en otros modelos epiteliales humanos se ha demostrado que el transporte de los quimioterápicos, análogos de nucleósidos, al interior celular se hace por medio de NT, en la actualidad no
existe ninguna evidencia ni de los mecanismos de entrada, ni de las
entidades que median estos procesos en CC o en modelos no tumorales
de colangiocitos.
iii
iv
Índice general
Abstract/Resumen
I
Prefacio
XI
Acrónimos
XV
1. Introducción
1.1. Señalización purinérgica: el purinoma . . . . . . . . . .
1.1.1. Ligandos extracelulares, mecanismos de secreción
1.1.2. Receptores P1 de adenosina . . . . . . . . . . .
1.1.3. Receptores de nucleótidos (P2) . . . . . . . . .
1.1.4. Transportadores de nucleósidos . . . . . . . . .
1.1.5. Ectonucleotidasas: enzimas metabolizadoras de
nucleótidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.1.6. Interacciones directas de elementos del purinoma
1.2. Epitelio biliar: colangiocitos . . . . . . . . . . . . . . .
1.2.1. Fisiologı́a del tracto biliar . . . . . . . . . . . .
1.2.2. Mecanismos de regulación de la secreción del
colangiocito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3. Colangiocarcinoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3.1. Patogénesis molecular del colangiocarcinoma .
1.3.2. Tratamiento del colangiocarcinoma . . . . . . .
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2. Objetivos
55
3. Materiales y Métodos
3.1. Cultivo Celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.1. Cultivo de lı́neas celulares . . . . . . . . .
3.2. Tratamientos de los cultivos celulares . . . . . . .
3.3. Ensayos de citotoxicidad: Curvas dosis-respuesta
3.4. Transporte de Nucleósidos . . . . . . . . . . . . .
3.4.1. Transporte de células en monocapa . . . .
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3.4.2. Medidas de transporte en transwell . . . . . .
3.5. Análisis de la expresión de proteı́nas . . . . . . . . . .
3.5.1. Obtención de lisados celulares . . . . . . . . . .
3.5.2. Electroforesis en SDS-PAGE . . . . . . . . . .
3.5.3. Inmunoblotting . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.4. Inmunocitoquı́mica . . . . . . . . . . . . . . . .
3.5.5. Análisis de resultados por microscopia confocal
3.6. Análisis de la expresión de RNA . . . . . . . . . . . .
3.6.1. Obtención de RNA total . . . . . . . . . . . . .
3.6.2. Análisis de la calidad y cantidad del RNA aislado
3.6.3. Sı́ntesis de cDNA: Retrotranscripción . . . . .
3.6.4. Real-Time PCR (PCR a tiempo real) . . . . .
3.6.5. Cuantificación relativa de la expresión génica .
3.6.6. Cuantificación absoluta de la expresión génica .
3.6.7. Fast Real-Time PCR tarjetas microfluı́dicas (TDLAS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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4. Resultados y Discusión
4.1. El purinoma en el colangiocito . . . . . . . . . . . . .
4.1.1. Mecanismos de regulación de adenosina . . . .
4.1.2. Regulación del transporte por ATP . . . . . . .
4.2. Colangiocarcinoma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.1. Caracterización del transporte de nucleósidos .
4.2.2. Efectos citotóxicos producidos por gemcitabina,
Cisplatino y 5-FU en la lı́neas de CC . . . . . .
4.2.3. Genes asociados a resistencia de la terapia antitumoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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5. Conclusiones
135
Anexos
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XVII
vi
Índice de figuras
1.1. Elementos que conforman el purinoma . . . . . . . . .
1.2. Representación de la estructura del cristal del receptor
A2A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3. Tabla resumen de las caracterı́sticas principales de los
receptores P1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.4. Señales de traducción intracelular activadas por los receptores de adenosina . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.5. Receptores P1 en la regulación del transporte iónico
epitelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.6. Mecanismos involucrados en la interacción A2A /D2 . .
1.7. Topologı́a de la estructura predicha de los receptores
P2Y humano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.8. Tabla resumen de las caracterı́sticas principales de los
receptores P2Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.9. Modelo de la estructura del cristal de P2X4 . . . . . .
1.10. Propiedades electrofisiológicas de los receptores P2X .
1.11. Caracterı́sticas farmacológicas de los receptores P2X .
1.12. Sistemas cinéticos de transportadores de tipo equilibrativo y las entidades moleculares que los identifican . .
1.13. Modelo de la topologı́a propuesta para ENT1 . . . . .
1.14. Sistemas cinéticos de transportadores de tipo concentrativo y las entidades moleculares que los identifican .
1.15. Representación esquemática de la topologı́a de CNT3
de Vibrio cholerae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.16. Modelo de la regulación del transporte de nucleósidos
en el hepatocito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.17. Representación del rol de las cuatro familias de ectonucleotidasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.18. Estructura del parénquima hepático . . . . . . . . . .
1.19. Estructura del tracto biliar . . . . . . . . . . . . . . .
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1.20. Sistemas de transporte involucrados en la formación de
la bilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.21. Regulación de la secreción de bicarbonato . . . . . . .
1.22. Heterogeneidad de la funcionalidad de las poblaciones
de colángiocitos del árbol biliar . . . . . . . . . . . . .
1.23. Modelo de la señal purinérgica a través del conducto
biliar intrahepático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.24. Propiedades sensoriales del cilio en el colangiocito . . .
1.25. Esquema de los fenotipos de Colangiocarcinoma . . . .
1.26. Mecanismos involucrados en la transformación maligna
de los colangiocitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.27. Metabolización de la gemcitabina . . . . . . . . . . . .
1.28. Mecanismo de acción del 5-FU . . . . . . . . . . . . .
3.1. Representación esquemática de una unidad de cámara
y filtro de tipo transwell . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2. Tabla resumen composición medio de cultivo de las NRCs
3.3. Tabla de condiciones de tratamiento en los cultivos celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4. Tabla resumen anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . .
3.5. Tabla resumen anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . .
3.6. Tabla resumen sondas utilizadas para el análisis por
Real-Time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7. Tabla resumen parámetros Real-Time PCR . . . . . .
3.8. Tabla resumen genes incluidos en el análisis transcriptómico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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4.1. Caracterización del transporte de nucleósidos en las NRCs 97
4.2. Efecto de la eliminación del cilio en el transporte de
nucleósidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
4.3. Caracterización del efecto de la activación de los receptores de adenosina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
4.4. Vı́as de señalización intracelular involucradas en la activación de CNT3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
4.5. Efecto de la activación de A2A en un modelo de colangiocitos polarizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
4.6. Regulación del transporte de nucleósidos por secretina 108
4.7. Efecto de la activación de A1 y D2 en la actividad de
los transportadores en los colangiocitos en transwell . 110
4.8. Análisis de la localización subcelular de A1 y A2A en
las NRCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
viii
4.9. Análisis de la localización subcelular de D2 con A2A en
las NRCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.10. Caracterización del efecto de ATP en la actividad del
transporte de nucleósidos. . . . . . . . . . . . . . . . .
4.11. Caracterización del efecto de ATP en la actividad del
transporte de nucleósidos en las NRCs en transwell. . .
4.12. Regulación de receptores P2Y sobre la actividad apical
del transporte de nucleósidos de las NRCs. . . . . . . .
4.13. Caracterización de la actividad del transporte de nucleósidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.14. Caracterización de la actividad equilibrativa en las lı́neas
celulares de CC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.15. Niveles de expresión cuantitativa de mRNA de los transportadores de nucleósidos . . . . . . . . . . . . . . . .
4.16. Resumen de IC50 de los fármacos utilizados en la terapia contra el CC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.17. Curvas de viabilidad de las células de CC frente a la
combinación gemcitabina-5-FU . . . . . . . . . . . . .
4.18. Curvas de viabilidad de las células de CC frente a la
combinación gemcitabina-Cisplatino . . . . . . . . . .
4.19. Análisis de la expresión de mRNA de familias génicas
de transportadores de fármacos . . . . . . . . . . . . .
4.20. Análisis de la expresión de mRNA de la familia génica
de transportadores ABC . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.21. Análisis de la expresión de mRNA de enzimas del metabolismo de fármacos . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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x
Prefacio
Todavı́a me acuerdo que Barcelona me recibió en fiestas de la
Mercé y no necesité mas que unos minutos para enamorarme de esta
ciudad, no puedo creer la suerte que tuve de poder estar aquı́.
Marçal te agradezco muchı́simo todo tu apoyo y esfuerzo para
“traerme” aquı́, por guiarme en todo el proyecto y por sobretodo
por el optimismo con que eres capaz de mirar las cosas. Me siento
muy afortunada de haber pasado por tu laboratorio. Muchas gracias
además por todos los cafés mañaneros y las conversaciones de pasillo.
Agradezco también a Gloria Riquelme, porque sin su ayuda no
habrı́a terminado aquı́, toda la base cientı́fica que me traje desde
Chile, la aprendı́ en su laboratorio.
Ekaitz, han pasado cuatro años! no sabes lo importante que fuiste
cuando llegué, valoro todos los consejos académicos y no académicos
que me regalaste. Laia, pensar que tu me enseñaste a hacer transportes, agradezco todo lo que me enseñaste, y agradezco aun más todo
lo que compartimos, aunque haya sido poquito tiempo, el momento
watoncito nunca será olvidado! Isa, cuantas cosas he aprendido de ti
sin que me las hayas dicho, eres un ejemplo para mi en muchos aspectos, gracias. Itzy ratoncita, gracias por tu disposición a enseñarme,
tus consejos y la compañı́a en las miles de horas invertidas en las
maratones de rascado, todo valió la pena.
Pau, nadie mas que nosotras puede entender la solidaridad sudamericana, gracias por tu cercanı́a, por las conversaciones extralaborales y los momentos Soda estéreo y los prisioneros al final de los
dı́as.
Ingrid, que serı́a de mi sin tu eficiencia? Tantas veces me salvaste
los experimentos y las células, y otras tantas que nos hiciste entrar
la lista vip de la secretaria, si hasta salvaste a mi violeta. Muchas,
muchas gracias por todo lo que compartiste conmigo.
Albert que gran fichaje para el lab, mil gracias por las risas mañaneras, que bien me lo he pasado este último tiempo, gracias (pobre no
sabes no que te espera).
xi
Anita guapa, gracias por la compañı́a y el apoyo en esta última
etapa, que diferente fueron los dı́as cuando estabas conmigo!
A mis niñas: uﬀf hay tanto q decir! Lorena, comienzo contigo porque gracias a ti es que pude matricularme en el master, aunque no me
conocı́as, todo empezó allı́ en esa fila del Clı́nic. Como poder agradecerte el tiempo compartido estos 4 años, los bailes, los chistes, las
risas, las listas de reproducción y los achuchones (y otras cosas que
dejo censuradas).
Estefi, todavı́a resuenan en mi cabeza las risas que hemos compartido, no olvido lo mucho que me ayudaste cuando era una nueva en
RST y en Barcelona, gracias por todo.
Sandra, esta tesis tiene muchos de tus toques, mil veces me bajaste a tierra en 5 minutos, tus comentarios son la base varios de mis
resultados, gracias por eso. Mas importante aún gracias por tu amistad, por las idas al cine, las cervezas de los viernes y la compañı́a que
siempre me has sabido dar.
Cris, fuiste mi primera amiga catalana, no sé como y ni bajo que
artilugio esta chilena consiguió saltar las barreras de una catalana
pura, te acuerdas de las clases del master? de nuestras conversaciones
en papel? Además de encontrar mi primer piso, conseguiste llevarme
a un super y hacer mi primera compra! Siento que mi preferencias
vayan más por el árabe que por el catalán però el poc que ara sé, és
en gran part a causa de tu.
Natalia linda, ya no estás conmigo pero es como si lo estuvieras!!!
No sé ni como empezar, en algún punto las Volldam de los viernes
empezaron a hacerse obligación. Te agradezco por sobretodo que insistieras, que me obligaras a sacarlo todo afuera, siempre estuviste
cuando te necesité.
No puedo olvidar a la gente de TEC, Adela y Nerea, a Vicente y
Xico, a Raquel, Toni y a Teresa. Todos me han ayudado en detalles
tan importantes y nisiquiera lo sospechan.
Agradezco también a toda la gente de Pamplona, por lo que me
han enseñado, pero aun más por todos los momentos que me regalaron, Ainhoa, Sarai, Elena, Alex, Fabian, January, Axel, Txus y Juan
Francisco.
A mis amigos de Barcelona: Issis y Hernán, no hay palabras para
todo lo que me han ayudado, además de hacerme una experta violinista, y una aficionada al Latex, cada uno me ha ayudado tanto,
los últimos empujones que me han dado para terminar la tesis han
significado mucho para mi.
Maru, amiga que te puedo decir! gracias por todo, hemos compartido tantas experiencias y tantas situaciones, que afortunada me
xii
siento de tenerte conmigo este último tiempo.
A todos los demás que hicieron su vida en Barcelona aunque no son
de aquı́, y que me han acompañado: Anne, Lauri, Francesita, Ljela,
Ivania y Nico.
A mis amigos de Chile; Diego, Liz y Jana que a la distancia siempre
estuvieron conmigo.
Finalmente a mi familia, a todos lo que están en Chile, a los Torres
y los Godoy, a mis primas-hermanas y a Leo, Arlyn y Oneisin, mis
refugios en Berlin. Y por supuesto a Pepe, Ivonne y Nydia, no puedo
creer todo lo que he dejado atrás, y el tiempo que les he robado.
Todos los saludos, besos y abrazos, las fotos, los videos, las oraciones,
las postales en mi cajón uﬀf ....todo eso hizo mucho la diferencia, y el
tiempo pasó rápido pero a la vez muy lento, muchas gracias.
xiii
xiv
Acrónimos
5-DFUR
5-FU
ACs
AE2
AKAP
APs
ATP
BAPTA-AM
CC
CFTR
CGS
CK
ClHy
CREB
CTP
DARPP-32
DMEM
DMSO
dNTPs
DPCPX
E-NPPasa
E-NTPasa
ET-1
GAPDH
GPCRs
β-GUS
IBMX
5-Fluoro-2’-deoxyuridine
5-Fluorouracilo
Adenilato ciclasas
Anion exchanger 2
A-Kinase anchor protein
Fosfatasas alcalinas
Adenosin trifosfato
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’tetraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl ester)
Colangiocarcinoma
Canal de Cl− activado por cAMP
2-p-(2-Carboxyethyl)phenethylamino5’-N-ethylcarboxamidoadenosine hydrochloride hydrate
Citoqueratina
Chloral hydrate
cAMP response element-binding protein
Citidin trifosfato
Dopamine- and cAMP-regulated phosphoprotein
Medio de Eagle modificado por Dulbecco
Diemetilsulfóxido
Dioxinucleótidos
8-Cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine
Ectonucleotidasa pirofofatasa/fosfodiesterasa
Ectonucleotidasa trifosfato difosfohidrolasa
Endotelina 1
Gliceraldehı́do 3-fosfato deshidrogenasa
Receptores acoplados a proteı́nas G
β-glucuronidasa
3’ isobutil-1’ metilxantina
xv
IP3
LPS
M-CSF
M3
MDCK
NBTI
NECA
NHE
NMC
NRC
ON
PBS
PC-1
PC-2
PCR
PLC
PP-1
PPADS
RB-2
rPIA
SDS
ES
SSTR2
TA
TBS
VIP
VNUT
ZM 241385
Inositol trifosfato
Lipopolisacárido
Macrophage Colony Stimulation Factor
Receptor muscarı́nico de acetilcolina 3
Madin-Darby Canine Kidney Cells
Nitrobenziltioinosina
5’-(N-Ethylcarboxamido)adenosine
Intercambiador Na+ /H+
(Normal Mouse Cholangiocytes)
(Normal Rat Cholangiocytes)
Toda la noche
Phosphate Buﬀered Saline
Policistina 1
Policistina 2
Reacción de la polimerasa en cadena
Fosfolipasa C
Phosphoprotein phosphatase 1
4-[[4-Formyl-5-hydroxy-6-methyl-3[(phosphonooxy)methyl]-2-pyridinyl]azo]
-1,3-benzenedisulfonic acid tetrasodium salt
Reactive Blue-2
(-)-N6-(2-Phenylisopropyl)adenosine
Dodecilsulfato sódico
Error estándar de la media
Receptor de somatostatina 2
Temperatura ambiente
Tris Buﬀered Saline
Vasoactive intestinal peptide
Transportador vesicular de nucleótidos
4-(-2-[7-amino-2-2-furyl1,2,4triazolo2,3-a
1,3,5triazin-5-yl-amino]ethyl)phenol
xvi
1
Introducción
1
2
1.1.
Señalización purinérgica: el purinoma
El concepto de las purinas como señal extracelular fue postulado
por Drury y Szent-Gyorgyi en 1929, en una publicación que mostraba
que la adenosina y el AMP, extraı́dos desde el músculo cardiaco, tenı́an
efectos biológicos pronunciados, que incluı́an dilatación arterial, disminución de la presión sanguı́nea, e inhibición de la contracción intestinal [1]. En 1934, Gillespie atrajo la atención a la relación estructuraactividad de los compuestos derivados de adenina, mostrando que la
deaminación reducı́a significativamente la actividad farmacológica y
la eliminación de los fosfatos a la molécula influenciaba no sólo en la
potencia pero también en el tipo de respuesta. La eliminación de los
fosfatos fue relacionada directamente con el aumento de la capacidad
de inducir vasodilatación e hipotensión, mientras que el ATP causaba
aumento de la presión en conejo y gatos que no eran observados con
el AMP o la adenosina. Mas aún, el ATP mostró ser más potente, que
el AMP o la adenosina, en causar contracción del ileon y el útero en
cobayos [2]. Estos reportes fueron la primera indicación de las acciones
diferenciales del ATP y la adenosina, y por consiguiente la primera
evidencia de la existencia de diferentes receptores de purinas.
Las purinas median sus efectos por la interacción con distintos receptores de membrana. Los receptores purinérgicos fueron formalmente reconocidos por Burnstock in 1978, cuando propuso que podı́an ser
divididos en dos clases; purinoreceptores-P1 para los cuales adenosina
es el principal ligando natural, y purinoreceptores-P2 que reconocen
ATP y ADP [3] Esta división fue basada en varios criterios, como
la potencia diferencial del ATP, ADP, AMP y adenosina; el efecto
antagónico selectivo de las metilxantinas sobre la adenosina; la activación de Adenilato ciclasas (ACs) mediada por la adenosina; y la
sı́ntesis de prostaglandinas mediada por ATP y ADP. Esta división
permanece dentro de la clasificación de los receptores purinérgicos,
aunque los receptores P1 y P2 ya han sido caracterizados de acuerdo a sus estructuras moleculares, perfil farmacológico y distribución
tisular [3] [4].
El concepto de señal purinérgica ha ido evolucionando desde el
tiempo en que se consideraba el ATP como una molécula propiamente intracelular, hasta la actualidad en que es aceptado que son
muchos los elementos que participan de la fisiologı́a de la señalización
purinérgica. Distintos tipos celulares expresan simultáneamente una
combinación de diferentes receptores purinérgicos, perfiles de degradación enzimática de nucleótidos y una variedad de rutas de salida y
entrada de nucleótidos y nucleósidos. Lo cual ha llevado a agrupar este
3
conjunto elementos bajo el nombre de purinoma (Figura 1.1) [5] [6] [7].
El concepto clave del purinoma viene dado por el hecho de que la
señal purinérgica no es exclusivamente regulada por ligandos o proteı́nas, receptores, enzimas o transportadores, actuando en forma singular, sino que en la actualidad existe suficiente evidencia para afirmar
que su regulación es mediada por un amplio espectro de interacciones
entre ellos.
Figura 1.1: Elementos que conforman el purinoma.
El purinoma está formado por la red de proteı́nas de membrana
que median el efecto final de las purinas extracelulares y sus metabolitos. Sus componentes actúan de forma sinérgica y concertada para
iniciar, mantener y terminar la señal purinérgica. Los elementos que
conforman esta red son: i) la vasta heterogeneidad de ligandos purinérgicos. ii) los receptores purinérgicos P1 para adenosina. iii) los receptores purinérgicos P2 para nucleótidos. iv) las ATP/ADPasas (ectonucleotidasas) responsables de la degradación extracelular del ATP
y ADP. v) los transportadores de nucleósidos equilibrativos (ENTs) y
concentrativos (CNTs) encargados del reciclaje de la adenosina [5] [6].
1.1.1.
Ligandos extracelulares, mecanismos de secreción
Durante muchos años, la presencia de ATP extracelular fue estrictamente asociada a procesos patológicos o de muerte celular. En la
actualidad, es aceptado que muchos tipos celulares responden fisiológicamente secretando ATP en respuesta ya sea a distorsión mecánica,
hipoxia o a estimulación por otras moléculas [8] [9]. Además el ATP
y sus metabolitos han emergido como potentes moléculas reguladoras de un amplio rango de tipos celulares, los cuales no se limitan a
células excitables y procesos de neurotrasnmisión, sino que incluyen
células epiteliales, como en el hı́gado, epitelio biliar y aéreo, y muchos
4
otros modelos, en donde actúa como una potente señal paracrina y
endocrina [10].
Los mecanismos asociados a la secreción del ATP, se han ido dilucidando en los últimos años. En un comienzo, se atribuyó este proceso
a los transportadores de la familia ABC, tales como la glicoproteı́na-P
y el canal de Cl− activado por cAMP, CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator ). Sin embargo, esto fue descartado
al comprobar que la sobreexpresión transitoria y el posterior bloqueo
de estas proteı́nas no afectó la liberación del ATP [11].
En la actualidad, un variado panel de proteı́nas comparten, junto a
la secreción vesicular, el rol de la liberación de ATP: El maxi-canal de
cloruro, los hemicanales; conexinas (Cx) y panexinas (Px), el receptor
de ATP; P2X7 , a los cuales se ha agregado el transportador vesicular
VNUT [8] [12] [13] [11] [14].
El rol de los canales iónicos en la translocación de ATP, parece lógico ya que a pH fisiológico forma Mg ATP+2 y debido a sus
altas concentraciones intracelulares, genera una gradiente concentración que favorece su movimiento fuera de la célula [10]. Aunque la
estructura molecular del maxi-canal de cloruro no ha sido definida, y
aun hay controversia en su homologı́a con la isoforma de VDAC de
membrana mitocondrial [15], su rol en la secreción de ATP ha sido
comprobado a través de la caracterización del ratón knock-out de la
isoforma de membrana plasmática; VDAC-1 [16].
Una vez en el espacio extracelular, el ATP es sustrato de una
gran variedad de ectonucleotidasas, que lo hidrolizan a nucleósidos
di o monofosfato y adenosina. Estos nucleótidos/nucleósidos servirán
luego como ligandos para los receptores purinérgicos P1 y P2.
Es importante notar, que la concentración efectiva de ligados purinérgicos extracelulares no es sólo producto de la secreción y degradación del ATP, sino que también depende de la entrada o salida de
adenosina a través de los transportadores de nucleósidos.
1.1.2.
Receptores P1 de adenosina
Los receptores P1 de adenosina son una familia compuesta por
los receptores: A1 , A2A , A2B , y A3 , los cuales han sido identificados
mediante técnicas moleculares y estudios bioquı́micos/farmacológicos.
Estos receptores fueron clonados desde una gran variedad de especies
y caracterizados luego de su expresión funcional en células de mamı́feros y en oocitos de Xenopus laevis [17]. Los receptores P1 pertenecen a
la familia de receptores acoplados a proteı́nas G (GPCRs) y de acuerdo a esto, su estructura corresponde a siete dominios transmembrana
5
Figura 1.2: Representación de la estructura del cristal del receptor A2A y acercamiento del sitio de unión a ligando. Imagen de Jaakola, 2008 [18].
conectados por tres loops extra e intra celulares, y con dominios N y C
terminal en el extra el medio intracelular, respectivamente. La estructura del cristal de A2A fue determinada hace pocos años (Figura 1.2),
y constituyó uno de los grandes acontecimientos en la determinación
de la estructura de un receptor acoplado a proteı́nas G [18] [19]. Los
resultados de esta caracterización permitieron re-plantearse las generalizaciones aceptadas para todos los GPCRs, las cuales se hicieron en
base a la estructura del receptor de rodopsina, ya que se encontraron
diferencias importantes, tales como en la localización del sitio de unión
a ligando y en la arquitectura de los loops extracelulares [18] [19].
Figura 1.3: Tabla resumen de las caracterı́sticas principales de los receptores P1
Las principales caracterı́sticas de los receptores de adenosina se
muestran el la Figura 1.3. Los receptores A1 y A2A fueron inicialmente clasificados en base a la señal de inhibición y estimulación de ACs,
respectivamente [20]. De hecho, los receptores A1 y A3 están acoplados
a proteı́na Gi (aunque también se ha descrito asociación a Go y Gq ,
respectivamente). Mientras que le receptor A2A puede asociarse con la
proteı́na Gs o Golf . Dependiendo del subtipo de proteı́na G, la activación del receptor desencadenará diferentes señales intracelulares. Por
6
lo tanto, la activación del receptor A1 media la inhibición de ACs, que
llevará a la activación de varios tipos de canales de K+ , la inactivación
de canales de Na+ y de Ca+2 (tipo-Q), y la activación de fosfolipasa
C-β (PLC-β). Por otra parte, la activación de los receptores A2A y
A2B , mediada por la proteı́na Gs tiene como resultado la formación
de cAMP a través de la estimulación de ACs. Aunque la asociación
de A2A a la proteı́na Gq media también la activación de PLC y la
movilización de Ca +2 intracelular (Figura 1.4). Todos los receptores
han mostrado tener una asociación positiva con la vı́a de señalización
de la cascada de las MAP quinasas. Sin embargo, dependiendo del
tipo celular, el efecto final puede llegar a ser muy amplio [21] [22] [20].
Figura 1.4: Señales de traducción intracelular activadas por los receptores de
adenosina. Imagen modificada de Jacobson y Gao, 2006 [23].
La adenosina, como agonista endógeno tiene un uso limitado para la investigación de los receptores P1, debido a su susceptibilidad
a la metabolización enzimática. Sin embargo, la estructura de este
nucleósido es la base de todos los agonistas farmacológicos sintéticos
diseñados hasta la fecha. Las metilxantinas constituyen el grupo prototipo de moléculas antagonistas, y modificación a estas moléculas tiene
como resultado una amplia variedad de derivados con distinta selectividad a los subtipos de receptores P1. Recientemente, otras familias
de moléculas; triazoloquinazolinas, triazolotriazinas, dihidropiridinas
y derivados de adenina, han servido como base para la sı́ntesis de
antagonistas no-xantı́nicos [4].
Receptores P1 y el transporte iónico epitelial
El control del transporte iónico mediado por adenosina ha sido
demostrado en una variedad de tejidos epiteliales como resultado de
7
la activación de los 4 subtipos de receptores. La modulación de la
secreción de Cl− controlando la actividad de CFTR, y la estimulación
de las corrientes de Ca+2 mediadas por la vı́a de la proteı́na Gi /PLC–
β, se encuentran entre los efectos mas estudiados y mas significativos
de la adenosina en las células epiteliales.
Los estudios mejor caracterizados del transporte epitelial mediado
por receptores P1 se han realizado en el epitelio del colon. En este
tejido, la activación del receptor A2B estimula la secreción de agua y
Cl− . Esto tiene una evidente importancia clı́nica, ya que las concentraciones de adenosina contribuyen en forma directa en la respuesta
patológica en los casos de diarrea en el marco de las enfermedades
inflamatorias y también en el tratamiento de la fibrosis quı́stica. [24].
En el epitelio pulmonar, A2B controla también la secreción apical de
Cl− , a través de un mecanismo dependiente de la proteı́na Gs , ACs
y aumento cAMP [25] [26]. En este epitelio A1 ha mostrado también
ejercer control en el transporte iónico de Cl− , a través de un mecanismo independiente de la presencia de CFTR [25].
Figura 1.5: Receptores P1 en la regulación del transporte iónico epitelial. Imagen
modificada de Bucheimer R y Linden J, 2003 [24].
El efecto neto de la adenosina en la estimulación del transporte
de Na+ en el epitelio renal, es una combinación de la acción de A1 ,
A2A y A3 [27]. La estimulación de A1 a través de activación de PKC
y aumento del Ca+2 intracelular es responsable de la estimulación
apical del transporte de Na+ . La activación de A2A en el dominio
basolateral del epitelio renal, activarı́a el transporte transepitelial de
Na+ a través de la vı́a dependiente de cAMP/PKA. Esta regulación se
producirı́a a través del control del pH intracelular, ya que el receptor
serı́a capaz de activar el intercambiador Na+ - H+ [28]. La disminución
8
de la concentración de H+ causarı́a un aumento directo del transporte
de Na+ . El receptor A3 se localiza en el lado apical de este epitelio, y
su activación inducirı́a la secreción de Cl− . Este efecto es dependiente
del aumento de Ca +2 intracelular, pero se cree que es mediado por
la estimulación de la proteı́na Gs /PKA la cual estimuları́a la entrada
de Ca +2 [29].
Receptor A2A
El rol fisiológico de este receptor ha sido ampliamente descrito en
el sistema nervioso central, ya que su regulación es parte fundamental
de los mecanismos moleculares involucrados en patologı́as tales como
Parkinson y Alzheimer. Su distribución en el cerebro está restringida
en el cuerpo estriado (dorsal y ventral), aun que también ha sido
descrito en la corteza, amı́gdala, hipocampo, hipotálamo, tálamo y
cerebelo [30] [31] [32]. En tejidos periféricos es expresado en el bazo,
timo, corazón, epitelio aéreo, epitelio renal, leucocitos y plaquetas [33].
La vı́a de traducción intracelular desencadenada por la activación del
receptor, depende de ACs y de su acoplamiento a proteı́na Gq o Golf
[34]. La activación de A2A mediada por ACs genera cAMP, que lleva a
la activación de PKA, la cual regula el estado de fosforilación de una
gran variedad de proteı́nas. En particular, uno de estos sustratos es
DARPP-32, que al ser fosforilada se convierte en un potente inhibidor
de PP-1 (protein phosphatase-1) la fosfatasa que mantiene inhibida
la actividad de CREB [35].
Oligomerización del receptor A2A
En los últimos años ha habido un aumento consistente de reportes
acerca de la oligomerización de GPRCs en la membrana plasmática.
La oligomerización puede ser resultado de la asociación entre receptores de adenosina y también de estos con otras subfamilias de GPCRs.
La homo o heteromerización es responsable de las denominadas
interacciones intramembrana, que tienen como consecuencia que la
farmacologı́a de los agonistas o antagonistas de un determinado receptor se vea modificada. Lo cual significa que la señal celular final
no siempre es el resultado de la suma de las señales generadas por la
activación de receptores de forma separada, e incluso la formación de
un complejo de proteı́nas puede llegar a mediar señales intracelulares
completamente diferentes [36]. Desde un punto de vista práctico, este
tipo de interacciones supone que la unión del ligando de uno de los
receptores del complejo, cambie las propiedades de unión del ligando
9
del otro receptor que conforma el complejo [37].
Los mayores avances para el entendimiento de estos fenómenos
se han llevado a cabo en células del sistema nervioso central (CNS).
En el caso particular de la adenosina, dentro del CNS se cree que su
concentración extracelular varı́a de acuerdo a la funcionalidad de la
actividad neuronal, y actuarı́a como un neuromudulador con capacidad de acción, pre-post y no-sinápticas [38].
Es por esto que la funcionalidad de los receptores de adenosina ha
sido ampliamente estudiada en el CNS, y se sabe que en las terminales nerviosas glutamatérgicas del cuerpo estriado, los receptores A1
y A2A , son los responsables de los efectos centrales de la adenosina.
Cuando estos receptores están formando un heretodı́mero, y las concentraciones extracelulares de adenosina son altas, la adenosina ejerce
su acción a través de A2A , y esto induce la transinhibición del receptor A1 [39]. Por el contrario, a concentraciones bajas de adenosina,
la activación del receptor A1 serı́a la predominante dentro del complejo. Este mecanismo de regulación tendrı́a un papel relevante en la
fisiologı́a del tejido nativo, ya que la oligomerización de los receptores A2A /A1 estarı́a involucrada directamente en el control de la señal
glutamatérgica [39].
Figura 1.6: Mecanismos involucrados en las múltiples interacciones entre A2A y
D2 . Imagen modificada de Ferré, 2004 [40].
Otro de los complejos heteroméricos que probablemente es el más
estudiado en el CNS es el formado por A2A /D2 . En un principio fue
reportado que la acción de un agonista del receptor D2 contrarres10
tarı́a completamente la acción desencadenada por el receptor A2A en
el cuerpo estriado. Bajo condiciones normales existirı́a una fuerte activación basal del receptor D2 , el cual estarı́a bloqueando la habilidad
del receptor A2A para señalizar a través de la via de cAMP/PKA. La
administración directa de una antagonista del receptor D2 (al cuerpo
estriado del animal de estudio) producı́a un aumento significativo de
la fosforilación de las proteı́nas downstream de la vı́a de la PKA, ya
que el bloqueo de D2 inducı́a la liberación de la vı́a de traducción
de señales de A2A y por lo tanto volvı́a a responder a estı́mulos de
adenosina [41].
Como se ve en la Figura 1.6, en estas mismas neuronas se ha descrito además otro mecanismo de regulación a nivel intramembrana,
que permitirı́a a los receptores A2A modular y controlar el efecto inhibitorio ejercido por los receptores D2 en la excitabilidad neuronal y
la secreción de neurotransmisores [42] [43] [44] [40].
Otras asociaciones del receptor A2A han sido descritas y en la
actualidad están siendo estudiadas debido a su importancia en la modulación farmacológica de una gran variedad de patologı́as: A2A /CB1 ,
A2A /D2 /CB1 , A2A /D2 /mGlu5 y A2A /D3 [45] [46] [47] [4].
1.1.3.
Receptores de nucleótidos (P2)
Los nucleótidos extracelulares como el ATP y el UTP, modulan la
función celular a través de la activación de los receptores de membrana P2. Existen dos familias principales de receptores P2: receptores
P2Y, acoplados a proteı́na G y receptores P2X, canales iónicos activados por unión a ligando. [17]. Aun cuando esta clasificación inicial fue
acertada, y confirmada por la distribución diferencial de los distintos
subtipos de receptores P2, la caracterización de los perfiles farmacólogicos de PY2 y P2X fue sesgada. A la fecha, resulta evidente que cada
subfamilia esta compuesta por un abanico heterogéneo de receptores,
que responden de manera diferente y tienen distintos perfiles de respuesta farmacológica. Siete isoformas de receptores P2X, P2X1 -P2X7 ,
y ocho receptores P2Y1 , P2Y2 , P2Y4 , P2Y6 , P2Y11 , P2Y12 , P2Y13 ,
P2Y14 , han sido clonados y caracterizados farmacológicamente como
miembros válidos de la familia P2.
Los receptores P2 son expresados en la superficie de la mayorı́a
de los tipos celulares, este hecho, refleja la importancia fisiológica de
sus acciones. Es más, son el blanco terapéutico de una gran variedad
de patologı́as, entre las cuales las mejor caracterizadas son la agregación plaquetaria modulada por P2Y1 y P2Y12 [48] [49]. El receptor
P2Y2 ha sido involucrado en mediar el aumento de flujos iónicos (se
11
utilizan agonistas para el tratamiento de la enfermedad de sequedad
ocular, [50]; y también existen agonistas para el tratamiento de la fibrosis quı́stica, [51]. El receptor P2X3 está involucrado en la señal de
transmisión del dolor [52]. Sin embargo, en muchos casos la caracterización farmacológica de estos receptores resulta difı́cil, debido a la
disponibilidad restrictiva de ligandos selectivos para cada isoforma.
Receptores P2Y
Tal como hemos mencionado, los receptores P2Y pertenecen a la
superfamilia de GPRCs y por lo tanto, tienen la topologı́a de siete
dominios transmembrana conectados por 3 loops extra e intracelulares, el dominio N-terminal extracelular y el C-terminal intracelular
(Ver la Figura 1.7). Sin embargo, entre las isoformas existe una baja
homologı́a entre sus secuencias y esto explicarı́a las marcadas diferencias que exhiben sus miembros, en relación a selectividad de ligandos
y especificidad de la proteı́na G. De hecho, los receptores humanos
P2Y1 y P2Y12 , mantienen sólo el 18 % de la homologı́a de sus secuencias aminoacı́dicas, aun cuando farmacológicamente comparten
muchas similitudes en su perfil.
Figura 1.7: Topologı́a de la estructura predicha de los receptores P2Y humano.
Imagen modificada de Fields, 2006 [53]
La familia de receptores P2Y se puede dividir en función de la selectividad por el ligando que los activa. Un primer grupo de receptores,
que incluye a P2Y1 , P2Y11 , P2Y12 y P2Y13 , es activado por nucleótidos derivados de adenina, pero no de uracilo. Otro grupo lo forman
receptores activados tanto por nucleótidos de adenina como de uracilo (receptores P2Y2 y P2Y4 ), y por último el P2Y6 , que es especı́fico
para pirimidinas. Un caso especial es el receptor P2Y14 , activado por
12
UDP-glucosa y otros UDP-azúcares. Alternativamente, estos receptores también pueden ser clasificados en dos categorı́as: Receptores que
prefieren como agonistas nucleótidos trifosfato (P2Y2 , P2Y4 y P2Y11
) o difosfato (P2Y1 , P2Y6 , P2Y12 y P2Y13 y P2Y14 ) [54] [55] [56].
Los receptores P2Y activan diversos mecanismos de señalización
intracelular. Por un lado, los receptores P2Y1 , P2Y2 , P2Y4 y P2Y6 y
P2Y11 están acoplados principalmente a la PLC, a través de una proteı́na Gq/11 . Como resultado del acoplamiento a la PLC y la generación
de IP3, los receptores P2Y producen incrementos en la concentración
intracelular de Ca+2 mediante la salida de calcio desde reservorios intracelulares y activan PKC en las células que los expresan, activando
ası́ numerosas cascadas de señalización secundarias [57].
Por otro lado, las isoformas P2Y12 , P2Y13 y P2Y14 , inhiben ACs y
en consiguiente disminuyen los niveles intracelulares de cAMP, ya que
están acoplados a proteı́na Gi . El receptor P2Y11 tiene caracterı́sticas
particulares, ya que puede unirse tanto a proteı́na Gq/11 , como Gi , y
de esta forma señalizar mediante las dos rutas intracelulares de los
receptores P2Y. Adicionalmente a estos mecanismos de traducción
intracelular, los receptores P2Y median los efectos moleculares de la
célula influenciando otras vı́as, tales como la inhibición de canales
de Ca+2 activados por voltaje de tipo-N (Cav2,2 ), de los canales de
K+ rectificadores de entrada (Kir3,1 , Kir3,2 ), o activando canales de
Cl− [8] [41]. La Figura 1.8 resume las principales caracterı́sticas de
esta familia de receptores.
Figura 1.8: Tabla resumen de las caracterı́sticas principales de los receptores P2Y
Los estudios de identificación molecular han sido posibles gracias a
la aparición de compuestos antagonistas. El uso combinado de diferentes nucleótidos y antagonistas permite la caracterización farmacológi13
ca de las isoformas de P2Y. Existe una gran variedad de compuestos,
el RB-2 (azul reactivo 2), la suramina y el PPADS, bloquean inespecı́ficamente la mayorı́a de los receptores y por lo tanto son usados
en las primeras etapas de la caracterización farmacológica. Suramina
a concentraciones µM altas (30-100 µM) afecta la actividad de todos
los receptores con excepción de P2Y4 . PPADS y RB-2 también bloquean mas de un subtipo de receptor aun cuando tienen efectos más
pronunciados en P2Y1 y P2Y6 [8] [41].
