Autoanticorpi nelle patologie del Sistema Nervoso

Autoanticorpi nelle patologie del Sistema
Nervoso Centrale e Periferico: metodi di studio
e significato clinico.
Autoanticorpi e Neuropatie Autoimmuni
Autoanticorpi diretti verso costituenti neuronali sono stati
associati ad un numero sempre maggiore di neuropatie
croniche.
Marilina Tampoia
Responsabile Struttura Semplice
di Autoimmunologia
U.O. Patologia Clinica I
Azienda Ospedaliera Universitaria– BARI
Neuropatie autoimmuni sono descritte soprattutto a carico del
SNP ma recenti studi sostengono l’ipotesi di un’eziopatologia
autoimmune anche in alcune patologie del SNC
Bassano del Grappa
7-9 settembre 2009
Target antigenici e patogenicità degli autoanticorpi nelle patologie autoimmuni
del sistema nervoso centrale (SNC )
Antigen
i target
Malattia
Risposta
immunoterapica
Patogenicità anticorpale
VGCK
Sindrome di Morvan
Epilessia
Encefalite Limbica
Buona
Alcune positive
Buona
Trasferimento passivo di IgG di pazienti con
neuromiotonia al topo provocano incremento
del rilascio di ACh. Gli anticorpi bloccano la
corrente di K+ nelle linee cellulari.
VGCC
Atassia cerebellare
Sindrome miastenica di
Lambert-Eaton
Sclerosi laterale amiotrofica
Mediocre
Buona
Anticorpi
anti-VGCC
(vari
sottotipi)
inibiscono la corrente del Ca2+ in culture di
cellule di Purkinje e di cellule dei granuli
GAD
Atassia cerebellare
Epilessia
Per lo più inefficace
IgG GAD-positive nel CSF riducono le
sinapsi inibitorie nel cervelletto
GM1
GQ1
Epilessia
Neuropatia multifocale motoria
Sindrome di Guillain-Barrè
Sindrome di Miller-Fisher
Occasionale in pazienti
trattati con IVIg
Non pervenuta
Non pervenuta
Non pervenuta
Trasferimento passivo di anti-GM1 determina
la malattia in modelli animali sperimentali
Demielinizzazione
con
blocco
della
conduzione
Meccanismo di mimicrismo molecolare
GluR3
Encefalite di Rasmussen
Transitoria
Conigli immunizzati con GluR3 sviluppano la
malattia. Anticorpi anti-GluR3 causano
disfunzione neuronale.
AQP-4
Neuromielite ottica
Buona
Non noto
NR2A e
2B
LES neuropsichiatrico
Specifica
Topi immunizzati con peptidi NMDA
sviluppano disfunzioni del SNC a seguito di
lesioni della barriera emato-encefalica
Non pervenuta
AUTOANTICORPI CON RUOLO PATOGENETICO NOTO:
autoanticorpi diretti verso antigeni noti con ruolo patogenetico dimostrato
¾Autoanticorpi diretti contro il recettore dell’acetilcolina
¾Autoanticorpi diretti contro i canali del potassio voltaggio-dipendenti
¾Autoanticorpi diretti contro i canali del calcio voltaggio-dipendenti
¾Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica
AUTOANTICORPI CON RUOLO PATOGENETICO
PROBABILE O NON NOTO:
autoanticorpi diretti verso antigeni noti con ruolo patogenetico probabile o non noto
¾Autoanticorpi diretti contro l’acido glutammico-decarbossilasi (GAD)
¾Autoanticorpi anti-recettore del glutammato
Autoanticorpi e Neuropatie Autoimmuni
La sola presenza di autoanticorpi circolanti non è sufficiente
per definire una malattia autoimmune;
è necessario
valutarne il ruolo patogenetico, la trasferibilità della malattia
all’animale o l’immunizzazione attiva.
Poco si conosce sul ruolo patogenetico e sul reale
significato clinico di alcuni autoanticorpi, che sono
suddivisi in markers: patogenetici ed non patogenetici
(epifenomeno).
