Protocollo per il progetto pilota UE finalizzato alla sorveglianza della
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Protocollo per il progetto pilota UE finalizzato alla sorveglianza della
EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Protocollo per il progetto pilota UE finalizzato alla sorveglianza della mortalità nelle colonie di api mellifere European Reference Laboratory on Honeybee Health Anses Unit of Honeybee Pathology 105, route des Chappes. PB 111. 06902 Sophia Antipolis cedex France [email protected] 1 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Indice 1 2 Principi generali............................................................................................................................... 5 1.1 Obiettivi ................................................................................................................................... 5 1.2 Modalità di applicazione ......................................................................................................... 6 1.3 Definizioni preliminari ............................................................................................................. 7 Patologie rilevabili durante la visita autunnale nell’apiario............................................................ 7 2.1 Mortalità invernale delle colonie di api .................................................................................. 7 2.2 Mortalità stagionale delle colonie di api ............................................................................... 10 2.3 Infestazione da Varroa e varroasi.......................................................................................... 12 2.3.1 Tasso di infestazione da varroa ............................................................................................. 12 2.3.2 Varroasi ................................................................................................................................. 13 2.4 DWV, ABPV e indagine sui fattori di rischio associati alla mortalità invernale ..................... 15 2.4.1 DWV e ABPV .......................................................................................................................... 15 2.4.2 Indagine sui fattori di rischio per mortalità invernale........................................................... 17 2.5 Nosemiasi .............................................................................................................................. 17 2.6 Paralisi cronica....................................................................................................................... 19 2.7 Peste americana e europea................................................................................................... 21 2.7.1 Peste americana .................................................................................................................... 21 2.7.2 Peste europea........................................................................................................................ 22 2.8 Parassitosi esotica: Aethina tumida e Tropilaelaps spp. ....................................................... 24 2.8.1 Aethina tumida...................................................................................................................... 24 2.8.2 Tropilaelaps spp. ................................................................................................................... 25 3 Metodo pratico per l’attuazione del protocollo............................................................................ 28 3.1 Campionatura e monitoraggio della colonia ......................................................................... 28 3.1.1 Numero di colonie da campionare ........................................................................................ 28 3.1.2 Selezione delle colonie .......................................................................................................... 29 3.2 Calendario delle ispezioni...................................................................................................... 30 3.3 Sintomi clinici, campioni e richieste analitiche ..................................................................... 30 3.4 Corso pratico per la visita...................................................................................................... 36 3.4.1 Visita n. 1 ‐ prima del periodo invernale ............................................................................... 36 3.4.2 Visita n. 2 ‐ dopo il periodo invernale ................................................................................... 37 3.4.3 Visita n. 3 ‐ durante la stagione attiva................................................................................... 38 2 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 4 APPENDICE 1: Istruzioni per eseguire, identificare, confezionare , conservare ed inviare i campioni ................................................................................................................................................ 39 5 APPENDICE 2: elenco dell’equipaggiamento per le visite ............................................................. 