Receptores P2X
De entre los canales activados por ligandos, los P2X son estructuralmente los más simples. Todos los miembros de esta familia están
conformados por dos subunidades funcionales, un dominio extracelular de alrededor de 280 aminoácidos al cual se une el agonista y
dos dominios transmembrana (TM1 y TM2) que forman el canal iónico, y los dominios N y C-terminal localizados intracelularmente. Esta
estructura es muy similar a la de los canales epiteliales de Na + (Figura 1.9).
Estos canales están conformados como homo y heterodı́meros.
Luego de la clonación de todas las isoformas, diversas aproximaciones sugirieron que estaban formados por varias subunidades P2X. De
hecho, la existencia de 11 heterodı́meros ha sido predicha por los resultados de inmunoprecipitación de Torres en 1999 [58]. Pero hasta
ahora, sólo se han caracterizado 6 heterómeros funcionales: P2X1/2 ,
P2X1/4 , P2X1/5 , P2X2/3 , P2X2/6 y P2X4/6 [59].
La cristalización del receptor P2X4 del pez zebra, confirmó que el
canal estaba conformado por tres subunidades [60], sugiriendo que el
canal tendrı́a tres sitios de unión a ATP. Además, estos sitios están
localizados en la interface de cada unidad, cada una contribuyendo
residuos necesarios para la interacción de la adenina y los grupos fosfatos.
Todos los receptores P2X son permeables a Na+ , K+ y Ca+2 . La
permeabilidad relativa para cada uno de estos iones varı́a según la
subunidad P2X implicada [61], si bien los receptores P2X presentan,
en general, una elevada permeabilidad al Ca+2 , similar o incluso superior a la descrita para los canales activados por acetilcolina o glutamato [62]. La principal consecuencia de la activación de los receptores
P2X es un incremento transitorio en la concentración intracelular de
Ca+2 libre debido, por una parte, a la despolarización de la membrana,
que induce la apertura de canales de Ca+2 dependientes de voltaje, lo
que se suma a la entrada de Ca+2 a través del propio canal P2X. El
14
Figura 1.9: Modelo de la estructura del cristal de P2X4, las tres subunidades
que lo conforman se muestran en distinto color. La molécula de ATP se localiza
en el sitio de unión a ligando predicha por Kawate, 2009. Imagen modificada de
Coddou, 2011 [59]
.
incremento del calcio citosólico dispara posteriormente una serie de
eventos intracelulares, en parte a través de la activación de MAPK,
PKC y calmodulina [57].
La activación de estos receptores consiste usualmente de tres fases, un rápido aumento de la corriente de entrada inducida por la
unión del agonista (fase de activación), un decaimiento lento de la
corriente, en presencia del agonista (fase de desensibilización), y una
caı́da mas rápida de la corriente después de la eliminación del ATP
(fase de desactivación). La gran diferencia entre las isoformas de los
receptores P2X es la sensibilidad a los agonistas, pero sobretodo la
capacidad de activación y desensibilización. Como muestra la Figura 1.10, el perfil de las corrientes de diferentes isoformas en respuesta
a dosis supra-máximas de ATP, es caracterı́stico de cada isoforma. Los
receptores P2X1 y P2X3 , se activan y desactivan rápidamente, mientras que P2X2 y P2X3 tienen una curva de desactivación mas lenta.
El perfil de P2X7 es mas complejo, lo cual queda demostrado por la
aparición de una corriente secundaria, durante la aplicación constante
del agonista.
Todas las isoformas de receptores P2X son activadas por ATP, el
cual es el agonista fisiológico más potente para este tipo de receptores,
con valores de concentraciones de EC50 del rango nano a submilimolar. Los receptores P2X son estructuralmente mas restrictivos que los
receptores P2Y. Además del ATP, sólo compuestos naturales como
15
Figura 1.10: Propiedades electrofisiológicas de los receptores P2X. Después de la
aplicación constante del agonista, se determinaron los perfiles de de activación de
la corriente en células HEK293 que expresaban transitoriamente receptores P2X
de rata. Figura obtenida de Coddou, 2011 [59].
di-adenosina polifosfatos, pueden activarlos con menor potencia. Por
sı́ solos, estos agonistas no pueden ser utilizados para distinguir isoformas de P2X, sin embargo otros nucleótidos trifosfato tales como CTP
y GTP pueden activar también algunas isoformas especificas. Por otra
parte, ADP, AMP y nucleótidos derivados de uracilo, con excepciones
muy puntuales, no son capaces de activarlos. la TABLA 1.11, muestra
el perfil farmacológico de la familia de receptores P2X. Al igual que en
el caso de los receptores P2Y, para el estudio de los receptores P2X, los
antagonistas mas utilizados son RB-2, suramina y PPADS [59] [8] [63].
La Figura 1.11, resume las caracterı́sticas farmacológicas principales
de la familia de receptores P2X.
Figura 1.11: Caracterı́sticas farmacológicas de los receptores P2X
Los receptores homoméricos P2X1 y P2X3 presentan una elevada
afinidad por el ATP, son activados por el análogo sintético de ATP
16
αβ-meATP y sufren una marcada desensibilización, inactivándose totalmente tras 1-2 segundos de exposición al agonista; además, la recuperación del canal tras la desensibilización es extremadamente lenta [4] [63]. Por otra parte, los receptores homoméricos P2X2 , P2X4 ,
P2X5 , P2X6 y P2X7 muestran, en general, una menor afinidad por el
ATP, son insensibles al αβ-meATP (excepto el P2X6 ) y su desensibilización es menos marcada. En este sentido destaca especialmente el receptor P2X7 que requiere concentraciones de ATP inusualmente altas
(>100 µM) para su activación y que no muestra desensibilización tras
varios segundos, e incluso minutos, en presencia del agonista [4] [63].
Otra caracterı́stica distintiva de P2X7 es que, en determinados tipos celulares, la estimulación prolongada del receptor conduce a la
apertura de un poro en la membrana que permite el paso de cationes
de elevado peso molecular (hasta 900 Da). Sin embargo, estudios recientes han mostrado que la formación del poro no es una caracterı́stica intrı́nseca del receptor P2X7 y que dicho poro podrı́a residir en una
proteı́na distinta (probablemente de la familia de las panexinas) con
la que el receptor P2X7 interacciona, directa o indirectamente, tras
su activación [64].
17
1.1.4.
Transportadores de nucleósidos
Los nucleósidos son moléculas clave para el organismo, no sólo por
ser precursores de los nucleótidos, necesarios para la formación de los
ácidos nucleicos, sino también por estar implicados en numerosos procesos metabólicos. Ası́ pues, encontramos nucleósidos formando parte del ATP, permitiendo la traducción de ciertas señales endocrinas,
como ligandos de los receptores purinérgicos. Dos rutas metabólicas
diferentes pueden conducir a la biosı́ntesis de nucleósidos y nucleótidos. La primera de ellas es la sı́ntesis de novo, en la cual tiene lugar
una serie de reacciones anabólicas que comportan gasto energético.
La segunda vı́a de obtención es la ruta de recuperación o salvage, mucho más favorable energéticamente y que implica el aprovechamiento
de las bases nitrogenadas presentes en el organismo o provenientes
de la dieta. Los nucleósidos y nucleótidos son moléculas hidrofı́licas
que difı́cilmente pueden atravesar la membrana plasmática, por lo
que se requiere la presencia de proteı́nas transportadoras especı́ficas.
La existencia de estas proteı́nas, permite no sólo la reutilización de
nucleósidos como mecanismo de eficiencia energética sino también la
regulación de los niveles de nucleósidos biológicamente activos. Esta familia de proteı́nas de membrana plasmática engloba dos tipos
de actividades diferentes, una equilibrativa y a favor de gradiente de
concentración (transportadores de nucleósidos equilibrativos) y otra
actividad concentrativa, en contra del gradiente de concentración y
dependiente de sodio (transportadores de nucleósidos concentrativos).
Transportadores de nucleósidos equilibrativos
Los transportadores de nucleósidos equilibrativos (ENTs) median
la entrada de los nucleósidos a través de la membrana plasmática a
favor de su gradiente de concentración. Son independientes de sodio y
potencialmente bidireccionales, permitiendo tanto la entrada como la
salida del sustrato. A pesar de tener una amplia especificidad de sustrato, transportando tanto purinas como pirimidinas, muestran una
baja afinidad por éstas, presentando constantes aparentes que varı́an
en el rango µM medio-alto (100-800 µM) (Figura 1.12). Este grupo
de transportadores está formado por cuatro miembros. Inicialmente
se describieron dos sistemas de transporte diferenciados por su sensibilidad a nitrobenziltioinosina (NBTI), un análogo estructural de la
adenosina. El sistema es o equilibrativo sensible, que corresponde al
transportador ENT1, es inhibible por concentraciones del orden nM
de NBTI mientras el sistema ei o equibrativo insensible, correspon18
diente a ENT2, el cual es inhibible por concentraciones superiores
a 1 µM (Figura). Además del NBTI, agentes vasodilatadores como
dilazep, dipiridamol o draflazina pueden inhibir ambos sistemas de
transporte, aunque también en este caso, el transportador ENT1 es
más sensible que ENT2. En la Figura 1.12 se muestran los sustratos
naturales afines a cada uno de los transportadores equilibrativos, y las
Km para cada uno de los sustratos. Ambos transportadores median
la entrada tanto de purinas como de pirimidinas, pero ENT1 es más
afı́n para la mayorı́a de sustratos. Además, ENT2 es capaz también de
transportar nucleobases como la hipoxantina pero con menor afinidad
que por los nucleósidos.
Figura 1.12: Sistemas cinéticos de transportadores de tipo equilibrativo y las
entidades moleculares que los identifican.
En los últimos años se ha conseguido clonar los diferentes sistemas
de transporte, lo que ha permitido su estudio individual al disponer
de sistemas de expresión heterólogos como los oocitos de Xenopus laevis, Sacaromices cerevisiae o células de mamı́fero. Estas herramientas, junto con la generación de anticuerpos especı́ficos contra estas
proteı́nas, nos han permitido conocer algunas de sus caracterı́sticas
moleculares, estructurales y funcionales, ası́ como la localización de
estas proteı́nas. El año 1997 se llevó a cabo la clonación del primer
miembro de la que conocemos ahora como familia génica SLC29 a
partir de placenta humana [65] [66]. El cDNA clonado codificaba para una proteı́na glicosilada de 456 residuos, que presentaba todas las
caracterı́sticas funcionales de un transportador tipo es, y que fue llamada hENT1. Se predijo una topologı́a de 11 dominios transmembrana conectados por regiones hidrofı́licas cortas, a excepción de dos
grandes textitloops. Utilizando la clonación por homologı́a a partir de
yeyuno de rata, se consiguió clonar la otra isoforma, rENT2. Cuando
19
se expresó este cDNA en oocitos de Xenopus laevis, se comprobó que
rENT2 mostraba la actividad correspondiente a ei. La topologı́a de
la proteı́na es similar a la descrita para hENT1/rENT1, con la misma estructura de 11 dominios transmembrana pero con diferencias
entre los textitloops (Figura 1.13). Dos grupos de investigación diferentes consiguieron clonar hENT2 de forma casi simultánea a partir de
placenta humana [66] [67]. hENT2 es una proteı́na de 465 aminoácidos con un 46-50 % de identidad con hENT1, localizada además de
en placenta, en cerebro, corazón y tejido ovárico. Su topologı́a es similar a la descrita para hENT1. Recientemente, se han identificado
Figura 1.13: Modelo de la topologı́a propuesta para ENT1.
dos nuevas isoformas aunque distintas a los miembros hasta ahora
conocidos. Estos nuevos miembros, denominados ENT3 y ENT4, se
han encontrado tanto en tejidos humanos como murinos [68] [69]. Las
isoformas humanas ENT3 y ENT4, de 475 y 530 aminoácidos respectivamente, presentan una baja identidad con hENT1, del 29 % y el
18 %, respectivamente. hENT3 se caracteriza por presentar un largo
dominio N-terminal hidrofı́lico (51 aminoácidos) que le confiere una
localización intracelular. hENT3 muestra una amplia especificidad de
sustrato y transporta nucleósidos y adenina con baja afinidad pero es
relativamente insensible a los inhibidores NBTI, dipiridamol y dilazep.
Además, en concordancia con su localización, es altamente dependiente del pH, con un pH óptimo de 5.5 [70]. Por otro lado, la isoforma
hENT4 es la más alejada funcionalmente del resto de miembros de
la familia y, de hecho, inicialmente se catalogó como un transportador de monoaminas y otros cationes orgánicos, denominado PMAT
(Plasma Membrane monoamine Transporter ). Aunque previamente
se habı́a descrito que no transportaba nucleósidos, Barnes y colaboradores (2006) demostraron una leve actividad de transporte a pH 7.5
y un acusado incremento del transporte de adenosina a pH entre 5.5
- 6.5. Este transporte no es dependiente de iones sodio, no es inhibi20
do por NBTI, pero si es inhibido de forma parcial, por dipiridamol y
dilazep [71] [69] [72].
Transportadores de nucleósidos concentrativos
Los transportadores concentrativos (CNTs) median el flujo unidireccional de nucleósidos con un gasto energético asociado al mantenimiento del gradiente transmembrana de sodio. A diferencia de
los transportadores equilibrativos, la ausencia de inhibidores de alta
especificidad para los transportadores concentrativos, obligó inicialmente a clasificarlos según la especificidad de sustrato (Figura 1.14).
Ası́, se identificaron hasta cinco sistemas diferentes (N1-N5). Los sistemas N1, N2 y N3 son ahora reconocidos como los transportadores
CNT2, CNT1 y CNT3, respectivamente. El transportador CNT1 media la entrada de nucleósidos pirimidı́nicos, CNT2 transporta purinas
y uridina, y el transportador CNT3 presenta un amplio espectro de
selectividad, siendo capaz de translocar tanto purinas como pirimidinas. Los dos últimos sistemas, N4 y N5, se han descrito únicamente
en tipos celulares muy concretos y no se han identificado hasta el momento los genes que los codifican. Es probable que estas isoformas
correspondan a variantes de los transportadores ya caracterizados, ya
que la mutación de determinados residuos de la secuencia de CNT1
reprodujo las caracterı́sticas descritas de N4 [73].
En general, los transportadores concentrativos muestran una mayor afinidad por sus sustratos que los equilibrativos, con valores de
Km aparente en el rango µM bajo (1-100 µM). Además, como las
concentraciones de nucleósidos circulantes son mucho menores que los
valores de Km aparente, probablemente estos transportadores no estarán saturados en condiciones normales [74] [75]. Los transportadores
concentrativos son más selectivos que los equilibrativos (Figura 1.14)
y no son inhibidos por NBTI ni dipiridamol aunque a dosis altas de
dipiridamol (mayores a 50µM) se puede producir cierta inhibición.
A pesar de no existir inhibidores de alta afinidad, la clonación
de éstos transportadores se realizó con anterioridad a los equilibrativos, constituyendo la familia génica SLC28. En 1994 se clonó por
primera vez una proteı́na transportadora de nucleósidos de células
de mamı́fero, correspondiente al transportador dependiente de sodio
con actividad N2 [76]. Este cDNA codificaba para una proteı́na de
648 aminoácidos (71 KDa) y fue denominada CNT1. Inicialmente, se
propusieron 14 dominios transmembrana, aunque la topologı́a deducida actualmente es de 11 dominios transmembrana. Un año después
de la clonación del primer transportador concentrativo, Che y co21
Figura 1.14: Sistemas cinéticos de transportadores de tipo concentrativo y las
entidades moleculares que los identifican.
laboradores (1995) clonaron otro sistema concentrativo dependiente
de sodio pero preferente para purinas expresado en hı́gado de rata y
que correspondı́a a la actividad N1, posteriormente renombrada como rCNT2 [77]. La secuencia nucleotı́dica predice una proteı́na de
659 aminoácidos (72 KDa), con una topologı́a de 13 dominios transmembrana. El ortólogo humano de CNT2 fue rápidamente clonado por
dos grupos simultáneamente [78] [79]. La proteı́na hCNT2 presenta un
83 % de identidad con rCNT2 y un 72 % respecto a hCNT1. El último
miembro de la familia SLC29 en ser clonado fue CNT3, el cDNA de
hCNT3 codifica para una proteı́na de 691 aminoácidos (77KDa) y su
homologı́a con los transportadores hCNT1 y hCNT2 es de un 48 % y
47 %, respectivamente, en su secuencia de aminoácidos. La topologı́a
predicha para hCNT3 también fue de 13 dominios transmembrana.
Sin embargo, en la última publicación de Johnson 2012, se mostró la
estructura del cristal de CNT3 de Vibrio cholerae, el cual tendrı́a una
topologı́a de 8 dominios transmembrana. El ortólogo humano además
tendrı́a 3 dominios del extremo amino terminal (los cuales no están en
procariontes). Los tres sistemas de transporte tendrı́an por tanto una
estructura predicha de 11 dominios transmembrana (Figura 1.15) [80].
Figura 1.15: Representación esquemática de la topologı́a de CNT3] de Vibrio
cholerae. Imagen de Johnson, 2012 [80].
22
Regulación de la función de los transportadores de nucleósidos
Análogamente a otras familias de transportadores, los transportadores de nucleósidos están altamente regulados por un gran número
de elementos que incluyen, desde hormonas y factores de crecimiento, hasta efectos nutricionales, hipoxia o progresión del ciclo celular [81] [82] [83] [84]. Diferentes estudios apoyan la idea de que la
regulación de los transportadores de nucleósidos es dependiente del
tejido, ya que un mismo elemento regulador puede actuar en sentidos
contrarios o no tener ningún efecto en tejidos diferentes [85] [86] [87].
Además, la abundancia de los transportadores de nucleósidos en los
diferentes tipos celulares depende en parte de las vı́as que estimulan
la proliferación o diferenciación de las células.
De manera general, podemos afirmar que la expresión de ENT1
se considera constitutiva y el aumento de su expresión se relaciona
con estı́mulos de tipo proliferativo, por lo que sus niveles de expresión suelen ser altos en tumores [88]. Sin embargo, ENT1 no resulta
crucial para la supervivencia celular, tal como demuestra el hecho de
que el ratón knock-out para este transportador sea viable [89]. La
redundancia en el rango de nucleósidos que son sustrato de los diferentes transportadores podrı́a justificar la ausencia de letalidad. Por
su parte, la expresión de los transportadores concentrativos se suelen
relacionar con procesos de diferenciación celular [90].
Los transportadores de membrana pueden ser regulados tanto a
nivel transcripcional como post-transcripcional. En el primer caso, la
tasa de producción de mRNA es modificada provocando cambios en
la cantidad de proteı́na. En el segundo caso la regulación tiene lugar directamente sobre la proteı́na existente, alterando su localización
subcelular, funcionalidad o tasa de degradación.
El conocimiento de la expresión constitutiva y/o regulada de los
transportadores de nucleósidos no sólo permite comprender el rol fisiológico especı́fico de cada miembro sino que también supone una herramienta de estudio de la bioasequibilidad de ciertos fármacos análogos de nucleósidos que depende de la expresión de estos transportadores [91] [92].
Distribución tisular de los transportadores de nucleósidos
Los transportadores de tipo equilibrativo, presentan una distribución tisular ubicua, aunque existe una gran variabilidad en los niveles
de expresión entre los diferentes tejidos [93]. En particular han des23
crito niveles elevados de expresión de mRNA y proteı́na de ENT1 en:
placenta, eritrocitos, cerebro, corazón, hı́gado, pulmón y colon, entre
otros [94] [95]. De igual forma, la distribución de ENT2 se considera
ubicua, aunque es particularmente abundante en el músculo esquelético [65] [67] [94].
Los transportadores equilibrativos juegan un papel importante en
la captación de nucleósidos provenientes de la dieta o producidos por
tejidos como el hı́gado, capaces de llevar a cabo la sı́ntesis de novo de nucleósidos. Ası́, la actividad de los ENTs permite que ciertos
tipos celulares como los eritrocitos puedan proveerse de nucleósidos
desde el medio extracelular y garantizar la cobertura de sus necesidades nucleotı́dicas gracias a la vı́a de salvage. ENT1 y ENT2 también
han demostrado su importancia en el intercambio de nucleósidos en
el cordón umbilical. Se ha relacionado la diabetes gestacional con una
disminución del mRNA de ENT1 y un incremento de la adenosina extracelular en células HUVEC, derivadas de endotelio de cordón umbilical [96]. Asimismo, la exposición de estas mismas células a estı́mulos
hipóxicos (1-2 % de O2) provoca una disminución de la actividad de
ENT1 que se acompaña también de una disminución del mRNA y de
la proteı́na [97].
La coexistencia de ENT1 y ENT2 en un mismo tipo celular ha
sido tradicionalmente difı́cil de justificar dado que ambos transportadores presentan una especificidad muy similar que comportarı́a cierta
redundancia. No obstante, pequeñas diferencias en la afinidad parecen
podrı́an justificar la presencia de ambos. Trabajos previos de nuestro
grupo de investigación muestran el papel de ENT1 en la proliferación
de macrófagos inducida por M- CSF [81]. A ENT1 también se le ha
atribuido un papel en la respuesta a la intoxicación etı́lica [89]. Por
otro lado, la capacidad de hENT2 de transportar nucleobases como la
hipoxantina podrı́a asignar a este transportador una mayor relevancia en el caso de la recuperación de purinas por el ahorro energético
que supone, aun cuando recientemente ha sido propuesto que ENT1
podrı́a trasnportar nucleobases [98]. Se ha sugerido que la mayor afinidad de ENT2 por la inosina justificarı́a su papel en la captación y
eflujo de los metabolitos de la adenosina en el músculo [67].
ENT3 también se expresa en numerosos tejidos, aunque es particularmente abundante en placenta. A diferencia de ENT1 y ENT2,
su localización es mayoritariamente intracelular y parece intervenir
en la translocación de nucleósidos a través de la membrana lisosomal,
hecho que justifica la gran dependencia de su actividad con el pH,
presentando una actividad óptima a pH 5,5 [70]. Se le asigna, pues,
una posible función en la degradación de los nucleósidos derivados de
24
los ácidos nucleicos, ya que los lisosomas han mostrado ser el principal
lugar de degradación del RNA [99]. ENT4 se expresa cuantiosamente
en la membrana ventricular de los miocitos y en las células endoteliales
vasculares, donde se le asigna un papel en el transporte de serotonina y en la regulación de la concentración de adenosina extracelular,
particularmente en situaciones acidóticas asociadas con isquemia [71].
De los transportadores concentrativos, CNT1 ha sido detectado
en homogenizados de hı́gado y riñón y en menor medida en intestino
delgado, corazón, pulmón, tejido adiposo marrón y páncreas. Por otra
parte, se ha demostrado también la presencia de CNT2 en estos tejidos
citados y además en: cerebro y en músculo esquelético, pero con un
perfil de expresión más homogéneo. Esta familia también se expresa en
células del sistema inmunitario. Los linfocitos B presentan actividad
de tipo CNT2 [100] y la proteı́na de CNT1 y CNT2 se detecta por
inmunoblotting en macrófagos de médula ósea en ratones [81] [101].
El último de los transportadores concentrativos clonado fue CNT3,
contrariamente a lo que se creı́a, se encuentra ampliamente representado en muy diversos tejidos, con una distribución incluso más amplia
que los anteriores. El patrón de distribución de hCNT3 fue investigado
utilizando un array de RNA con cDNA de 76 tejidos y lı́neas celulares.
El resultado fue una gran cantidad de tránscritos en glándula mamaria, médula ósea, tráquea y páncreas; también se detectó en intestino,
hı́gado, pulmón, placenta, próstata, testı́culos y diferentes partes de
cerebro y corazón, aunque los niveles son moderados o bajos [102].
El estudio de distribución de los diferentes transportadores en rata
y ratón al que se ha hecho mención anteriormente ha demostrado que
el patrón de expresión de CNT3 parece ser diferente en ambas especies
[103]. En ratas, los niveles más elevados de mRNA se han detectado en
pulmón, siendo dicha expresión un 87 % (superior en machos respecto
a hembras). En ratones, en cambio, los niveles de mRNA más elevados
se encuentran en útero, mientras que en el pulmón son bajos. En
ambas especies se ha encontrado una expresión moderada en testı́culo,
prótata, ovario, cerebro, pituitaria y estómago y baja en el resto de
tejidos, aunque en ratón también se observa una moderada expresión
en intestino delgado, que en rata es difı́cilmente detectable. También
resultan claras las diferencias entre estas especies y la humana, como
en el caso del hı́gado o la médula ósea, tejidos en los que mCNT3 y
rCNT3 no parecen expresarse [103].
El papel fisiológico de los transportadores concentrativos es especialmente relevante en tejido epitelial renal e intestinal. El análisis
de expresión de mRNA en estos tejidos muestra que CNT1 y CNT3
son más abundantes en riñón, mientras que en intestino la expresión
25
de CNT2 es 20 veces superior a la del resto de transportadores [104].
Asimismo, experimentos de inmunoblotting e inmunohistoquı́mica han
permitido identificar la presencia de CNT1 exclusivamente en la membrana apical de las células epiteliales absortivas, no detectándose marcaje en la membrana basolateral [105]. De hecho, tanto los estudios
funcionales como los de inmunodetección parecen confluir hacia un
modelo de distribución asimétrica en el cuál los transportadores equilibrativos se sitúan en el polo basolateral y los concentrativos en el
lado apical de la célula [106] [107]. Esto asignarı́a a los transportadores
concentrativos una relevancia particular en la absorción de nucleósidos
provenientes de la dieta o del filtrado glomerular.
En el hı́gado, los transportadores concentrativos se distribuyen de
otra forma. En este caso, CNT1 se sitúa en el dominio apical, en
contacto con el canalı́culo biliar, desempeñando un papel en la absorción de nucleósidos provenientes de la acción de ectonucleotidasas. En
cambio, CNT2 se sitúa preferentemente en el dominio basolateral, correspondiente al dominio celular en contacto con el sinusoide hepático,
por el cuál circula la sangre proveniente de la circulación hepática y
porta [108].
En el riñón de rata, se ha visto una distribución segmental de los
transportadores concentrativos. En el glomérulo donde es necesaria
una alta capacidad de reabsorción de nucleósidos, se expresan lasy
tres isoformas estarı́an contribuyendo al clearance renal. Sin embargo,
en las zonas en donde la adenosina tiene un rol importante en la
regulación de la función renal (por ejemplo en el túbulo colector),
sólo se encontró expresión de CNT2 y CNT3, lo cual sugiriere una
contribución anexa de estos transportadores en la modulación de las
concentraciones extracelulares de adenosina [109] .
Regulación del transporte de nucleósidos en el hı́gado
Las células parenquimales del hı́gado son la mayor fuente de nucleótidos en el cuerpo, por lo tanto los hepatocitos juegan un rol importante en la distribución de éstos al resto del organismo. De hecho,
el estadio de diferenciación de los hepatocitos puede determinar el
perfil de expresión de los transportadores de nucleósidos.
Los estudios realizados con hepatocitos aislados de fetos, de neonatos o de ratas adultas, muestran que unas células altamente replicativas como los hepatocitos fetales presentan una mayor actividad
equilibrativa mayoritariamente sensible a NBTI (ENT1), la cual es
casi negligible o nula en hepatocitos neonatales o adultos [110]. En
hepatocitos neonatales la mayor parte de la actividad es insensible
26
a NBTI (ENT2) mientras que en hepatocitos adultos, la actividad
mayoritaria es concentrativa (CNT). Este patrón de expresión, según
las necesidades replicativas, se ha corroborado en una lı́nea celular
derivada de hepatoma de rata, en la que tanto ENT1 como ENT2
se encuentran altamente expresados [90]. También se ha descrito la
pérdida selectiva de las isoformas CNTs en dos modelos de hepatocarciogénesis en rata [111].
Se ha observado también, regulación de tipo nutricional en los
transportadores concentrativos en el hı́gado de forma opuesta a la
regulación observada en intestino delgado. Se ha visto que CNT1 es
sensible a la disponibilidad de nutrientes en el intestino delgado, ya
que su expresión se veı́a incrementada en la superficie del epitelio
intestinal en ratas mantenidas en ayuno durante 48 horas, con un
correspondiente aumento en la actividad sodio-dependiente. Parece
que el responsable de estos efectos son los nucleótidos de la dieta, ya
que si se administra a las ratas una dieta libre de nucleótidos, también
se observa un incremento de la expresión de CNT1 [112].
En la lı́nea celular FAO, derivada de hepatoma de rata, el transportador es regulado de forma dependiente del ciclo celular [84]. Además,
durante la regeneración del hı́gado después de una hepatectomı́a parcial se observó un incremento en los niveles de proteı́na de los transportadores CNT1 y CNT2 [113], explicando de este modo por qué la
actividad de transporte sodio-dependiente se induce significativamente durante la fase pre-replicativa de la regeneración hepática [114].
Después de una lesión de hı́gado, se requiere una gran cantidad de
citoquinas o factores de crecimiento para iniciar y mantener la proliferación del hepatocito. Dos de estas citoquinas, el TNF-α y la IL-6,
fueron estudiadas en la lı́nea celular FAO y en células parenquimales hepáticas. Ambos factores indujeron tanto la expresión como la
actividad CNT1, pero por mecanismos diferentes, jugando el TNF-α
un papel de modulador prioritario y la IL-6 secundario [115]. Sin embargo, el transportador CNT2 permaneció insensible a estos factores,
aunque fue altamente regulado por el agente pro-apoptótico TGF-β1,
a través de la vı́a JNK [116].
Como se ha comentado anteriormente, CNT2 es un transportador
de alta afinidad para adenosina, de forma que puede ser un buen candidato para regular los niveles de adenosina extracelular. En la lı́nea
celular FAO y en células parenquimales hepáticas, se ha demostrado
que CNT2 está bajo control purinérgico vı́a el receptor A1 , de una manera dependiente de los canales KAT P [115]. En el mismo modelo se ha
demostrado, que el tratamiento con ácidos biliares aumenta también
la actividad CNT2, lo cual resulta en un aumento del transportador
27
Figura 1.16: Modelo de la regulación del transporte de nucleósidos en el hepatocito. Imagen adaptada de la Tesis doctoral de Pedro Cano.
en la membrana plasmatica [117]. Todos estos datos nos llevan a concluir que la regulación de los transportadores de nucleósidos en hı́gado
es un complejo y coordinado proceso en el que intervienen diferentes
factores y vı́as.
Regulación del transporte de nucleósidos en otros epitelios
Tal como ya se ha mencionado, se ha sugerido una distribución
asimétrica de los transportadores, según la cuál los transportadores de
tipo concentrativo se situarı́an preferentemente en la membrana apical
(hacia el lumen intestinal) y los ENTs en la membrana basolateral
[105].
Dado que un gran número de transportadores son regulados por su
propio sustrato, los primeros estudios de regulación en tejido intestinal
se realizaron a este nivel, los cuales mostraron que la expresión de
CNT1 en intestino delgado depende de la disponibilidad de sustrato.
Ası́, el análisis in vivo en parénquima hepático y yeyuno mostró un
incremento en la expresión y actividad del transportador pirimidinopreferente tras un ayuno de 48 h [112].
En las células IC-6 (un modelo de enterocito), la presencia de
factores mitogénicos aumenta selectivamente la expresión de ENT1,
tanto a nivel de mRNA como de actividad. En cambio, en este mismo
modelo la inducción de la diferenciación mediada por glucocorticoides
incrementó la expresión de mRNA, proteı́na y actividad de CNT1 y
CNT2 [118]. Además, se ha definido un mecanismo de regulación rápida dependiente del estado energético celular. La adición de adenosina
al medio extracelular provoca la activación de la quinasa dependiente
de AMP (AMPK), efecto que puede ser bloqueado por la inhibición
28
del sistema de transporte CNT2 con el análogo de adenosina no metabolizable formicina B [119].
Como ya se ha descrito previamente, en el riñón, los transportadores de nucleósidos intervienen en la absorción de éstos a partir del
filtrado glomerular. En el epitelio renal se expresan tanto los componentes concentrativos como los equilibrativos, actuando de forma
secuencial para permitir un flujo transepitelial neto de nucleósidos que
permite la reabsorción desde el túbulo renal [120].
Este proceso afecta consecuentemente la concentración sanguı́nea
de estos compuestos, lo cual es posible gracias a la distribución asimétrica de los transportadores. Esta distribución consiste en un predominio
de CNTs en el dominio apical, y una expresión mayoritaria de ENTs
en la membrana basolateral. Cabe destacar, no obstante, que mientras que CNT1 y CNT3 están completamente confinados al dominio
apical, parte de CNT2 se encuentra en la membrana basolateral [121].
Recientemente, CNT3 ha demostrado ejercer un papel importante
en el flujo de nucleósidos a través del epitelio renal, afectando no sólo
a la biodisponibilidad de nucleósidos naturales sino también la de
sus derivados farmacológicos. Adicionalmente, esto demuestra que la
vı́a de entrada del nucleósido afecta directamente su metabolismo, de
forma que mientras los transportadores equilibrativos, mayoritarios en
el dominio basolateral, se encargan de la translocación del nucleósido,
los transportadores concentrativos están coordinados con los enzimas
del metabolismo de nucleósidos, permitiendo su catabolismo hacia la
obtención de nucleobases [122].
1.1.5.
Ectonucleotidasas: enzimas metabolizadoras de
nucleótidos
Las ectonucleotidasas son una familia de enzimas con capacidad
de metabolización de nucleótidos, que se encuentran localizadas en la
membrana plasmática y tienen sus sitios activos orientados hacia el
exterior celular [123]. Estas proteı́nas actúan removiendo los grupos
fosfatos de los nucleótidos hasta la formación secuencial de adenosina, por lo tanto tienen el potencial de disminuir las concentraciones
de nucleótidos en favor de las de nucleósidos, modulando la biodisponibilidad de los ligandos de receptores P1 y P2 [5]. Es por esto que
representan una forma de comunicacion purinérgica. Además de este
rol, estas enzimas producen las moléculas necesarias para las vı́as de
salvage de purinas en numerosos tipos celulares [124].
Existen cuatro familias de ectonucleotidasas (Figura 1.17):
Las ectonucleotidasas trifosfato difosfohidrolasas (E-NTPDasa) que
29
hidrolizan nucleósidos tri y di-fosfatos extracelulares. Esta familia
tiene cuatro miembros localizados en la membrana plasmática (ENTPasa 1,2,3,8) entre estos, la E-NTPasa 1, es también conocida como CD39.
La siguiente familia corresponde a las pirofosfatasa/fosfodiesteras
(E-NPP), que pueden hidrolizar pirofosfatos o enlaces fosfodiester,
metabolizando ATP a AMP y difosfatos. Esta familia tiene siete miembros (NPP1-7).
La Ecto-5’-nucleotidasa/CD73, es la enzima responsable de terminar la cascada de fosforilación a adenosina, ya que hidroliza el nucleósidos monofosfatos (AMP) a adenosina.
Finalmente, la última familia esta formada por las Fosfatasas alcalinas (APs), las cuales son hidrolasas que remueven el grupo fosfato
de la posición 5’- y 3’- de una gran variedad de moléculas, que incluyen nucleótidos, proteı́nas y alcaloides. Como su nombre sugiere, estas
enzimas son mas efectivas en microambientes alcalinos [125] [123].
Figura 1.17: Representación del rol de las cuatro familias de ectonucleotidasas
en la degradación del ATP. Imagen modificada de Fields y Burnstock, 2006 [53].
La contribución de las distintas ectonucleotidasas a la modulación
de la señal purinégica, depende no sólo de la disponibilidad y preferencia de sustratos, sino que también de su distribución en distintos
tejidos y tipos celulares. Estas enzimas tienen una distribución tisular
amplia y redundante, con gran diversidad entre distintos miembros
de la misma familia. Debido a esto, es difı́cil asignar mecanismos concretos de regulación purinérgica a enzimas especı́ficas. Aun cuando,
la familia de CD39 ha mostrado tener un rol crı́tico en la modulación
de los niveles de nucleótidos circulantes en las células endoteliales,
30
limitando la activación de receptores P2 expresados en las plaquetas
y leucocitos, y generando adenosina para revertir los eventos inflamatorios [126]. En los hepatocitos, alteraciones en la expresión de
CD39 tienen impactos directos en el metabolismo hepático, los mecanismos de regeneración y las respuesta inmune mediadas por la señal
purinérgica [125] [5].
1.1.6.
Interacciones directas de elementos del purinoma
La gran mayorı́a de fenotipos celulares expresan simultáneamente
una combinación selectiva de diferentes receptores tanto P2, como P1,
además de un pool de diferentes ectonucleotidasas, y diversas rutas de
secreción de nucleótidos y transporte de nucleósidos [5] [127] [10] [128].
Además, la señal purinérgica no es sólo regulada por los elementos
que componen el purinoma, sino que está bajo el control de una gran
variedad de interacciones directas e indirectas. Ejemplo de esto son las
bien establecidas formación de homo-hetero oligómeros entre subunidades de receptores P2Y y P2X, además de las interacciones de entre
receptores P2 y P1, y el gran número de evidencias de la formación
de heterómeros de receptores de adenosina con receptores de dopamina, adrenérgicos o de NMDA [129]. Estudios recientes muestran que
también las E-NTPasas pueden asociarse entre ellas, y con receptores
P1 y P2Y. [6].
Todos estos antecedentes indican que el purinoma no es sólo una
juxtaposición de unidades purinérgicas, sino que es un sistema de
cross-talk molecular complejo y dinámico. Y por lo tanto, este concepto también podrı́a incluir enzimas como la ecto-adenosina deaminasa
o la ecto-purina nucleósido fosforilasa, responsables de la degradación
de adenosina a inosina e hipoxantina, respectivamente. Además, hoy
es claro que las enzimas intracelulares que regeneran el ATP (adenilato quinasa, nucleósido difosfato quinasa y ATP sintasa) pueden ser
también co-expresadas en la superficie celular [130], y por lo tanto
también podrı́an ser consideradas parte del purinoma.
31
1.2.
1.2.1.
Epitelio biliar: colangiocitos
Fisiologı́a del tracto biliar
El tracto hepatobiliar es la estructura histológica y funcional que
comienza en los canalı́culos biliares del hepatocito, donde la bilis es
generada, y continúa por los conductos biliares, donde su composición
es modificada por los colangiocitos durante su paso hacia el intestino.
El parénquima hepático está conformando lobulillos hepáticos, en
donde los hepatocitos se disponen en forma radiada en torno a una
vena central, ubicada en el centro del lobulillo (Figura 1.18). Los hepatocitos, el tipo celular más abundante del hı́gado (65 % del total),
son células polarizadas, con el dominio basolateral o sinusoidal hacia
el tracto vascular, y un dominio apical que forma el canalı́culo.
Otro de los tipos celulares presentes en el hı́gado es el colangiocito.
Estas células constituyen una población minoritaria (aproximadamente 5 % del total de la población), y corresponden a las células que conforman los conductos biliares. Los colangiocitos son células epiteliales
y polarizadas, con un dominio basolateral que encara la circulación y
un dominio apical o luminal que encara el lumen del conducto biliar.