Autoanticorpi determinati per fini di ricerca
(fase sperimentale)
Autoanticorpi determinati per fini clinici
(pratica routinaria)
¾in pochi centri specializzati e con metodologie home made
¾in alcuni laboratori clinici con metodologie commercializzate
(radioimmunologica, immunofluoresenza indiretta,
immunodot-blot, immunoenzimatica)
¾Autoanticorpi anti-gangliosidi
¾Autoanticorpi anti acquaporina-4
1
Autoanticorpi e neuropatie demielinizzanti croniche
Neuropatia associata ad anticorpi anti-MAG IgM
¾Gammopatia monoclonale (MG) occorre nell’1% della
popolazione di età > 50 anni (3% > 70 anni)
¾10-20% delle MG sono IgM (100-200/100.000 > 50 anni)
¾15-30% dei pazienti con MG IgM hanno PoliNeuropatia (PN)
Original report, che per prima riportò la presenza
di elevati titoli di anticorpi anti-MAG IgM in un
paziente con neuropatia demielinizzante
¾40-50% dei pazienti con PN associate a IgM MG hanno
anticorpi anti-MAG IgM
La prevalenza di PN associata ad antiMAG IgM nella
popolazione di età > 50 anni potrebbe essere almeno
10/100.000
N Eng J Med, 1980
Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG)
Antigeni
L’antigene verso il quale sono diretti gli autoanticopi è la MAG,
principale glicoproteina associata alla mielina del sistema nervoso
centrale e periferico, formata da cinque domini extracellulari Iglike, un singolo dominio transmembrana e uno citoplasmatico.
Glicoproteina mielinica
Funzioni principali
™stabilizzare i contatti tra gli assoni mielinizzati e i processi gliali,
™formare la guaina mielinica morfologicanente intatta delle cellule
di Schwann,
™compattare la struttura mielinica degli oligodendrociti
Altre funzioni
¾rallentamento dell’invecchiamento della mielina
¾trasmissione del segnale
¾regolazione della fosforilazione a cascata dei neurofilamenti
¾controllo del calibro dell’assone, cruciale per l’efficienza della
trasmissione nel SNP
Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG)
La patogenicità degli autoanticorpi anti-MAG è dimostrata:
¾trasferimento passivo della malattia con siero di pazienti con
anticorpi anti-MAG al gatto;
¾l’iniezione intraneuronale di sieri nei nervi sciatici del
coniglio induce un rapido esordio di demielinizzazione
complemento-mediata dei nervi periferici;
Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG)
L’identificazione degli anticorpi anti-MAG è
stata possibile grazie a metodiche di
westernblot (WB) su elettroforesi SDS con
mielina centrale.
In questo modo è stata evidenziata una banda di
92kD corrispondente al PM della MAG.
¾evidenza di depositi di anticorpi anti-MAG e componenti del
complemento attivati sulle guaine mieliniche colpite.
2
Anticorpi anti-MAG possono essere dimostrati con metodiche
di immunofluorescenza indiretta su nervo di scimmia e cervelletto
Anticorpi anti-MAG possono essere dimostrati con metodiche di immunoenzimatica,
che utilizzano come antigene MAG umana ricombinante
9 antigene coating : MAG umana ricombinante
9 diluizioni elevate del siero (1:800)
9 coniugato monospecifico IgM, polispecifico Ig totali
9 incubazioni overnight
cervelletto di primate
nervo periferico di primate
Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG)
9 incubazioni a temperatura controllata 2-8°C
Autoanticorpi anti-glicoproteina mielinica (MAG)
¾La frequenza di anticorpi anti-MAG in pazienti affetti da
MG IgM è significativamente più elevata (chi-quadro =44.10,
P>.00001) in pazienti con neuropatia associata (45.1%)
piuttosto che in quelli senza neuropatia (6.8)
S, sensoriale
M, motoria
¾La specificità ed il valore predittivo positivo per neuropatia
degli anti-MAG IgM tra i pazienti con MG IgM sono
rispettivamente 93.2% e 91.4%.
¾Quando presenti gli anticorpi sono associati ad un quadro clinico
tipico delle neuropatie sensoriali demielinizzanti , lentamente
progressive, distali e simmetrici.
Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008
Autoanticorpi e neuropatie demielinizzanti croniche
sono principalmente IgM monoclonali e sono diretti contro:
¾glicoproteine associate alla mielina (MAG)
¾autoanticorpi anti-sulfatide
¾anti-gangliosidi (GM1, GM2,GD1a, GD1b, GQ1b).
Anticorpi anti-MAG sono quasi sempre associati a neuropatie e
ne predicono l’inizio. E’ stato dimostrato un miglioramento
clinico correlato con la riduzione del titolo.