42 3 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 1 Principi generali 1.1 Obiettivi Il progetto pilota di sorveglianza intende armonizzare procedure di sorveglianza attiva per consentire stime affidabili delle perdite di colonie nei paesi europei selezionati. Il programma intende, inoltre, favorire lo studio delle patologie più importanti delle api. Il protocollo consentirà di valutare l'incidenza della malattia dopo l’applicazione di procedure armonizzate su indicatori epidemiologici condivisi. Gli obiettivi dell’indagine sono i seguenti: ‐ valutare il tasso di mortalità invernale delle colonie; ‐ valutare il tasso di mortalità stagionale; ‐ valutare il tasso d’infestazione da Varroa destructor prima della stagione invernale; ‐ valutare la prevalenza clinica delle principali malattie delle api prima prima e dopo l’inverno, e durante la stagione attiva: in particolare, peste americana, peste europea, varroasi, nosemiasi e paralisi cronica (CBPV); ‐ valutare il tasso di infezione da ABPV e DWV prima dell’inverno o verificare se DWV o ABPV possano essere fattori di rischio che producono mortalità invernale o malattie invernali; ‐ garantire un sistema di allerta rapida in caso di rilevamento dei due artropodi esotici, Aethina tumida e Tropilaelaps spp; ‐ Censimento di apiari ad elevato rischio per presenza di artropodi esotici. 1.2 Modalità di applicazione Il progetto pilota relativo alla sorveglianza della mortalità nelle colonie di api si basa sulla sorveglianza attiva. Questo tipo di sorveglianza implica visite, a scadenze fisse, eseguite da ispettori qualificati, su un campione rappresentativo di apiari. Nel presente documento, si considera ispettore apistico ogni agente sanitario, veterinario o qualsiasi altro soggetto ufficialmente incaricato delle ispezioni nell’apiario. Le ispezioni saranno effettuate in diversi periodi, nell’arco di un mese, per consentire la comparabilità dei risultati. Calendario delle attività: ‐ Autunno 2012: visita da effettuarsi prima del periodo invernale (settembre‐ottobre, il periodo esatto verrà stabilito in base alle caratteristiche climatiche di ogni Stato Membro o unità geografica); ‐ Primavera 2013: visita da effettuarsi alla fine del periodo di svernamento (febbraio‐marzo‐aprile, tardo inverno o all’inizio della primavera, in base alle caratteristiche climatiche di ogni Stato Membro o unità geografica); 4 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality ‐ Estate 2013: visita da effettuarsi durante la stagione attiva. Popolazione‐target per le ispezioni Prima dell’autunno 2012, saranno scelti in modo casuale un numero x di apiari per unità geografica. La selezione potrà essere stratificata sulla base della dimensione dell’apiario, della localizzazione e di altri criteri. Il numero di apiari sarà stabilito in base alla prevalenza attesa (in relazione alla situazione epidemiologica del paese) e ad un livello definito di precisione assoluta o relativa. All’interno di ogni apiario verranno selezionate in modo casuale y colonie durante la prima visita autunnale (rispettando la prevalenza attesa di ciascun apiario). Durante tre ispezioni saranno visitati gli stessi apiari selezionati e le relative colonie. 1.3 Definizioni preliminari Apicoltore Qualsiasi soggetto legale o persona fisica, possessore o detentore di una o più arnie. Ape mellifera Ape domestica (Apis mellifera). Colonie di api Gruppo di api allevato per produrre miele o altri prodotti dell’alveare. Arnia Unità abitativa di una colonia di api. Apiario Arnia o gruppo di arnie la cui gestione consente l’identificazione di una singola unità epidemiologica. 2 Patologie rilevabili durante la visita autunnale nell’apiario 2.1 Mortalità invernale delle colonie di api Obiettivi Valutare il tasso di mortalità invernale della colonia. definire il “caso” di mortalità invernale della colonia di api 5 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Una colonia selezionata è considerata colpita da mortalità invernale se/quando: ‐ ‐ Durante la visita autunnale del 2012 (prima del periodo di invernamento), la colonia selezionata è stata rilevata in vita dall’ispettore apistico e l’apicoltore l’ha ritenuta in grado di sopravvivere durante il periodo invernale. Durante la visita primaverile del 2013 (dopo il periodo di svernamento): ¾ La colonia selezionata ospita le api, ma è considerata non‐vitale (quasi estinta = meno di 500 api nella colonia) e incapace di riprendersi durante la stagione attiva, secondo il parere qualificato dell’ispettore apistico, ¾ OPPURE, la colonia selezionata si trova in una delle seguenti condizioni: tutte le api all’interno dell’alveare sono morte; tutte le api sono morte e l’alveare è vuoto; la colonia selezionata ospita api operaie fucaiole, ma in assenza dell’ape regina. Per valutare il tasso di mortalità invernale, la visita dopo il periodo invernale deve essere effettuata con sufficiente anticipo, prima del tipico aumento primaverile della popolazione di api. La data va adattata alle condizioni meteorologiche dell’area‐campione. Osservazioni durante la prima visita (autunno 2012) ‐ Per organizzare la visita: chiedere informazioni riguardo all’attività di apicoltura per fissare una data