Figura 1.18: Estructura del parénquima hepático: Lóbulos hepáticos con venas
centrolobulillares y espacios porta. Imagen modificada del Instituto John Hopkins
El sistema biliar intrahepático humano esta formado por una red
tri-dimensional de conductos biliares de distintos tamaños, que se extienden desde los canales de Hering hasta los conductos extrahepáticos. Los canales de Hering corresponden a los conductos biliares mas
32
pequeños, que se encuentran adyacentes a la membrana canalicular
de los hepatocitos, y por lo tanto reciben directamente la bilis formada por estos. Además de estos, los conductulos, los conductos interlobulares y los conductos septales constituyen los denominados pequeños conductos del sistema intrahepático, que van confluyendo en
conductos de mayor tamaño, hasta converger en dos grandes conductos hepáticos. Estos últimos, reciben la bilis procedente de los lóbulos
derecho e izquierdo, y se unen en el conducto hepático común hasta el colédoco, que desemboca directamente en el duodeno. Entre el
conducto hepático común y el colédoco se sitúa el conducto cı́stico,
que conduce a la vesı́cula biliar, donde se almacena la bilis durante
los periodos en que no hay digestión. El colédoco se une al conducto
pancreático para drenar la papila duodenal mayor, ubicada en la cara
interna del duodeno.
Los conductos septales de mayor tamaño, los conductos hepáticos
y el colédoco conforman el denominado sistema biliar de grandes conductos, en donde se desarrollan las principales enfermedades de origen
biliar y que ha sido más estudiado (Figura 1.19).
Figura 1.19: Estructura del tracto biliar. El epitelio biliar está compuesto por
múltiples segmentos que van aumentando su diámetro y que tienen diferentes propiedades funcionales. Imagen modificada de Strazzabosco, 2000 [131].
Aun cuando, la red de conductos biliares intrahepáticos tienen
caracterı́sticos tı́picas, que son utilizadas como marcadores de tejido
epitelial biliar, tales como citoqueratina-7 (CK-7) y CK-19, existe una
heterogeneidad en relación a su diámetro, que va aumentando a lo
largo del conducto.
33
La heterogeneidad del árbol biliar se ve reflejada en su funcionalidad. Muchas de las proteı́nas claves en la función secretora del
colangiocito, tales como el intercambiador de aniones Cl− /HCO3 − ;
AE2, el canal de Cl− estimulable por cAMP; CFTR y el receptor de
la hormona secretina, son exclusivamente expresados en los conductos
biliares intrahepáticos medianos y grandes (interlobulillares y septales
iniciales) pero no en los conductos pequeños [132].
En cuanto a propiedades proliferativas, el sistema biliar es también heterogéneo ya que los colangiocitos grandes proliferan de modo
dependiente a la señalización por cAMP, mientras que los colangiocitos pequeños lo hacen por estı́mulos de receptores de histamina y
señalización mediada por Inositol trifosfato (InsP3 o IP3)/Ca+2 [133].
Formación de la bilis, rol del colangiocito
Los hepatocitos son la población celular que genera y secreta la
bilis primaria a través del canalı́culo biliar [134]. Como complemento
a esta función, los colangiocitos a través de una serie de procesos
secretorios o absortivos, diluyen y alcalinizan el fluido biliar [135],
[136].
La bilis primaria está compuesta por sales biliares y solutos orgánicos e inorgánicos. Entre los compuestos orgánicos hay una alta proporción por ácidos biliares, fosfolı́pidos, colesterol, pigmentos biliares,
glutation, ATP y proteı́nas. Por otra parte, los principales compuestos
inorgánicos son: HCO3 − , Cl− , Na+ , K+ y Ca+2 [137]. La composición
y concentración de cada uno de todos estos solutos va cambiando a lo
largo del tracto hepatobiliar.
Debido a esto, se pueden distinguir tres tipos de bilis i) la bilis
canalicular, la cual es la recién formada por el hepatocito ii) la bilis
ductular, que se encuentra en proceso de fluidificación y alcalinización
a lo largo de los conductos biliares intrahepáticos, antes de llegar a la
vesı́cula a través del conducto hepático y iii) la bilis vesicular, que es
la que se acumula y transforma en la vesı́cula biliar para ser expulsada
finalmente al duodeno a través del colédoco.
Existen tres tipos de flujo biliar, que comprenden una serie de
mecanismos que aseguran un correcta composición de la bilis. Estos
componentes son: el flujo biliar dependiente de sales biliares, generado en los hepatocitos, los cuales secretan de ácidos biliares y agua
al canalı́culo biliar. Se estima que un 50 % de todo el flujo biliar canalicular tiene lugar por este mecanismo, representando algo más del
33 % del flujo biliar total. El segundo componente es el flujo biliar
independiente de sales biliares, que también ocurre en la membra34
na canalicular y que se constituye por la secreción de una serie de
compuestos orgánicos e inorgánicos. Finalmente el tercer componente
corresponde al flujo del conducto biliar, que produce una parte del
flujo independiente de sales biliares pero que es llevado a cabo por los
colangiocitos. Los cuales, en respuesta a señales hormonales o factores
regulatorios, secretan un flujo enriquecido en HCO3 − [138] [135].
Figura 1.20: Sistemas de transporte involucrados en la formación de la bilis.
Imagen adaptada de Kullak-Ublick, 2003 [139].
Las sales biliares de la bilis se encuentran circulando entre el hı́gado y el intestino, en la sangre portal, a través de la circulación enterohepática. En el dominio basolateral del hepatocito, el principal
transportador estas sales biliares conjugadas es NTCP (sodium dependent bile salt transporter, SLC10A1). Paralelamente a este proceso, la
reabsorción de los componentes del flujo biliar independiente de sales
biliares, lo realizan transportadores OATPA, OATPC y OATP8 de
la familia SCLO. Durante el trayecto intracelular hacia la membrana
canalicular, los ácidos biliares son conjugados con glicina y taurina,
este tránsito citoplasmático se realiza por medio de microvesı́culas
relacionadas con el aparato de Golgi y con la participación de los
microtúbulos [140] [141] [142].
En la membrana canalicular del hepatocito, la secreción de sales
biliares monovalentes es mediada por BSEP (bile salt export pump,
ABCB11), mientras que la secreción de aniones orgánicos como bilirrubina, acido glucurónico y sales biliares sulfatadas o glucuronizadas es mediada por MRP2 (multidrug resistance associated protein,
35
ABCC2). La secreción biliar de fosfolı́pidos y colesterol se hace a
través de MDR3 (ABCB4) y ABCG5/ABCG8, respectivamente. La
salida masiva de moléculas, origina un gradiente de concentración superior en el fluido biliar que en la sangre portal, lo cual supone disponibilidad de fuerza osmótica y salida de agua hacia el lumen canalicular.
Una vez generada, la bilis canalicular es diluida y alcalinizada en
su paso por el sistema biliar. Y aun cuando la proporción de colangiocitos es pequeña en comparación con la de hepatocitos, su capacidad
secretora es muy efectiva, ya que son responsables del 30-40 % del
volumen biliar total [143]. Estas modificaciones en la composición de
la bilis, mediadas por los colangiocitos, son resultado de la secreción
activa de osmolitos, fundamentalmente HCO3 − y Cl− .
Los colangiocitos pueden también, absorber sales biliares desde
el lumen del conducto biliar. Para esto expresan en la membrana
apical el transportador ASBT(apical dependent bile salt transporter,
SLC10A2). En el dominio basolateral, por otra parte expresan MRP3
que media la salida de sales hacia el plexo capilar perilobular [139].
1.2.2.
Mecanismos de regulación de la secreción del colangiocito
Secreción mediada por secretina
Una de las más importantes y mejor estudiadas funciones del colangiocito es la secreción de HCO3 − , estimulada por secretina. Los
receptores de secretina pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteı́na G y luego de su activación, la señal intracelular ocurre
vı́a ACs y PKA [144].
La secretina es un péptido con propiedades neuroendocrinas, que
es sintetizado por las células S de la mucosa del duodeno y el yeyuno
proximal. La secretina estimula la secreción de pepsina e inhibe la de
los ácido gástricos y de la gastrina. Además, afecta la motilidad del
intestino delgado, disminuye la presión del esófago, relaja el esfı́nter
de Oddi e inhibe el vaciamiento post-prandial. Esta hormona regula
además, las funciones fisiológicas de muchos órganos, tales como el
cerebro, páncreas, intestino e hı́gado [135].
En el hı́gado, los receptores de secretina son expresados exclusivamente por los colangiocitos en su dominio basolateral, y su unión al
receptor estimula la secreción biliar a través de una serie de eventos
coordinados.
En un comienzo, la unión de la secretina induce un incremento del
cAMP intracelular lo cual activa la PKA. Subsecuentemente, la PKA
36
fosforila a CFTR, lo cual induce la apertura de este canal de Cl− y
la secreción de este anión en la membrana apical de las células, causando una depolarización de la membrana. El flujo de Cl− generado
por CFTR, crea una gradiente de Cl− que favorece por una parte la
activación de los intercambiadores Cl− /HCO3 − (AE2), y la salida de
agua a través de aquaporina -1 (AQP-1), ambos mecanismos resultan
en un flujo neto de HCO3 − y agua hacia el lúmen biliar.
Figura 1.21: Regulación de la secreción de bicarbonato mediada por secretina en
el colangiocito. Imagen adaptada de Glaser, 2009 [145].
Además de la activación de PKA, otra proteı́na blanco del aumento de cAMP intracelular, Epac (exchange proteins activated directly
by cyclic AMP ), puede regular también la función del canal de Cl− ,
independiente de la acción de la PKA [146]. La participación de Epac
no ha sido directamente relacionada con la activación de CFTR en
colangiocitos. Sin embargo, reportes recientes muestran la activación
de isoforma 2 de Epac está relacionada al mecanismo que regula el
aumento de cAMP intracelular mediado por receptores purinérgicos
en las funciones quimio-sensoras del cilio [147]. Este tema se discutirá más adelante.
La vı́a de señalización dependiente de Epac, aún no ha sido completamente dilucidada, pero en hepatocitos se ha descrito que en la
vı́a downestream de Epac, se activan proteı́nas tales como LKB1 y
AMPK [148].
Como consecuencia de la despolarización inducida por la salida de
−
Cl , hay también entrada de HCO3 − desde el dominio basolateral hacia el citoplasma. Esta entrada es mediada por el intercambiador AE2,
lo cual contribuye a mantener el pH intracelular en rangos fisiológicos.
La secretina estimula directamente la apertura del canal CFTR,
pero no regula directamente ni el intercambiador Na+ /HCO3 − , ni el
37
intercambiador Na+ / H+ (NHE-3) [149].
El incremento del cAMP intracelular desencadena una respuesta
paralela a la activación directa del canal CFTR presente en el dominio
apical. Frente al estı́mulo colerético de la secretina, se activa el tránsito
de vesı́culas hacia la membrana apical donde se produce la exocitosis
de sus componentes. Estas vesı́culas están enriquecidas en AQP-1,
AE2 y CFTR , que se encuentran en su estado basal (no activado). El
mecanismo es rápido, ya que estas células tienen una alta capacidad
de recambio. Este movimiento vesicular resulta en una amplificación
de la respuesta secretora activada por cAMP [150] [151] [152].
Factores que regulan la secreción mediada por secretina
El ganglio celı́aco y el nervio vago inervan simpáticamente y parasimpáticamente el hı́gado. Adicionalmente, la presencia de la arteria
hepática y la vena porta suman a esta inervación mecanismos de regulación del epitelio biliar y las células del parénquima hepático. El
sistema parasimpático ejerce una modulación directa de la secreción
mediada por secretina. En 1996, Nathanson et al. demostraron que
la acetilcolina (ACh) inducı́a un aumento de Ca2+ , causado por un
aumento de entrada de Ca2+ y movilización de reservorios de Ca2+ sensibles a tapsigargina [153].
La liberación de ACh, llevará a su interacción con los receptores
M3 en el dominio basolateral del colangiocito, induciendo un aumento
de la secreción estimulada por secretina, debido a un aumento de la
actividad de AE2 por un mecanismo mediado por Ca2+ -calcineurina
y activación de ACs independiente de PKC [154]. La interrupción de
los mecanismos regulados por el sistema parasimpático en el hı́gado,
vagotomı́a total, disminuyó la expresión del receptor M3 y el de de
secretina, y la secreción del flujo biliar mediado por esta hormona en
el colangiocito [155].
Otro de los factores involucrados en la modulación de la secreción
del flujo biliar, es la presencia de APs. Los colangiocitos están continuamente expuestos a altas concentraciones de APs en la bilis [156].
La administración aguda de AP al dominio apical del colangiocito,
disminuyó tanto la secreción basal, como la estimulada por secretina,
lo cual serı́a resultado la inhibición de la actividad de AE2 [157]. Cabe
destacar que este efecto fue dependiente de la exposición prolongada
de AP al dominio basolateral del colangiocito. Se postula que este
efecto es mediado por un bloqueo de la actividad del canal CFTR o
al aumento de la hidrólisis del ATP presente en la bilis [157]. Estos
resultados fueron los primeros indicios de un rol importante del ATP
38
presente en el plasma y la bilis, en la función secretora del colangiocito [157] [135].
Las hormonas gastrointestinales: gastrina y somatostatina, son
también importantes factores en la inhibición de la secreción biliar
producida por secretina. Por una parte la inhibición mediada por la
gastrina, es debida a la activación de la vı́a de la PKC, que inhibe el
aumento de los niveles de cAMP generado por la secretina. La unión
de somatostatina a los receptores de tipo SSTR2, inhibe directamente
la generación de cAMP, y por tanto la activación de los canales de
Cl− , y de AE2 [135].
Otros factores son capaces también de modular el flujo de bicarbonato y agua generado por la activación del receptor de secretina. Entre
estos se encuentran algunos péptidos; endotelina (ET-1), el péptido intestinal vasoactivo (VIP), y la sustancia P. Los ácidos biliares también
tienen la capacidad de regular de secreción, a través de la modulación
de la actividad de ASBT (Ver la sección 1.2.1). Otras moléculas como
el Óxido nı́trico y las citoquinas IL-5 y IL-6, tienen capacidad de modular los mecanismos de secreción desencadenados por secretina [135].
Es importante notar, que la población de colangiocitos es heterogénea a lo largo del árbol biliar, hecho que se ve reflejado también
en su funcionalidad. Ejemplo de esto, es que los colangiocitos que
conforman los conductos mas pequeños (colangiocitos pequeños), no
expresan el receptor de secretina y por lo tanto no responden a ella.
Si bien son capaces de secretar agua y bicarbonato al lumen biliar,
a través de la activación de AE2 y CFTR, la regulación de sus funciones se realiza mediante la activación de otros elementos. Entre los
que destacan, receptores de dopamina (D2 ), receptores adrenérgicos,
de insulina y de ETs. La activación de estas señales activarı́a la secreción a través de un mecanismo dependiente del aumento de Ca2+
intracelular [158] [133].
Secreción mediada por la señal purinérgica
La señal purinérgica ha emergido como una importante vı́a en la
regulación de la formación y secreción biliar. Aun cuando la presencia
de ATP en la bilis es conocida desde hace tiempo [160], sólo en los
últimos años se ha determinado que esta molécula es liberada a la bilis
tanto por hepatocitos como por colangiocitos en respuesta a estı́mulos
de origen mecánico y a cambios de volumen celular [161] [162] [163].
En el dominio apical del colangiocito se ha encontrado expresión
de una gran variedad de receptores P2Y: P2Y1 , P2Y2 , P2Y4 , P2Y6 ,
además del receptor P2Y12 presente en el cilio. En el dominio basolate39
Figura 1.22: Heterogeneidad de la funcionalidad de las poblaciones de colángiocitos del árbol biliar. Imágen modificada de Alpini, 2004 [159].
ral, por otra parte, la identidad molecular de los receptores purinérgicos no ha sido determinada, ya que la señal purinérgica es rápidamente
atenuada por la acción de ectonucleotidasas. Además, se sabe de la
expresión funcional de P2X4 , aun cuando su ubicación no es clara y no
se descarta la presencia de P2X6 [164]. Estos antecedentes, permiten
suponer que estas células podrı́an ser activadas no sólo por ATP, sino
que por una mayor variedad de nucleótidos [165].
El ATP extracelular activa a los receptores P2 de la membrana
apical del colangiocito, lo cual a través de un mecanismo dependiente
de PI3K y PKC [166] [167], induce un incremento de Ca2+ intracelular
y activa los canales de K+ de conductancia intermedia y pequeña [168],
y los canales de Cl− activados por Ca2+ [169]. Aun no es claro, el
rol del canal CFTR en esta vı́a de secreción, ya que en la población
celular de colangiocitos pequeños (que no expresan CFTR) es posible
observar una potente respuesta secretora al estı́mulo del ATP [163].
Adicionalmente, ambas poblaciones de colangiocitos son capaces de
40
secretar ATP por un mecanismo dependiente de tráfico vesicular y en
donde muy recientemente se ha descrito la participación de VNUT
[170].
Figura 1.23: Modelo de la señal purinérgica a través del conducto biliar intrahepático. Imagen modificada de Woo, 2010 [163].
Mecanismos de regulación del cilio
La presencia de un cilio primario fue descrita en los años 60-70ś,
sin embargo su importancia fisiológica no fue descrita hasta hace pocos años [171] [172]. Toda la población de colangiocitos (grandes y
pequeños) tiene un cilio primario que proyecta hacia el lumen biliar.
Esta ubicación estratégica le permite detectar cambios en el flujo, la
composición y la osmolaridad del fluido biliar. Es decir, estos organelos tienen un papel sensorial y por lo tanto son capaces de controlar
funciones del colangiocito tales como la formación del flujo biliar ductal [146].
El cilio esta conformado por un axonema, cuya estructura es de
9 pares de microtúbulos periféricos sin el par central (9+0), es decir
que no contienen los dos microtúbulos centrales. El cuerpo basal es
derivado de los centriolos, que actúan como puntos de anclaje para
las proteı́nas, que a su vez anclan los microtúbulos a los centrosomas.
Contrariamente a lo que se cree, con pocas excepciones (células
sanguı́neas nucleadas, adipocitos y hepatocitos) el cilio primario es
un organelo de expresión ubicua [173]. En los ductos biliares de gran
diámetro, los axonemas ciliares son casi dos veces el tamaño de los de
los ductos de menos diámetro.
Como ya se ha comentado, la heterogeneidad del árbol biliar no es
sólo anatómica si no también funcional, por lo tanto probablemente
41
las funciones ciliares de los colangiocitos pequeños y grandes sean
heterogéneas. En las lı́neas celulares de ratón y rata (NRCs y NMCs,
respectivamente) el cilio primario aparece 3 dı́as luego de alcanzada la
confluencia, alcanzando el tamaño máximo 7-10 dı́as más tarde, que
es cuando la mayorı́a de la población celular tiene el cilio [171].
Figura 1.24: Propiedades sensoriales del cilio en el colangiocito. Las lı́neas discontinuas indican mecanismos desconocidos. Imagen modificada de Masyuk 2008
Tres funciones sensoriales han sido atribuidas y estudiadas en los
últimos años al cilio: quimiosensor, osmosensor y mecanosensor Las
primeras evidencias de las propiedades como sensor mecánico, fueron observadas en experimentos con células MDCK (epitelio renal
canino), en donde el estı́mulo de una unidad ciliar con el roce de una
micropipeta, o aumentando la velocidad de perfusión del flujo biliar,
inducı́a un aumento de Ca2+ intracelular, mientras que la eliminación farmacológica del cilio suprimı́a completamente este efecto [174].
Ahora se sabe que la capacidad mecanosensora del cilio es debida a la
presencia del receptor de membrana policistina-1 (PC-1) y del canal
de Ca2+ policistina-2 (PC-2). El movimiento del cilio por el aumento
del volumen o composición del flujo biliar, activarı́a ambas proteı́nas
provocando i) aumento de Ca2+ intracelular, y ii) activación de AC-6
(inhibición de cAMP) [172].
La propiedad osmosensora del cilio es ejercida por TRPV4 (Transient Receptor Potential Vanilloid ). Este canal es extremadamente
sensible a cambios osmóticos del medio extracelular, es activado por
hipotonicidad e inhibido por hipertonicidad [175]. La activación de
TRPV4 induce aumento de Ca2+ intracelular, el cual es dependiente
de la fuentes extracelulares de Ca2+ [176]. Cambios en la tonicidad
42
biliar inducen también secreción de ATP, los cual sugiere que las propiedades osmosensoras del cilio podrı́an modular la formación de la
bilis ductal [146].
La función quimiosensora del cilio, es mediada por el receptor purinégico P2Y12 , el cual es activado por nucleótidos presentes en la bilis
(ATP y ADP), y que induce cambios en los niveles de cAMP [146].
El cilio expresa componentes de la vı́a de señalización intracelular de
AKAP (A-kinase anchoring protein), complejo que incluye tres isoformas de AC (AC-4, AC-6 y AC-8) dos isoformas de PKA y una
isoforma de Epac. Esto sugiere un rol importante del cAMP en la
regulación esta función ciliar.
43
1.3.
Colangiocarcinoma
El término colangiocarcinoma (CC) comprende un grupo diverso
de tumores que tienen su origen en el epitelio del tracto biliar. El CC
se presenta frecuentemente de dos formas, como una lesión dentro del
hı́gado ( CC intrahepático) o como una obstrucción del tracto biliar
que se atribuye a obstrucción de un conducto mayor (CC ductal).
Estos dos fenotipos difieren en su etiologı́a, historia natural, comportamiento clı́nico y respuesta a las terapias. En consecuencia, el manejo
clı́nico de los pacientes es diferente. De forma general, este cáncer es
muchas veces difı́cil de diagnosticar, su patogénesis no está claramente
definida y es de muy mal prognosis [177].
Figura 1.25: Esquema de los fenotipos de Colangiocarcinoma. Imagen modificada
de Patel, 2011 [177].
El CC intrahepático, se origina presumiblemente desde los conductos biliares pequeños dentro del hı́gado y puede crecer bastante
antes de que el paciente presente sı́ntomas. En contraste, el CC ductal, se origina en los conductos biliares de gran tamaño tales como,
el conducto biliar común, los conductos comunes hepáticos derecho
e izquierdo, y los pacientes presentas sı́ntomas tempranos derivados
de la obstrucción del tracto biliar. El cáncer de origen perihilar ha
sido históricamente considerado como otro fenotipo de CC, ya que el
manejo quirúrgico es diferente al de los CC tı́picos. Sin embargo, el
comportamiento biológico y la terapia del cáncer perihilar es distinto
del CC intrahepático y ahora es considerado como una subclasificación
de CC ductal [177].
En cuanto al CC intrahepático, este fenotipo comprende también
cánceres de origen hepatocı́tico o con diferenciación ductular, y aunque están dentro de la clasificación de intrahepáticos, tienen un com44
portamiento diferente y por tanto merecen una distinción especial al
momento de iniciar la terapia [178] [179] [177] [180].
La incidencia del CC es baja en muchas partes del mundo, Europa
y USA, contando con menos del 3 % entre todos lo tumores malignos.
Además las tasas de incidencia varı́an considerablemente, lo cual refleja la importancia de los factores de riesgo asociados a la distribución geográfica, y de las diferencias genéticas entre poblaciones [180].
Las mayores tasas de incidencia del CC intrahepático se encuentra en
Tailandia, China y otras partes del sudeste asiático [181]. Sin embargo, en los últimos años además ha aumentado la incidencia en otras
partes del mundo: Europa, América del Norte, Asia, Japón y Australia [182] [180] [183] [181]. Este aumento de incidencia representa un
aumento real, y no es debido a una mejora en las técnicas de detección
y reclasificación del cáncer [184]. A pesar de esto, es importante notar
que la cifra exacta de la incidencia de este cáncer es probablemente superior a la apreciada actualmente, esto debido al subdiagnóstico
histórico y a las diferencias en los criterios de clasificación.
Las tasas de incidencia y mortalidad del CC ductal se han mantenido constantes e inclusive tienen una tendencia a la disminución en
muchos paı́ses [181]. Al igual que en el caso del CC intrahepático, la
difı́cil clasificación anatómica de estos tumores, que muchas veces se
combina con el cáncer de vesı́cula biliar, o que se clasifica como intrahepático cuando la lesión es hilar, hacen que los datos epidemiológicos
de la incidencia de este cáncer sean difı́ciles de interpretar.
Los factores de riesgo del CC incluyen: enfermedades del tracto biliar crónicas, tales como colangitis esclerosante primaria (PSC),
hepatolitiasis, quistes del colédoco y enfermedades hepáticas parasitarias o infecciosas, cambios congénitos secundarios a la enfermedad
poliquı́stica del hı́gado (Caroli´s disease). Entre los factores de riesgo
de origen no biliar se encuentran: uso crónico del alcohol, obesidad,
enfermedad del hı́gado graso (no alcohólica), hepatitis C, VIH y cirrosis, colitis ulcerativa, exposición a quı́micos y uso crónico de ciertos
medicamentos [185] [186] [177] [187] [188]. Estos factores tienen en
común el provocar una inflamación crónica del epitelio biliar.
La presentación clásica del CC intrahepático es la aparición de una
masa que forma una lesión hepática, la cual puede ser bastante grande
en el momento del diagnóstico, aunque el progreso en la calidad de
las imágenes médicas a llevado a detectar lesiones pequeñas con más
frecuencia. Por otra parte, los primeros signos y sı́ntomas que aparecen
como consecuencia del CC ductal, son ictericia y colangitis, debidos a
la obstrucción biliar, lo cual resulta evidente en los resultados de los
estudios de imagen y de laboratorio en donde se evidencia la colestasis
45
[189].
No existe un marcador especı́fico de CC, además de las caracterı́sticas morfológicas del tumor, el diagnóstico se establece en base
a la exclusión del origen secundario a un carcinoma metastásico o de
un hepatocarcinoma. El uso de marcaje por inmunohistoquı́mica es
de gran ayuda, aun cuando no hay consenso general de los marcadores
a detectar. Un panel que incluya CK7, CK19, CK20, CDX-2, TTF1, ER, PR, BRST-2 y PSA, elegidos de acuerdo al contexto clı́nico,
ayudará a excluir metástasis de origen pulmonar, de colón, de mama
o de próstata. El CC intrahepático es comúnmente positivo a CK7,
negativo o débilmente positivo para CK20 y prácticamente negativo
para los otros marcadores del panel. En cambio en el CC ductal, CK20
muestra un marcaje fuertemente positivo [189]. No es posible diferenciar mediante esta técnica un tumor de origen intrahepático, de una
metástasis de la vesı́cula biliar, del páncreas o del tracto gastrointestinal superior, ya que todos tienen el mismo perfil de detección de
marcadores que el CC, una investigación exploratoria de estos órganos permite descartarlo. Estudios recientes muestran que la expresión
de N-caderina es mas frecuente en CC intrahepático y podrı́a ser utilizado para el diagnóstico diferencial [190].
1.3.1.
Patogénesis molecular del colangiocarcinoma
Los mecanismos moleculares involucrados en el desarrollo del CC
no han sido completamente definidos, aun cuando en los últimos años
muchos estudios han contribuido al entendimiento de la transformación maligna de los colangiocitos. [191] [192]. Estos mecanismos pueden ser simplificados en la Figura 1.26. Tal como hemos comentado,
el CC se desarrolla usualmente en un ambiente de inflamación crónica
del epitelio biliar lo que genera un daño asociado a la obstrucción del
flujo biliar [177]. La gran cantidad de citoquinas y factores secretados durante el proceso inflamatorio desencadena el proceso de colangiocarcinogénesis [191]. Las moléculas que participan en este proceso
inducen la neoplasia a través de un mecanismo ligado al daño de protooncogenes, daño en la reparación del DNA, aumento de la proliferación
celular, apoptosis, represión de genes supresores, invasividad y neoangiogénesis. Lo cual resulta en proliferación celular descontrolada e
invasión. Como en muchos otras clases de cáncer, los genes K-ras, p53,
p14ARF, p16INK4a, y β-catenina pueden sufrir mutaciones durante
le desarrollo del CC [193] [194] [195]
46
Figura 1.26: Mecanismos involucrados en la transformación maligna de los colangiocitos. Imagen modificada de Fava, 2012 [194].
Vı́as de señalización involucradas
La mayorı́a de los factores de riesgo mencionados, tienen en común
la generación de inflamación hepática, colestasis y aumento del turnover del colangiocito. La inflamación crónica crea un microambiente
que induce a las células a activar las señales intracelulares de proliferación, y a aumentar la producción de factores mitogénicos [191] [195].
Estudios recientes han mostrado que los colangiocitos secretan citoquinas, como interleuquina 6 (IL-6), TGF-β, IL-8, TNF-α y factor
de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Las citoquinas en los
colangiocitos, activan la oxido nı́trico sintasa (iNOS), lo cual induce
la generación de óxido nı́trico, y otras especies reactivas del oxı́geno,
lo cual altera las bases del DNA, produciendo un daño directo tanto
en el DNA, como en los mecanismos de reparación del DNA [196]. El
daño en el DNA genera la aparición de mutaciones y la alteración de
los genes cruciales para la proliferación celular. Entre los genes que
sufren una sobrexpresión están; EGFR, erb-2, K-ras, BRAF y el factor
de crecimiento de hepatocito/c-met (HGF). Adicionalmente, también
ha sido reportada la activación de c-erbB 2, (un proto-oncogen) en
muchos pacientes con CC [197].
Otros mecanismos ligados a la carcinogénesis involucran alteracio47
nes en los genes supresores: p53, APC y DPC4, como consecuencia
de las deleciones cromosómicas, mutaciones o metilaciones, además
de inestabilidad microsatélite [198] [195]. La activación de iNOS promueve también la upregulation de la COX-2 en colangiocitos de ratón,
lo cual sugiere que los prostanoides podrı́an también jugar un rol en
la carcinogénesis [199].
Especial atención merece IL-6, ya que juega un importante papel
en los mecanismos de evasión de la apoptosis en el colangiocito. Las
células neoplásicas secretan IL-6 de forma autocrina, lo cual induce la
activación de p38 y AKT [200] [201]. IL-6 es capaz de inducir la expresión de Mcl-1 a través de la regulación de STAT3 y AKT [202] [203].
Mcl-1 es una proteı́na anti-apoptótica, su expresión es controlada por
el microRNA: mir-29, el cual está suprimido en las células malignas [204].
Un área relativamente nueva es el estudio de stem cells. Aun cuando hay poca investigación que involucre a las stem cells, o a las células
progenitoras del árbol biliar en la colangiocarcinogénesis, es interesante notar que los sitios de mayor frecuencia de crecimiento del colangiocarcinoma ductal son el área perihilar y periampular, las cuales
corresponden exactamente con las zonas de mayor densidad de glándulas peribiliares en donde se encuentran las stem cells multipontentes
hepáticas [205].
1.3.2.
Tratamiento del colangiocarcinoma
La resección quirúrgica en pacientes que tienen el tumor localizado, es la única estrategia terapéutica tanto en el CC ductal como en
el intrahepático. Sin embargo, pocos pacientes son diagnosticados en
estadios tempranos de la enfermedad, ya que los sı́ntomas comunes
son inespecı́ficos e indoloros (pérdida de peso, colangitis e ictericia) y
por la tanto no pueden optar a cirugı́a. Además con el fin de mantener
la funcionalidad hepática, no siempre es posible la resección completa
del tumor aun cuando se encuentre localizado [206] [177].
El tratamiento a seguir en el caso que la resección sea parcial
es la quimioterapia con 5-FU o gemcitabina. Si CC es intrahepático
y esta localizado pero no es posible removerlo quirúrgicamente, se
utilizan terapias regionales, tales como TACE (quimioembolización
transarterial) o TARE (radioembolización transarterial). Cuando el
cáncer se encuentra en estadios avanzados, es decir existe metástasis
o es de crecimiento progresivo, la terapia indicada será sistémica y
basada en la combinación de gemcitabina con un fármaco que contiene
platino (II) en su estructura, como Cisplatino u oxaliplatino.
48
El tratamiento del CC ductal avanzado, requiere de un drenaje
biliar, luego de lo cual se puede tratar con terapias locales como terapia fotodinámica o braquiterapia y stenting o con terapia sistémica
basada en el uso de gemcitabina o 5-FU, al contrario del CC intrahepático no existe evidencia de que la combinación con Cisplatino sea
más efectiva [177].
La supervivencia promedio a los 3-5 años de los pacientes con
CC ductal que han sido sometidos a la resección quirúrgica total es
del 20-40 % lo cual asciende a 45 % si no hay invasión a los vasos o
implicación de los ganglios linfáticos. En el caso de que la resección
no fue completa, el pronóstico es mucho menor y comparable al de los
pacientes que han recibido exclusivamente cuidados paliativos.
Los pacientes con CC intrahepático tratados con terapia sistémica
tienen un pronóstico de de 8-12 meses de vida. Luego de la resección
quirurgica y la quimioterápia la supervivencia en 1 y 5 años es de
68 % y 32 %, respectivamente [207] [177]. En un grupo muy reducido
de pacientes la aproximación multifocal, combinando el transplante de
hı́gado con quimio y radioterapia, ha resultado en una supervivencia
de 5 años mayor al 70 % [208].
La terapia de gemcitabina combinada con un agente derivado de
platino es considerada hoy como la primera opción al tratamiento del
colangiocarcinoma no resectable, en base a los resultados obtenidos
por dos ensayos clı́nicos radomizados fase 2 y 3 (Advanced Biliary
Cancer (ABC 014 and ABC 025)) [209].
En contraste, aproximadamente la mitad de los pacientes que no
reciben tratamiento muere dentro de 3-4 meses luego de la aparicion
de los primeros sı́ntomas, ya sea por por efectos indirectos de la progresión tumoral, como por obstrucción biliar, falla hepática o por sepsis
secundaria a la colangitis y los absesos. El manejo de estos pacientes
es paliativo, enfocado en reducir la colestasis obstructiva, el prurito y
la colangitis [177].
Fármacos utilizados en la quiometarápia del CC
Gemcitabina, Gemzar�: La gemcitabina (dFdC, 2’,2’ - difluorodesoxicitidina) es un análogo de la citarabina, que es activa en tumores sólidos [210]. Es captada al interior celular por hENT1, hENT2,
hCNT1 y hCNT3 [211] [122], aunque pareciera que la internalización
de la gemcitabina por hENT1 y hCNT1 es más eficiente. Tras ingresar en la célula, la gemcitabina es fosforilada a su forma monofosfato
(dFd-CMP) por la deoxicitidina quinasa (DCK) y a su forma activa
trifosfato (dFd-CTP) por las pirimidina quinasas [212] [213] La inac49
tivación de la forma monofosfato la realizan las 5’-Nucleotidasas y
la de la gemcitabina viene dada por la desaminación por parte de la
Citidina deaminasa [213] [214].
Figura 1.27: Mecanismos de metabolización involucrados en la acción terapéutica
de la gemcitabina. Imagen modificada de Okazaki, 2010 [215].
Como muestra la Figura 1.27 el mecanismo de acción de la gemcitabina se da a diferentes niveles. Por un lado, es incorporada a la
cadena de DNA durante su sı́ntesis y tras ello, se da la adición de
un nucleósido natural de forma que no se puede dar la reparación del
DNA y se produce un fenómeno conocido como terminación enmascarada de la cadena (masked chain termination) [213]. Por otro lado,
la gemcitabina puede inhibir la Desoxicitidina monofosfato desaminasa y la Ribonucleótido reductasa (RRM1), disminuyendo los niveles
intracelulares de dNTPs [213] [216]. La disminución de dCTP inhibe
la Desoxicitidina monofosfato deaminasa, lo que incrementa los niveles de gemcitabina monofosfato. Además, la gemcitabina también es
capaz de incorporarse al RNA [217].
La mayor retención de los metabolitos activos de la gemcitabina
y su mayor efecto sobre tumores sólidos si lo comparamos con otros
fármacos análogos de nucleósidos, puede ser debido a que la gemcitabina es mejor sustrato de los transportadores de nucleósidos, se fosforila
más rápidamente y es eliminada más lentamente. Estas caracterı́sticas permiten a los metabolitos activos permanecer más tiempo en el
interior celular, lo cual podrı́a explicar su efecto en células tumorales
con tiempos de duplicación más lento.
5-Fluorouracilo: El 5-Fluorouracilo (5-FU) es un análogo de uracilo con un átomo de fluor en la posición C5. No es claro el mecanismo de entrada utilizado por este fármaco, aunque en los últimos años la captación de 5-FU se ha atribuido a los transportadores
50
OAT2 y OAT3 [218] [219]. Una vez el 5-FU se encuentra en la célula, es metabolizado a sus metabolitos activos, 5-fluorodesoxiuridina
monofosfato (5-FdUMP), 5-fluorodesoxiuridina trifosfato (5-FdUTP)
y 5-fluorouridina trifosfato (5-FUTP). La principal reacción limitante
en el efecto citotóxico del 5-FU es su catabolismo mediante la dihidropirimidina deshidrogenasa (DPYD), que convierte al 5-FU en el
metabolito inactivo dihidrofluorouracilo (DHFU). De hecho, más del
80 % del 5-FU administrado es degradado por la DPYD en el hı́gado,
donde la DPYD se expresa abundantemente [220].
La capecitabina se desarrolló como una alternativa para evitar la
baja biodisponibilidad del 5-FU y además presenta la ventaja de ser
de administración oral [221]. La capecitabina es metabolizada por la
carboxilesterasa a 5’-desoxi-5-fluorocitidina, la cual es desaminada por
la Citidina desaminasa a 5’-desoxi-5-fluorouridina (5’-DFUR), enzima
que se encuentra aumentada en hı́gado y tumores sólidos. La 5’-DFUR
es la molécula internalizada por los transportadores de nucleósidos
y convertida a 5-FU por la Timidina fosforilasa (TYMP), la cual es
mucho más abundante en tejido tumoral que en tejido sano [222] [223].
Figura 1.28: Mecanismo de acción del 5-FU. El 5-FU es capaz de incorporarse al
RNA y al DNA, pero también inhibe la timidilato sintasa (TYMS), alterando los
niveles de dNTPs y produciendo un daño en el DNA.
El mecanismo de acción del 5-FU es diferente de gemcitabina Figura 1.28, ya que actúa principalmente inhibiendo la Timidilato sintasa
(TYMS) mediante el 5-FdUMP y a través de la incorporación del 5FUTP al RNA. La TYMS es la enzima que cataliza el paso de dUMP
51
a dTMP, siendo éste el único modo de sintetizar de novo dTMP. El
5-FdUMP se une a la TYMS y forma un complejo estable que impide
la unión del sustrato natural dUMP [224]. Esto provoca una disminución de dTMP y por tanto una depleción de dTTP, lo que conlleva
un desequilibrio en los niveles de dNTPs [225]. Al impedir la unión
del sustrato natural dUMP a la TYMS detiene su metabolización a
dTMP, se produce un aumento de dUMP y por tanto de dUTP, este
hecho junto con la fosforilación que puede experimentar el FdUMP
hasta la forma trifosfato, pueden aumentar el daño en el DNA por
su equivocada incorporación al mismo [226]. Además, los efectos de
la inhibición de la TYMS pueden ser revertidos a través de la acción
de la TK1 mediante la adición de timidina, representando esta vı́a de
salvamento un mecanismo de resistencia [227].
El 5-FUTP se incorpora al RNA con una elevada eficiencia y esto
afecta tanto al pre-procesado del pre-rRNA a rRNA maduro, como
a las modificaciones post-transcripcionales del tRNA, como a la actividad de los complejos snRNA/proteı́na y por tanto al splicing del
pre-mRNA, todo esto acaba conduciendo a la muerte celular [228].
R
Cisplatino (Neoplatin�):
El Cisplatino (cis - diamminedichloridoplatinum (II)), junto con el oxaliplatino y el carboplatino, pertenece
a un grupo de fármacos que se caracterizan por tener un átomo de
platino en su estructura. Aunque no es un agente alquilante, ya que no
tiene grupos alquilo, su mecanismo de acción es similar. Este fármaco
es usado principalmente en el tratamiento del cáncer testicular, en
cuyo tratamiento actúa como un agente quimioterapéutico altamente
activo. También se utiliza en el tratamiento del cáncer de páncreas,
de sarcomas, de algunos carcinomas y leucemias.