3
Autoanticorpi anti-gangliosidi
Struttura dei gangliosidi
¾sono rivolti contro più di 20 differenti gangliosidi e glicolipidi e
associati a diverse neuropatologie:
¾reagiscono contro la porzione disaccaridica dei gangliosidi
delle guaine mieliniche
¾si legano, a livello strutturale, alla superficie dei neuroni
motori ma non di quelli sensitivi spiegando la predominanza
motoria della malattia; in particolare gli epitopi bersaglio
degli anticorpi sono altamente concentrati a livello del nodo di
Ranvier (Corbo 1993)
Sfingosina
O
acido grasso
Ceramide
Glc
Gal
NAc
Gal
Gal
Sial.
Ac
catena carboidrati
Glc = Glucosio; Gal = Galattosio; GalNAc = N-Acetil-Galattosamina; Sial. Ac = ac.sialico
Glc = Glucosio; Gal = Galattosio; GalNAc = N-Acetil-Galattosamina; Sial. Ac = ac.sialico
sono componenti della Cell Wall delle cellule di mammifero
presenti in alta concentrazione nel sistema nervoso centrale e
periferico
Nomenclatura dei gangliosidi
G D 1 a
Posizione dell‘acido sialico
aob
Migrazione in cromatografia
1, 2 o 3
Ganglioside
Anticorpi, metodi di ricerca
Combinazioni disponibili
Esempi di strip incubate
Immuno-blot
Antigeni disponibili:
GM1, GM2, GM3, GD1a,
GD1b, GT1b, GQ1b
Numero di molecole di acido
sialico M = monoD = diT = triQ = (lat. Quad-) tetra-
Immunoenzimatica
9 antigene coating : miscele di gangliosidi o
singolo ganglioside
9 diluizioni elevate del siero (1:800)
9 coniugato monospecifico IgM, polispecifico
Autoanticorpi anti-gangliosidi in pazienti affetti
da neuropatie croniche immuno mediate
Pazienti
539 pazienti consecutivi affetti da neuropatia, arruolati
302 pazienti affetti da polineuropatia cronica immuno-mediata
166 pazienti affetti da PN, polineuropatia
41 pazienti affetti da MMN, neuropatia motoria multifocale
237 pazienti affetti da neuropatie non immuno-mediate
Metodi
Immunoblot, immunoenzimatico
9 incubazioni overnight
9 incubazioni a 2-8°C
Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008
4
Autoanticorpi anti-gangliosidi in pazienti affetti
da neuropatie croniche immuno mediate
Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008
Nobile Orazio E, J Neurol Sci 2008
Autoanticorpi e Neuropatie Autoimmuni
Sclerosi Multipla (SM)
¾la più frequente patologia neurologia nei giovani a rischio di disabilità
nel tempo
¾2.5 milioni di individui nel mondo sono affetti da SM
Nuovi anticorpi come marcatori diagnostici
e prognostici nella Sclerosi Multipla
SM decorso di malattia
SM varianti cliniche
™95% esordio con episodi di
9Mielite trasversa acuta
riacutizzazione e remissione
9Encefalomielite acuta disseminata (ADEM)
™50%
dopo 10-15 anni
converte
in
un
decorso
secondario cronico progressivo
9Leucoencefalite acuta emorragica (AHLE)
9Neuromielite ottica di Devic
9MS acuta tipo Marburg
9Sclerosi concentrica Balo
™10%
decorso primario
cronico progressivo
Autoanticorpi nella MS
9MS Mielinoclastica Schilder
Anticorpi come marcatori diagnostici di forma clinica
¾Anticorpi come marcatori diagnostici
¾Anticorpi come marcatori di progressione di malattia
¾Anticorpi come marcatori di riparazione/demielinizzazione
¾Anticorpi come marcatori predittivi di risposta al trattamento
5
Neuromielite Ottica (Sindrome di Devic)
Wingerchuck DM et al. Neurology 2006
Pazienti con anticorpi anti-MOG/MBP
Elevato rischio di sviluppare CDMS
Entro una media di 7.5 mesi
Pazienti con anticorpi anti-MOG isolati
Medio rischio di sviluppare CDMS
Entro una media di 15 mesi
Pazienti senza anticorpi anti-mielina
Conversione a CDMS in un tempo
> 45 mesi o mai
Anticorpi anti-interferoni
Anticorpi anti-interferoni e progressione clinica
¾Interferoni possono indurre la produzione di anticorpi
neutralizzanti (NABs)
¾NABs usualmente compaiono dopo 12 mesi dal
trattamento
¾I titoli anticorpali sono variabili e possono cambiare
nel corso del tempo
¾Alti titoli anticorpali impattano negativamente
-attività biologica del farmaco
-decorso clinico
La comparsa di autoanticorpi anti-interferone si accompagna ad una
peggiore prognosi di malattia
Kappos L et al. Neurology 2005
6
Autoanticorpi e Sindromi Neurologiche
Paraneoplastiche (SNP)
NOTE STORICHE
™legame tra disturbi neurologici e neoplasie era noto da oltre 50 anni.