El Cisplatino es capaz de atravesar la membrana celular por difusión pasiva pero por el carácter polar de la molécula se tiende a pensar
que también es transportado de forma activa por sistemas de transporte de la membrana plasmática. Diversos autores han demostrado
que las mismas proteı́nas de membrana que median la captación de
cobre son capaces de transportar también cisplatino [229] [230].
La primera evidencia de la relación entre los transportadores de
cobre y la farmacologı́a celular del Cisplatino fue en el año 2000. En este trabajo se vio que la expresión del transportador de cobre ATP7B
conferı́a resistencia al tratamiento con cisplatino en la lı́nea celular
derivada de carcinoma epidérmico KB-3-1 ( [231]). Este transportador estarı́a mediando, por tanto, la eliminación del fármaco hacia el
exterior celular. Desde entonces, diversos trabajos han corroborado
la correlación entre la expresión del ATP7A y ATP7B y la resistencia a Cisplatino [232] [233]. La proteı́na Ctr1 es otro transportador
52
de cobre, pero en este caso, media su influjo. Ishida y colaboradores
demostraron que Ctr1 de mamı́feros es capaz de mediar también la
captación de Cisplatino [234].
El transportador de iones catiónicos orgánicos hOCT2 también
puede transportar cisplatino y hOCT1 lo harı́a con mucha menor afinidad [235] [236]. De hecho, estos transportadores juegan un papel
muy importante en la nefrotoxicidad del cisplatino presente tras el
tratamiento con el mismo [237]. Por último, proteı́nas de la familia
MRP (Multi-drug Resistance Proteins) como ABCC2 (MRP2) también han sido implicadas en la extrusión del Cisplatino [238].
Una vez que el Cisplatino ya está en el interior celular, los dos átomos de cloro son desplazados por agua debido a la baja concentración
intracelular de este ion, y de esta forma pasa a su forma activa. Esta
activación permite que la molécula se una a los nitrógenos de los nucleótidos del DNA formando complejos de DNA (DNA adducts). De
los cuatro residuos nucleotı́dicos del DNA, el cisplatino parece unirse
preferentemente con la guanina.
Las proteı́nas del Grupo de Alta Movilidad HMG (High Mobility
Group) tienen una elevada afinidad por el complejo cisplatino-DNA
y se unen a él provocando que, al activarse la maquinaria de reparación de daño del DNA, ésta no pueda acceder al DNA para reparar
el daño produciendo el arresto celular. A pesar de que el cisplatino
es capaz de actuar en una célula en cualquiera de sus fases, parece
ser la fase G2/M aquella en la que la célula para su ciclo ( [239]. Finalmente, cuando la maquinaria de reparación no puede reparar este
daño, la célula es conducida a apoptosis. Durante este proceso, se da
un aumento de expresión de p53 y de p21 de forma dependiente e
independiente de p53. Por otro lado, el cisplatino también es capaz
de unirse a los factores de transcripción ZFP (zinc-finger protein), de
forma que impiden la actividad de la DNA polimerasa α y por tanto,
inhiben la transcripción, lo que en último término conduce también a
la muerte celular.
Se han descrito diversos mecanismos de resistencia asociados al
tratamiento con cisplatino, como una menor acumulación del fármaco,
una mayor detoxificación, la inhibición de la apoptosis o el aumento
en la reparación del daño al DNA. Incluso se piensa que en un mismo
tipo celular, se podrı́a estar presentando más de un mecanismo de
resistencia al mismo tiempo. El transporte del fármaco hacia el interior
o hacia el exterior celular podrı́a estar jugando un papel determinante,
pues la principal caracterı́stica de las lı́neas celulares resistentes al
tratamiento con cisplatino es una menor concentración de fármaco
intracelular [240]. De hecho, diversos trabajos demuestran el papel
53
que juegan algunos miembros de la familia de proteı́nas de resistencia
a multidrogas en la resistencia al cisplatino y otros fármacos. Por
ejemplo, la inhibición de ABCC2 (MRP2) incrementa la sensibilidad
al cisplatino, reduciendo su IC50 en 25 veces en la lı́nea celular HepG2
o revirtiendo la resistencia en la lı́nea celular humana de carcinoma de
ovario resistente al tratamiento con cisplatino A2780RCIS [241] [242].
Además, la inhibición de la expresión de MRP3 en lı́neas celulares humanas derivadas de glioma aumenta entre dos y cinco veces la
sensibilidad a Cisplatino [243]. Contrariamente a lo que demuestran
estos trabajos, un estudio realizado por Gottesman y colaboradores,
demuestra que lı́neas resistentes al Cisplatino tienen una menor expresión de las proteı́nas de la famı́lia de las ABC, ABCC1 (MRP1) y
ABCC2 (MRP2) y se observa también una mayor captación de carboplatino, aunque no detectan un mayor eflujo del fármaco, por lo
que describen un nuevo mecanismo de resistencia de estas proteı́nas
al Cisplatino [244].
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2
Objetivos
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56
En base a lo que hemos expuesto, resulta claro que el conjunto de
elementos que conforman el purinoma tiene importantes efectos en la
regulación de la funcionalidad de diversos epitelios. En particular, en
el epitelio biliar el ATP ha emergido como una importante señal en
la regulación de la respuesta secretora y es probable que otras entidades purinérgicas estén también participando de este mecanismo. La
determinación de estos elementos podrı́a además ayudar a dilucidar
nuevas dianas en la patogénesis y tratamiento del colangiocarcinoma.
Estos antecedentes nos llevaron a plantearnos el siguiente objetivo
general de este proyecto:
Identificar y estudiar nuevos elementos del purinoma en el epitelio
biliar y determinar su papel en modelos fisiológicos y patológicos.
Este objetivo fue dividido en los siguientes objetivos especı́ficos:
Determinar la expresión y la actividad de los transportadores
y receptores de adenosina en un modelo fisiológico de epitelio
biliar de rata.
Estudiar los mecanismos de cross-talk entre los elementos del
purinoma en los colangiocitos.
Analizar las eventuales alteraciones de la expresión de los transportadores de nucleósidos en colangiocarcinoma.
Identificar posibles mecanismos de resistencia a fármacos utilizados en la quimioterapia del colangiocarcinoma, derivadas de
alteraciones en la expresión de sus transportadores.
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3
Materiales y Métodos
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3.1.
Cultivo Celular
Se entiende por cultivo celular el mantenimiento de células fuera
del organismo de origen en un ambiente que aporta las condiciones
adecuadas para la conservación de sus propiedades fisiológicas, bioquı́micas y genéticas. La experimentación con células en cultivo permite el análisis de poblaciones relativamente homogéneas de células,
aportando ası́ ventajas en la investigación biomédica. Los cultivos preparados directamente a partir de los tejidos de un organismo reciben
el nombre de cultivos primarios. Asimismo, se pueden generar experimentalmente, mediante transformación, células que proliferan casi
indefinidamente, dando lugar a las lı́neas celulares. Las lı́neas celulares permiten una mejor conservación y la realización de experimentos
a más largo plazo que el cultivo primario. No obstante, al haber perdido el control de proliferación, pierden también algunas caracterı́sticas
celulares dando lugar a células menos diferenciadas que el tejido de
origen. Según su capacidad de adhesión a los soportes utilizados en su
cultivo, las células pueden crecer dando lugar a una monocapa o bien
en suspensión. En el primer caso las células son dependientes de anclaje y no inician la proliferación hasta haberse adherido al sustrato. De
forma general, las células provenientes de órganos crecen en monocapa, mientras que las células de origen sanguı́neo crecen normalmente
en suspensión. Sin embargo, ciertas lı́neas celulares pueden crecer formando varias capas superpuestas o tener la facultad de crecer tanto
en monocapa como en suspensión.
Técnica de Trabajo
La experimentación con células en cultivo implica el mantenimiento de unas estrictas condiciones de esterilidad. Para ello se trabaja
siempre en una cabina de flujo laminar previamente esterilizada con
radiaciones ultravioleta y todo el material desinfectado y esterilizado
con etanol al 70 %. El material necesario para el cultivo incluye:
Campana de flujo laminar vertical con sistema de esterilización
por ultravioleta y sistema de aspiración
Incubador de células con atmósfera controlada a 37o C y 5 % de
CO2 con una humedad relativa del 95 %
Equipamiento criogénico: congeladores a -20o C y -80o C, tanque
de nitrógeno lı́quido y recipiente con isopropanol para la criogenia gradual de las células
61
Baño termostatizado, para atemperar a 37o C y descongelar medios
Material de desinfección (etanol 70 %) y de esterilización (autoclave)
Microscopio óptico invertido
Cámara de Neubauer para el contaje celular
Otros materiales: pipeteador, material de plástico estéril
3.1.1.
Cultivo de lı́neas celulares
El mantenimiento rutinario de las lı́neas celulares implica el uso
de medios de cultivo que contienen los nutrientes necesarios para la
supervivencia celular. Además, con el objetivo de compensar la falta
de factores circulantes, estos medios se suplementan con suero y otros
factores según las necesidades especı́ficas de cada lı́nea celular. El
trabajo con células implica el replaqueo, o pase de una parte de un
cultivo de cierta densidad a un nuevo frasco o placa con medio fresco
para garantizar su viabilidad.
Cultivos en monocapa
Las células en monocapa crecen adheridas a la superficie, que normalmente suele ser un frasco o una placa de plástico. Estas células son
separadas de la superficie en la mayorı́a de los casos usando un enzima
llamado tripsina que rompe las uniones de las células a la superficie,
ası́ como las uniones entre las células. Este proceso debe realizarse con
cuidado ya que la tripsina también es capaz de destruir las células por
digestión total.
Medios y reactivos
Tripsina-EDTA (Gibco, Life Technologies)
Tampón fosfato PBS: NaCl 140 mM, KCl 2.7 mM, KH2 PO4 1.5
mM y Na2 HPO4 8.1 mM
Procedimiento: Las células se dejan crecer hasta 75-80 % de confluencia y es en este momento cuando se lleva a cabo la tripsinización.
En una cabina de flujo laminar se aspira el medio del frasco o placa
en el que se mantenı́an las células y se realiza un lavado con PBS
estéril, ya que los restos de suero pueden inhibir la actividad de la
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tripsina. A continuación, se extrae el PBS y se añade un volumen de
tripsina con el que nos aseguramos que se cubre toda la monocapa (1
mL generalmente). Las células son incubadas con tripsina el tiempo
suficiente para que se disgreguen a simple vista o en caso necesario, se
puede usar el microscopio óptico para asegurase. A continuación, se
retira la tripsina y se resuspenden las células en medio suplementado
con un 10 % de suero que inhibirá cualquier actividad enzimática posterior. Para homogeneizar el cultivo se utiliza una pipeta de plástico
estéril que se apoya sobre la base del frasco o placa y por la cual se
hacen pasar las células 3-4 veces. Esta homogeneización permite que
al replaquear las células se repartan homogéneamente y no formen
grupos. Dependiendo del tipo de experimento, tipo celular y tiempo
de duplicación de las células, se pueden hacer diferentes diluciones o
se pueden contar si necesitamos un número exacto de éstas. Se debe
tener en cuenta que cada vez que las células entran en contacto con el
agente que se utiliza para la disgregación, en este caso la tripsina, se
realiza lo que denominamos un “pase”. Las lı́neas celulares no pueden
ser pasadas de manera indefinida, ya que con los pases se produce la
acumulación de mutaciones que hacen diferentes a las células originales. Por tanto, es conveniente llevar un control del número de pases
que se realizan. Debido a esto, se debe minimizar el número de pases y
se debe congelar el mayor número de viales con células que provengan
de un cultivo lo más cercano posible al cultivo original.
Cultivos polarizados
Existen algunas lı́neas celulares que pueden inducirse a polarizar
consiguiéndose ası́ la diferenciación completa de la membrana apical y
basolateral. Para ello, se usan placas de cultivo con insertos especiales
denominados transwell , que permiten utilizar superficies permeables
para el estudio de células polarizadas. Estos filtros de policarbonato
permiten la diferenciación de las membranas apical y basolateral y
la formación de uniones estancas entre las células. De este modo, se
consigue un ambiente muy similar al estado in vivo de las células. En
esta tesis se ha trabajado con NRCs (Normal Rat Cholangiocytes)
sobre los sistemas mencionados.
Medios y reactivos
Placas de 24 multipocillo transwell (12 mm diámetro membrana,
0,4 mm poro; Corning Costar)
Colágeno tipo I de cola de rata a 10 µg/ml en medio de cultivo
63
sin suero. Se diluye a partir de una solución de concentración
aproximada de 3.7 mg/ml (BD)
Procedimiento: Cuando se trabaja con el sistema transwell (Figura
3.1) es necesario tratar previamente los filtros de policarbonato con
colágeno para que las células se distribuyan en los filtros y polaricen
correctamente. El colágeno se añade en 200 µl de medio sin suero por
cada inserto y se deja incubar por 3 horas a 37o C. Transcurrido este
tiempo, se aspira el medio y se siembran las células resuspendidas en
0,5 ml de medio completo sobre la membrana permeable. Inmediatamente se agrega 1 ml de medio al compartimento basal. Las NRCs son
células que polarizan relativamente rápido. Todos los ensayos fueron
realizados a los 7-10 dı́as después de la siembra. El cambio de medio
se debe hacer cuidando no alterar la monocapa, para ello, retiramos
primero el medio basal y después el apical y se añade primero en apical
y finalmente en basal.
Figura 3.1: Representación esquemática de una unidad de cámara y filtro de tipo
transwell.
Para controlar si las células se encuentran polarizadas se mide la
resistencia o TEER (Trans Epithelial Electric Resistance) mediante
el Millicell-Electrical Resistance System (Millipore) entre el compartimiento apical y el basolateral, ya que ésta aumenta cuando el cultivo en monocapa se encuentra polarizado. La medida regular de este
parámetro demuestra que la monocapa celular llega a una resistencia
superior a 1000 Ω/cm2 [245].
Congelación y descongelación de células
La congelación de células es un proceso conveniente para mantener una reserva de células en nitrógeno lı́quido, ya que después de un
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tiempo en cultivo las células pierden sus caracterı́sticas. Además, ante
una eventual contaminación celular siempre tendremos un stock de las
células originales. Para realizar la congelación manteniendo la viabilidad de las células, es necesario el uso de agentes preservantes como
el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO). La composición del medio
de congelación puede variar dependiendo de la sensibilidad al proceso
de congelación y descongelación de cada tipo celular. Por tanto, en
algunos casos es suficiente con añadir al medio de cultivo suplementado un 10 % de DMSO estéril, en otros, se pueden usar soluciones de
sales de alginato y, en el caso más común, se utiliza suero fetal bovino
suplementado con un 10 % de DMSO estéril, siendo este último el utilizado en esta memoria. Las células en general se dejan crecer hasta
un 70-80 % de confluencia, se tripsinizan, se resuspenden en medio de
cultivo, se traspasan a un tubo cónico y se centrifugan a 1200 rpm
durante 4 minutos. El medio se elimina por aspiración y se añade 1
ó 2 ml de medio de congelación. Luego, las células son resuspendidas
y alicuotadas en uno o dos criotubos. Rápidamente, se colocan en un
tanque de congelación gradual con isopropanol a -80o C y se dejan un
mı́nimo de 24 horas y un máximo de 1 mes hasta que se trasladan
a un tanque de nitrógeno lı́quido donde se almacenan permanentemente hasta su uso. Los puntos crı́ticos de este procedimiento son la
toxicidad de los agentes preservantes y la velocidad de congelación.
Los agentes preservantes son tóxicos para las células a temperatura
ambiente y a concentraciones superiores al 2 %. Por este motivo, es
conveniente mantener el tanque de isopropanol a 4o C reduciendo de
esta forma el tiempo de contacto entre las células y el agente crioprotector. Por otro lado, la velocidad de congelación debe ser lenta
para evitar la formación de cristales intracelulares que puedan dañar
la célula, preservando ası́, la viabilidad celular. El proceso de descongelación, al contrario que el de congelación, se debe realizar de forma
rápida. Se incrementa abruptamente la temperatura para evitar que
las células sufran grandes cambios de volumen y estallen. El criotubo
se saca del tanque de nitrógeno y rápidamente se traspasa a un baño
termostatizado a 37o C. Una vez descongeladas, las células se vierten
en un tubo cónico con medio de cultivo suplementado y se centrifugan a 1200 rpm durante 4 minutos. Tras eliminar el sobrenadante por
aspiración, las células se resuspenden en medio de cultivo fresco y se
siembran.
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Lı́neas celulares utilizadas
Linea Celular NRC:
Esta lı́nea celular se obtuvo en el Laboratorio de Genética Molecular, a cargo del Dr. Juan F Medina en el CIMA de la Universidad
de Navarra. Los colangiocitos se obtuvieron a partir de unidades de
conducto biliar intrahepático (IBDUs) aisladas de ratas. Los animales utilizados fueron mantenidos en la zona SPF (Specific Patogen
Free) del animalario del CIMA hasta el momento de su utilización de
acuerdo con la normativa europea de manejo de animales de experimentación [246]. El protocolo de obtención de los IBDU de rata se
basa principalmente en el procedimiento descrito por Mennone, 1995,
y la posterior obtención de NRCs del protocolo descrito por Vroman
y LaRusso, 1996 [247] [248]. Estas células mantienen el fenotipo de
colangiocitos, tienen capacidad de polarización, que es evidenciada
por la morfologı́a y la funcionalidad que muestran frente a los estı́mulos clásicos, tales como hormonas y cambios en la concentración de
cAMP.
Condiciones de Cultivo: La composición del medio utilizado para
el matenimiento en cultivo de estas células se muestra en la Figura
3.2. Dependiendo de el tipo de crecimiento (monocapa o polarizado) el medio es enriquecido con factores especı́ficos, de esta forma se
consigue aumentar la expresión del fenotipo celular diferenciado con
propiedades de colangiocitos fisiológicamente normales. El pH del medio es también crucial para el buen mantenimiento de las células en
cultivo [245].
Figura 3.2: Tabla resumen composición medio de cultivo de las NRCs
Adicionalmente es necesario hacer notar que para su matenimiento, estas células deben ser sembradas en frascos de cultivo de 75 cm2
66
recubiertos con una capa de colágeno de cola de rata tipo I, de 2 mm
de grosor [248]. Para el subcultivo de esta células, cuando han alcanzado la confluencia y por lo tanto han formado una monocapa, el medio
es cambiado por una solución de colagenasa-dispasa (Sigma) que se
mantiene por 1 h hasta la completa disolución de la capa de colágeno.
De esta forma, se consigue que las células se mantengan en monocapa
y puedan ser sembradas para matenimiento o ensayos experimentales.
Linea Celular TFK-1:
La lı́nea TFK-1 (DSMZL :ACC 344) fue generada por Saijyo S,
1995 a partir de un tumor de adenocarcinoma de conducto biliar extrahepático humano. Estas células muestran fenotipo epitelial, creciendo en monocapa y formando clusters poligonales, hasta llegar a
polarizar [249].
Condiciones de Cultivo:El medio utilizado para su crecimiento es
RPMI 1640, suplementado con 10 % de FBS, 1 % de glutamina y 1 %
de Penicilina-estreptomicina (Gibco, Life Technologies, Life Technologies). Tienen una capacidad de crecimiento rápido y para el matenimiento de sus caracterı́sticas funcionales deben subcultivarse antes de
que lleguen a confluencia (80 %), y pasarse en una dilución 1:6 [249].
Linea Celular EGI-1:
Esta lı́nea celular (DSMZL :ACC 385) fue generada a partir de un
carcinoma de conducto biliar humano extrahepático, de baja diferenciación. El fenotipo de estas células es epiteloide, de crecimiento en
monocapa formando clusters.
Condiciones de Cultivo: El medio utilizado es DMEM, suplementado con 10 % de FBS, 1 % de glutamina y 1 % de Penicilina-estreptomicina
(Gibco, Life Technologies). Al igual que las células TFK-1, crecen
rápidamente y para el matenimiento de sus caracterı́sticas funcionales deben subcultivarse antes de que lleguen a confluencia (80 %), y
pasarse en una dilución 1:6 [250].
Lineas Celulares Mz-ChA-1, Mz-ChA-2 y SK-ChA-1:
Estas tres lineas celulares de tracto biliar extrahepático humano,
fueron establecidas a partir de metástasis de adenocarcinoma de vesı́cula biliar (Mz-ChA-1 y 2) y a partir de una ascitis maligna de una
paciente con adenocarcinoma primario (SK-ChA-1) por el grupo de
Knuth A en 1985. Estas células no tienen capacidad de formar monocapas polarizadas. Entre todas ellas, Mz-ChA-1 parece ser la mas
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diferenciada ya que es la única lı́nea con capacidad de secreción de mucus. Adicionalmente, se diferencian en su capacidad de secreción de
diferentes elementos del complemento, y proteı́nas marcadoras [251].
Condiciones de Cultivo: El medio utilizado para su cultivo es RPMI 1640, suplementado con 10 % de FBS inactivado, 1 % de glutamina,
1 % de Penicilina-estreptomicina, 1 % de aminoácidos no esenciales y
1 % de Piruvato de sodio (Gibco, Life Technologies) Las células MzChA-1 crecen mas lentamente llegando a confluencia en 3-4 dı́as, en
cambio las células Mz-ChA-2 y SK-ChA-1, lo hacen en 2 dı́as. El subcultivo de todas estas células se hace en una dilución 1:4-1:5.
Lı́neas Celulares BCLC-12 y BCLC-7:
Las lı́neas celulares BCLC 12 y 7 han sido cedidas por el Dr. J
Bruix del IDIBAPS del Hospital Clinico de Barcelona, donde fueron
generadas a partir de resecciones quirúrgicas de colangiocarcinoma intrahepático humano. Si bien las propiedades y marcadores de ambas
lı́neas son tı́picas de colangiocarcinoma, tienen caracterı́sticas fenotı́picas bastantes dispares.
Condiciones de Cultivo: El medio utilizado para su crecimiento
es DMEM/F-12, suplementado con 10 % de FBS inactivado, 1 % de
glutamina, 1 % de Penicilina-estreptomicina, 1 % de aminoácidos no
esenciales y 1 % de Piruvato de sodio (Gibco, Life Technologies). Las
BCLC-12 crecen rápidamente y para el matenimiento de sus caracterı́sticas funcionales deben subcultivarse antes de que lleguen a confluencia (90-100 %) en una dilución 1:6. Las células BCLC-7 crecen
muy lentamente, y tienen un fenotipo mas cercano a células indiferenciadas. Es por esto que el medio de cultivo utilizado para su matenimiento contiene también, en una proporción 1/4, medio enriquecido
de las células BCLC-12 (filtrado), para de esta forma suplementarlas
con factores propios liberados por estas células. Debido a su bajo porcentaje de crecimiento, y escasa capacidad de amplificación, esta lı́nea
celular fue sólo incluida para estudios de expresión de RNA. Para el
matenimiento en cultivos, deben pasarse en confluencias del 70-80 %,
ya que no llegan a confluencia total, en una dilución 1:5, en frascos
con un recubrimiento de gelatina al 4 %.
Linea Celular NP29:
Esta lı́nea celular a fue generada a partir de un adenocarcinoma
pancreático humano excrino [252].
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Condiciones de Cultivo: El medio utilizado es DMEM-F-12, suplementado con 10 % de FBS, 1 % de glutamina y 1 % de Penicilinaestreptomicina (Gibco, Life Technologies). Para el matenimiento de
sus caracterı́sticas funcionales deben subcultivarse antes de que lleguen a confluencia (80 %), y pasarse en una dilución 1:6 [252].
Todas las lı́neas celulares utilizadas en esta tesis, fueron regularmente sometidas a control de contaminación por micoplasma.
3.2.
Tratamientos de los cultivos celulares
La Figura 3.3 muestra la lista de compuestos utilizados en los
tratamientos a los que se han sometido las lı́neas celulares anteriormente descritas. La lista de agentes incluye hormonas, moduladores
purinérgicos e inhibidores ó activadores de diversas proteı́nas. Los tratamientos fueron realizados a los tiempos y concentraciones descritos
en la tabla, y fueron escogidas de acuerdo a lo descrito bibliografı́a.
Figura 3.3: Tabla de condiciones de tratamiento en los cultivos celulares
En el caso particular del tratamiento de células con agentes quimioterapéuticos, este tipo de agentes suelen ser suministrados de forma sólida, de manera que se deben reconstituir antes de su utilización.
La mayorı́a de ellos pueden ser resuspendidos en agua o algún otro
disolvente como el DMSO, siempre manteniendo las condiciones de
69
esterilidad. Algunos de los fármacos se degradan o pierden actividad
en los procesos de congelación y descongelación, por lo que es recomendable generar pequeñas alı́cuotas de la disolución madre o incluso
una nueva, cada vez que se realiza el experimento.
El 5’-desoxi-5-fluorouracilo (5’DFUR), el 5-fluorouracil (5-FU) y
el cis-diaminodicloroplatino (II) (Cisplatino) se comercializan en polvo (Sigma) y son estables a temperatura ambiente. La solución madre de 5’DFUR se prepara a una concentración de 100 mM en agua.
En el caso de 5-FU y Cisplatino la solución madre (100 mM ) se
disuelve en DMSO y las soluciones posteriores en agua. Las alı́cuotas se guardan congeladas a -80o C. La gemcitabina (Gemzar; 2’,2’difluorodesoxicitidina) es una donación de Lilly S.A. (Madrid, España). Hay que tener en cuenta para su preparación, que al partir
del fármaco comercial, la cantidad de principio activo (gemcitabina)
es de 48,3 g por 100 g de Gemzar. Tras la resuspensión en agua, las
alı́cuotas se guardan congeladas a -80o C.
3.3.
Ensayos de citotoxicidad: Curvas dosisrespuesta
El análisis de la citotoxicidad de un fármaco se basa en la valoración de la supervivencia luego de la exposición a dicho fármaco. Existe
una gran variedad de métodos para determinar la citotoxicidad, los
cuales se basan en medir la proliferación celular (cuantificación de incorporación de [3 H]-timidina al DNA), la viabilidad celular (reducción
de sales de tetrazolium, exclusión de azul de tripán, actividad luciferasa como indicador de ATP) o apoptosis (marcaje con anexinaV). La
elección del método depende del tipo de fármaco, del tipo celular y de
la metodologı́a disponible. Las curvas dosis-respuesta se representan
como viabilidad relativa tomando como 100 % de viabilidad el número
de células del cultivo control, en ausencia de fármaco. Utilizando el
software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software) cada conjunto de
datos se ajusta a una curva dosis-respuesta sigmoidal, lo que permite
obtener un valor de IC50 , que corresponde a la dosis de fármaco que reduce la viabilidad en un 50 %. En esta tesis se ha utilizado el método
de reducción de sales de tetrazolium. El ensayo con MTT (bromuro de 3-(4,5- dimetietiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium) es un método
cuantitativo colorimétrico para medidas de proliferación celular, viabilidad y citotoxicidad que se basa en la reducción de esta sal. Como
consecuencia de esta reacción, la sal de color amarillo forma cristales azul oscuro de formazán que pueden ser solubilizados en DMSO
70
u otro disolvente orgánico. La densidad óptica de este compuesto disuelto correlaciona con el número de células metabólicamente activas,
ya que sólo aquellas células con actividad succinato deshidrogenasa
son capaces de provocar la rotura de la sal de tetrazolium. En esta
memoria el ensayo de citotoxicidad mediante MTT se ha utilizado en
las lı́neas celulares EGI-1, TFK-1, BCLC-12, Mz-ChA-1, Mz-ChA-2
y NP-29.
Procedimiento:
Las células se siembran a la confluencia adecuada, en nuestro caso
50000 células/cm2 . Posteriormente, se incuban con dosis crecientes
del fármaco en estudio durante 24 h. Es necesario dejar pocillos sin
tratar para poder usarlos como controles y relativizar el resto. Pasado
este tiempo el fármaco es retirado y reemplazado por medio completo
fresco. 48 h después, se prepara una solución de 7.5 mg/ml de MTT
en PBS (el MTT es fotosensible y se debe mantener envuelto en papel
de aluminio a 4o C) y se mezcla con medio completo no estéril en una
proporción 1: 9. Se aspira el medio de las células y se añaden 100 µl de
la mezcla preparada, dejándose incubar entre 30-45 minutos a 37o C.
Pasado este tiempo se forma un precipitado violáceo que se encuentra
en el interior de las células y que es visible a simple vista. Se aspira
el medio y se añaden 100 µl de DMSO no estéril en cada pocillo de
la placa de 96 pocillos para disolver los cristales. Finalmente se lee la
Absorbancia a 550 nm.
3.4.
Transporte de Nucleósidos
El método utilizado para la medida de la captación de nucleósidos
y análogos de nucleósidos en cultivos celulares en monocapa y polarizados, consiste en la incubación simultánea de las células con unas
concentraciones conocidas de sustrato no radiactivo (frı́o) y sustrato
marcado radiactivamente durante un tiempo determinado. La proporción entre ambos vendrá determinada por la actividad especı́fica
del sustrato radioactivo; teniendo en cuenta que es necesario disponer
de marcaje suficiente para que pueda ser detectado y que la cantidad de sustrato restante hasta conseguir la concentración deseada se
completará con sustrato frı́o. El tiempo durante el que se realiza el
transporte ha de ser tal, que la reacción de transporte se encuentre
dentro del rango de velocidad inicial, en el que la cantidad de sustrato
transportado es directamente proporcional al tiempo de incubación.
Tras la parada de la captación de ambos sustratos, la lisis celular y la
71
posterior solubilización en lı́quido de centelleo, es posible la determinación de la cantidad total sustrato captado midiendo la radiactividad
incorporada.
Medios de transporte, reactivos y materiales
Medios de transporte:
Medio de transporte con sodio: NaCl 137 mM, KCl 5.4 mM,
CaCl2 1.8 mM, MgSO4 , 1.2 mM, Hepes 10 mM. Se ajusta a pH
7.4 con Tris-Base 1M
Medio de transporte con colina: La composición es idéntica a la
del medio anterior, si bien se substituye el cloruro de sodio por
cloruro de colina 137 mM. Análogamente se ajusta el pH a 7.4
con Tris-Base
Solución Stop: NaCl 137 mM, Hepes 10 mM. Esta solución se
ajusta también a pH 7.4 con Tris-Base 1 mM
Otros reactivos y materiales necesarios:
Solución de lisis: Tritón-X100 0.5 %, NaOH 100 mM para ensayos en monocapa y SDS 0.1 %, NaOH 100 mM para ensayos en
transwell
Lı́quido de centelleo Ecolite (ICN)
Kit de valoración de proteı́nas (Pierce)
Lector de Absorbacia rango visible, para microplacas de 96.
Contador de radioactividad β (Packard 1500 Tri-Carb)
Stocks de citidina, guanosina, uridina, NBTI, dipiridamol, 5’DFUR,
5-FU, gemcitabina, Cisplatino a concentraciones de 1 a 100 mM
Nucleósidos y análogos de nucleósidos marcados con tritio: [53 H(N)]citidina, [8-3 H]guanosina, [5,6-3 H]uridina (Amersham Pharmacia Biotech).
3.4.1.
Transporte de células en monocapa
Los estudios de captación de los diferentes sustratos analizados
(nucleósidos y análogos de nucleósidos) se pueden realizar a distinta
confluencia celular, dependiendo del tipo celular y, generalmente, en
placas de 24 pocillos.
72
Preparación de los medios de transporte
Una vez preparados los medios de transporte y atemperados a
tanto el medio sodio como el medio colina se suplementan con
el nucleósido para una concentración final de 1 µM y un volumen
determinado del nucleósido marcado correspondiente, que asegure 1
µCi por mililitro de medio de transporte.
El ensayo con ambos medios se realiza en las mismas condiciones de modo que la sustracción de los valores de captación en medio
sin sodio a aquéllos obtenidos en medio con sodio permite conocer
el transporte dependiente de sodio, es decir, de tipo concentrativo.
Alternativamente, los valores de captación independientes de sodio
corresponderán a la sumatoria del transporte mediado por los transportadores equilibrativos y la difusión pasiva, que es prácticamente
despreciable en los tiempos ensayados.
37o C,
Ensayo de transporte de células sembradas en monocapa
En el momento de realizar el ensayo, las células se extraen del incubador y se lavan dos veces con medio sodio o colina previamente
atemperados para eliminar los restos de medio de cultivo. En el momento en el que retiramos el último lavado, aspiramos cualquier resto
lı́quido y ponemos el medio radiactivo de transporte, comienza el ensayo de captación (230 µl por pocillo y cada punto por cuadruplicado).
Concluido el proceso de incubación con el medio radiactivo, se retira
rápidamente y se sustituye por la solución de parada que se encuentra
a 4o C. Al realizar dos lavados con esta solución, la captación se detiene debido al cambio de temperatura y a la dilución realizada con los
lavados. Nuevamente, nos aseguramos de aspirar cualquier resto que
haya quedado de la solución de parada y, a continuación añadimos
100 µl de la solución de lisis permitiendo la liberación del contenido
intracelular. La placa se deja en agitación horizontal durante 30-60
minutos a temperatura ambiente. A continuación se homogeniza el
lisado resultante, se guarda una alı́cuota de 10 µl para la valoración
de la cantidad de proteı́na y el resto se recoge en viales a los que se
añade lı́quido de centelleo. Este último permite convertir la energı́a
de la partı́cula emitida durante el proceso de decaimiento radiactivo
en luz, la cual es detectada por el contador de centelleo.
3.4.2.
Medidas de transporte en transwell
Aproximadamente unas 2 horas antes de realizar las medidas de
captación se cambia el medio de las placas de cultivo por medio fresco.
73
Antes de comenzar el ensayo de captación, se realizan dos lavados en
medio sodio o colina, aspirando primero el medio basal y después el
apical de los tres primeros insertos de la placa, prestando atención de
añadir primero el medio de lavado en el lado apical y después en el
basolateral para evitar la des-estructuración del epitelio formado. Tras
los dos lavados se añaden 500 µl del medio de transporte en la cámara
que corresponda (apical o basolateral) y el tampón correspondiente
en la cámara opuesta (sodio o colina). Para determinar la velocidad
inicial, dos minutos después de añadir el medio radiactivo, éste se
aspira y se lava dos veces con medio stop que se mantiene a 4o C. Una
vez finalizado el ensayo, se detiene el transporte con la solución de
Stop. A continuación se elimina totalmente cualquier resto de solución
de parada y se dejan secar los filtros.
Posteriormente cada uno de los filtros se separa del soporte de la
placa de transwell , se coloca dentro de un eppendorf al cual se le
añaden 300 µl de tampón de lisis (SDS 0.1 %, NaOH 100 mM) y se
incuban en agitación durante dos horas a 37o C. Una vez las células
han sido lisadas, se resuspenden con la ayuda de una micropipeta. Del
homogenizado resultante, se recogen 10 µl para la determinación de
proteı́na (por duplicado) y 100 µl para depositar dentro de viales con 3
ml de medio de centelleo, de donde se obtendrá la tasa de acumulación
intracelular del sustrato radiactivo.
Cálculos
Los valores de la radiactividad asociada a cada muestra, en desintegraciones por minuto (DPM), se relativizan a la cantidad de
proteı́na correspondiente. Este cálculo es imprescindible para corregir posibles diferencias en la cantidad de células, tanto intra- como
inter-experimento. El cálculo a realizar es el siguiente:
Actividad(pmol/mg ∗ prot) =
DP Mmuestra ∗ 103
AE ∗ Vmuestra ∗ [prot(µg/µl)]
(3.1)
Donde AE corresponde a la actividad especı́fica del medio radiactivo utilizado en DPM/pmol.
Valoración de la concentración de proteı́na
A pesar de que se intenta realizar una siembra homogénea, el
número de células por pocillo nunca es idéntico. Esta diferencia hay
que tenerla en cuenta para que los resultados de las diferentes medidas de transporte sean comparables entre sı́, es por eso que los valores
74
de captación de nucleósidos se corrigen por la concentración de proteı́na de cada muestra. La valoración de proteı́na se realiza mediante
el método del ácido bicinconı́nico (BCA) para la detección y cuantificación de proteı́na total. Este método combina la reducción de Cu+2
a Cu+ en medio alcalino (reacción de Biuret) con la elevada y selectiva reacción colorimétrica del catión Cu+ con el ácido bicinconı́nico.
El color purpura final de la reacción se genera como resultado de la
quelación de dos moléculas de BCA con un ión Cu+ ; este complejo
presenta una elevada absorbancia a 562 nm y es prácticamente lineal
entre 20 y 2000 µg/mL de proteı́na. La estructura macromolecular
proteı́ca junto con el número de enlaces peptı́dicos y la presencia de
determinados aminoácidos (cisteı́na, triptófano y tirosina) son los responsables de la formación del color por su interacción con el BCA.
Las disoluciones comerciales de “BCATM Protein assay kit” de
Pierce se mezclan en un proporción 1:50 y se dispensan 200 µl por
pocillo de placa de 96 donde previamente hemos cargado los 10 µL de
cada una de las muestras. En paralelo se prepara un recta patrón con
albúmina sérica bovina (BSA) a concentraciones 0, 125, 250, 500,1000,
2000 µg/ml, con el fin de extrapolar los valores de absorbancia de cada
muestra a 562 nm.
3.5.
Análisis de la expresión de proteı́nas
3.5.1.
Obtención de lisados celulares
Los lisados celulares se obtienen a partir de placas de cultivo de 60
o 100 mm sembradas con la lı́nea celular de interés o bien mediante
la homogenización de muestras de tejido.
Obtención de lisados crudos a partir de células en cultivo
Reactivos y material:
Tampón PBS: NaCl 0.14 M; KCl 2.7 mM, KH2 PO4 1.5 mM,
Na2 HPO4 .2H2 O 8.1 mM
Tampones de lisis: TRIS-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 250 mM,
NP-40 1 %, pirofosfato sódico 5 mM, NaF 50 mM y ortovanadato
sódico 1 mM
Complete TM Protease inhibitor cocktail tabletes (Roche)
Rascadores de células (scrapers) (Corning).
75
Procedimiento: Se elimina el medio de cultivo de las placas y se
realizan dos lavados con tampón PBS. Se aspiran los restos de tampón
y se disponen las placas en hielo. A partir de este momento todo el
procedimiento debe hacerse en hielo o a 4o C para evitar la degradación de las proteı́nas. Se añade tampón de lisis (habitualmente 70 µl
para placas de 60 mm y 150 µl para placas de 100 mm, aunque el volumen es dependiente de la densidad celular). Utilizando un rascador
se desenganchan las células y la suspensión resultante se incuba en
hielo durante 15 min, homogenizando cada 3-5 min con ayuda de un
vórtex. El lisado obtenido se centrifuga 5 min a 8000 x g y se recupera
el sobrenadante, el que puede ser conservado a -20o C.
Obtención de lisados a partir de homogenización de muestras
de tejido
Procedimiento: Se pesa el tejido, y se pulveriza utilizando un mortero estéril en nitrógeno lı́quido, a continuación se añade el tampón
de lisis con inhibidores de proteasas en relación 1/10 (p/v). Luego se
homogeniza la muestra. El lisado obtenido se centrifuga 5 min a 8000
x g y se recupera el sobrenadante, que puede ser conservado a -20o C.
3.5.2.
Electroforesis en SDS-PAGE
El sistema más clásico para la resolución de mezclas de proteı́nas
en función de su tamaño es la electroforesis en gel de poliacrilamida con Sodio DodecilSulfato (SDS) (Laemmli, 1970). Este sistema se
basa en tratar la mezcla de proteı́nas con un tampón que contiene el
detergente iónico SDS, de tal modo que se confiere una carga negativa
a las proteı́nas, pero se mantiene la relación carga/masa constante. La
mezcla de proteı́nas se hace correr por acción de un campo eléctrico
en una red formada por un polı́mero de acrilamida y bisacrilamida.
Reactivos y material:
Tampón de electroforesis: Compuesto por TRIS-Base 250 mM,
glicina 1,91 M y SDS al 1 %. Se prepara diez veces concentrado
y se conserva a temperatura ambiente
Tampón de carga: Se prepara cinco veces concentrado. Para 100
ml se necesitan 32 ml de tampón TRIS-HCl 1 M a pH 6,8, 10
g de SDS, 10 mg de azul de bromofenol, 50 ml de glicerol y se
enrasa con agua destilada hasta 100 ml. En el momento de su
76
utilización, se añade 2-mercaptoetanol a una concentración final
del 10 %, para que sea reductor.
Estándar Biorad que contiene marcadores de pesos moleculares
entre 14 y 220 KDa.
Aparato de PAGE: Sistema MiniProtean (Biorad) equipado con
una fuente de voltaje.
Geles de acrilamida: Se preparan con una disolución comercial
de acrilamida-bis-acrilamida al 30 % (Biorad). Es necesario prepararlos en el momento en que se realiza el ensayo.
El gel separador está formado por 4 ml de agua destilada, 3,3
ml de la disolución acrilamida-bis-acrilamida, 2,5 ml de tampón
TRIS-Base 1,5 M a pH 8,8, se añaden 4 µl de TEMED (Biorad)
que es el desencadenante de la reacción de polimerización.
El gel concentrador está formado por 2,7 ml de agua destilada, 0,67 ml de la disolución comercial de acrilamida, 0,5 ml de
tampón TRIS 1M a pH 6,8, 40 µl de SDS al 10 %, 40 µl de
persulfato amónico al 10 % y 4 µl de TEMED.
Preparación de las muestras: Generalmente se usan 10-40 µg de
muestra dependiendo del origen de la muestra y la sensibilidad del
anticuerpo primario, en un volumen final de 20-40 µl en función de la
concentración proteica y el tipo de pocillo que se use. Por tanto, se
coloca el volumen necesario de muestra para la cantidad de proteı́na
que se desea y, se añade tampón de carga 5x y agua destilada con la
intención de conseguir un mismo volumen y una misma cantidad de
todas las muestras. De esta forma se garantiza una carga homogénea
y precisa de las diferentes muestras, que a efectos de un posterior
análisis cuantitativo es considerada de vital importancia. Finalmente,
con el objetivo de conseguir la desnaturalización de esta mezcla, las
muestras se llevan a ebullición durante 5 minutos, aunque en el caso de la detección de transportadores de nucleósidos las muestras se
mantienen durante 30 min a 37o C
3.5.3.
Inmunoblotting
Para realizar el ensayo de inmunoblot, las proteı́nas separadas en
gel de poliacrilamida son transferidas electroforéticamente a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF, donde son detectadas por anticuerpos que reconocen los antı́genos que hay en ellas.
77
Electrotransferencia de proteı́nas
Reactivos y material:
Tampón de transferencia: Tris base 25 mM, glicina 192 mM y
metanol al 20 % (v/v)
Metanol
Papel de filtro Whatman 3MM
Membrana Immobilon-P Transfer Membrane (Millipore)
Aparato de transferencia de geles a membranas. Sistema Mini
Protean (Bio-Rad)
Procedimiento: Al acabar el proceso de electroforesis se coloca el
gel separador en tampón de transferencia durante unos minutos mientras se prepara la transferencia. Se corta un trozo de membrana con
las mismas medidas que el gel (5 x 9 cm) y se activa sumergiéndola en
metanol absoluto durante un minuto. Pasado este minuto, se lava con
agua destilada y la dejamos reposar en tampón de transferencia hasta
el momento de montar la transferencia. Además de la membrana, se
cortan 6 trozos de papel Whatman, también con las mismas medidas
de la membrana y se sumergen en tampón de transferencia. Se realiza
el montaje de transferencia colocando tres papeles Whatman, el gel,
la membrana y otros tres papeles Whatman, todo entre dos esponjas,
evitando la formación de burbujas entre el gel y la membrana y asegurando una correcta transferencia. Este sándwich se coloca en la cubeta
llena de tampón de transferencia agitado continuamente por una barra magnética. Además, para evitar el calentamiento del tampón y del
resto del montaje, se añade una cubeta con hielo. Se conecta a una
fuente de voltaje y se aplica un voltaje de 100 V durante 45-90 min
dependiendo del grosor del gel y del peso molecular de la proteı́na a
detectar.
Inmunodetección
La inmunodetección se basa en un procedimiento indirecto en el
cual la interacción entre el antı́geno fijado en el filtro y el anticuerpo
primario se detecta mediante la reacción de la peroxidasa de rábano
que se encuentra ligada al anticuerpo secundario.
Reactivos y material:
78
Solución PBS-Tween 0.2 %
Solución de bloqueo y de dilución de anticuerpos: Leche desnatada en polvo al 5-10 % (p/v) disuelta en PBS-Tween 0.2 %. En
el caso de reutilización del anticuerpo, normalmente anticuerpos comerciales, es preferible utilizar una solución de albúmina
sérica bovina (Sigma) al 1 % (p/v) en PBS-Tween 0.2 %
Finalizada la electrotransferencia de proteı́nas, se procede a bloquear los lugares inespecı́ficos de la membrana. Para ello introducimos
la membrana de nitrocelulosa en una bolsa de plástico con 10 ml de
una solución rica en proteı́nas (PBS-Tween 0.2 % con 10 % leche) durante una hora a temperatura ambiente o, alternativamente toda lo
noche a 4o C. Una vez acabado el bloqueo, la membrana se incuba
con el anticuerpo primario a la dilución correspondiente en 5 ml de la
solución de bloqueo (5 % leche). La incubación se realiza durante un
mı́nimo de una hora a 37o C o toda la noche a 4o C y con agitación suave de forma que toda la membrana pueda mantener el contacto con
el anticuerpo. Al terminar la incubación, la solución de anticuerpo
primario se puede recuperar, conservándola a 4o C. Retirado el anticuerpo, el siguiente paso es eliminar el exceso de anticuerpo en la
membrana. Para ello, se realizan 3 lavados de 10 minutos con TBSTween 0.1 % con agitación suave y a temperatura ambiente. Después
de los lavados, la membrana se incuba con el anticuerpo secundario en solución de bloqueo (5 % leche). La incubación es similar a la
realizada con el anticuerpo primario y una vez finalizada también se
realizan tres lavados de 10 minutos de duración, el primero de ellos
con TBS-Tween 0.1 % y los otros dos solamente con TBS.
La lista de los anticuerpos utilizados se muestra en la Figura 3.4
Figura 3.4: Tabla resumen de las condiciones de uso de los anticuerpos utilizados
en los ensayos de inmunodeteción.
79
Revelado utilizando ECL y análisis
La detección del anticuerpo secundario, acoplado a la peroxidasa, permite localizar la unión especı́fica del anticuerpo primario a la
proteı́na de interés. Basados en este principio, se utiliza un método quı́mico (Enhanced ChemiLuminiscesce) que facilita la detección
luminiscente de antı́genos especı́ficos inmovilizados y conjugados de
forma directa o indirecta con anticuerpos marcados con peroxidasa
de rábano. La visualización final de los resultados se recoge en una
autorradiografı́a.
Procedimiento: Después de finalizar el último lavado con PBS, cubrimos la membrana durante un minuto con 0,3 ml del reactivo ECL.
Este reactivo se prepara mezclando en igual proporción dos soluciones
que provee la casa comercial. Después del minuto de incubación, se
seca la membrana del exceso de reactivo y se introduce en un plástico. Para revelar la membrana, se expone en una cámara fotográfica de
elevada sensibilidad, LAS 3000. El análisis de las imágenes obtenidas
se lleva a cabo usando el software Adobe Photoshop CS4.
3.5.4.
Inmunocitoquı́mica
La inmunocitoquı́mica es una técnica que permite el estudio de la
localización de determinadas moléculas dentro de la célula. Lo más
habitual es la detección de dichas moléculas mediante el uso de anticuerpos especı́ficos unidos a un fluorocromo o bien el uso secuencial
de dos anticuerpos: el primario, especı́fico contra la proteı́na de interés, y el secundario marcado con el fluorocromo, de esta manera es
posible amplificar la señal. El uso de diferentes anticuerpos permite la
localización simultánea de varias proteı́nas, permitiendo determinar
su localización relativa en el seno de la célula.
Fijación de las muestras y montaje
Reactivos y material:
Cubreobjetos de 12 mm de diámetro
Solución de lavado: PBS pH 7.4 suplementado con 1 mM de
CaCl2 y 1 mM MgCl2 /PBS-20 mM glicina, pH 7.4
Solución de fijación: 4 % paraformaldehido/ PBS, pH 7.4
Procedimiento: Se disponen los cubres en los pocillos de una placa de 24 pocillos y se esterilizan durante 10-15 minutos con UV. Se
80
siembran las células y cuando éstas están a punto para ser ensayadas se aspira el medio y se realizan dos incubaciones de 5 min con
la solución de lavado. La presencia de 1mM de CaCl2 y MgCl2 tiene
por objetivo evitar el desprendimiento de las células de la superficie
del cubreobjetos. A continuación se aspira el medio de lavado y las
células se fijan durante 15 min con la solución de fijación que contiene
paraformaldehido, tras lo cual se realizan dos lavados de 10 min con
PBS-20 mM glicina que permiten la eliminación del paraformaldehido sobrante. Hasta este punto tenemos el protocolo normalizado de
fijación de las células.
Inmunodetección
La inmunodetección supone la detección de nuestra proteı́na de
interés mediante anticuerpos.
Reactivos y material:
Solución de permeabilización: PBS -20 mM glicina, 0.1 % Tritón
X-100, pH 7.4
Solución de bloqueo: PBS -20 mM glicina, 0.1 % Tritón X-100,
1 % Albúmina sérica bovina (BSA), pH 7.4
Anticuerpos primarios y secundarios marcados con fluorocromo
(Figura 3.5)
Portaobjetos
Medio de montaje: AquaPoly Mount (Polysciences Inc.)
Figura 3.5: Tabla resumen de las condiciones de uso de los anticuerpos utilizados
en los ensayos de inmunicitoquı́ca.
Procedimiento: En los casos en los que se pretende que un anticuerpo penetre al interior de las células se procede entonces a la permeabilización de las células durante 10 min con la solución de permeabilización. En este caso, el agente que permite la entrada del anticuerpo es
81
el Tritón X-100, el cual se recomienda mantener en las incubaciones
posteriores. Todas las incubaciones de este procedimiento se deben
realizar en suave agitación orbital. Con el objetivo de evitar la unión
inespecı́fica de los anticuerpos, los cubreobjetos con las células permeabilizadas se incuban con la solución de bloqueo durante 45 min
en agitación, y a continuación se puede proceder a la incubación con
50 µl del anticuerpo primario a la dilución correspondiente, durante
1 hora a TA ó ON a 4o C. Para realizar este paso se puede disponer
el anticuerpo en forma de gota en un trozo de papel de parafina y
colocar cuidadosamente con unas pinzas el cubreobjetos sobre la gota
evitando la formación de burbujas de aire. Se recomienda poner los
cubreobjetos en una cámara húmeda para evitar excesiva evaporación. Para eliminar correctamente el anticuerpo no unido se vuelven a
colocar los cubreobjetos en la placa de 24 pocillos y se realizan tres lavados de 10 min con la solución de bloqueo. A continuación se incuba
1 hora con 50 µl de anticuerpo secundario, siguiendo el mismo procedimiento que con el primer anticuerpo. En este caso sin embargo, se
debe tener la precaución adicional de proteger las muestras de la luz
para evitar la degradación del fluorocromo. Se realizan los tres últimos
lavados con la solución de bloqueo y se montan los cubreobjetos sobre
el portaobjetos con una gota de medio de montaje evitando la formación de burbujas de aire y el contacto con la luz. Una vez el medio
de montaje haya gelificado las muestras ya están listas para su observación en el microscopio de fluorescencia. Para el correcto análisis de
la expresión de las diferentes proteı́nas se deben realizar una serie de
controles en paralelo. Lo más habitual es un control de autofluorescencia (sin incubar con ningún anticuerpo) un control de incubación
única con anticuerpo secundario, y un control de entrecruzamiento de
anticuerpos si se realiza un doble marcaje.
3.5.5.
Análisis de resultados por microscopia confocal
El análisis de las preparaciones se puede hacer mediante microscopia de epifluorescencia o confocal. En este caso todas la imágenes mostradas se captaron en el microscopio confocal espectral Leica TCS-SP5 del Centro Cientı́fico Tecnológico de la Universitat de
Barcelona, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63x. Las
imágenes se procesaron posteriormente mediante el software ImageJ
(www.macbiophotonics.ca/downloads.htm).
82
3.6.
3.6.1.
Análisis de la expresión de RNA
Obtención de RNA total
La purificación de RNA a partir de cualquier tipo de muestras de
partida se puede realizar utilizando diferentes alternativas. En esta
tesis se han utilizado kits comerciales con los que se maximiza el rendimiento y minimiza el tiempo empleado. Pero antes conviene saber
de la extrema fragilidad del RNA y la presencia de RNAasas endógenas y exógenas en la práctica totalidad de los objetos que entran en
contacto con los seres humanos. Por tanto, es necesario tener en cuenta una serie de medidas antes y durante su manipulación con el fin de
evitar la contaminación y degradación de la muestra. Se debe trabajar con guantes y utilizar material especı́fico libre de RNA asas. Por
consiguiente, el material de vidrio ha de estar perfectamente limpio y
autoclavado, ası́ como las puntas y pipetas utilizadas durante el proceso. Además, las disoluciones se tienen que preparar con agua-DEPC
(tratada con en inhibidor de RNAasas).
Procedimiento: El kit comercial utilizado para la extracción de
RNA desde cultivos celulares es el SV Total RNA Isolation System
(Promega), el cual requiere de cuatro pasos para la satisfactoria purificación del ARN: la disrupción de las células o tejidos, desnaturalización de los complejos de nucleoproteı́nas, inactivación de la actividad
de las ribonucleasas endógenas y la eliminación del DNA y proteı́nas
contaminantes. Cuando se trabaja con lı́neas celulares, normalmente
se parte de placas de 100 ó 60 mm en las cuales después de dos lavados
con PBS frı́o se añade el tampón de lisis. En este primer paso de lisis
celular se utilizan las propiedades disruptivas y protectoras del tiocianato de guanidina (GTC) y el beta-mercaptoetanol para inactivar las
ribonucleasas presentes en los extractos celulares. El GTC disgrega los
complejos nucleoproteicos en asociación con el SDS, de manera que se
aı́sla el RNA libre de proteı́nas. La dilución de los extractos celulares
en presencia de altas concentraciones de GTC causa la selectiva precipitación de proteı́nas celulares, mientras que el RNA permanece en
solución. A continuación el RNA se precipita con etanol y se purifica
mediante una columna de sı́lice a la que se une rápidamente. Además,
se aplica DNasa I libre de RNAasas sobre la columna para eliminar
la posible contaminación con DNA, ya que este podrı́a servir como
molde en la reacción en cadena de la polimerasa e inducir falsos positivos. Una vez finalizado el tratamiento con la DNAasa I, se realizan
una serie de lavados para eliminar las últimas impurezas que pudiera
83
mantener el RNA y finalmente se eluye con agua libre de nucleasas.
Para la extracción de RNA desde muestras de tejido, se utilizó el
reactivo TriPure (Roche), el cual detiene la rápida degradación que
sufre el RNA tisular durante la extracción desnaturalizando todas las
proteı́nas celulares por la acción de las sales de guanidinio. Además,
permite la extracción simultánea de RNA y proteı́nas. El tejido fue
pesado, homogenizado y pulverizado en un mortero con Nitrógeno
lı́quido. Se agregó 1 ml de Trizol por cada 10 mg de tejido.
La mezcla se centrifuga a 12,000 x g por 10 min a 4o C. El sobrenadante enriquecido en proteı́nas, RNA y DNA es retirado y transferido
a un tubo estéril de propileno, al que se le agregó 0.2 ml de cloroformo
por cada 1 ml de TriPure inicial. Se incubó 15 min y se centrifugó 12,
0000 x g durante 15 min a 4o C. En el tubo se separa tres fases, de las
cuales se toma la fase acuosa superior (traslúcida) y se transfiere a un
nuevo tubo, agregando 0.5 ml de isopropanol 100 % por cada ml de
TriPure inicial para precipitar el RNA y separalo del DNA. ) El pellet
de RNA total, se lava con etanol al 75 % y tras centrifugarlo y retirar
el exceso del alcohol, se resuspende en 30-100 µl de agua-DEPC a
60o C.
3.6.2.
Análisis de la calidad y cantidad del RNA aislado
Cuantificación por espectrofotometrı́a
Los ácidos nucleicos presentan un máximo de absorción a una longitud de onda de 260 nm, mientras que las proteı́nas, posibles contaminantes, lo presentan a 280 nm. La longitud de onda de 260 nm
indica la concentración del RNA, la relación entre las dos longitudes
de onda proporciona información de la integridad y calidad de los ácidos nucleicos. La relación óptima DO260/DO280 se encuentra entre
1.8 y 2.0. Si esta relación es superior, los ácidos nucleicos podrı́an estar degradados, mientras que una relación inferior a 1.8 indicarı́a una
presencia excesiva de proteı́nas en nuestra muestra. También se debe
tener en cuenta la relación DO260/DO230, porque aunque menos frecuente, el RNA puede presentar contaminación por azúcares. En esta
memoria se ha utilizado para cuantificar ácidos nucleicos el espectrofotómetro de placas (Magellan Biosciences, WA, USA). Este aparato
es sensible y permite mayor reproducibilidad y sobretodo minimiza el
tiempo y la cantidad de muestra. Una gota de 2 µl es suficiente para
determinar de forma automática la concentración y calidad del RNA.
84
3.6.3.
Sı́ntesis de cDNA: Retrotranscripción
Una vez aislado el RNA se procede a la sı́ntesis del DNA complementario (DNAc) que servirá como molde en la reacción de PCR.
En la reacción de retrotranscripción se puede utilizar como RNA molde tanto RNA total como RNA mensajero (mRNA). Se usa mRNA
cuando se quiere aumentar la amplificación de RNAs mensajeros poco abundantes, ya que la proporción de éstos con respecto al RNA
total es de 1-5 %. La retrotranscripción se lleva a cabo utilizando la
enzima transcriptasa reversa, de origen viral. Las más usadas son la
del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) o del virus de
la mieloblastosis aviar (AMV). En nuestro caso, teniendo en cuenta
algunos factores como longitud del molde, temperatura óptima, requerimientos iónicos y la actividad ribonucleasa intrı́nseca (RNAasa
H) se decidió utilizar la retrotranscriptasa M-MLV. Además de la enzima, el RNA molde y los dNTPs, la reacción necesita cierto tipo de
oligonucleótidos sintéticos. Esta elección dependerá de la calidad del
RNA de partida y del tamaño y la especificidad del DNA que se quiera
obtener.
Oligo(dT)12-18. Es recomendable cuando el RNA es de alta calidad. Se unen a la cola de poli(A) endógena de mRNA para
producir cDNA completos (full-length)
Hexanucleótidos aleatorios. Este tipo de oligos es recomendable
cuando se tiene mRNA fragmentado (longitud < 500 bases). Se
unen a diferentes lugares del RNA y se generan cDNA cortos.
Son ideales para evitar estructuras secundarias en el molde y
transcriben de forma más eficaz la regiones 5‘ .
Oligonucleótidos especı́ficos. Se unen únicamente al gen de interés y es recomendable cuando se amplifica transcritos poco
abundantes.
Procedimiento: La sı́ntesis de cDNA se inicia partiendo de 1 µg
de RNA total utilizando hexanucleótidos como oligos en la reacción
de la M-MLVRT. El primer paso es la desnaturalización del RNA a
65o C durante 5 min, tras el cual, el RNA se deposita inmediatamente
en hielo y se añade una mezcla que contiene el tampón de la enzima,
DTT 10 mM, dNTPs 500 µM cada uno, 10 µg/ml de Random hexamer
(Promega), 0.75 U/µl de RNAsin (Promega) y 7.2 U/µl de M-MLVRT
(Gibco, Life Technologies). La reacción se incuba 2 h a 37o C y se acaba
con la inactivación de la enzima, 10 min a 65o C.
85
3.6.4.
Real-Time PCR (PCR a tiempo real)
Esta aplicación a diferencia de la PCR convencional donde solamente se puede detectar el producto de amplificación en el punto final
de la reacción, permite la detección del producto de PCR a medida
que se acumula. De este modo, se puede tomar la fase exponencial de
la reacción como punto óptimo para analizar los datos.
Por tanto, la Real-Time PCR proporciona un método más especı́fico, sensible y reproducible de cuantificar el número de copias de una
muestra o comparar niveles de expresión entre diferentes muestras.
En nuestro laboratorio el sistema escogido es el sistema Taqman de
Applied Biosystems, basado en el uso de una sonda fluorogénica. Ésta
consta de un marcador fluorescente en su extremo 5‘ y un reductor
de emisión (quencher ) en el extremo 3‘ . Mientras la sonda permanece
intacta, unida al DNA, el reductor puede actuar evitando la emisión
de fluorescencia.
Al realizarse la amplificación, la Taq polimerasa provoca la degradación de la sonda gracias a su actividad 5‘ nucleasa, lo que provoca la
separación del marcador y el reductor permitiendo la emisión de fluorescencia. En cada ciclo se liberan progresivamente nuevas moléculas
fluorescentes, produciendo una señal proporcional a la cantidad de
amplicón producido. Durante los primeros ciclos de la PCR prácticamente no se observan cambios de fluorescencia, hecho que nos define
la lı́nea basal (baseline). Un incremento de fluorescencia por encima
de esta lı́nea indica la detección del producto de PCR acumulado.
Se fija un lı́mite (threshold ) de fluorescencia por encima de la lı́nea
basal, de esta manera se denomina Ct (Ciclo lı́mite) al ciclo en que la
fluorescencia supera el lı́mite fijado. Es posible realizar una cuantificación relativa del mensajero diana mediante la comparación de sus
Ct. Se trata de una técnica equivalente a una PCR semicuantitativa
y como en ésta, se utiliza un control endógeno normalizador. El control endógeno debe mantenerse invariable en las diferentes condiciones
experimentales, razón por la que se utilizan los genes housekeeping.
En la presente memoria se ha recurrido tanto a la cuantificación
relativa como a la absoluta de los transportadores de nucleósidos,
utilizando como control endógeno los genes de las proteı́nas GAPDH o
β-glucuronidasa (β-GUS), ya que son de uso habitual por su expresión
constitutiva.
86
Diseño de primers
Las sondas y primers que se han utilizado en esta memoria han
sido sintetizados por Applied Biosystems (ABI). Para amplificar los
transportadores de nucleósidos fueron diseñadas usando el software
Primer de ABI y optimizados en nuestro grupo. Sin embargo, las
sondas y primers utilizados como los controles endógenos fueron diseñados y validados por ABI (Assay on Demand Gene Expression),
por lo que no se dispone de la secuencia exacta (Figura 3.6).
Figura 3.6: Tabla resumen de las sondas utilizadas para el análisis por Real-Time
PCR
Reactivos y material:
Aparato ABI PRISM 7700 Sequence Detection System
Sondas Taqman y primers (Figura 3.6)
Taqman Universal Master Mix
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ABI PRISM Optical Adhesive Cover Starter Pack
ABI PRISM 96-well Optical Reaction Plate
Todo lo necesario se ha adquirido en Applied Biosystems.
Procedimiento: Para esta técnica es importante trabajar con guantes, soluciones estériles y material de plástico también estéril con el
fin de evitar la presencia de cualquier molécula de material genético
contaminante, ya que esta técnica es muy sensible y podrı́amos fácilmente obtener un falso positivo. Por este motivo las reacciones van
acompañadas siempre de controles negativos a los que no se le añade
el DNA molde.
En cada reacción de PCR se añade Taqman Universal Master Mix
2X, primers, sonda y 2.5 µl de cDNA hasta llegar a volumen final de
25 µl. Para la amplificación de las diferentes isoformas de los transportadores de nucleósidos se optimizó la concentración de sonda a
200 nM y la de primers a 400 nM. En el caso de las sondas y primers
diseñados por ABI (Assay on Demand Gene Expresión), éstos se encuentran en una solución 20X en condiciones óptimas para su uso. Al
igual que la secuencia de estas sondas y primers las concentraciones
son desconocidas para el usuario.
Utilizando este tipo de sondas y Master mix, Applied Biosystems
aconseja unas condiciones de PCR universales: Los tiempos temperaturas escogidos para la PCR son los parámetros universales propuestos
por Applied Biosystems. Los ensayos diseñados utilizando el software
y los reactivos Master mix de Applied Biosystems pueden ser realizados utilizando unos parámetros de PCR universales.
Las condiciones de la Real-Time PCR, se muestran el la Figura 3.7
Figura 3.7: Tabla resumen parámetros Real-Time PCR.
3.6.5.
Cuantificación relativa de la expresión génica
En esta tesis se ha utilizado la cuantificación relativa de la expresión génica de los transportadores de nucleósidos y receptores de
88
adenosina en las NRCs. La relación entre el Ct del gen diana y del
control endógeno proporciona un valor de Ct(n) normalizado de la
diana, que sirve para estandarizar la cantidad de cDNA añadido a la
reacción. Este valor no presenta ningún tipo de unidad y puede ser
utilizado para la comparación relativa de la cantidad de gen diana
entre diferentes muestras. Es necesario designar la muestra que proporciona el valor de 1 de expresión con el fin de poder comparar los
resultados. Existen dos alternativas: utilizar una muestra calibrada
a la que se refieren todos los resultados, o bien, dar el valor 1 a los
controles de cada experimento, que es la que se ha elegido.
Análisis de los resultados por el método de comparación de
Ct
En los siguientes puntos se detalla cómo calcular los resultados de
los experimentos realizados mediante esta técnica:
Calcular la Ct media de cada muestra para cada una de las
dianas y para el control endógeno
Calcular ∆Ct = Ctdiana - Ctcontrolendogeno
Calcular el error estándar (SE):
�
SE = (SEdiana )2 + (SEcontrol )2
(3.2)
Siempre que el número de réplicas sea el mismo para los dos
genes.
Calcular ∆∆Ct, resultado de la diferencia:
∆Ctmuestra - ∆Ctmuestracontrol
El SE de ∆∆Ct es el mismo que el de ∆Ct de la diana
Calcular la expresión de la muestra relativa al control, que es
2−∆∆Ct . El SE es el mismo que el de ∆∆Ct.
3.6.6.
Cuantificación absoluta de la expresión génica
La técnica de Real Time PCR nos permite también obtener el
número de copias de mensajero para un determinado gen, lo que nos
permite comparar genes entre si, a diferencia de la técnica anterior
que solo permite comparar el mismo gen en diferentes condiciones experimentales. La reacción de PCR es idéntica a la expuesta para la
cuantificación relativa y lo único que varı́a con respecto a esta es el
89
análisis de los resultados y la necesidad de una recta patrón.
Procedimiento: El elemento esencial es la recta patrón de cada gen
se quiera cuantificar, para ello necesitamos una construcción plasmı́dica de cada uno de ellos. El plásmido en el que se encuentre insertado
el gen no es importante, pero sı́ lo es su tamaño. En nuestro caso
se utilizaron rectas patrón de las construcciones hCNT1pcDNA3.1
Zeo (+), hCNT2 pcDNA3.1 Zeo (+) y hCNT3pcDNA3.1 Zeo (+),
hENT1pcDNA3.1 Zeo (+), hENT2pcDNA3.1 Zeo (+). Se mide la absorbancia a 260 nm y después sabiendo el tamaño de la construcción
y usando la relación pares de bases/ng se puede calcular el número de
copias de plásmido/µl. El siguiente paso consiste en diluir los plásmidos para hacer la curva (107 , 106 , 105 , 104 , 103 , 102 , 101 y 1 copias de
plásmido), la Real-Time PCR se carga con 2,5 µl de las diferentes
diluciones del plásmido. La recta patrón se obtiene de la representación gráfica del logaritmo de copias de plásmido frente a las Ct. En
paralelo se realiza la Real-Time PCR de las muestras de interés y el
valor de Ct obtenido para las diferentes muestras lo extrapolamos en
la recta patrón para obtener el logaritmo del número de copias del
mensajero del gen diana. Finalmente, la normalización de éste valor
por el volumen de muestra utilizado en la reacción y los µg de RNA
utilizados por muestra nos darán el valor de copias de mensajero del
gen diana/µg de RNA.
3.6.7.
Fast Real-Time PCR tarjetas microfluı́dicas (TDLAS)
Las tarjetas o placas microfluı́dicas (Microfluidic Cards o Low
Density Arrays) son placas de 384 pocillos, comercializadas por Applied Biosystems en diversos formatos. Esta tecnologı́a se basa en la
Real-Time PCR con las sondas Taqman de Applied Biosystems, pudiendo analizar una muestra por cada pocillo de la placa, es decir, 384
reacciones de PCR al mismo tiempo.
Entre las ventajas de su uso se encuentra que se puede diseñar la
placa a medida en función de las necesidades que requiera el estudio
que se pretenda realizar y que el volumen de cDNA que se utiliza para
cada reacción de PCR es mucho menor. Es un método sensible, fiable,
más barato que si se compran todas las sondas por separado y, sobre
todo, muy rápido.
Las sondas Taqman vienen liofilizadas en cada uno de los pocillos
y, en función del formato que se elija, se puede analizar la expresión
de entre 12 y 384 genes diferentes. Por ejemplo, si se escoje el formato
90
de 12, en la placa habrá 12 sondas diferentes por cuadruplicado y
se podrán analizar 8 muestras por placa. En cambio, si se escoje el
formato de 384, en la placa se tendrán 384 sondas diferentes y tan sólo
se podrá analizar una muestra por placa. En esta tesis se ha utilizado
el formato 48 de las tarjetas microfluı́dicas, en el cual se escogieron 45
genes y los controles endógenos GAPDH y β-GUS (Figura 3.8).
Los niveles de expresión de los diferentes genes pueden determinarse a partir de los datos de emisión de fluorescencia generados cuando
las tarjetas son procesadas en el equipo 7900HT de Applied Biosystems y analizadas con el software ABI PRISM SDS 2.2.2.
Análogamente a la Real-Time PCR, el análisis que realizamos es
una cuantificación relativa y se realiza por el método de comparación de Ct descrito anteriormente, usando β-GUS y GAPDH como
controles endógenos.
91
Figura 3.8: Tabla resumen de los genes incluidos en el análisis transcriptómico
con TLDAs
92
4
Resultados y Discusión
93
94
4.1.
4.1.1.
El purinoma en el colangiocito
Mecanismos de regulación de adenosina
Los transportadores de membrana tienen un rol fundamental el la
función de lo epitelios absortivos, facilitando la reabsorción y la secreción de moléculas de importancia fisiológica y farmacológica. Entre
estos sistemas de transporte, los transportadores de nucleósidos son
los responsables de la captación de los nucleósidos naturales, tales como adenosina. En el hı́gado su presencia es particularmente relevante,
ya que este órgano expresa los enzimas de la vı́a de recuperación de
nucleósidos y suministra estas moléculas a otros tejidos que carecen
de la vı́a de sı́ntesis de novo, como enterocitos y macrófagos [128].
Los hepatocitos y los colangiocitos son las células epiteliales del
hı́gado, y ambos tipos celulares participan en la producción de la bilis. Aun cuando los hepatocitos son la población celular mayoritaria
(65 %) y son las células que producen la bilis primaria en el canalı́culo, las células epiteliales que conforman el conducto biliar (5 %) son
las que a través de una serie de procesos de reabsorción y secreción,
diluyen y alcalinizan el fluido biliar durante su paso por el tracto biliar [135] [253] [138]. Existe numerosa información de los patrones de
expresión de los transportadores de adenosina, y de los mecanismos
de regulación de su actividad en hepatocitos [117] [254] [255]. Sin embargo, en colangiocitos, aún no existe evidencia funcional directa de
su presencia.
Para esta caracterización utilizamos como modelo de estudio las
células de conducto biliar intrahepático de rata (NRC, normal rat
cholangiocytes), tal como se ha explicado en el capitulo de Materiales
y Métodos (Sección 3.1.1). Para poner a punto las técnica de cultivo
de las NRCs, el proceso de aprendizaje se hizo en el Laboratorio de
Genética Molecular a cargo del Dr. JF Medina, en el Centro de investigación Médica Aplicada (CIMA), de la Universidad de Navarra en
Pamplona. En este laboratorio, la obtención de colangiocitos de rata
y ratón se hacen de forma regular.
Entre las ventajas de la utilización de NRCs, cabe destacar su
similitud al trabajo con cultivos primarios, ya que estas células son
extraı́das directamente del conducto biliar de la rata y son capaces
de conservar las caracterı́sticas funcionales del epitelio biliar hasta el
pase 25 [245].
95
Caracterización del transporte de nucleósidos
La primera aproximación en la determinación funcional de los
transportadores presentes en los colangiocitos, la hicimos utilizando
[3 H]-uridina, esto debido a que este nucleósido es el sustrato común
de todos los transportadores de nucleósidos. La Figura 4.1A, muestra
el time-course en el que se analizó el transporte total de nucleósidos
en función del tiempo, en las NRCs sembradas en monocapa (7 dı́as
después de alcanzada la confluencia). Los resultados mostraron transporte sodio-dependiente lineal con respecto al tiempo, con actividad
no saturable aun a los 10 min de ensayo. Lo cual puso en evidencia la
alta capacidad de internalización de nucleósidos de estas células aun
a tiempos altos. La actividad sodio-independiente (equilibrativa) fue
significativamente menor, a los 10 min de ensayo no superó valores de
5 pmol/mg proteı́na.
Esto podrı́a deberse al estado de diferenciación alcanzado por las
NRCs en la confluencia a la que son ensayadas, ya que se a descrito que a mayor contacto celular, células derivadas de epitelio renal
(LLC-PK1) detienen su crecimiento y entran en un estado de diferenciación [256]. En el caso de las células intestinales de rata (IEC-6),
cuando fueron expuestas a estı́mulos de diferenciación, incrementaban la expresión y la actividad de CNT1 y CNT2 y cuando eran
sometidas a estı́mulos proliferativos, se observaba aumento de la expresión de ENT1 [118]. La activación de mediante LPS provocó una
regulación positiva de los transportadores concentrativos en linfocitos
procedentes de médula ósea [257].
Una vez determinada la presencia de actividad de tipo concentrativa en las NRCs, el siguiente paso consistió en caracterizar dicha
actividad y determinar la/las entidades moleculares responsables del
transporte sodio-dependiente de uridina observado. De esta forma,
realizamos ensayos de inhibición cruzada de [3 H]-uridina, con concentraciones saturantes (100 µM) de los sustratos frı́os; guanosina, citidina y uridina (Figura 4.1B). La inhibición parcial del transporte de
[3 H]-uridina con citidina frı́a supuso la presencia de un transportador
de uridina inhibible por citidina (CNT1 y/o CNT3). La inhibición total del transporte de[ 3 H]-uridina con guanosina nos mostró que toda
la actividad de transporte observada corresponderı́a a transportadores de uridina inhibibles por guanosina, es decir CNT2 y CNT3. Es
decir, la inhibición completa del transporte de uridina con guanosina
y sólo parcial con citidina nos indicó que la actividad concentrativa
de las NRCs serı́a el resultado de la presencia de tanto CNT3 como
de CNT2.
96
Figura 4.1: Caracterización del transporte de nucleósidos en las células NRC.
A) Ensayo time-course del transporte de [3 H]-uridina. B) Inhibiciones de sustrato
para la determinación de la identidad molecular de los transportadores. C) Inhibición del transporte de [3 H]-citidina con concentraciones crecientes de guanosina.
D) Inhibición del transporte de [3 H]-guanosina con concentraciones crecientes de
citidina. E) Análisis del perfil de expresión de los transportadores en las NRCs, valores normalizados en relación a los niveles de mRNA en homogenizado de hı́gado
de rata. Los resultados se expresan como el promedio ± ES. de los valores de radioactividad obtenidos por cuatruplicado, y son representativos de 2-3 experimentos
llevados a cabo en diferentes dı́as con diferentes pases célulares.
Con el fin de obtener una aproximación de la proporción de cada
transportador con respecto a la sodio-dependencia total en las células,
realizamos un análisis de inhibición de la actividad de transporte con
cantidades crecientes de sustrato frı́o. Inhibiendo tanto el transporte
de [3 H]-guanosina con citidina (Figura 4.1C), como el de [3 H]-citidina
con guanosina (Figura 4.1D). Esta aproximación nos permitió confirmar los resultados del perfil de inhibiciones y además concluir que
ambos transportadores se encuentran en una proporción cercana al
50 % en estas células.
Tal como hemos expuesto en la introducción, en el riñón también es posible observar la presencia de CNT2 y CNT3 en distintos
segmentos de la nefrona. La adenosina es un modulador del feedback
túbulo-glomerular, y por esto la presencia de ambos transportadores
se atribuyó a la necesidad de un estricto control de las concentraciones extracelulares de adenosina [109]. Por sus caracterı́sticas cinéticas
CNT2 y CNT3, con mayor eficiencia, son los transportadores de mayor
capacidad de internalización de adenosina de la familia.
No nos fue posible determinar la identidad molecular responsable
del equilibrativo, debido a la baja actividad mostrada por las NRCs
97
(datos no mostrados).
El análisis por Real-Time PCR de los diversos transportadores,
confirmó los resultados funcionales mostrando expresión de CNT2 y
CNT3. Además observamos una elevada expresión de ENT2 en los
colangiocitos (Figura 4.1E). La baja actividad equilibrativa, a pesar
de los niveles detectados de mRNA, puede explicarse por el hecho de
que la expresión de los transportadores no va siempre asociada a la
aparición de la actividad correspondiente, ya que los transportadores
pueden expresarse y quedar retenidos intracelularmente. Este es el caso de CNT3 en células de pacientes con Leucemia linfática crónica.
Estas células mostraron elevados niveles de expresión de CNT3, sin
embargo fue detectado sólo en citoplasma y los ensayos de actividad
no mostraron transporte sodio-dependiente, por lo tanto su presencia
no contribuı́a al transporte de nucleósidos [258]. En nuestro laboratorio se han descrito los motivos del dominio N-terminal de CNT3
necesarios para su tránsito a membrana [259]. Y muy recientemente,
se ha descrito que ENT2 se encontrarı́a retenido en un dominio submembrana, y que su liberación a membrana plásmatica dependerı́a de
la inhibición de PKC (Tesis doctoral de Natalia Grañé Boladeras).
Debido a que guanosina es el sustrato natural de CNT3 y CNT2,
los ensayos de actividad posteriores a esta caracterización se realizaron utilizando [3 H]-guanosina y [3 H]-guanosina con 100 µM de citidina
frı́a, lo cual nos dio cuenta del transporte total (CNT3 + CNT2) y
del transporte especı́fico de CNT2, respectivamente. De esta forma,
en todos los experimentos realizando la diferencia entre ambas determinaciones pudimos calcular el transporte asociado a CNT2 y a
CNT3.
Como hemos expuesto, los colangiocitos, como muchas otras células epiteliales, proyectan hacia el lumen biliar un cilio primario [146]
[260]. Esta localización ha sido asociada a importantes funciones en
el marco de la fisiologı́a del epitelio biliar, ya que el cilio tendrı́a propiedades mecano, quimio y osmo-sensoras, que llevarı́a a cabo por la
expresión diferencial de diversas proteı́nas [172] [261].