Brain R 1951.
™evidenza di un legame tra disturbi neurologici, neoplasie e coinvolgimento
immunologico.Greenlee 1983 JE and Graus F 1985
™sono state pubblicate le prime linee guida per la ricerca e la classificazione
degli anticorpi neuronali paraneoplastici. Moll JWB 1995.
™sono state pubblicate le raccomandazioni per standardizzare i criteri
diagnostici delle sindromi neurologiche paraneoplastiche.Graus F2004.
Anticorpi, sindromi neurologiche paraneoplastiche e tumori associati
Autoanticorpi Onconeuronali
Anticorpi anti-nucleo neuronale (ANNA)
Caratteristiche antigeniche e pattern immunoistochimico
anticorpo
antigeni
proteine identificate
pattern
Anti-Hu
(ANNA-1)
nuclei di cellule neuronali e
di gangli dorsali
HuC, HuD (35-40 kDa)
fluorescenza dei nuclei
neuronali e dei gangli
dorsali
Anti-Ri
(ANNA-2)
nuclei di cellule neuronali e
non dei gangli dorsali
Nova-1, Nova-2 (55, 80
kDa)
fluorescenza dei soli
nuclei neuronali
ANNA-3
nuclei delle cellule del
Purkinje
? (170 kDa)
fluorescenza dei nuclei
delle cellule del
Purkinje
Anti-Ma
nuclei di cellule neuronali
Ma1/Ma, Ma2/Ta, Ma3
(39.8, 41.5, 53.3 kDa)
fluorescenza dei
nucleoli dei nuclei
neuronali
de Beukelaar J et al The Oncologist 2006
Autoanticorpi Onconeuronali
Autoanticorpi Onconeuronali
Anticorpi anti-nucleo neuronale (ANNA)
Anticorpi anti-nucleo neuronale (ANNA)
Anti-Hu
Anti-Ri
anticorpo
CERVELLETTO DI SCIMMIA
Neoplasie
Disordini
neurologici
Altre Neoplasie
Anti-Hu
(ANNA-1)
microcitoma polmonare
(80% dei pz positivi ha una
neoplasia polmonare
Encefalite paraneoplastica (PE)
con le sue varianti : limbica
(PEL), del tronco ed associata a
neuropatia subacuta sensitiva
(Sindrome anti-Hu)
neuroblastoma
ca prostatico,
seminoma ed
adenoca vescicale
Anti-Ri
(ANNA-2)
una neoplasia mammaria è
presente nel 75% dei pazienti
con anticorpi anti-Ri (M/F 1:2)
nell’opsoclono mioclono
paraneoplastico (POM)
dell’utero, carcinoma
della vescica
Anti-Ma
giovani con carcinoma delle
cellule germinali del testicolo
encefalite limbica
paraneoplastica (PEL)
INTESTINO
(ganglio dorsale)
substrato
7
Autoanticorpi Onconeuronali
Anticorpi anti-citoplasma delle cellule di Purkinje (PCA)
CERVELLETTO DI SCIMMIA
Autoanticorpi anti-Yo (PCA-1)
reagiscono contro antigeni citoplasmatici delle cellule del Purkinje, recentemennte
identificati (CDR 34,CDR 53, CDR 62)
Anti-Yo
Anti
Anti-Yo
sono presenti nel 50% dei pazienti affetti da Degenerazione Cerebellare Paraneoplastica
(PCD) (Hammack 1990), più comune sindrome paraneoplastica del SNC, prevalente nel
sesso femminile ( neoplasie ovariche (60%) e mammarie(30%)), caratterizzata da
sintomatologia subacuta invalidante (vertigini, parola scandita, tremore intenzionale,
dismetria, atassia del tronco e della marcia)
i sintomi precedono la diagnosi di neoplasia in 50% dei casi
altri tumori associati sono ca gastrico, adenocarcinoma parotideo ed esofageo.