En base a estos antecedentes, decidimos determinar el efecto de
la deciliación de las NRCs sobre la actividad de los transportadores
encontrados. Para esto, las células en estado confluente, fueron incubadas por 24 h con 4 mM de ClHy, este tratamiento elimina el cilio de
diferentes tipos celulares desestabilizando la unión entre el axonema
ciliar y el cuerpo basal, sin causar alteraciones significativas de tipo
estructural o funcional en las células tratadas Figura 4.2B. Además,
es la única herramienta farmacológica para remover el cilio disponible
hasta la fecha [262] [174].
98
Figura 4.2: Efecto de la eliminación del cilio en el transporte de nucleósidos.
A) Las NRC fueron incubadas 24 h con ClHy 4 mM, para remover el cilio primario, luego se realizaron ensayo de actividad utilizando [3 H]-guanosina. Análisis
estadı́stico del control vs el tratamiento con ClHy. (*p<0.05). Los resultados se
expresan como el promedio ± ES de los valores de radioactividad obtenidos por
cuatruplicado, y son representativos de 2-3 experimentos llevados a cabo en diferentes dı́as con diferentes páses célulares. B) Imagen de efecto del tratamiento
con ClHy en colangiocitos de ratón, fotografı́a confocal obtenida de Gradilone,
2007 [261]
El tratamiento de deciliación en las NRCs causó una disminución
significativa de CNT3, sin afectar la actividad de transporte de CNT2,
como se puede ver en la Figura 4.2A. Este resultado podrı́a dar cuenta
de la presencia directa de CNT3 en el cilio, como es el caso del receptor
P2Y12 y de las proteı́nas PC-1 y PC-2, que luego del tratamiento con
ClHy perdı́an los efectos observados en el colangiocito.
Este resultado, podrı́a tambien indicar que en el cilio del colangiocito existe algún elemento regulador de la actividad de CNT3, necesario para su funcionamiento basal. No hay ejemplos de mecanismos
de regulación positiva del cilio sobre un transportador en el colangiocito, pero en stem cells neuronales, la eliminación del cilio genera
una disminución significativa de le la vı́a de señalización hedgehog,
lo cual afecta negativamente la neurogésis [263]. Además en células
renales genéticamente deficientes de cilio, extraı́das desde ratones con
fenotipo de PKD (Enfermedad policı́stica del riñón) se ha visto que
la ausencia del cilio genera un aumento en de la actividad y expresión apical del transportador NHE-1. Lo cual hiperactiva la absorción
de Na+ [264]. Estos antecedentes sugieren que la presencia del cilio
podrı́a modular la actividad de proteı́nas que están localizadas en
otros dominios celulares, como es el caso de CNT3.
99
Regulación purinérgica, receptores de adenosina
En nuestro laboratorio se ha descrito el control purinérgico del receptor A1 , sobre la actividad del transportador CNT2 en cultivos de
hepatocitos de rata y en la lı́nea celular FAO [115], describiendo por
primera vez un link funcional entre un la actividad de un transportador de adenosina y un receptor. Este control sugerı́a un mecanismo
que permitirı́a la desensibilización del receptor luego de la activación
por su agonista, ya que aun cuando los hepatocitos expresaban funcionalmente ENT1 y CNT2, el control purinérgico sólo se ejercerı́a a
través de CNT2.
Basándonos en estos antecedentes, y por la cercanı́a de los modelos
en estudio (células de hı́gado de rata) decidimos verificar el control
purinérgico de los receptores de adenosina en los transportadores de
adenosina presentes en el colangiocito.
La primera aproximación a la caracterización de los receptores
de adenosina, la hicimos a nivel de mRNA. Como muestra la Figura 4.3A, el análisis del perfil de expresión realizado por Real-Time
PCR, mostró que las células de conducto biliar expresaron las cuatro
isoformas de receptores de adenosina descritas, tal como ya ha sido
demostrado en los hepatocitos [265] [266]. Los valores brutos de Ct
de todos los receptores fueron elevados, sin embargo como relativizamos estos valores respecto de los encontrados en un homogenizado de
hı́gado de rata, que es un órgano rico en estos receptores, el resultado
final parece inferior. El receptor A1 fue normalizado relativizando su
expresión respecto de la de homogenizado de células FAO.
Para el estudio de la modulación de los receptores de adenosina detectados, sobre la actividad de los transportadores, realizamos
un ensayo preliminar de dosis-repuesta de la internalización de [3 H]guanosina en las células expuestas a dosis crecientes de NECA, un
agonista inespecı́fico que es capaz de activar todos los receptores
de adenosina. Como podemos ver en la Figura 4.3A, este agonista
provocó un incremento de la actividad total de transporte de [3 H]guanosina (CNT2 y CNT3), a dosis del rango nM. El aumento de
actividad provocado por bajas dosis de NECA, se mantuvo a dosis
mas elevadas. No vimos cambios adicionales en la actividad de los
transportadores a dosis del rango µM de NECA.
Este resultado nos mostró por una parte que existı́an receptores
de adenosina funcionales en el epitelio biliar, que estarı́an modulando
positivamente la actividad concentrativa de las células. Por otra parte, estos receptores serı́an de alta afinidad de unión para adenosina
(A1 -A2A ), ya que el efecto de modulación sobre la actividad de los
100
transportadores sólo lo observamos a dosis del agonista capaces de
activar receptores de alta afinidad.
Estos resultados no permitieron descartar la presencia funcional
de los receptores de menor afinidad de adenosina, A2B y A3 , en las
células de epitelio biliar, sin embargo indicaron que ninguno de ellos
tendrı́a efecto en la actividad de los transportadores de nucleósidos
encontrados, aun cuando encontramos elevados niveles de expresión
de este último.
Figura 4.3: Receptores P1 de adenosina en los colangiocitos. A) Análisis de la
expresión de los receptores de adenosina mediante Real-Time PCR en la células de
epitelio biliar. Los valores fueron relativizados a homogenizado de hı́gado de rata,
a excepción del receptor A1 , que fue normalizado con respecto a extracto de células
FAO. B) Dosis-respuesta de la actividad de los transportadores frente al agonista
NECA. C) y D) Ensayos de time-course de [3 H]-guanosina en las NRCs incubadas
con rPIA 50 nM y CGS-21680, respectivamente. D) Efecto de los antagonistas A1
y A2A en la actividad de los transportadores. Las células fueron pre-incubadas
con el antagonista de A1 (DPCPX;10 nM) o de A2A (ZM241385;10 nM) 30 min
antes de agregar el CGS.Los resultados se expresan como el promedio ± ES de los
valores de radioactividad obtenidos por cuadruplicado, y son representativos de
3-4 experimentos llevados a cabo en diferentes dı́as con diferentes pases celulares.
(*p<0.05, **p<0.01)
El siguiente paso consistió en determinar cual de los receptores
de alta afinidad de adenosina era el responsable del efecto observado
con NECA en la actividad del transporte de nucleósidos. Para esto,
utilizamos agonistas con mayor selectividad para A1 y A2A , a dosis
que aseguraran su unión especı́fica a estos receptores. Como se puede
observar en la Figura 4.3B, el agonista especı́fico de A1 , rPIA 50 nM,
no tuvo un efecto significativo en la actividad de los transportadores
en función del tiempo, es más el efecto fue errático y bajo constantes
101
variaciones dependientes del batch celular utilizado.
El tratamiento con el agonista de A2A , CGS 50 nM, provocó un
incremento significativo de la actividad de transporte con respecto al
control, en particular de CNT3. Este efecto fue máximo a los 5-10 min
de incubación (Figura 4.3C).
Para verificar estos resultados, analizamos el efecto de ZM241385
y DPCPX, antagonistas de los receptores A2A y A1 , respectivamente,
en el incremento de la actividad de transporte observado con el tratamiento con CGS. Para esto, las NRCs fueron preincubadas por 30 min
con 10 nM de cada antagonista, transcurrido este tiempo, las células
fueron incubadas por 10 min con CGS, 50 nM. El tiempo de incubación con CGS fue escogido de acuerdo al efecto máximo observado en
la curva de time-course de la Figura 4.3C.
Como muestra la Figura 4.3D, el tratamiento con ZM241385 fue
capaz de revertir, de forma exclusiva, el efecto de CGS sobre la actividad especı́fica de CNT3. El tratamiento con DPCPX no mostró un
inhibición clara de la acción de CGS sobre CNT3. Los antagonistas
no tuvieron un efecto significativo en la actividad basal de los transportadores cuando fueron agregados por separado.
Se ha comentado en la Introducción (1.1.2), que el aumento de
cAMP mediado por la activación de ACs es la vı́a de traducción primaria del receptor de A2A . Además, como, la unión de la secretina
a su receptor también produce la activación de ACs lo cual produce
un aumento del cAMP intracelular (1.2.2). Esta señal, desencadena el
tráfico de proteı́nas hacia la membrana apical que aseguran la secreción de osmolitos hacia el lumen biliar [267] [150].
Basándonos en estos antecedentes, quisimos determinar las vı́as
de traducción intracelulares responsables de la regulación especı́fica
de A2A sobre CNT3. Y como primera aproximación, nos plateamos
analizar la respuesta de los transportadores frente al aumento directo del cAMP intracelular. Por esto realizamos ensayos de time-course
de las células tratadas con una combinación de 100 µM de Forskolina y 500 µM de IMBX, fármaco activador de las ACs e inhibidor
de la acción de fosfodiesterasas, respectivamente. Esta combinación
aseguró un incremento sustancial y no transitorio del cAMP.
Como es posible observar en la Figura 4.4A el tratamiento con
esta combinación de agentes provocó una inducción, superior al 200 %
de la actividad de transporte especı́fica de CNT3, similar a lo que
habı́amos visto con el agonista especı́fico de A2A (Figura ??D).
La activación directa de la PKA, por el cAMP es otro punto importante en la vı́a intracelular de secreción y proliferación en los colangiocitos. Su activación esta ligada a la activación del CFTR presente
102
en la membrana apical del colangiocito, y además es el punto de partida en la señalización del tráfico de las vesı́culas que se fusionaran
con el dominio apical para aumentar ası́ la capacidad secretora de la
célula [150] [145].
Para continuar caracterizando la cascada intracelular activada por
el cAMP utilizamos H89, un agente inhibidor de la actividad de la
PKA, y también utilizamos colchicina, para inhibir la polimerización
de los microtúbulos en las células y de esta forma bloquear la movilización de vesı́culas y su tráfico a membrana.
Tal como muestra la Figura 4.4B, ambos tratamientos revirtieron
de forma significativa el aumento de actividad de CNT3 mediado por
CGS, sin afectar significativamente la actividad basal de CNT3. Por
lo tanto, la activación de PKA y el posterior tráfico de proteı́nas a
membrana activadas por el incremento de cAMP intracelular, estarı́an
directamente involucrados en el cross-talk entre A2A y CNT3.
Analizamos por otra parte, el rol de PI3K, que ha sido involucrada en la regulación de procesos secretorios del colangiocito los colangiocitos. Y además el rol del aumento de Ca2+ intracelular, que es
paralelamente al cAMP, una de las vı́as principales de regulación de
la proliferación del epitelio biliar [268] [145] [269].
Por esto, quisimos determinar si alguna de estas vı́as estaba involucrada en el efecto de A2A sobre CNT3. Para esto, las células fueron
tratadas con dos agentes; BAPTA-AM; quelante del Ca+2 intracelular,
y wortmanina un inhibidor de la acción de PI3K. Ninguno de estos
tratamientos tuvo un efecto significativo en la activación de CNT3
causada por CGS. Figura 4.4C.
Para complementar los ensayos de actividad realizados, llevamos
a cabo detección mediante inmunoblotting del estado de fosforilación
de una serie de proteı́nas que podrı́an estar downstream al efecto de
activación de A2A . Entre los posibles blancos escogimos: ERK 1/2 y
CREB ya que ambas proteı́nas han sido históricamente ligadas a la
activación de PKA y se encuentran dentro de la vı́a de señalización
de A2A [23].
Incluimos también AMPK, debido a que muy recientemente se
ha descrito que la activación de Epac podrı́a inducir la activación de
esta proteı́na en hepatocitos [148], y podrı́a ser una determinación
indirecta de la participación de Epac en la señalización intracelular
de A2A en el colangiocito.
Además, para descartar la participación de PI3K, incluimos en el
análisis a AKT.
Tal como muestra la La Figura 4.4D, el time-course del tratamiento de las NRCs con 50 nM de CGS por periodos de 0-20 min,
103
Figura 4.4: Vı́as de señalización intracelular involucradas en la activación de
CNT3. A) time-course del efecto de la inducción del aumento de cAMP por el tratamiento combinado de 100 µM de Forskolina y 500 µM de IBMX, en la actividad
de transporte CNT2 y CNT3. B) Efecto de la inhibición de la activación de PKA y
del tráfico intracelular en las células tratadas por 1 h con 10 µM de H89 y 0,05 µM
de colchicina, en la actividad de transporte sodio-dependiente de las células control
y tratadas por 10 min con 50 de nM CGS. C) Efecto de la inhibición de las vı́as
intracelulares dependientes de Ca+2 intracelular y PI3K, en la activación de CNT3
mediada por A2A . Las células fueron pre-incubadas con 30 µM de BAPTA-AM por
1 h, ó 100 nM de wortmanina por 30 min, antes del tratamiento con 50 nM de
CGS. Los resultados se expresan como el promedio ± ES de los valores de radioactividad obtenidos por cuadruplicado, y son representativos de 3-4 experimentos
independientes. D) Análisis por por inmunoblotting del time-course del efecto de
50 nM de CGS en el perfil de fosforilación de ERK1/2, CREB, AKT y AMPK.
Imágenes representativas de 3 experimentos independientes. (*p<0.05, **p<0.005,
***p<0.001)
provocó una serie de cambios en los estados de fosforilación de las
proteı́nas detectadas.
Por una parte, la activación de A2A indujo la fosforilación de ERK
1/2 y CREB a los 5-10 min de exposición al agonista, fue consecuente
con el tiempo en que el CGS inducı́a el efecto máximo en la actividad
de CNT3.
El perfil de AKT, por otra parte, no mostró cambios en su estado
de fosforilación, confirmando que esta cascada no está involucrada en
el signaling del efecto de A2A sobre CNT3.
La activación de A2A indujo demás la fosforilación de AMPK, lo
cual fue un resultado inesperado. AMPK ha sido definida como un
104
sensor del estado energético celular, ya que es activada por cambios
en el radio de concentraciones de AMP/ATP. En nuestro grupo se ha
descrito que en células epiteliales de intestino de rata, la adenosina
extracelular induce una rápida activación de esta proteı́na, por medio
de un mecanismo dependiente de la CNT2 [119]. Por lo tanto, su
activación secundaria a la activación de A2A , podrı́an ser parte del
mecanismo de regulación del metabolismo energético del colangiocito.
Adicionalmente, también ha sido descrito que en tejido epiteliales
AMPK es capaz de inhibir la función de CFTR [270] [271]. Esto podrı́a
sugerir un mecanismo secundario de la regulación de la secreción en
el colangiocito a través de la adenosina y AMPK. Serı́a interesante,
determinar la participación de Epac en la activación de AMPK, y a
además estudiar la participación de CNT2 y CNT3 en este efecto en
el epitelio biliar.
Los colangiocitos son células epiteliales y por lo tanto forman una
barrera epitelial entre dos compartimientos, el lumen biliar y la sangre de la vena porta. Como las células en estudio, son capaces de
formar de monocapas polarizadas [248], consideramos interesante i)
confirmar la presencia de CNT2 y CNT3 en un modelo mas cercano
al de la fisiologı́a del epitelio biliar, ii) determinar la distribución de
los transportadores en las células, y iii) validar la modulación de A2A
sobre la actividad de CNT3, observada previamente en las células en
monocapa sin polarizar. polarizados.
En otros modelos de epiteliales, como en determinados segmentos de la nefrona, se ha encontrado también la presencia de CNT3 y
CNT2, lo que podrı́a estar relacionado con la regulación de los niveles
extracelulares de adenosina. Particularmente, la actividad de transporte de CNT2 se encontraba bajo el control purinérgico de A1 [115].
En cambio, la actividad de CNT3 fue ligada a la capacidad de mantener el flujo vectorial de nucleósidos en células del túbulo contorneado
proximal [122].
En contraste, en sinciciotrofoblasto placentario humano hemos caracterizado la presencia exclusiva de CNT1, en membrana apical, basal
y en lipid rafts de la membrana apical. Y el rol de este transportador
estarı́a mas relacionado con la mantención del salvage de pirimidinas
y su importancia en el crecimiento placentario [272].
Las NRCs fueron sembradas sobre una membrana de policarbonato de tipo transwell para permitir su polarización. Las medidas de
transporte se realizaron añadiendo [3 H]-guanosina alternativamente al
lado apical o al basolateral de los compartimientos del transwell.
Como muestra la Figura 4.5, encontramos actividad de ambos
transportadores en el dominio apical de las NRCs, con actividades
105
Figura 4.5: Efecto de la activación de A2A en un modelo de colangiocitos polarizados. El CGS (50 nM) fue agregado selectivamente al compartimiento apical
o basolateral de los insertos tipo transwell y luego se determinó la actividad de
transporte de [3 H]-guanosina (2 min) para CNT3 (A) y CNT2 (B). Los resultados
se expresan como el promedio ± ES de los valores de radioactividad obtenidos por
triplicado, y son representativos de 4-7 experimentos independientes. (**p<0.005,
***p<0.001). (C) Modelo resumen del efecto de la activación de A2A en la actividad de transporte de CNT3 y CNT2, y las vı́as señalización probablemente
involucradas en este cross-talk.
de magnitud similar; 25,1 ± 4,8 pmol Guo/mg prot de CNT2 vs 28,6
± 6,1 pmol Guo/mg prot de CNT3 (resultados se expresan como el
promedio ± ES).
En el dominio basolateral, sólo encontramos actividad correspondiente a CNT2 en una magnitud de 8, 2 ± 0,5 pmol Guo/mg prot. Lo
cual equivalente al ∼30 % de la actividad encontrada en el dominio
apical.
A continuación, incubamos selectivamente las células durante 10
min con el agonista de A2A ; CGS 50 nM, en el compartimento apical
o en el basolateral. El tiempo de incubación fue el mismo en el que
CGS ejercı́a su efecto máximo en la células sembradas en monocapa.
Esta aproximación experimental nos permitió determinar el efecto
de la activación de A2A en la actividad de los transportadores especı́ficamente en cada dominio epitelial.
La Figura 4.5A muestra, que la activación de A2A afectó de forma
106
exclusiva la actividad de CNT3 presente en el dominio apical. Además,
coincidiendo con los resultados de la modulación de las células en
monocapa, la adición de CGS tanto al lado apical como al basolateral,
no tuvo efecto sobre CNT2 en ninguno de los dominios del colangiocito
(Figura 4.5B).
Con respecto al efecto sobre CNT3, cuando el agonista fue agregado al lado apical indujo un aumento significativo de la actividad de
CNT3 (∼200 %). Sin embargo, cuando fue aplicado al lado basolateral
provocó el efecto contrario, disminuyendo la actividad de CNT3 apical en un ∼70 %. Es decir, la activación de A2A tuvo efectos opuestos
en la actividad de CNT3, dependiendo del dominio en que el receptor
fue activado.
El modelo de la Figura 4.5C, resume la localización de los transportadores en los colangiocitos. Además, muestra los efectos de la
activación de A2A en la actividad de transporte de CNT3 y CNT2 y
las probables vı́as de señalización involucradas.
Hemos descrito que la activación de A2A sobre CNT3 fue dependiente del aumento intracelular de cAMP (Figura 4.4A). Debido a
esto, analizamos tanto en las células sembradas en monocapa como
en insertos tipo transwell, el efecto de la incubación de secretina sobre
la actividad de los transportadores. De esta forma, podrı́amos dilucidar si el aumento intracelular de cAMP inducido desde el dominio
basolateral tenı́a algún efecto negativo en la actividad de CNT3, y
ası́ explicar el efecto opuesto de la activación basolateral de A2A , ya
que teóricamente el receptor de secretina y el receptor A2A tienen vı́as
intracelulares de traducción similares.
La secretina es la principal hormona en la regulación de la secreción de osmolitos en epitelio biliar [138] [267] [152], por esto también
consideramos necesario analizar si inducı́a algún cambio en la actividad de los transportadores.
La Figura 4.6A muestra el efecto de la incubación con secretina 100
nM en el time-course de la actividad de CNT2 y CNT3, en la células
crecidas en monocapa. La secretina no tuvo un efecto significativo en
la actividad de ninguno de los transportadores, la actividad de CNT3
se vio incrementada levemente, y la de CNT2 se mantuvo constante
durante el tiempo.
Sin embargo, cuando analizamos el efecto de la incubación de la
misma concentración de secretina por 15 min en el compartimiento
basolateral de las células polarizadas en transwell, pudimos observar
que esta hormona sı́ afectó la funcionalidad de los distintos transportadores. Por una parte la actividad de CNT2 apical y basolateral se
vio disminuida por la unión la secretina a su receptor (Figura 4.6B),
107
mientras que el transporte de CNT3 apical experimentó un incremento significativo de ∼200 %. Además, la activación de la secretina sobre
CNT3 indujo la aparición de la actividad de este transportador en el
dominio basolateral del colangiocito, donde en estado basal CNT3 no
se encontraba activo (Figura 4.6C). La Figura 4.6D, resume los resultados del efecto de la secretina, en la actividad de transporte de
CNT3 y CNT2 en los colangiocitos.
Figura 4.6: Regulación del transporte de nucleósidos por secretina. A) Ensayo de
time-course del transporte de [3 H]-guanosina en las NRCs tratadas con 100 nM
de secretina. B) y C) Efecto del tratamiento con 100 nM de secretina basolateral
por 15 min, en la actividad de CNT3 y CNT2 (respectivamente), en las células
sembradas en insertos tipo transwell. Los resultados se expresan como el promedio
± ES de los valores de radioactividad obtenidos por cuadruplicado (transporte
en monocapa) y triplicado (transporte en transwell ) y son representativos de 35 experimentos independientes. (*p<0.05). D) Modelo resumen del efecto de la
secretina en los transportadores.
Es interesante notar, que la señal colerética inducida por secretina tendrı́a efectos opuestos en la actividad de trasnporte de CNT2
y CNT3 el colangiocito. Ya hemos comentado que en células intestinales, la adenosina mediante un mecanismo dependiente de CNT2,
actúa regulando la actividad de AMPK. Este fue una de las primeras evidencias que establecieron que un transportador concentrativo
podrı́a tener una función alternativa y no involucrada con el salvage
108
de nucleótidos [119]. Recientemente nuestro grupo ha caracterizado
la interacción de CNT2 con dos proteı́nas también ligadas al metabolismo energético [255]. Una de estas proteı́nas es Aldolasa-B, la cual
participa en el proceso de gluconeogénesis.
Estos antecedentes, mas las evidencias del rol de secretina en la
regulación de metabolismo en adipocitos de rata [273] [274]. Nos hacen pensar en colangiocitos CNT2 y CNT3 tendrı́an otros roles mas
allá del de mediar paso de nucleósidos al interior celular. En particular, CNT2 podrı́a estar involucrado en las vı́as de regulación del
metabolismo energético del colangiocito.
Adicionalmente, estos resultados mostraron de forma indirecta que
la señal de aumento de cAMP intracelular desencadena desde el dominio basolateral del colangiocito, inducı́a un aumento de la actividad
de CNT3 apical. Efecto contrario al observado con la activación del
receptor A2A en el dominio basolateral. Es por esto que buscamos
otros modelos celulares en donde el efecto de la activación de un receptor pudiera ser opuesto dependiendo del dominio desde el cual se
inicie la señal.
Los fenómenos de dimerización han sido ampliamente caracterizados en el sistema nervioso central, donde ya es aceptado que muchos receptores acoplados a proteı́na G dimerizan formando hetero o
homo-complejos estableciendo ası́ nuevos controles a la regulación de
diversos procesos fisiológicos [275] [39] [46].
Debido a que el efecto diferencial de A2A sobre la actividad de
CNT3, fue dependiente del dominio en que se localiza, y que este
receptor es una proteı́na presente en diversos heterómeros descritos,
tales como; A2A -A1 , A2A -D2 , A2A -CB1 [39] [45], nos planteamos la posibilidad de que la heteromerización de este receptor fuera la causa de
la diferencia del comportamiento en los distintos dominios del epitelio
biliar. Basándonos en bibliografı́a buscamos proteı́nas que al dimerizar con A2A afectaran su capacidad de activación por adenosina, que
hubieran sido descritas en colangiocitos.
En base a esto, decidimos analizar el efecto de la activación del
receptor D2 para dopamina. Este receptor ha sido descrito en el dominio basolateral del colangiocito. Donde tiene capacidad de modular
la secreción de bicarbonato mediada por secretina y también controla
el crecimiento neoplásico del epitelio biliar. [276] [277]
Adicionalmente, teniendo en cuenta que los efectos vistos en monocapa no necesariamente correlacionan con lo determinado en transwell,
y que el efecto de rPIA fue bastante errático en las NRCs sembradas
en monocapa, decidimos incluir en este análisis el receptor A1 .
Para esto nos concentramos en los ensayos en transwell y nos pla109
teamos la determinación del efecto de la incubación de rPIA 50 nM,
por 10 min en el compartimiento apical y basolateral. Mientras que
para el análisis del efecto de D2 , nos enfocamos en el efecto su agonista, quinpirole, exclusivamente en el compartimiento basolateral. El
efecto de estos agonistas fue evaluado sólo en la actividad de los transportadores presentes en el dominio apical.
La activación por rPIA indujo una leve bajada de la actividad de
transporte de CNT2, la cual no fue significativa (Figura 4.7B). Por
otra parte, ambos agonistas indujeron una modulación negativa de
la actividad de CNT3, disminuyendo significativamente su capacidad
de transporte. Hecho que coincide con lo ocurrido en neuronas del
cuerpo estriado, y que podrı́a dar cuenta de la dimerización entre A1
y A2A [39] (Figura 4.7A).
Ninguno de estos compuestos, rPIA o quinpirole, afectó la actividad de CNT2 (Figura 4.7B).
Lo siguiente que nos planteamos, fue la detección y localización
de estas proteı́nas en las NRCs, para esto realizamos experimentos de
inmunolocalización utilizando anticuerpos especı́ficos contra A2A , A1
y D2 .
Figura 4.7: Efecto de la activación de A1 y D2 en la actividad de los transportadores en los colangiocitos en transwell. A) y B) El agonista de A1 , rPIA 50 nM,
fue agregado al compartimiento apical o basolateral durante 10 min antes de determinar la actividad de CNT2 y CNT3, respectivamente. D) y E) Actividad del
transporte de CNT2 y CNT3 (respectivamente) luego del tratamiento basolateral
por 10 min con 25 nM de quinpirole, agonista especı́fico de D2 . Los resultados se
expresan como el promedio ± ES de los valores de radioactividad obtenidos por
triplicado, y son representativos de 3 experimentos independientes. (*p<0.05)
La Figura 4.8 muestra el estudio de co-localización de A1 con A2A .
No nos fue posible realizar esta técnica en las membranas tipo transwell, por lo tanto los experimentos fueron llevados a cabo en células
sembradas en monocapa. Por esta razón, el estudio fue realizado en
cortes de 0,4 µm de espesor para determinar a lo largo del eje z la
localización de estas proteı́nas.
Como se puede ver, los marcajes de A1 y de A2A siguen distintos
110
patrones, A2A fue detectado claramente de forma intracelular, tanto
en la zona núclear, como en el citoplasma cercano a este. A1 por otra
parte, fue detectado en citoplasma de forma homogénea, y aun cuando
no podemos asegurar su presencia en membrana este marcaje podrı́a
revelar a lo menos su presencia en el compartimiento sub-membranoso.
Figura 4.8: Análisis por microcopia confocal de la localización subcelular de A1
y A2A en las NRCs. Las NRCs fueron sembradas y cultivadas hasta su confluencia,
luego fueron fijadas y procesadas para el estudio de localización en cortes 0,4 µm.
Detección de A1 , en verde (A) y A2A , en rojo (B) y doble inmunofluorescencia
de A1 y A2A en los distintos planos del estudio. Imágenes representativas de 3
experimentos independientes.
La co-localización de las dos proteı́nas en los planos superiores fue
bastante escasa, pero aumentó en los cortes mas profundos del eje z,
evidenciando su coexistencia en el citoplasma de las células.
Con respecto a D2 (Figura 4.9), el marcaje de esta proteı́na fue
inesperado, con un patrón intracelular y probablemente nuclear. Si
bien vimos co-localización con A2A , no podemos determinar en que
lugar de la célula se encuentran con certeza.
Ninguno de estos resultados permiten explicar el efecto diferencial de A2A sobre CNT3, sin embargo la teorı́a de la dimerización
tiene que ser más trabajada y más experimentos son necesarios para
111
Figura 4.9: Análisis por microcopia confocal de la localización subcelular de D2
con A2A . en las NRCs. Las NRCs fueron sembradas y cultivadas hasta su confluencia, luego fueron fijadas y procesadas para el estudio de localización en cortes 0,4
µm. Detección de D2 en verde (A) y A2A en rojo (B). y doble inmunofluorescencia
de D2 y A2A en los distintos planos del estudio. Imágenes representativas de 3
experimentos independientes.
comprobarla.
112
4.1.2.
Regulación del transporte por ATP
En el hı́gado, el ATP está presente tanto en sangre venosa como en
la bilis [160]. Como ya se ha descrito, en colangiocitos se han descrito
una amplia variedad de receptores de tipo P2Y y P2X que estarı́an activando una respuesta secretora mayor inclusive que la activada por la
vı́a clásica de la secretina [165] [168]. Por esto, nos planteamos determinar si existı́a algún tipo de regulación del ATP sobre las actividades
de CNT3 y CNT2.
Para esto realizamos ensayos de tipo time-course, de actividad de
los transportadores en función del tiempo, incubando las células con
50 µM de ATP. En la Figura 4.10A se puede observar que el ATP
provocó una ligera disminución de la actividad de CNT3, efecto que
fue máximo a los 10 minutos de incubación y que se mantuvo a lo
largo del ensayo.
Con el fin de determinar si esta disminución era causada por una
modulación negativa de un receptor de ATP sobre CNT3, se realizaron ensayos de actividad de los transportadores, con dos antagonistas
inespecı́ficos de receptores P2Y (Figura 4.10B). Ambos compuestos,
suramina (50 µM) y PPADS (30 µM), fueron incubados solos o en
combinación con ATP y γ-S-ATP. Este último, es un derivado no
hidrolizable del ATP.
Como muestra la Figura 4.10C, tanto la adición de ATP como
de γ-S-ATP provocaron una leve disminución de la actividad CNT3,
indicando que su efecto es debido a la acción directa del ATP y no
de sus productos de metabolismo. Sin embargo, ni la suramina ni el
PPADS fueron capaces de revertir este efecto, indicando que es probable que el ATP extracelular module la actividad CNT3 a través de
otro receptor P2 cuya activación sea insensible a suramina y PPADS.
P2X4 ha sido ampliamente estudiado en el sistema nervioso central
donde participa en la señalización del ATP ligado a la sensación de
dolor [278]. En colangiocitos se han encontrado elevados niveles de
mRNA pero su función y ubicación no es clara [164]. Para su estudio,
no existen moduladores especı́ficos de su actividad, es insensible a la
mayorı́a de inhibidores para P2Y (incluyendo suramina y PPADS) y
aun cuando el ortólogo humano muestra sensibilidad a Briliant Blue G
(BBG), en rata no es posible reproducir este efecto. Para su estudio
se utiliza CTP, ya que se sabe que reproduce el efecto de ATP, y
además que este efecto es potenciado por ivermectina, un modulador
alostérico del receptor [63] [279].
En base a estos antecedentes, hicimos estudios del efecto del CTP,
113
Figura 4.10: Caracterización del efecto de ATP en la actividad del transporte de
nucleósidos en las NRCs. A) Ensayo de time-course del efecto de 100 µM de ATP
en la actividad de transporte de [3 H]-guanosina de CNT3 y CNT2 en función del
tiempo. B) Resumen de la especificidad de sustrato de los inhibidores de receptores
P2Y descritos en colangiocitos. C) Efecto de la inhibición de receptores P2Y por
suramina o PPADS en el transporte de nucleósidos de las células tratadas con ATP
o γ-S-ATP. D) Análisis comparativo del efecto de CTP y ATP con ivermectina.
Los resultados se expresan como el promedio ± ES de los valores de radioactividad
obtenidos por cuadruplicado, y son representativos de 3 experimentos independientes.
y de la combinación CTP/ivermectina, y lo comparamos con el efecto
inhibidor del ATP en la actividad de transporte de CNT3 y de CNT2.
La Figura 4.10D resume este análisis, como es posible observar CTP
indujo una disminución en la actividad de CNT3, sin llegar a ser
significativa y más leve que la ejercida por ATP. Por otra parte, su
combinación con ivermectina no mostró indicios de una potenciación.
Todas estas observaciones y el hecho de que en los experimentos
previos, habı́amos visto que las células sembradas en monocapa pueden no mostrar el mismo comportamientos que los observados cuando
se trabaja con células polarizadas, nos llevaron a proponernos examinar el efecto de ATP en los colangiocitos crecidos en transwell.
La Figura 4.11A, muestra que el tratamiento con 50 µM de ATP
por 10 min en el compartimiento basolateral, tuvo un efecto inhibitorio importante en la actividad de CNT3 apical. La incubación bajo las
mismas condiciones pero en el compartimiento apical, no provocó cambios en la actividad de transporte de CNT3. En el caso de CNT2
(Figura 4.11B), la incubación con ATP 50 µM en el lado basolateral,
114
indujo una disminución de la actividad de este transportador, a nivel
apical y basolateral.
Figura 4.11: Caracterización del efecto de ATP en la actividad del transporte de
nucleósidos en las NRCs en transwell. Resumen del efecto dominio-especı́fico de 50
µM de ATP o γ-S-ATP en la actividad de CNT3 (A y C) y CNT2 (B y D). Los
resultados se expresan como el promedio ± ES de los valores de radioactividad
obtenidos por triplicado, y son representativos de 3 experimentos independientes.
(*p<0.05)
Para descartar el probable solapamiento de los efectos del ATP
y de sus productos su metabolismo extracelular, decidimos continuar
con esta caracterización utilizando γ-S-ATP bajo las mismas condiciones que habı́amos ensayado con ATP (en relación a la dosis y tiempo
de incubación).
La Figura 4.11C muestra el resumen del tratamiento con γ-S-ATP
en CNT3. De acuerdo con el efecto observado usando ATP en el dominio basolateral, este compuesto provocó una importante disminución
de la actividad apical de CNT3. En contraste, su efecto en el lado
apical fue opuesto al inducido por el ATP, desencadenando también
una importante disminución de su actividad.
El efecto del tratamiento con γ-S-ATP sobre la actividad de CNT2
fue similar a lo observado con el ATP, el tratamiento con γ-S-ATP
reprodujo la disminución de la actividad de CNT2 apical, causada por
el ATP cuando fue agregado al dominio basal, también provocó un
efecto inhibitorio a este nivel cuando fue incubado en el lado apical
(Figura 4.11D).
Es decir, la adición de γ-S-ATP provocó una evidente disminución
115
de la actividad de ambos transportadores en el dominio apical, tanto
si fue agregado al dominio apical como al basolateral. Este resultado
concuerda con lo publicado por Salter en 2000, acerca de la diferencia
en los perfiles de hidrólisis del ATP en cada dominio del colangiocito. Si bien, aun no se han descrito las enzimas responsables de este
mecanismo, existen diferencias importantes de los perfiles de cinética de degradación de ATP entre los dominios del colangiocito [280].
En el lado apical del colangiocito la degradación del ATP tiene una
cinética consistente con una única vı́a de metabolización de ATP, en
donde el 13 % de la dosis inicial es degradado en el primer minuto de
exposición. En el dominio basolateral por otra parte, el time-course
de la degradación es mas complejo, evidenciando vı́as de degradación
múltiples de metabolización del ATP, inicialmente de forma rápida
(30 % de la dosis inicial) seguido de una forma más gradual de declive. De alguna forma, la rápida metabolización observada en el compartimiento basolateral, con la consecuente generación de adenosina,
podrı́a contrarrestar con mayor rapidez la acción del ATP y por esta
razón a los 10 min de ensayo el efecto del ATP y el γ-S-ATP en los
transportadores del dominio apical es tan distinto.
Finalmente, con el fin de dilucidar la identidad molecular de el/los
receptores P2 responsables de la modulación observada en los transportadores. Nos planteamos determinar en las NRCs, el efecto de la
inhibición inespecı́fica de los receptores P2Y en la acción del γ-S-ATP
sobre los transportadores de nucleósidos. Como en los ensayos previos con γ-S-ATP no vimos cambios significativos de su acción en la
actividad de los transportadores presentes en el dominio basolateral,
estos ensayos fueron enfocados exclusivamente en el dominio apical
del colangiocito.
La Figura 4.12A, resume el efecto de la pre-incubación por 10 min
con 50 µM de suramina en la acción de γ-S-ATP. Tal como se puede
observar, el tratamiento previo con este inhibidor al compartimiento
apical, revirtió por completo la acción inhibitoria observada por el γS-ATP. Lo cual nos mostró, que la regulación del γ-S-ATP en CNT3
y CNT2 es probablemente debida a la acción de P2Y1 , P2Y2 ó P2Y6 ,
que son los receptores que han sido localizados en el dominio apical
del colangiocito y que son sensibles al efecto de suramina [165]. El
experimento control con suramina no mostró cambios en la actividad
basal de CNT3 o CNT2.
El efecto de la incubación de γ-S-ATP y suramina en el dominio basolateral, sobre la actividad de los transportadores del dominio
apical, mostró ser mas complejo. Por una parte, en el experimento se
suramina control vimos que este tratamiento de por sı́ inducı́a una dis116
Figura 4.12: Regulación de receptores P2Y sobre la actividad apical del transporte de nucleósidos de las NRCs. Las células crecidas en transwell fueron tratadas
con γ-S-ATP (50 µM; 10 min), luego de la pre-incubación con el inhibidor inespecı́fico suramina (50 µM; 15 min). Los resultados se expresan como el promedio ±
ES de los valores de radioactividad obtenidos por triplicado, y son representativos
de 3 experimentos independientes. Análisis estadı́stico de los valores del control vs
el tratamiento (*p<0.05, **p<0.001, **p<0.001). Análisis estadı́stico de los valores del tratamiento con suramina vs el tratamiento con suramina mas el γ-S-ATP
(&p<0.05).
minución de la actividad de CNT3 y CNT2, evidenciando un elemento
regulador adicional al que nos habı́amos planteado, por lo tanto probablemente exista un receptor sensible a suramina en el dominio basolateral del colangiocito que esté modulando directa o indirectamente la
actividad basal de CNT3 y CNT2 en el dominio apical. Nuestro grupo
ha descrito que en hepatocitos el control purinérgico de A1 sobre la actividad de CNT2 es mediado por canales de K+ [115], por lo tanto, es
probable que la inhibición de la actividad de los transportadores apicales, sea mediada por mecanismos indirectos desencadenados por los
receptores P2Y sensibles a suramina, presentes en el dominio basolateral del colangiocito. Estos mecanismos podrı́an incluir la regulación
de las corrientes de K+ , Na+ o Cl− , además de la homeostasis del
Ca+2 intracelular [24].
Además de este efecto, el tratamiento con γ-S-ATP provocó una
disminución significativa de la actividad de CNT3 con respecto a la actividad basal y también con respecto al efecto del pre-tratamiento con
117
suramina. Por tanto, el efecto de γ-S-ATP desde el dominio basolateral serı́a a través de un receptor no inhibible por suramina, tales como
P2Y1 , P2Y4 ó P2X4 , que han sido descritos en colangiocitos [165].
El efecto de la combinación de γ-S-ATP y suramina en la actividad
de CNT2, indujo una inhibición significativa con respecto al control,
sin embargo no lo fue respecto del efecto provocado por suramina. Por
lo tanto no podemos determinar que tipo de receptor está detrás de
la acción de γ-S-ATP sobre la actividad de CNT2.
Es importante notar que existe una controversia en el perfil de expresión de las isoformas de los receptores P2Y en el colangiocito, los
primeros estudios se hicieron determinando cambios en la intensidad
de corriente en NRCs mediante voltage-clamp [281]. Esta aproximación determinó la presencia de un receptor P2Y con las caracterı́sticas
farmacológicas de P2Y2 . Sin embargo en el estudio del perfil de expresión de mRNA y respuesta farmacológica de estos receptores realizado
por Dranoﬀ en 2001, se encontró actividad de P2Y1 , P2Y2 , P2Y4 y
P2Y6 en el dominio apical, la identidad de el/los receptores en el dominio basolateral no fue clarificada [165]. Este análisis se hizo con
colangiocitos de rata en cultivo primario, y la diferencias entre los
hallazgos con el estudio en NRC, se atribuyeron a diferencias en el
modelo utilizado. Por lo tanto, en la actualidad las únicas isoformas
que han sido estudiadas directamente en las NRCs son P2Y2 , P2X4 y
P2Y12 [281] [164] [147], de las cuales sólo P2Y2 es sensible a suramina y por lo tanto es probable que corresponda al receptor apical que
induce la inhibición del transporte de CNT3 y CNT2 en el dominio
apical del colangiocito. De todas formas un estudio acabado, utilizando antagonistas especı́ficos es necesario para excluir la participación
de otros receptores P2Y.
La identidad de el/los receptores PY2/P2X insensibles a suramina,
responsables de los efectos observados desde el dominio basolateral
del colangiocito, también queda por ser caracterizada aunque como
ya hemos adelantado, si nos basamos en lo que hay en bibliografı́a es
probable que uno de estos receptores corresponda a P2X4 , que ha sido
descrito en el dominio basolateral de las NRCs y que que es insensible
a la acción de la suramina [164].
En suma, estos resultados muestran que los transportadores de
nucleósidos se encontrarı́an bajo el control de las concentraciones extracelulares de adenosina y de ATP provenientes de la bilis y de la
sangre portal. Particularmente en el dominio apical, pudimos determinar un cross-talk directo y diferencial tanto de receptores de tipo P2
sensibles a suramina, como de receptores de tipo P1 de alta afinidad
para adenosina en la actividad de transporte de CNT3 y CNT2. Lo
118
cual sugiere que estos transportadores tienen un rol adicional al del
salvage de nucleósidos, en la fisiologı́a del colangiocito.
119
4.2.
4.2.1.
Colangiocarcinoma
Caracterización del transporte de nucleósidos
Aun cuando en los últimos años los estudios de la fisiopatologı́a
del cáncer de epitelio biliar han aumentado considerablemente, muchos vacı́os quedan por llenar. No existe terapia farmacológica para
su tratamiento y de hecho la quimioterapia con agentes consolidados
y eficaces en el tratamiento de otros cánceres no es usada más que
como tratamiento paliativo, ya que las combinaciones probadas en
estudios clı́nicos no han mostrado tasas de supervivencia mayores al
32 %, proyectadas en 5 años [207] [177].
En el primer capitulo de resultados, describimos la presencia y
actividad de transportadores de nucleósidos en un modelo fisiológico de epitelio biliar de rata, los cuales estaban bajo regulación de
las concentraciones extracelulares tanto de adenosina como de ATP.
Por lo tanto, podrı́amos asumir que tienen un rol importante en la
modulación de los efectos de ambos compuestos en la fisiologı́a del
epitelio biliar (Apartado 4.1.1). Sin embargo, aun cuando muchos de
los fármacos que se utilizan en el tratamiento del CC (o están en fases
clı́nicas) son análogos de nucleósidos y por lo tanto son internalizados
a la célula cancerı́gena a través de transportadores de nucleósidos,
hasta la fecha no hay evidencia del perfil de expresión o funcionalidad
de estas proteı́nas en el colangiocarcinoma.
En base a estos antecedentes, como primera aproximación en la
caracterización del transporte de nucleósidos en el epitelio biliar, se
realizaron ensayos con cuatro lı́neas celulares de CC humano, TFK-1
derivada de CC extrahepático; Mz-ChA-1 y Mz-ChA-2 derivadas de
vesı́cula biliar; y BCLC-12, una linea celular generada por el grupo
del Dr. Jordi Bruix directamente desde un CC intrahepático, aparte
de las diferencias en su origen, las lı́neas celulares difieren también en
otra serie de caracterı́sticas (Materiales y métodos, sección 3.1.1).
Para caracterizar las entidades responsables del transporte de nucleósidos en las cuatro lı́neas, se determinó la captación de [3 H]guanosina y [3 H]-citidina y se realizaron inhibiciones cruzadas con
citidina y guanosina, respectivamente, para elucidar los transportadores implicados. Como muestra la Figura 4.13 todas las lineas mostraron actividad de transporte de nucleósidos, de la cual sólo un bajo porcentaje correspondió a actividad sodio-dependiente (transporte
concentrativo).
La actividad sodio-dependiente, reveló un patrón heterogéneo de
expresión de isoformas en las lı́neas celulares, ya que la adición de con120
centraciones elevadas de diferentes nucleósidos naturales, provocó una
inhibición parcial de la actividad de transporte sodio-dependiente total, en todas las lı́neas celulares. El poco transporte de componente
concentrativo no nos permitió determinar con exactitud el o los transportadores responsables, aunque no perece depender de una isoforma
en particular.
Sólo en el caso particular de la lı́nea Mz-ChA-2 (Figura 4.13G-H),
su perfil de inhibición reflejó la presencia de CNT3, pero, como la
actividad concentrativa total es baja (cercana a los 5 pmol/mg prot)
no pudimos establecerlo con seguridad.
Figura 4.13: Caracterización de la actividad del transporte de nucleósidos en
las lı́neas celulares de CC. Inhibición del transporte sodio-dependiente de [3 H]guanosina y [3 H]-citidina (1µCi/ml) con 100µM de citidina o guanosina, respectivamente, en las células TFK-1 (A y B), BCLC-12 (C y D), Mz-ChA-1(E y F)
y Mz-ChA-2 (G y H). Los resultados se expresan como el promedio ± ES de los
valores de radioactividad obtenidos por cuadruplicado, y son representativos de 4
experimentos independientes.
121
Por otra parte, las lı́neas mostraron diferentes niveles de actividad
ENT1 y ENT2 (Figura 4.14), lo cual fue determinado por la inhibición
del transporte de [3 H]-guanosina en medio colina, con NBTI 1 µM
ó con dipiridamol 10 µM .
En las lı́neas TFK-1, Mz-ChA-1 y Mz-ChA-2, la actividad equilibrativa serı́a comparable entre ENT1 y ENT2, aportando ambos
transportadores magnitudes similares (valores aproximados de 50 %,
40 % y 60 %, respectivamente) de la actividad sodio-independiente total. La actividad mediada por ENT1 en el caso de BCLC-12 , serı́a la
principal entidad representando casi el 100 % de su actividad equilibrativa total.
Al contrario de lo observado en el modelo sano de colangiocitos,
donde las magnitudes fueron tan bajas que no se pudo determinar la
entidad molecular, en las lı́neas de CC observamos un gran porcentaje
de actividad equilibrativa, siendo éste claramente el transporte de
nucleósidos mayoritario en las lı́neas analizadas. Estas diferencias se
pueden deber por una parte, al cambio de especie o también a a la
malignidad de las lı́neas celulares. Sin embargo, la imposibilidad de
obtener colangiocitos humanos sanos impide dilucidar entre estas dos
opciones.
Figura 4.14: Caracterización de la actividad equilibrativa en las lı́neas celulares
de CC. Transporte de [3 H]-guanosina (1µCi/ml) en medio colina, suplementado
con NBTI (1 µM) para la determinación de ENT1 ó con dipiridamol (10 µM) para
la determinación de ENT2. Los resultados se expresan como el promedio ± ES de
los valores de radioactividad obtenidos por cuadruplicado, y son representativos
de 3-4 experimentos independientes.
Según lo reportado recientemente por Kobayashi, 2012 y en paralelo por Borbath, 2011. Los niveles de expresión de hENT1, determinados por inmunohistoquı́mica, podrı́an ser un importante marcador
predictivo de la supervivencia y la prognosis de pacientes tratados con
terapia adyuvante basada en gemcitabina en CC [282] [283].
Sin embargo, los niveles de expresión de una proteı́na no siem122
pre están correlacionados con la actividad detectada. Para corroborar
esto realizamos un estudio cuantitativo de la expresión de los transportadores en las lı́neas celulares. En este análisis, se incluyó la lı́nea
BCLC-7 a las cuatro lı́neas ya caracterizadas funcionalmente, esta
lı́nea fue incluida sólo en los estudios de análisis de expresión, ya que
es de lento crecimiento en cultivo y esto dificultó su uso para estudios
de caracterización funcional.
Como muestra la Figura 4.15A, el análisis por Real-Time PCR
cuantitativa reveló altos niveles de mRNA de hENT1 y hENT2 en
todo el panel de lı́neas. Los niveles de expresión de los transportadores
concentrativos fueron casi tres órdenes de magnitud menores que los
del transporte equilibrativo.
La dificultad para obtener colangiocitos sanos, no nos permite determinar si existe variabilidad de expresión de los transportadores,
entre el tejido sano y las lı́neas derivadas de tumor. En este sentido sólo podemos concluir que existe una elevada variabilidad entre
las 5 lı́neas analizadas, aunque en todas ella predomina claramente
la expresión de los transportadores equilibrativos hENT1 y hENT2.
Además, la mayor expresión de los transportadores de tipo equilibrativo es coherente con los resultados de la caracterización de la actividad
de transporte realizados previamente.
Figura 4.15: Niveles de expresión cuantitativa de mRNA de los transportadores
de nucleósidos en cinco lı́neas celulares de CC (A) y en ocho biopsias humanas
(B). Los valores corresponden al promedio de los resultados de la determinación
en dos pases celulares diferentes, por duplicado ± ES. En el caso de las biopsias,
la determinación se hizo de forma independiente dos veces, por duplicado.
Este análisis también lo realizamos en paralelo con un panel de 8
muestras de biopsias humanas, con diagnóstico histopatológico de CC
123
(Figura 4.15B), obtenidas del Hospital Clı́nico de Barcelona. En estas
muestras observamos también altos niveles de expresión de hENT1 y
hENT2.
Los niveles de expresión de los transportadores concentrativos fueron mayores a los mostrados por las lı́neas celulares, pero menores a los
de los transportadores equilibrativos. Exhibiendo también una alta variabilidad en la expresión entre los distintos tumores, particularmente
de hCNT3 y hCNT1.
La pérdida selectiva de la expresión de transportadores concentrativos, en particular de CNT1 y CNT2, ha sido investigada por nuestro
grupo en lı́neas celulares de hepatocarcinoma [111], por Zollner, 2005
en muestras humanas de carcinoma hepatocelular [284], y mas recientemente por el grupo de Marin JJG, 2012, que confirmó la pérdida
de expresión de CNT1 en lineas de CC humano, si se comparan con
su expresión en hı́gado sano [285]. La pérdida de expresión de CNT1
se ha observado también en un gran número de tumores humanos
no hepáticos como el cáncer de mama, páncreas y distintos tumores
ginecológicos [286] [287] [288].
La importancia de estos hallazgos es que la disminución de la expresión de los transportadores de tipo concentrativo, y en particular
de CNT1 podrı́a correlacionarse con la menor capacidad de transporte
de drogas derivadas de nucleósidos, como la gemcitabina y por tanto
podrı́a ser uno de los mecanismos involucrados en la generación de
resistencia a esta droga en CC [289] [288].
4.2.2.
Efectos citotóxicos producidos por gemcitabina,
Cisplatino y 5-FU en la lı́neas de CC
Aun cuando hemos demostrado que las lı́neas tendrı́an capacidad
de transporte que asegurarı́a la entrada de los fármacos análogos de
nucleósidos hacia el interior celular, el porcentaje de éxito del tratamiento del CC con estos fármacos es baja. Por esto, seleccionamos los
tres fármacos de uso mas frecuente en la terapia del CC; gemcitabina,
5-FU y Cisplatino [290] [209] [291], y determinamos sus efectos citotóxicos en las cuatro lı́neas celulares utilizadas en la caracterización
funcional, e incluı́mos además, una lı́nea de carcinoma pancreático
(NP29) sensible a gemcitabina [289].
La Figura 4.16, resume los resultados de las curvas de dosis-respuesta
en las lı́neas. Como es posible observar, sólo el Cisplatino (Figura 4.16C) fue efectivo induciendo muerte celular en todas las lı́neas
celulares, con valores de IC50 del orden µM en todas ellas, similar a lo
descrito para lineas celulares derivadas de otros tumores [292] [293].
124
Todas las lı́neas mostraron comportamientos semejantes a la acción de la gemcitabina y el 5-FU (Figura 4.16A y B). En las célu-
Figura 4.16: Resumen de las IC50 determinadas por ensayos de citotoxicidad
en las lı́neas celulares de CC para los fármacos utilizados en la terapia contra el
CC. Curvas de muerte celular inducida por dosis creciente de 5-FU, Cisplatino y
gemcitabina. A), B) y C) respectivamente. Las células fueron expuestas al fármaco
durante 24 h, el ensayo de viabilidad fue realizado 48 h después. D) Tabla resumen
de los valores de IC50 . ND: No determinada. Los resultados se expresan como el
promedio ± ES de los valores de citotoxicicidad obtenidos por cuadruplicado y son
representativos de 3-7 experimentos independientes.
las Mz-ChA-2, ambos fármacos sólo indujeron un bajo porcentaje de
muerte no superior al 25 % y 40 % para gemcitabina y 5-FU, respectivamente, inclusive a dosis altas (500µM). Sin embargo, es importante
destacar que está lı́nea fue la que mostró mayor sensibilidad a la acción
del Cisplatino. En comparación, la lı́nea TFK-1 mostró una respuesta
ligeramente mayor al tratamiento con gemcitabina y 5-FU. Aún ası́,
la gemcitabina indujo un bajo porcentaje de muerte, cercano al 50 %,
y en el caso de 5-FU la IC50 fue en el rango mM, lo que queda fuera
del rango útil para su uso en terapia clı́nica.
Las células BCLC-12 y Mz-ChA-1 fueron las que mostraron mayor
sensibilidad a la acción de los tres fármacos, con magnitudes de IC50
del orden µM para gemcitabina y 5-FU. Sin embargo, al igual que
lo visto en todas la lı́neas la gemcitabina no produjo muerte celular
125
superior a un 75 %. La respuesta citotóxica de las células NP-29 frente
a los tres fármacos fue la esperada, validando los resultados obtenidos
con las lı́neas de CC.
No parece existir una correlación entre la sensibilidad de las lı́neas
al tratamiento con los fármacos análogos de nucleósidos, y la expresión
o la actividad de los transportadores, lo cual podrı́a estar indicando
que son otros los factores involucrados.
Debido a que la quimioterapia contra el CC consiste generalmente
de una combinación de fármacos, probamos también el efecto de la
combinación gemcitabina-Cisplatino y gemcitabina-5-FU en la viabilidad de las lı́neas celulares. Para esto la concentración de gemcitabina
fue mantenida en un valor aproximado de la IC20 , el cual fue calculado entre las lı́neas sensibles y correspondió a una concentración de 10
nM. Las escalas de dosis de Cisplatino y 5-FU se mantuvieron igual
a las utilizadas en los ensayos de dosis-respuesta de los fármacos en
monodosis.
Figura 4.17: Curvas de viabilidad frente a la combinación gemcitabina-5-FU en
las células TFK-1 (A), BCLC-12 (B), Mz-ChA-1 (C), Mz-ChA-2 (D).Los resultados
se expresan como el promedio ± ES de los valores de citotoxicicidad obtenidos por
cuadruplicado y son representativos de 3-6 experimentos independientes.
La Figura 4.17 muestra la comparación de las curvas de dosisrespuesta de gemcitabina, 5-FU y la combinación de ambos fármacos.
En general el tratamiento combinado no consiguió aumentar la mortalidad máxima observada con los fármacos en monodosis, sin embargo
si se observó un desplazamiento en las curvas de sensibilidad.
En las células TFK-1 (Figura 4.17A), no observamos un cambio
en la forma de la curva citotoxicidad de 5-FU, la presencia de gemci126
tabina indujo un leve desplazamiento de la curva de 5-FU sin afectar
mayormente los valores de IC50 determinados para el 5-FU en monodosis.
En las lı́neas BCLC-12 y Mz-ChA-1 (Figura 4.17B y C), la dosis de
gemcitabina afectó positivamente la sensibilidad de las células a dosis
bajas de 5-FU. Pudimos observar un aumento en la muerte celular
a dosis del orden µM. Sin embargo, a dosis mayores vemos que este
efecto disminuyó, sin llegar alterarse significativamente ni el valor de
IC50 , ni el porcentaje de muerte máxima provocada por el tratamiento
con 5-FU en monodosis.
La combinación de gemcitabina con 5-FU en las células Mz-ChA2 (Figura 4.17D), indujo un cambio en el perfil del efecto citotóxico
en las células, cambiando la curva dosis-respuesta de forma similar a
la de la gemcitabina en monodosis, y aumentando la muerte celular
a menores dosis con 5-FU, pero sin afectar el porcentaje de muerte
total observado con el 5-FU en monodosis.
Estos resultados permiten deducir que todas las lı́neas celulares
parecen tener dos sub-poblaciones que responden de forma diferente
a los fármacos análogos de nucleósidos. Una sub-población sensible
a estos fármacos y en en la cual se observa un efecto aditivo de la
combinación de gemcitabina y 5-FU. La otra población insensible, no
se ve afectada por el tratamiento combinado, y parece ser resistente
a la acción de ambos fármacos. Esto podrı́a ser importante de tener
en cuenta para la quimioterapia en pacientes, en donde es importante
que la combinación de fármacos esté dirigida a aumentar la sensibilidad y también aumentar el porcentaje de muerte de las células
cancerı́genas, sin seleccionar poblaciones. Serı́a interesante caracterizar la presencia de estas sub-poblaciones celulares y determinar que
factores son responsables de estas diferencias.
Por otra parte, en el caso de la combinación de gemcitabina con
Cisplatino (Figura 4.18), observamos un evidente cambio en el perfil
de sensibilidad a Cisplatino en todas la lı́neas (a excepción de las
células BCLC-12), que se ve reflejado en el cambio de la forma de
las curvas de dosis-repuesta. Este cambio no tuvo un efecto en los
porcentajes de muerte máxima inducidas por Cisplatino, manteniendo
este altos porcentajes de muerte total en todas las lı́neas celulares.
En las células TFK-1 (Figura 4.18A), la gemcitabina indujo una
disminución de la sensibilidad a Cisplatino, aumentando el valor de
IC50 . En contraste, en las células Mz-ChA-1, la combinación tuvo un
efecto aditivo, sensibilizando las células a dosis menores de Cisplatino
y disminuyendo el valor de IC50 (Figura 4.18C). En las lı́neas BCLC-12
y Mz-ChA-2 , no se vieron cambios significativos en los valores de IC50
127
Figura 4.18: Curvas de viabilidad frente a la combinación gemcitabina-Cisplatino
en las células TFK-1 (A), BCLC-12 (B), Mz-ChA-1 (C), Mz-ChA-2 (D). Los resultados se expresan como el promedio ± ES de los valores de citotoxicicidad obtenidos
por cuadruplicado y son representativos de 3-6 experimentos independientes.
con la combinación de fármacos, pero en las células Mz-ChA-2, si se
observó un afecto aditivo a dosis bajas de Cisplatino (Figura 4.18D).
La sensibilidad al Cisplatino parece ser homogénea y no estarı́an
afectando distintas sub-poblaciones celulares, ya que indujo porcentajes de muerte máxima superiores a 90 % en todas las lı́neas celulares
ensayadas. La combinación con gemcitabina, tiene en general efectos
positivos aumentado la sensibilidad celular, si las dosis de Cisplatino
utilizadas se mantienen bajas.
4.2.3.
Genes asociados a resistencia de la terapia antitumoral
En conjunto, los resultados anteriores indicaron que es probable
que otros factores, independientes de los mecanismos de entrada del
fármaco antitumoral a la células, sean los responsables del fracaso
terapéutico observado por los análogos de nucleósidos en las lı́neas
celulares de CC. Entre los candidatos, podrı́amos sugerir otro tipo de
transportadores tales como MRP3 y MDR1, involucrados en la salida
de drogas y que han sido descritos en colangiocitos [294] [295] [296], o
miembros de la familia de transportadores SLC22 que en otros tejidos
han sido asociados a efectividad de la terapia [297]. Aunque tampoco
podemos descartar que la disminución en la expresión de enzimas del
metabolismo intracelular de los análogos de nucleósidos tales como la
deoxicitidina quinasa (DCK), timidina fosforilisa (TYMP) o la dehi128
dropirimidina deshidrogenasa (DPYD), involucradas en la resistencia
en otros tejido, sean responsables de la baja eficiencia de inhibición
encontrada [298] [299].
Utilizando la técnica de Fast Real-Time PCR mediante el uso tarjetas microfluı́dicas (TDLAS), realizamos el análisis transcriptómico
de la expresión del mRNA en distintas familias de genes involucrados
en los mecanismos de resistencia de la terapia antineoplásica. Incluimos en este análisis 45 genes y dos controles endógenos, los cuales se
han descrito en Materiales y métodos (Sección 3.6.7, Figura 3.8). El
análisis fue realizado en seis lı́neas celulares de CC de distinto origen,
y una de las muestras de biopsias humanas utilizadas en la cuantificación del mRNA de los transportadores de nucleósidos. Esta muestra
fue escogida al azar y utilizada como control de la expresión relativa
calculada para todo el resto de genes.
Del total de genes analizados, 3 fueron excluidos del análisis, ya
que su expresión en todas las lı́neas se encontraba bajo el lı́mite de
detección de la técnica. Estos genes corresponden a las enzimas 5’
Nucleotidasa A y B (NT5C1A y B) y a la Ribonucleótido reductasa
(RRM1).
La primera familia de genes que analizamos corresponde a la familia génica SLC22, la cual codifica para transportadores orgánicos de
cationes (OCTs), para transportadores activos de carnitina(OCTNs)
y para transportadores orgánicos de aniones (OATs), y aunque no
parecen contribuir al transporte de nucleósidos naturales, han sido
implicados en la captación de fármacos derivados de nucleósidos y
nucleobases, que no son transportados por los transportadores de nucleósidos, como es el caso del 5-FU [300]. Adicionalmente también
participan en el transporte de Cisplatino y otros fármacos derivados
de platino [235] [301].
En la Figura 4.19A, vemos una alta expresión de OCT2 y OCT3,
en la lı́nea Mz-ChA-1. Ninguno de estos transportadores ha sido descrito en el epitelio biliar. OCT2 ha sido ampliamente estudiado en el
riñón y su expresión está relacionada con la aparición de efectos tóxicos a la terapia de Cisplatino. Por otra parte, OCT3 es un transportador ubicuo, y en hepatocitos se encuentra en la membrana basolateral.
La elevada sensibilidad de la lı́nea Mz-ChA-1 a Cisplatino podrı́a estar
relacionada con la sobreexpresión de estos transportadores [302] [303].
OCT1 también es un importante transportador en la farmacologı́a
antitumoral, al igual que OCT2 es responsable del transporte de los
fármacos derivados de platino y probablemente de las antraciclinas
[304]. De acuerdo al estudio realizado por el grupo de Marı́n en 2012,
nuestros resultados mostraron que todas las lı́neas de CC exhibieron
129
niveles muy bajos, casi indetectables de este transportador [285].
En esta figura vemos también una elevada expresión de OAT2 en
las lineas celulares en general. Si bien se sabe de la expresión de OAT2
en el hı́gado, la ubicación subcelular no es clara. Sin embargo se ha
descrito que es capaz de transportar 5-FU y por lo tanto su baja
expresión se podrı́a correlacionar con la sensibilidad al tratamiento
con 5-FU [218]. En contraste, en todas las lı́neas celulares encontramos
bajos niveles de expresión de OAT3, que también ha sido involucrado
en la captación de 5-FU y por lo tanto podrı́a tener relación con la
resistencia mostrada por las lı́neas [219].
No vimos ningún cambio significativo que pudiera estar relacionado con la respuesta farmacológica de las lineas celulares en los transportadores de la familia SLCO ( Figura 4.19C).
Figura 4.19: Análisis transcriptómico de familias génicas de transportadores de
fármacos en las células de CC. El análisis de la expresión de mRNA fue realizado
utilizando placas microfluı́dicas (TLDs, Applied Biosystem). Las placas incluyeron
sondas para la detección de transportadores de la familia SLC22 (A), SLCO (B)
y ATP7-SLC31 (C). Los valores corresponden el promedio de los resultados de la
determinación en dos pases celulares diferentes, por duplicado ± ES.
130
Analizamos también los niveles de expresión de transportadores
asociados directamente con la captación y la salida del Cisplatino,
por esto incluimos en el análisis los transportadores ATP7A y ATP7B,
los responsables de la salida de Cu+2 desde la célula, e incluimos el
transportador CTR1, el cual esta descrito como el mediador principal
de la entrada del cobre desde la sangre al interior celular [297].
Como se puede ver en la Figura 4.19C las células BCLC-12 tienen
una sobrexpresión de los niveles de todos los transportadores asociados a la homeostasis del Cu+2 . Aunque, tanto los niveles de los
transportadores de salida (ATP7A y B) como los de entrada (CTR1)
están aumentados, no se observaron diferencias significativas en la
sensibilidad de estas células comparadas con todas las demás.
Dentro del análisis transcriptómico, incluimos también la familia de transportadores ABC (ATP-binding cassette), los cuales son
fundamentales en el transporte de salida de una gran variedad de sustancias, por tanto, tienen un rol vital en la modulación de numerosas
funciones celulares. Estos transportadores tienen un papel protector
en varios tejidos, ya que excretan los compuestos tóxicos y sus metabolitos fuera de la célula. Muchos de estos transportadores, están
altamente expresados en el hı́gado y el sistema biliar, lo que asegura una correcta eliminación de compuestos endógenos y exógenos del
organismo, y una correcta composición de la bilis [305].
En la Figura 4.20A, se muestra el perfil de expresión de los transportadores de las familias ABCA, ABCB y ABCG en las lı́neas celulares. Entre los miembros de esta familia observamos una alta variabilididad en la expresión de MDR1 y de ABCG2.
MDR1 también conocida como glicoproteı́na-P, es una de las proteı́nas que participa en la detoxificación de compuestos en el epitelio
biliar, donde se localiza en la membrana apical de los colangiocitos.
La sobreexpresión de MDR1 y ABCG2, ha sido correlacionada con la
resistencia a diversas drogas anticancerı́genas [306]. En particular en
CC, la pérdida en la expresión de ABCG2 podrı́a llegar a servir como
elemento de mal prognosis del CC intrahepático [307].
En cuanto a los transportadores de la familia ABCC (MRPs), en
la Figura 4.20B se puede ver que también existe variabilidad en la
expresión de MRP1, MRP2 y MRP3 entre las lı́neas celulares.
MRP2 y MRP3 han sido descritos en el dominio apical del epitelio
de la vesı́cula biliar y del epitelio biliar, respectivamente [308] [309]
[138]. Es importante destacar los altos niveles de MRP3 encontrados en TFK-1 y Mz-ChA-2, las lı́neas celulares que mostraron menor
sensibilidad al tratamiento con análogos de nucleósidos, ya que en el
páncreas, el aumento de la expresión de esta proteı́na ha sido relacio131
Figura 4.20: Análisis de la expresión de mRNA de la familia génica de transportadores ABC. El análisis fue realizado utilizando TLDs, las placas incluyeron sondas
para la detección de los transportadores de la familia ABCA-ABCB y ABCG (A)
y ABCC (B). Los valores corresponden el promedio de los resultados de la determinación en dos pases celulares diferentes, por duplicado ± ES.
nada con resistencia al tratamiento con 5-FU. [310] [311].
Finalmente, en cuanto al análisis del perfil de expresión de enzimas
involucradas en el metabolismo de fármacos, 5 de las 6 lı́neas celulares mostraron niveles elevados de expresión de Deoxicitidina quinasa
(DCK), la enzima responsable de la activación intracelular de la gemcitabina, y paso limitante para su activación una vez internalizada
(Figura 4.21A). La deficiencia de esta enzima es uno de los mecanismos mas descritos de resistencia a gemcitabina, ya que existe una
estrecha relación entre la disminución de su actividad y la aparición
de resistencia [312] [299].
Análogamente, encontramos elevados también los niveles de expresión de Timidina quinasa 1 (TK1), enzima análoga a DCK pero
con especificidad para fármacos derivados de timidina, tales como el
antiviral aciclovir. Aun cuando su función puede no tener relación
directa con el metabolismo de las drogas estudiadas, la expresión de
esta enzima es elevada en células que se encuentran proliferando o en
fase S [313]. Además, altos niveles de TK1 en plasma se han correlacionado con estadios mas avanzados de cáncer en una gran variedad
de cáncer de tumores sólidos [314] [315] [316]. Por lo tanto, serı́a interesante determinar si existe alguna correlación entre su expresión
132
.
Figura 4.21: Análisis de la expresión de mRNA de enzimas del metabolismo de
fármacos análogos de nucleósidos. Los valores corresponden el promedio de los
resultados de la determinación en dos pases celulares diferentes, por duplicado ±
ES.
y la progresión del CC, ya que hasta la fecha no existen marcadores
claros para su uso en clı́nica.
Todas las lı́neas (exceptuando BCLC-12) mostraron bajos niveles de expresión de Dihidropirimidina deshidrogenasa (DPYD) (Figura 4.21B), la enzima responsable de la metabolización de 5-FU, su
baja actividad ha sido relacionada con mejor respuesta al tratamiento
con este fármaco [317] [318]. También encontramos disminuidos los
niveles de expresión de las enzimas Uridina-citidina quinasa (UCK2),
Uridina monofosfato sintetasa (UMPS) y Folilpoliglutamato sintesasa
(FPGS), y no vimos cambios significativos en la expresión de enzimas
como la UNG (Figura 4.21C).
Si bien no encontramos una correlación evidente entre la expresión
de los genes involucrados en resistencia y la sensibilidad a las drogas
ensayadas en las lı́neas celulares de CC, es importante notar que sólo
hemos analizado el perfil de expresión de mRNA, lo cual no siempre
correlaciona con los niveles de proteı́na y actividad de las diferentes
133
entidades moleculares determinadas. Serı́a interesante caracterizar dos
hallazgos relacionados con la sensibilidad al tratamiento con 5-FU, por
una parte la baja expresión de OATP3, uno de los transportadores
involucrados en la captación de 5-FU. Y por otra parte, los altos
niveles de expresión de MRP3 encontrados en las lı́neas con mayor
resistencia al tratamiento de 5-FU y gemcitabina.
Este estudio podrı́a ser de utilidad como punto de partida en el
estudio de nuevas dianas involucradas en la resistencia del tumor, en
donde los genes involucrados directamente en la patogénesis del CC,
como las vı́as de apoptosis y proliferación celular, podrı́an jugar un
importante rol en el fracaso de la quimioterapia actual del CC.
Además, en conjunto estos resultados pueden servir para planificar
otras alternativas de terapia contra el CC, que puedan terminar con
la resistencia que muestran estos tumores a los tratamientos convencionales, en este sentido el uso de TDLAs puede ser una metodologı́a
útil en el diseño de una terapia adecuada y personalizada para cada
paciente.
134
5
Conclusiones
135
136
Los transportadores concentrativos CNT2 y CNT3 son las principales entidades presentes en el colangiocito, su localización es
diferencial y sus actividades son moduladas por elementos claves
en la fisiologı́a del colangiocito, tales como el cilio y los estı́mulos
coleréticos de secretina y ATP.
El receptor A2A modula la actividad de transporte apical de
CNT3, induciendo a nivel apical un aumento de su actividad y
en contraste a nivel basolateral provocando una disminución de
su actividad. Este mecanismo podrı́a deberse a la dimerización
con otras proteı́nas de membrana, como el receptor A1 o el receptor para dopamina D2 .
La actividad en el dominio apical de CNT2 y CNT3 está bajo
el control del ATP el cual a través de la acción de receptores de
tipo P2Y sensibles a suramina (probablemente P2Y2 ), inhibe la
actividad de transporte.
La diferente regulación del transportador apical de adenosina
CNT3, por receptores de tipo P1 (estimulándolo) y P2 (inhibiéndolo) anticipan una regulación coordinada de la funcionalidad asociada a la secreción y metabolización del ATP.
El cambio de expresión de los transportadores CNT y ENT en el
CC, no parece correlacionarse con la variable y en general baja
quimiosesibilidad del CC a los derivados de nucleósidos.
El análisis combinado de las principales vı́as de internalización,
metabolización y salida de estos fármacos tampoco parece poder explicar la quimioresistencia, lo que se sugieren componentes
farmacodinámicas capaces de condicionar la correcta respuesta
al tratamiento.
137
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164
Anexos
xvii
xviii
0026-895X/11/8005-809–817$25.00
MOLECULAR PHARMACOLOGY
Copyright © 2011 The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics
Mol Pharmacol 80:809–817, 2011
Vol. 80, No. 5
71837/3723736
Printed in U.S.A.
Expression and Distribution of Nucleoside Transporter Proteins
in the Human Syncytiotrophoblast
Ekaitz Errasti-Murugarren,1 Paula Díaz,2 Valeria Godoy,3 Gloria Riquelme,
and Marçal Pastor-Anglada
Received February 18, 2011; accepted August 8, 2011
ABSTRACT
The plasma membrane distribution and related biological activity of nucleoside transporter proteins (NTs) were investigated
in human syncytiotrophoblast from term placenta using a variety of approaches, including nucleoside uptake measurements
into vesicles from selected plasma membrane domains, NT
immunohistochemistry, and subcellular localization (basal,
heavy, and light apical membranes as well as raft-enriched
membranes from the apical domain). In contrast with other
epithelia, in this epithelium, we have identified the high-affinity
pyrimidine-preferring human concentrative nucleoside transporter (hCNT) 1 as the only hCNT-type protein expressed at
both the basal and apical membranes. hCNT1 localization in
Introduction
Fetal exposure to xenobiotics is known to be harmful in
many cases, compromising gestation itself and neonatal development. The placenta is known to express a broad scope of
xenobiotic transporters (Leazer and Klaassen, 2003), which
appear to be key players in the regulation of placental vectorial flux of nutrients and xenobiotics, potentiating either
This research was supported in part by Fondecyt-Chile [Grants 1070695
and SAF2008-00577] (the former to G.R.); Centro de Investigación Biomédica
en Red (an initiative of Instituto de Salud Carlos III); Generalitat de Catalunya [Grant 2009SGR00624] (to M.P.-A.); and the Ministerio de Ciencia e
Innovación [Grant AP2003–3938] (to E.E.-M.).
G.R. and M.P.-A. contributed equally to this work.
1
Current affiliation: Institut de Recerca Biomèdica, Barcelona, Spain.
2
Current affiliation: Maternal and Fetal Health Research Centre, University of Manchester, Manchester, United Kingdom.
3
Current affiliation: Universitat de Barcelona Institute of Biomedicine de
la Universitat de Barcelona-Centro de Investigación Biomédica en Red en el
Área temática de Enfermedades Hepáticas y Digestivas, Barcelona, Spain.
Article, publication date, and citation information can be found at
http://molpharm.aspetjournals.org.
doi:10.1124/mol.111.071837.
lipid rafts is also dependent on its subcellular localization in the
apical plasma membrane, suggesting a complex cellular and
regional expression. Overall, this result favors the view that the
placenta is a pyrimidine-preferring nucleoside sink from both
maternal and fetal sides, and hCNT1 plays a major role in
promoting pyrimidine salvage and placental growth. This finding may be of pharmacological relevance, because hCNT1 is
known to interact with anticancer nucleoside-derived drugs
and other molecules, such as nicotine and caffeine, for which a
great variety of harmful effects on placental and fetal development, including intrauterine growth retardation, have been
reported.
their maternofetal transfer or their detoxification. Among
the plasma membrane proteins that might play this dual role
of being both nutrient and xenobiotic transporters, most
members of the SLC28 and SLC29 gene families have been
reported to be expressed in the placenta at the mRNA level
(Barros et al., 1995; Griffiths et al., 1997; Gray et al., 2004;
Govindarajan et al., 2007; Errasti-Murugarren et al., 2009).
SLC28 and SLC29 genes encode human concentrative nucleoside transporter (hCNT) and human equilibrative nucleoside transporter (hENT) proteins, respectively (Pastor-Anglada et al., 2008; Young et al., 2008). To date, only human
equilibrative nucleoside transporter proteins hENT1 and
hENT2 have been reported to be expressed in placenta, although their plasma membrane localization is still unclear
(Barros et al., 1995; Govindarajan et al., 2007). Occurrence of
hCNT proteins in human placenta has not been studied in
detail, although the human syncytiotrophoblast-derived cell
line BeWo has been shown to express hCNT3 mRNA and
protein (Yamamoto et al., 2007).
ABBREVIATIONS: h, human; CNT, concentrative nucleoside transporter; ENT, equilibrative nucleoside transporter; NT, nucleoside transporter
protein; RT, reverse transcriptase; PCR, polymerase chain reaction; bp, base pair(s); LMVM, light microvillous membrane; MVM, microvillous
membrane; BM, basement membrane; NBTI, nitrobenzylthioinosine; MES, morpholinoethanesulfonic acid; PBS, phosphate-buffered saline.
809
Downloaded from molpharm.aspetjournals.org at Biblioteca de la Universitat de Barcelona on April 10, 2012
Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain (E.E.-M.,
V.G., M.P.-A.); Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain (E.E.-M., V.G., M.P.-A.); Centro de
Investigación Biomédica en Red en el Área temática de Enfermedades Hepáticas y Digestivas, Barcelona, Spain (E.E.-M.,
M.P.-A.); and Departamento de Fisiología y Biofísica, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de
Chile, Santiago, Chile (P.D., V.G., G.R.)
810
Errasti-Murugarren et al.
Materials and Methods
Reagents. Uridine, cytidine, adenosine, thymidine, guanosine,
5!-deoxy-5-fluorouridine, and zidovudine (AZT) were obtained from
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Tritiated uridine ([5,6-3H], 35–50
Ci/mmol), thymidine ([5,6-3H], 35–50 Ci/mmol), and adenosine ([5,63
H], 35–50 Ci/mmol) were purchased from GE Healthcare (Chalfont
St. Giles, Buckinghamshire, UK). Cytidine ([5-3H(N)], 21.5 Ci/mmol)
and guanosine ([8-3H(N)], 7 Ci/mmol) were purchased from Moravek
Biochemicals (Brea, CA).
RNA Isolation and RT-PCR. Total RNA was extracted from
placenta lysates using an RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Barcelona,
Spain). RNA was treated with DNase I from an RNase-Free DNase
Set (QIAGEN) to eliminate contaminating DNA. cDNA was generated from 1 !g of total RNA by reverse transcription using TaqMan
reagents as described by the manufacturer (Applied Biosystems,
Foster City, CA). Different sets of primers were designed and synthesized for PCR analysis of each transporter. For amplifying
hCNT1, the primers used were 5!-GAG GGG TCT AGC TCT TGC
TG-3! (forward) and 5!-CAC CTT CAC GGA GAT GGC GGC C-3!