sono rilevabili su sezioni criostatate di cervelletto dove producono una
fluorescenza localizzata soprattutto al citoplasma delle cellule del Purkinje
substrato
Autoanticorpi Onconeuronali
Autoanticorpi Onconeuronali
Altre reattività anticorpali
Anticorpi anti-citoplasma delle cellule di Purkinje (PCA)
anticorpo
pazienti
Anti-Yo
(PCA-1)
sesso:femmine>>maschi
età: media 64 aa*
range 37-79
Degenerazione
cerebellare,atassia
cerebellare
subacuta,neuropatia
sensori-motoria
Ovaio
mammella
PCA-2
sesso:femmine>maschi
età: media 52 aa
range 44-82
Sindrome neurologica
progressiva multifocale,
encefalomielite
Polmone §
sesso:femmine>maschi
età: media 61 aa
range 14-75
Degenerazione
cerebellare,atassia
cerebellare, encefalite
limbica°
Linfoma di
Hodgkin
Anti-Tr
Disordini neurologici
anticorpo
Neoplasie
localizzazione antigenica
Disordini neurologici
Neoplasie
Anti-Zic4
nuclei neuronali dei granuli
layer cerebellari
Degenerazione cerebellare
polmone
Anti-GAD
terminazioni GABA-ergiche
del SNC (cervelletto e
midollo spinale)
Stiff Man Syndrom
mammella,
colon,
polmone
AntiCV2/CRMP5
citoplasma degli
oligodendrociti
Encefalomielite,neuropatia
sensoriale
polmone,
timoma
Antiamfifisina
terminazioni presinaptiche
centrali
Stiff Man Syndrome
mammella
, polmone
Anti-mGluR1
citoplasma delle cellule di
Purkinjie
Degenerazione cerebellare
linfoma di
Hodgkin
AGNA
nuclei della glia di Bergman
del cervelletto, glia della ...
Lambert-Eaton myasthenic
syndrome, disordini
neurologiche paraneoplastiche
polmone
*Shams’ili S. Brain 2003
§ Vernino S. Ann Neurol 2000
°Bernal af. Neurology 2003
Metodologie di laboratorio
Perchè la ricerca di autoanticorpi è importante?
• Identifica il tumore
• Definisce la prognosi
• Individua nuove sindromi cliniche
9 Immunoistochimica
9 Immunofluorescenza indiretta
9 Western-blot
9 Western-blot con antigeni ricombinanti
9 Line-blot con antigeni ricombinanti
9 Immunoprecipitazione
8
Western-blot
Metodologie di laboratorio
immunofluorescenza
indiretta
Hu: 38 kDa
Ri: 80 kDa
55 kDa
Il pattern di immunofluorescenza può essere difficile da
interpretare specie se vi è associazione tra anticorpi
neurono-specifici e anticorpi sistemici.
Il loro riscontro in immunofluorescenza è solo indicativo
e la specificità anticorpale deve essere sempre confermata
con altre metodologie.
Altre metodologie
Yo: 62 kDa
34 kDa
più
Yo ricom.
Hu ricom.
Hu ricombinante
Yo ricombinante
Paziente 4: maschio, di 70 anni, affetto da SSN senza neoplasia.
siero controllo
Westerblot
Immunoblot
Immagini IFI, Western-blot di 2 pazienti controllo
Immagini IFI, Western-blot di 2 pazienti controllo
9
Landscape viewing
La diagnostica autoanticorpale delle SNP ha subito negli ultimi
decenni un importante impulso, ma la sua collocazione nei laboratori
di routine appare ancora piuttosto problematica a causa di:
• bassa frequenza di sindromi paraneoplastiche (<1 caso per 200.000 all’anno),
• bassa prevalenza di autoanticorpi identificabili nel siero di pazienti
• difficile selezione clinica dei pazienti da sottoporre alle indagini anticorpali
• differenti caratteristiche analitiche dei metodi per la determinazione degli
anticorpi
Landscape viewing
•Alcuni autori sostengono che i laboratori specialistici con più
elevato turnover diagnostico siano meglio deputati alla diagnostica
delle patologie neurologiche autoimmuni.
•Tuttavia se questo poteva trovare giustificazione quando la ricerca
degli anticorpi veniva eseguita con metodologie indaginose come
l’immunoistochimica, oggi l’avvento di metodi di immunoblotting
e l’utilizzo di antigeni ricombinanti ne rende più facile la
esecuzione, interpretazione e standardizzazione.
•Il laboratorio dispone oggi di più metodi per la ricerca degli
anticorpi e sempre nuovi anticorpi vengono descritti nella diagnosi
delle SNP ma anche un’accurata preselezione del paziente con le
informazioni cliniche fornite può contribuire ad incrementarne
l’efficacia diagnostica.
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