(reverse), which generated a 822-bp product; for hCNT2, the primers
were 5!-CCC GCC TGA GGC TTT GGA CG-3! and 5!-CAA CCC CAA
AGG CTA TGA AGG-3!, which generated a 650-bp product; for
hCNT3, the primers were 5!-GCA CAC TCA AAC TGC TCC ACC-3!
and 5!-GGG CTC TGT GAA AGT TCA GC-3!, which generated a
446-bp product and a 622-bp insert-containing (hCNT3ins) product;
for hENT1, the primers were 5!-GGG CCA CCG CCT GCT GAA ACG
G-3! and 5!-CCT TGA CCA GCG CCT CCC C-3!, which generated a
410-bp product; and for hENT2, the primers were 5!-CCT CAA CTC
CTT CCT GTA CC-3! and 5!-CCC ACA CAG GGC GTG ATA AAG-3!,
which generated a 355-bp product. PCRs were performed using the
following cycling conditions: 40 cycles of 94°C for 1 min; 55°C
(hCNT1, hCNT2, hENT1, and hENT2) or 57°C (hCNT3) for 1 min
and 72°C for 3 min, followed by a final extension at 72°C for 15 min
and cooling to 4°C. The amplified fragments were separated and
visualized on 1% ethidium bromide-stained agarose gels.
Preparation of Syncytiotrophoblast Plasma Membranes.
Placentae were obtained from normal pregnancies and collected at
term immediately after delivery from the San José Hospital Maternity Unit (Santiago, Chile). Human placental plasma membrane
vesicles were prepared from fresh normal-term placentae by a
method described previously that allows the simultaneous isolation
of apical and basal membranes from the same placenta (Jimenez et
al., 2004). This method involves differential centrifugation, precipitation of nonmicrovillous membranes with magnesium ions, and a
sucrose gradient step. All solutions were buffered with 20 mM Trismaleate, pH 7.4. A portion (0.5–1 ml) of either the microvillous or
basal membrane-enriched fraction was overlaid on the surface of a
discontinuous sucrose gradient. The bands at the 10%/37% and 37%/
45% sucrose interfaces correspond to the light microvillous membrane (LMVM) fraction and heavy microvillous membrane (MVM)
fraction, respectively, whereas the band at the 47%/52% interface
corresponds to the basal membrane (BM) fraction. Each fraction was
collected and diluted 10-fold with 20 mM Tris-maleate, pH 7.4, and
centrifuged at 110,000g for 30 min. The final pellets were resuspended in preload medium containing 250 mM sucrose, 0.2 mM
CaCl2, 20 !M MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.5, and 150 mM KSCN
and stored in liquid nitrogen. The protein concentration was determined using a BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA). The purity and enrichment of the apical and basal
membrane fraction were determined routinely by assaying for classic
marker protein activities as described previously (Jimenez et al.,
2004). Alkaline phosphatase was used as an apical membrane
marker. Enrichment of alkaline phosphatase activity was more than
20-fold for MVM and LMVM compared with the activity of the
homogenate. The cross-contamination of purified basal membranes
with apical membranes was low, as evidenced by the lack of alkaline
phosphatase enrichment in the basal fraction. The ratio of placental
alkaline phosphatase activity enrichment of BM compared with that
of apical membranes was 0.1 for the placentae used in this study,
lower or equivalent to that from several other reports for single or
paired apical and basal membrane preparations (Glazier et al., 1990;
Illsley et al., 1990) as we demonstrated previously (Jimenez et al.,
2004). In addition, for both MVM and BM vesicles, orientation is
preferentially right-side out, as reported previously (Illsley et al.,
1990). For LMVM vesicles, data about orientation are not available.
However, it is expected that after this isolation protocol, all three
type of vesicles show a preferential right-side out orientation. In fact,
when setting up these methods, we initially observed that preparations, including both MVM and LMVM fractions, showed at least
90% of properly oriented vesicles, as determined by measuring phos-
Downloaded from molpharm.aspetjournals.org at Biblioteca de la Universitat de Barcelona on April 10, 2012
The elucidation of what particular types of CNT proteins
are expressed in the human syncytiotrophoblast, along with
the analysis of their polarized expression relative to that of
ENT-type proteins, may be of great interest in pharmacology.
This assumption is based on the evidence that NT proteins
mediate the translocation of natural nucleosides and also the
uptake of most nucleoside-derived anticancer drugs and
some nucleoside-derived inhibitors of retroviral reverse transcriptases used in antiviral therapies (Errasti-Murugarren
and Pastor-Anglada, 2010). Some reports have related nucleoside-derived therapies with placental dysfunction. The demethylating agent 5-azacytidine, a good hCNT1 and hENT1
substrate (Huang et al., 2004; Rius et al., 2009), has been
reported to induce a variety of harmful effects in rodent
placenta, including reduced mass, altered structure, and impaired proliferation of trophoblast cells (Serman et al., 2007).
Gemcitabine, a suitable hCNT1, hCNT3, hENT1, and hENT2
substrate (Mackey et al., 1999; Errasti-Murugarren et al.,
2007), has been reported to induce developmental toxicity in
mice (Eudaly et al., 1993), whereas it has been shown recently that placental tissue of HIV-1 infected antiretroviral
therapy-exposed pregnancies shows mitochondrial DNA depletion (Gingelmaier et al., 2009). Moreover, HIV-uninfected
children born to HIV-infected mothers are apparently at risk
of long-term mitochondrial toxicity (Poirier et al., 2003).
Of interest, nucleoside transporters are also known to interact with compounds such as caffeine and nicotine with
high affinity (Lang et al., 2004). Both xenobiotics have been
comprehensively studied as risk factors during pregnancy.
Among many other observations in the literature, it is known
that caffeine intake increases the risk of early spontaneous
abortion among nonsmoking women (Cnattingius et al.,
2000), whereas modest maternal caffeine exposure may impair fetal cardiovascular function and growth (Momoi et al.,
2008) and also promotes long-lasting behavioral changes in
mouse offspring (Björklund et al., 2008). Nicotine exposure
during pregnancy has also been related to a variety of harmful effects, including, among many others, intrauterine
growth retardation (Einarson and Riordan, 2009).
On the basis of this previous evidence, the goal of this
contribution was to investigate the expression, activity, and
subcellular localization of nucleoside transporters in nonpathological syncytiotrophoblasts. This investigation is of
crucial interest for the understanding of the role these transporters play in placental physiology, but, more importantly,
this study also represents the first step in the future analysis
of how drug-induced placental dysfunction can be associated
with altered NT-related transport processes, thereby affecting fetal growth and performance.
Nucleoside Transporters in Human Placenta
the trophoblastic localization of nucleoside transporters. After tissue
sections were rinsed with PBS, they were incubated for 1 h at room
temperature with Rhodamine Red X-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories,
West Grove, PA), which recognizes anti-hENT1, anti-hENT2, and
anti-hCNT1), and with Cy2-conjugated goat anti-mouse antibody
(Jackson ImmunoResearch Laboratories), which recognizes the anticytokeratin 7 antibody. Control sections were incubated with secondary antibody after incubation in PBS buffer without the primary
antibody. Sections were viewed using a Leica TCS SP5 laser scanning confocal microscope (Leica Microsystems Heidelberg GmbH,
Mannheim, Germany) equipped with a DMI6000 inverted microscope, a diode-pumped solid-state argon laser (561 nm), and a 63" oil
immersion objective (numerical aperture 1.4). Cy2 and Rhodamine
Red X labeling was visualized by acquiring images sequentially at
the 488- and 561-nm laser lines using an Acousto-Optical Beam
Splitter, with emission detection at 500 to 550 and 571 to 650 nm,
respectively. Optical sections were collected every 0.3 !m in a
1024 " 1024 format with a confocal pinhole (radius) of 1 airy unit,
zoom # 4, and a pixel size of 60 " 60 nm. Differential interference
contrast images were acquired simultaneously.
Western Blot Analysis. All flotation gradient fractions were
evaluated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting. An aliquot (50 !l) of each fraction was incubated with 10%
(v/v) trichloroacetic acid for 30 min on ice and centrifuged at 21,000g
for 30 min at 4°C. The pellets were resuspended in sample buffer and
sonicated for 30 min. Trichloroacetic acid-precipitated protein (40
!g) from LMVM and MVM preparations was separated on 10%
polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes
(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Membranes were incubated
with primary anti-hENT1, anti-hENT2, or anti-hCNT1 antibodies
diluted 1:1000. In addition, anti-human placental alkaline phosphatase (clone 8B6, 1:1000; Sigma-Aldrich) and anti-human transferrin
receptor (clone H68.4, 1:500; Zymed Laboratories) were used as raft
and nonraft markers, respectively. After incubation with primary
antibody, proteins were detected using a horseradish peroxidaseconjugated secondary antibody and an enhanced chemiluminescence
detection kit (GE Healthcare).
Data Analysis. Data are expressed as the mean $ S.D. of uptake
values obtained in three filter inserts from three independent placentae. Data are representative of three experiments carried out on
different days on different batches of membranes.
Results
A study of nucleoside transporter-related mRNA showed
that the five nucleoside transporters analyzed (hCNT1,
hCNT2, hCNT3, hENT1, and hENT2), as well as the recently
characterized spliced isoform of hCNT3 (hCNT3ins), were
expressed in human placenta (Fig. 1).
Nucleoside transport in syncytiotrophoblast plasma membrane-derived vesicles was characterized using either uridine or cytidine as substrates. Figure 2 shows the time course
of uridine (Fig. 2A) and cytidine (Fig. 2B) uptake (1 !M) by
Fig. 1. Qualitative RT-PCR analysis of nucleoside transporters in human placenta. RT-PCR was used to amplify
hCNT1, hCNT2, and hCNT3 (top) and hENT1 and hENT2
(bottom) from human placenta (P). Kidney (K), liver (L),
and pancreas (Pc) were used as positive controls for
hCNT1, 2, and 3, respectively, and kidney was used as a
positive control for both hENTs. Positive controls for both
wild-type (446-bp) and the recently reported hCNT3 splicing isoform hCNT3ins (622-bp) are shown. Representative
agarose gels showing the amplification of cDNA fragments
of the anticipated size are shown. C%, negative control.
Downloaded from molpharm.aspetjournals.org at Biblioteca de la Universitat de Barcelona on April 10, 2012
phatase alkaline activity before and after saponin treatment (Barros,
1993), suggesting a preferential right-side out orientation for LMVM
vesicles.
Nucleoside Transport Assay. Uptake studies in syncytiotrophoblast-derived plasma membrane vesicles were performed using the
rapid filtration technique, as described previously (Ruiz-Montasell et
al., 1992). In brief, uptake was initiated by mixing 10 !l of vesicle
suspension with 40 !l of uptake medium (250 mM sucrose, 0.2 mM
CaCl2, 20 !M MgCl2, and 10 mM HEPES, pH 7.5) containing either
150 mM NaSCN or KSCN and 1 !M 3H-labeled substrate. Reactions
were terminated at the indicated times by adding 1 ml of ice-cold stop
solution (250 mM sucrose, 150 mM NaCl, 0.2 mM CaCl2, and 10 mM
HEPES, pH 7.5) and then filtered through 0.45-!m nitrocellulose
filters. Filters were washed with 4 ml of ice-cold stop solution, and
radioactivity on filters was determined subsequently by liquid scintillation counting. All experimental values were corrected by subtracting nonmediated uptake values obtained by adding the stop
solution into the transport before the vesicles. In addition, to distinguish between hENT1 and hENT2 activities, 1 !M nitrobenzylthioinosine (NBTI), a specific ENT1 inhibitor, was added to the transport
medium.
Preparation of Apical Lipid Microdomains. Apical plasma
membrane microdomains were isolated from MVM- and LMVMenriched preparations as a separate detergent-resistant fraction by
extraction with Triton X-100, as described by Godoy and Riquelme
(2008). In brief, aliquots (0.6 mg) of both isolated membrane fractions
were homogenized 30 times in a manual glass homogenizer with 1%
Triton X-100 in MES-buffered saline (25 mM MES, pH 6.5, and 150
mM NaCl). After incubation for 90 min on ice, vesicles (1 ml) from
both apical preparations (LMVM and MVM) were mixed with 1 ml of
80% sucrose to obtain a final sucrose concentration of 40%. A discontinuous gradient was then prepared by overlaying the 40% cushion successively with 2 ml of 35% sucrose and 1 ml of 5% sucrose, and
then tubes were centrifuged at 21,700g for 20 to 22 h in a swingingbucket rotor (AH-650 Sorvall; Thermo Fisher Scientific). After centrifugation, 10 fractions (0.5 ml each) were collected starting at the
top of the gradient.
Immunohistochemistry. Samples of human placental tissue
from normal pregnancies were rinsed in 0.9% NaCl, frozen in Cryogel Cancer Diagnostics, Inc., Birmingham, UK), and sectioned. Sections (10-!m-thick) were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 min
and rinsed three times with Tris-buffered saline, pH 7.6, for 5 min.
In parallel, 3.7% buffered formalin-fixed placentae were processed,
and paraffin was embedded according to standard protocols. The
5-!m sections thus obtained were subsequently deparaffinized and
rehydrated. Slides containing both types of tissue sections (fixed and
paraffin-embedded) were treated with 0.1 M citrate buffer, pH 6.0
(antigen recovery treatment), and then were incubated with 4%
bovine serum albumin for 1 h to block nonspecific binding. Slides
were incubated overnight at 4°C in a humidified chamber with
primary polyclonal antibodies (diluted 1:100) against hENT1,
hENT2, or hCNT1 (Farré et al., 2004). Slides stained for individual
transporters were costained with mouse anti-cytokeratin 7 antibody
(clone OVTL 12/30; Zymed Laboratories, South San Francisco, CA)
diluted 1:100 in phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4, to confirm
811
812
Errasti-Murugarren et al.
vesicles derived from human placental LMVM (top), MVM
(middle), and BM (bottom) (n # 3 independent placentae).
Both sodium-dependent and -independent components were
observed. Inhibition of sodium-independent uptake with
NBTI revealed that both NBTI-sensitive and -insensitive
carriers, hENT1 and hENT2, respectively, appear functional
in these membrane preparations (Fig. 2), in agreement with
the pattern of mRNA expression detected in this tissue (Fig.
1). Sodium-dependent transport of both nucleosides into
plasma membrane vesicles was observed when uptake was
measured in the presence of an outside-to-inside sodium gradient (150 mM, out & in), similar to that reported in renal
and intestinal brush-border membrane vesicles (Gutierrez
and Giacomini, 1993; Ngo et al., 2001). Because nucleoside
uptake was linear up to at least 40 s and this time point
provided greater sensitivity, values obtained at 40 s are
reported for all experiments conducted with placental syncytiotrophoblast plasma membrane vesicles. To analyze to
which transport agent this sodium-dependent component
was attributable, the profiles of 3H-labeled natural nucleoside uptake in LMVM, MVM, and BM vesicles and inhibition
of [3H]uridine uptake by nucleosides and nucleoside-derived
drugs were analyzed (Fig. 3). Measurements of [3H]uridine,
[3H]cytidine, [3H]thymidine, [3H]adenosine, and [3H]guanosine uptake in the presence of a sodium gradient demon-
strated the existence of sodium-dependent transport for all
three pyrimidine nucleosides in both apical and basal membrane vesicles (Fig. 3A). Sodium-coupled adenosine uptake in
LMVM and MVM vesicles, although small, was significant,
whereas sodium-dependent guanosine uptake was negligible.
Moreover, sodium-dependent uptake of [3H]uridine (1 !M)
was completely inhibited by 100 !M cytidine, thymidine, and
adenosine but was not significantly blocked by 100 !M
guanosine (n # 3 independent placentae) (Fig. 3B). The nucleoside derivatives, 5!-deoxy-5-fluorouridine and gemcitabine (100 !M), also significantly inhibited [3H]uridine uptake into apical and basal membrane vesicles, as did the
nucleoside analog zidovudine, albeit to a lesser extent (Fig.
3B). All these results indicate that hCNT1 is the unique
concentrative nucleoside transport activity present in syncytiotrophoblast plasma membrane-derived vesicles.
The immunohistochemical analysis of human placental tissue sections showed that hCNT1, hENT1, and hENT2 were
expressed in the maternal-facing side of the syncytiotrophoblast (Fig. 4, A–C). Although some immunofluorescence was
evident in intracellular compartments, especially in some
nuclei, staining was clearly most apparent at the syncytiotrophoblast apical membrane. Increasing exposure to the laser
source revealed light staining of hENT2 and hCNT1 in the
basal membranes, but basal membrane staining of hENT1
Downloaded from molpharm.aspetjournals.org at Biblioteca de la Universitat de Barcelona on April 10, 2012
Fig. 2. Time course of nucleoside uptake.
Time course of [3H]uridine (A) and
[3H]cytidine (B) (1 !M) uptake in syncytiotrophoblast LMVM (top), MVM (middle), and BM (bottom) vesicles. Uptake
into vesicles was assayed in medium containing radioactive uridine or cytidine
and either 150 mM sodium (NaSCN, f) or
potassium (KSCN, Œ) as described under
Materials and Methods. Equilibrative nucleoside transport activities were identified by means of NBTI (1 !M) inhibition
(!). Results are presented as means $
S.D. of triplicate estimations made on
three independent preparations.
Nucleoside Transporters in Human Placenta
813
Discussion
Fig. 3. Characterization of CNT activity in plasma membrane vesicles.
A, sodium-dependent uptake of pyrimidine and purine nucleosides (1 !M)
by LMVM, MVM, and BM at 40 s was measured in transport medium
containing 150 mM NaSCN or 150 mM KSCN. Sodium-dependent transport was calculated as uptake in sodium medium minus uptake in potassium medium. B, inhibition profile of sodium-dependent [3H]uridine uptake (1 !M) by LMVM, MVM, and BM at 40 s. Data are presented as a
percentage of uridine transport normalized to the control. Transport
experiments in A and B were performed as in the legend to Fig. 2. Data
are expressed as the mean $ S.D. of triplicate estimations made on three
independent preparations.
was not detected under any laser exposure condition tested
(data not shown). Double immunostaining with cytokeratin 7
confirmed the localization of these transporters to microvillous and basal syncytiotrophoblast membranes, demonstrating plasma membrane localization of nucleoside transporter
proteins (Fig. 4, D–I). No significant fluorescence was observed in slides treated with secondary antibodies only (data
not shown).
The presence of distinct lipid rafts in the apical plasma
membrane domain of placental syncytiotrophoblast has been
reported (Godoy and Riquelme, 2008), although the presence
of nutrient transporters, particularly nucleoside transport-
Maternofetal transfer of nutrients such as glucose and
amino acids is mostly determined by the activity of specific
transporter proteins expressed in the placental syncytiotrophoblast plasma membranes. Glucose transport from the
mother to the fetus seems to be influenced by the maternal
blood glucose concentration across the placenta and is mediated by members of the facilitative glucose transporters
(Baumann et al., 2002), although evidence for SLGT1-mediated Na'-coupled transport in the syncytiotrophoblast has
also been provided (Kevorkova et al., 2007). The maternofetal
transfer of most amino acids is dependent on the coupling of
secondary active amino acid transporters localized in the
microvillous apical membrane of the syncytiotrophoblast (in
direct contact with the maternal blood) and facilitative transporters present in the basal membrane (facing the fetal circulation) (Grillo et al., 2008). This model of nutrient vectorial
flux is to some extent similar to the one described for nucleosides in (re)absorptive epithelia (intestinal and renal epithelial cells), also involving the asymmetric distribution of
concentrative (CNT-type) and equilibrative (ENT-type)
nucleoside transporter proteins in apical and basolateral
domains, respectively, although some ENT1 expression at
the apical side has also been reported (Errasti-Murugarren
et al., 2007).
Downloaded from molpharm.aspetjournals.org at Biblioteca de la Universitat de Barcelona on April 10, 2012
ers, in these domains has not been established. In this regard, Western blot detection of nucleoside transporter
proteins in purified syncytiotrophoblast membranes and
analysis of the distribution of hCNT1, hENT1, and hENT2 in
different lipid microdomains were performed. Nucleoside
transporter proteins in paired samples of purified apical and
basal fractions from four placentae were analyzed by Western blotting. Figure 5A shows a representative Western blot
with bands corresponding to the molecular weight of hCNT1
(top), hENT1 (middle), and hENT2 (bottom) in both apical
LMVM and MVM preparations as well as BM preparations.
In agreement with uptake assay and immunohistochemical
results, hCNT1 and hENT2 were present in all apical and
basal purified fractions, whereas hENT1 was present only in
light and heavy apical membranes.
To determine whether hCNT1, hENT1, and hENT2 are
localized to membrane rafts, we isolated a detergent-resistant membrane fraction by sucrose density centrifugation, as
described recently (Godoy and Riquelme, 2008). In Western
blots of LMVM-containing gradient fractions (Fig. 5B),
hCNT1 and hENT1 immunoreactivity was detected in both
detergent-resistant (lipid raft) and -nonresistant fractions,
although hCNT1 mainly partitioned into lipid raft fractions,
and hENT1 was predominantly associated with nonlipid raft
fractions. In contrast, hENT2 was totally absent from the
detergent-resistant membranes of the LMVM flotation fractions, indicating that hENT2 does not localize to lipid rafts in
this fraction. Western blotting of gradient fractions enriched
for MVM showed a completely different distribution of both
hCNT1 and hENT1 transporter proteins. Here, both transporters were absent from the low sucrose density fractions
and were found exclusively in nonraft fractions. hENT2 immunoreactivity was found mainly in nonraft fractions, although it could be detected in some, but not all, lipid raft
fractions (Fig. 5B).
814
Errasti-Murugarren et al.
Of interest, the “absorptive model” for the vectorial flux of
nucleosides is not the only one that could be applied to the
syncytiotrophoblast epithelium. Previous evidence supported
apical and basal localization of equilibrative nucleoside
transport activities and transporters in the syncytiotrophoblast (Barros et al., 1995; Govindarajan et al., 2007). This
result is further reinforced in this contribution by combining
functional data and hENT1 and hENT2 immunodetection.
hENT2 was present in both domains (apical and basal) when
determined by Western blot, although this pattern was not
exactly reproduced when hENT2 expression was investigated with immunohistochemistry. Putative post-translational modifications of the protein, perhaps related to its
polarized sorting, might interfere with staining procedures.
Regarding hENT1, its apical localization was corroborated by
Western blot experiments. However, in agreement with previous observations (Barros et al., 1995; Govindarajan et al.,
2007), a hENT1-like activity identified at the basal plasma
membrane vesicles was not associated with a detectable
hENT1 protein, as measured by either Western blot or immunohistochemical analysis. The possibility of two distinct
isoforms of the hENT1 protein in the syncytiotrophoblast
apical and basal membranes should be further evaluated. In
fact, splicing isoforms of the SLC29A1 gene could affect both
protein immunodetection and/or subcellular localization in
polarized epithelia as previously reported for the SLC28A3
gene product (Errasti-Murugarren et al., 2009). As an alternative, there is the possibility that immunoreactivity using
antibodies raised against the intracellular loop between
transmembrane domains 6 and 7 might be impaired if significant post-translational modification occurs in the loop
(i.e., phosphorylation). In any case, it seems that transport
activities consistent with the occurrence of both types of
transporter proteins (hENT1 and hENT2) are present at both
poles of this epithelium.
Nevertheless, and more importantly, this study also demonstrates that a concentrative nucleoside transport activity,
mostly, if not exclusively, linked to the expression of the
pyrimidine-preferring nucleoside transporter hCNT1 is
found at both the microvillous and basal membranes of the
syncytiotrophoblast. This represents a unique distribution of
CNT-type proteins in a polarized epithelium. The occurrence
of hCNT1 is based on the selectivity profile of the uptake of
natural nucleosides and the cis inhibition of uridine uptake
by nucleosides into apical and basal plasma membrane vesicles. In this case, the functional evidence is strongly supported by hCNT1 immunodetection. In fact, immunohistochemical analysis of placental sections further identified
hCNT1 at both poles of the syncytiotrophoblast. The low
staining for hCNT1 at the basal side is probably due to its
comparatively low expression in this membrane domain, as
confirmed by the activity measurements and the Western
blot analysis of the subcellular membrane fractions.
All these observations taken together would be consistent
with the model of NT protein distribution in the syncytiotrophoblast shown in Fig. 6, a model that rules out the occur-
Downloaded from molpharm.aspetjournals.org at Biblioteca de la Universitat de Barcelona on April 10, 2012
Fig. 4. Expression of hCNT1, hENT1, and
hENT2 proteins in human term placenta.
Confocal fluorescence micrograph of immunohistochemical sections of a normalterm human placenta showing hCNT1
(A), hENT1 (B), and hENT2 (C) staining
of the apical syncytiotrophoblast membrane. Double immunostaining with an
anti-cytokeratin 7 (Cyt7) antibody (D, E,
and F) shows intense staining of all three
transporter proteins at the apical microvillous membrane of the syncytiotrophoblast (MVM) and in intracellular
structures (G, H, and I).
Nucleoside Transporters in Human Placenta
rence of hCNT2/3 functional expression, at least in placentae
at term. Moreover, residual adenosine uptake found in vesicles would be consistent with previous evidence showing that
adenosine is a high-affinity hCNT1 inhibitor (with a Ki value
in the low micromolar range) but a poor permeant (Larráyoz
et al., 2004; Smith et al., 2004), suggesting that endogenous
maternal adenosine levels could reduce interaction of hCNT1
with nucleoside-derived drugs, reducing in that way their
fetal toxicity. In agreement with previous observations
(Yamamoto et al., 2007), all five NT-related mRNAs could be
found in placenta. This observation is consistent with either
CNT2/3 transporters being expressed in other cell types or
being developmentally regulated in the syncytiotrophoblast
or both. Nevertheless, the occurrence of hCNT1 as the unique
concentrative nucleoside transporter in this epithelium has a
physiological rationale. The expression levels (mRNA transcript amounts) of the enzymes implicated in both pyrimidine
and purine nucleoside metabolism in placenta have been
searched in the Unigene database (Sayers et al., 2009). The
enzyme machinery expressed in placenta is consistent with
high purine but low pyrimidine nucleotide de novo synthesis.
Of interest, the enzyme machinery implicated in salvage
pathways shows the opposite pattern: the enzymes responsible for pyrimidine recycling are highly expressed. This scenario is consistent with the need for a plasma membrane
pyrimidine-preferring concentrative nucleoside transporter
(hCNT1) to mediate pyrimidine but not purine salvage.
It is not evident whether this NT distribution pattern will
in turn confer vectoriality to nucleoside transport across the
placenta. The fetus is highly dependent on glucose and amino
acids, which are the building blocks of purine and pyrimidine
nucleotides and de novo synthesis is highly prevalent in the
growing fetus (Alexiou and Leese, 1992; Boza et al., 1996). In
this context, it is tempting to speculate that both apical and
basal hCNT1 are implicated in the pyrimidine nucleoside
supply to the placenta, from both maternal and fetal sides.
This speculation would be consistent also with the expression
pattern of hENT2, present at both poles, being the only NT
protein known to mediate transport of nucleobases, which
could also be used for pyrimidine salvage purposes (Fig. 6).
As discussed above, this model is based on results obtained in
term placenta. A previous report showed slight variations in
thymidine uptake (a hCNT1 substrate) along different ges-
Fig. 6. Model of nucleoside transporter protein distribution
in the syncytiotrophoblast. Integrated model of nucleoside,
amino acid, and glucose transporter distribution in human
placenta together with expression levels of nucleoside metabolism key enzymes. PRPS1/2, phosphoribosyl pyrophosphate synthase 1/2; CAD, carbamoyl phosphate synthetase
II/aspartate transcarbamoylase/dihydro-orotase; DD, dihydroorotate dehydrogenase; UP, uridine phosphorylase 1;
UCK, uridine-cytidine kinase; TK, thymidine kinase; TP,
thymidine phosphorylase; PyN, pyrimidine nucleoside; PN,
purine nucleoside; NB, nucleobase; NP, nucleoside phosphate; AAT, amino acid transporter.
Downloaded from molpharm.aspetjournals.org at Biblioteca de la Universitat de Barcelona on April 10, 2012
Fig. 5. Distribution of nucleoside transporters in raft and nonraft fractions isolated from LMVM and MVM preparations. Lipid rafts were
isolated from apical membrane vesicles, prepared from normal-term human placentae, by solubilizing in ice-cold 1% Triton X-100 and fractionating on a sucrose gradient. A, immunoblot analysis shows that both
hCNT1 and hENT2 are present in apical and basal purified membranederived vesicles, whereas hENT1 is present only in apical membrane
vesicles. B, LMVM and MVM sucrose gradient fractions were separated
by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and analyzed by Western
blotting using antibodies against hCNT1, hENT1, and hENT2, with
placental alkaline phosphatase (PLAP) and human transferrin receptor
(htf-R) used as raft and nonraft markers, respectively. Top panel, a
representative Western blot of LMVM samples showing the distribution
of hCNT1 and hENT1 into both lipid raft and nonraft fractions and
exclusive distribution of hENT2 to nonraft fractions. Bottom panel, Western blot of MVM samples showing localization of hCNT1 and hENT1 to
nonraft fractions and distribution of hENT2 to some raft and all nonraft
fractions.
815
816
Errasti-Murugarren et al.
syncytiotrophoblast. The only concentrative nucleoside
transporter protein expressed at significant levels in this
epithelium at term is hCNT1, a pyrimidine-preferring,
sodium-coupled concentrative nucleoside transporter. Its occurrence at both poles of the epithelium, basal and apical, is
consistent with the fact that the placenta has the ability to
synthesize purine nucleotides de novo but seems to be dependent on pyrimidine nucleoside salvage. Thus, hCNT1 would
be a key player in this process. Considering that some anticancer nucleoside-derived drugs and xenobiotics such as nicotine and caffeine are either translocated by or bound to
hCNT1 with high affinity, we suggest that most of the harmful effects triggered by these drugs can be mediated, at least
in part, by their ability to interact with hCNT1, thus impairing the pyrimidine nucleoside salvage process.
Acknowledgements
We express our gratitude to Dr. M. Pérez and the staff of the San José
Hospital Maternity Unit (Santiago, Chile) for their assistance in obtaining biological material and the Confocal Microscopy Facility of Serveis
Cientificotècnics (Universitat de Barcelona-Institut d’Investigacions
Biomèdiques August Pi i Sunyer) for their support and advice with
confocal techniques. We also thank C. Vallejos for continuous support in
the preparation of plasma membranes, A. Valdebenito for technical
assistance, and Dr. Felipe Barros (Centro de Estudios Científicos, Valdivia, Chile) for helpful discussions.
Authorship Contributions
Participated in research design: Errasti-Murugarren, Riquelme,
and Pastor-Anglada.
Conducted experiments: Errasti-Murugarren, Díaz, and Godoy.
Performed data analysis: Errasti-Murugarren, Díaz, Riquelme,
and Pastor-Anglada.
Wrote or contributed to the writing of the manuscript: ErrastiMurugarren, Díaz, Riquelme, and Pastor-Anglada.
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total uptake and does not rule out the possibility that the
contribution of particular nucleoside transporter proteins to
nucleoside uptake changes during placental growth. This
may be of interest in the understanding of placental physiology but difficult to address in human studies.
As introduced above, hCNT1 is a high-affinity transporter
for selected anticancer drugs, such as gemcitabine and 5-azacytidine (García-Manteiga et al., 2003; Rius et al., 2009).
These drugs have been reported to induce a variety of harmful effects in rodent placenta and developmental toxicity as
well (Eudaly et al., 1993; Serman et al., 2007). Moreover,
inhibition of hCNT1 by selected drugs may compromise pyrimidine salvage by the syncytiotrophoblast, thus contributing to impaired placental function. Conclusions drawn from
the use of cell lines expressing exclusively low-affinity ENTtype transporters should be made cautiously and reevaluated
(Chishu et al., 2008).
Finally, the occurrence of selected hNT proteins in raft
microdomains might be relevant also in functional terms. We
have recently shown that localization of hCNT3 in lipid rafts
might determine its biological activity (Errasti-Murugarren
et al., 2010), and, interestingly, CNT1 protein had also been
identified in a caveolin-enriched plasma membrane fraction
isolated from quiescent rat liver (Duflot et al., 2002). On the
basis of this previous evidence, the analysis of the localization of hNT proteins in lipid rafts was performed. As described above, Western blotting of the LMVM gradient
showed a bimodal distribution for hCNT1 and hENT1 immunoreactivities, being detected both in lipid raft and nonlipid
raft fractions, whereas hENT2 was totally absent in raft
fractions. Of interest, the heavy apical MVM showed a completely different distribution for both hCNT1 and hENT1
transporter proteins, being found exclusively in nonraft fractions. The heavy MVM and LMVM fractions used in this
study correspond to the finger-like projections and the bottom part between the microvilli, respectively (Godoy and
Riquelme, 2008), which also show a heterogeneous population of raft domains (Braccia et al., 2003; Godoy and
Riquelme, 2008). The expression of particular cytoskeletal
proteins in finger-like projection regions of the microvilli
(MVM) that has been proposed to be tightly associated with
plasma membrane lipidic microdomains could explain the
presence of lipid raft markers in nonraft fractions (Godoy and
Riquelme, 2008). In this regard, both hCNT1 and hENT1
transporters in MVM are located mainly in nonraft fractions,
which are clearly defined by the human transferrin receptor,
whereas distribution of hENT2 protein is less clear. All these
observations, taken together, suggest that nucleoside transporter proteins show heterogeneous distribution not only in
polarized epithelia but also at the subcellular level in particular apical domains. Although the elucidation of the physiological rationale for this distribution and the effect on nucleoside transport activity requires further analysis, it is
interesting to point out that preliminary data from our laboratories (E. Errasti-Murugarren, unpublished observations)
indicate that in some pathological conditions, such as preeclampsia, disruption of lipid raft domains will result in
altered distribution of hNT proteins, thus probably affecting
their biological function.
In summary, this study provides the first comprehensive
analysis of nucleoside transporter expression in the human
Nucleoside Transporters in Human Placenta
817
and nicotine with human concentrative nucleoside transporters 1 and 2 stably
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Address correspondence to: Dr. Marçal Pastor-Anglada, Departament de
Bioquímica i Biologia Molecular, Institute of Biomedicine (IBUB), Universitat
de Barcelona and CIBER EHD, Avda Diagonal 645, Edifici annex, Planta-1,
08028 Barcelona, Spain. E-mail: [email protected]
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Journal of Hepatology
Vol. 56 Supplemental 2. Pages S139-140
High affinity adenosine receptors modulate CNT3 activity on biliary epithelia.
Valeria Godoy1, Jesús M. Banales2, Juan F. Medina2, Marçal Pastor-Anglada1
1 Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics Group, Department of
Biochemistry and Molecular Biology, Institute of Biomedicine, University of Barcelona (IBUB)
and CIBER EHD, Barcelona-Spain.
2 Molecular Genetics Group, Department of Gene Therapy and Hepatology, Center for
Applied Medical Research (CIMA), University of Navarra and CIBER EHD, Pamplona-Spain.
The ability of ATP and other nucleotides/nucleosides such as adenosine, to regulate its
biological functions is strictly related to its extracellular concentration. Thus, beside the
presence of specific P1 and P2 receptors, the actions of ectonucleotidases hydrolysing ATP,
and of nucleoside transporters (NT), such as concentrative (CNT) and equilibrative (ENT),
internalizing adenosine into cells, are key factors determining the final effect of the purinergic
signaling.
In the hepatobiliary system, ATP is released into bile by both hepatocytes and
cholangiocytes, and acts a potent autocrine/paracrine stimulus to activate secretion
mechanisms in cholangiocytes. Thus, it is highly probable that purinergic control might
regulate biliary functions. However several key players of the purinergic signaling, as P1
receptors and NT, have not been described in cholangiocytes.
The aims of this work were, firstly to establish and to characterize in primary normal rat
cholangiocytes (NRC), the presence and activity of the NT and the P1 receptors, and
secondly, to provide proof of evidence for their functional cross-talk.
Our results showed that the main! nucleoside uptake activity was! concentrative, and
principally located at the apical domain. The inhibition profiles assays showed that the
concentrative activity corresponded to CNT2 and CNT3, which are the only NT proteins
showing high affinity concentrative transport of adenosine, thus being major players in
adenosine removal from the extracellular milieu.
NRC were also shown to express adenosine A1, A2A and A2B receptors, although only the
agonists of high affinity A1 and! A2A receptors exerted a direct modulation of the CNT3
activity. This modulation was evident when NRC were grown as polarized epithelia.
Interestingly, A2A agonists exerted a differential effect on CNT3 related activity depending on
the epithelial domain they were added to. Apical stimulation of A2A receptors resulted in
increased CNT3 activity whereas this function was markedly depleted when A2A agonists
were added at the basolateral side. These observations provide a unique example of
differential regulation of the apically localized CNT3 protein by the same receptor, and
together confirm the presence!of purinergic signaling!elements in NRC and anticipated a role
of adenosine in the physiopathology of the biliary epithelia.!
Acknowledgements: SAF2008-00577, SAF2011-23660, CIBER- Acción Transversal en
Cáncer, 2009SGR624, and CONICYT-Chile.
Journal of Hepatology
Vol. 54 Supplemental 1. Pages S277-278
Characterization of the Purinome on the Biliary Epithelia.
Valeria Godoy1, Jesús M. Banales2, Juan F. Medina2, Marçal Pastor-Anglada1
1 Regulation of Transport Systems Group, Department of Biochemistry and Molecular
Biology, Institute of Biomedicine, University of Barcelona (IBUB) and CIBER EHD, BarcelonaSpain.
2 Molecular Genetics Group, Department of Gene Therapy and Hepatology, Center for
Applied Medical Research (CIMA), University of Navarra and CIBER EHD, Pamplona-Spain.
Introduction: Purinoma has been defined as the molecular network responsible for the final
biological effect of the extracellular purine and pyrimidine ligands, as adenosine and its
metabolites (ATP, ADP and AMP). The protein machinery implicated in the purinoma, consist
of purinergic receptors classified as P1 for adenosine/AMP and P2 for nucleosides tri-/
diphosphates, ectonucleotide-metabolizing enzymes hydrolysing ATP and ADP, and
nucleoside transporters, such as concentrative nucleoside transporters (CNTs) and
equilibrative nucleoside transporters (ENTs). Notably, these elements are not independent,
but they play tightly concerted actions under physiological conditions. As a whole and not
singularly, they trigger, maintain and terminate the purinergic signalling.
In the liver, ATP has emerged as an important signalling molecule regulating hepatobiliary
function, where is released into bile by both hepatocytes and cholangiocytes. Even thought,
in cholangiocytes ATP acts as a potent autocrine/paracrine stimulus for secretion via P2
receptors, no other purinoma element has been described.
Objective: The aim of this work was to establish and to characterize in a rat model of
cholangiocyte (NRC), the presence and activity of the nucleoside transporters and the
purinergic receptors P1, describing the cross-talk between these elements of purinoma.
Results: Our results show the presence of both equilibrative and concentrative nucleoside
activity in NRC. The magnitude of the concentrative activity related to the equilibrative activity
was significantly greater, in monolayer and polarized model, and was mainly located in the
apical domain of the cholangiocyte. The inhibition profiles with substrates showed that the
concentrative activity corresponds to CNT2 and CNT3 transporters, which are those that
display a best transport capacity for adenosine. Additionally, the study of the profile of P1
receivers showed the presence of A1, A2A and A2B in NRC, of which A2A seems to exert a
direct modulation in the activity of CNT3. Conclusion: These results confirm the presence of
the elements of purinoma in NRC and anticipate a role of adenosine in the physiology of the
biliary epithelia.
Acknowledgements: SAF2008-00577, CIBER- Acción Transversal en Cáncer,
2005SGR00315, and CONICYT-Chile.