per la visita, ‐ registrare il numero totale di colonie nell’apiario, ‐ selezionare casualmente un campione di y colonie ed identificarlo in modo preciso, ‐ aprire le colonie selezionate e compilare la scheda fornita. Tale informazione sarà cruciale per la successiva analisi dei dati. ‐ Se la colonia selezionata dovesse essere estinta, scegliere in modo casuale un’altra colonia per mantenere invariato il numero totale di colonie selezionate. ‐ In altri casi (colonia debole) mantenere la colonia nel campione. Nota importante: Non è consigliabile scartare le colonie in cattivo stato, anche se l’ispettore apistico ritiene che tale colonia non sopravviverà all’inverno. Tale selezione potrebbe generare una distorsione campionaria. Osservazioni durante la seconda visita (primavera 2013) ‐ Rilevare il numero totale di colonie nell’apiario ‐ Aprire ed ispezionare ognuna delle colonie precedentemente identificate e selezionate ‐ Compilare il modulo ‐ Indicare anche: 6 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality o Il numero di colonie che sono state vendute, spostate o divise tra le due ispezioni o Il numero di colonie che sono state riunite tra le due ispezioni e specificarne i motivi o Il numero di colonie morte ‐ Nota importante: Nella scheda va indicato se il tasso di mortalità invernale osservato dall’apicoltore è legato specificamente all’apiario o all’azienda in generale. ‐ Saranno pertanto riportati due tassi di mortalità delle colonie: ‐ ‐ Uno relativo alle colonie ispezionate (selezionate ed identificate) Uno fornito dall’apicoltore e relativo sia all’apiario che all’azienda in generale. Produzione dei dati Indicatore epidemiologico: Si tratta del rapporto fra numero di colonie selezionate affette da mortalità in inverno (fare riferimento alla definizione del caso) e numero di colonie campione riportate vive dall’ispettore apistico durante la prima visita (autunno 2012). Questo indicatore rappresenta il tasso di mortalità invernale per apiario. 2.2 Mortalità stagionale delle colonie di api Obiettivi Valutare il tasso di mortalità stagionale delle colonie Definizione di mortalità in colonie di api a metà‐stagione Una colonia selezionata è considerata affetta da mortalità stagionale se: ‐ ‐ Durante la visita primaverile del 2013 (dopo il periodo di svernamento), la colonia selezionata è stata segnalata in vita dall’ispettore apistico ed è stata precedentemente considerata dall’apicoltore in grado di sopravvivere per l’intera stagione. Durante la visita estiva del 2013 (durante la stagione attiva): ¾ La colonia selezionata ospita un certo numero di api, ma è considerata non‐vitale (quasi estinta = meno di 500 api nelle colonia) e incapace di proseguire nella stagione apistica, secondo al parere qualificato dell’ispettore apistico 7 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality ‐ ‐ ‐ ‐ ¾ OPPURE la colonia selezionata mostra uno dei seguenti sintomi clinici: tutte le api sono morte all’interno dell’alveare; la colonia ospita api operaie ovificatrici, ma in assenza di ape regina, ¾ OPPURE la colonia selezionata, tra la II e la III visita, è stata riunita con un’altra. Osservazioni durante la terza visita (estate 2013) Riportare il numero totale di colonie nell’apiario Aprire e ispezionare ognuna delle colonie precedentemente identificate e selezionate Compilare la scheda Indicare anche: o Il numero di colonie che sono state vendute, spostate o divise tra le due ispezioni o Il numero di colonie che sono state riunite nel periodo fra le due ispezioni e specificarne i motivi o Il numero di colonie morte Nota importante: il tasso di mortalità stagionale osservato dall’apicoltore va riportato nella scheda, sia nel caso sia riferito all’apiario, sia nel caso sia riferito all’azienda in generale. Saranno pertanto riportati due tassi di mortalità delle colonie di api: ‐ ‐ Uno relativo alle colonie ispezionate (quelle selezionate ed identificate) Uno fornito dall’apicoltore, relativo all’apiario o all’azienda in generale. Produzione dei dati Indicatore epidemiologico: si tratta del rapporto fra numero di colonie affette da mortalità (con riferimento alla definizione del caso) e il numero di colonie campione registrate in vita dall’ispettore apistico durante la seconda visita (primavera 2013), meno il numero di colonie selezionate che sono state vendute tra la II e la III visita. L’indicatore rappresenta il tasso di mortalità stagionale delle colonie per apiario. 2.3 Infestazione da Varroa e varroasi Obiettivi ‐ Valutare l’infestazione da Varroa destructor in apiari prima dell’inverno ‐ Valutare l’infestazione da Varroa destructor in colonie all’interno di apiari prima dell’inverno ‐ Valutare la prevalenza clinica di varroasi durante le 3 ispezioni. 8 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 2.3.1 Tasso di infestazione da varroa Definizione del caso Una colonia è considerata infestata da Varroa destructor quando vi è almeno una varroa nel campione della colonia di api. Indicazione/o commento: Misurare il grado d’infestazione da varroa: L’infestazione della colonia è misurata valutando il numero di varroe staccatesi dalle api adulte. Informazioni, campioni ed osservazioni • Informazi sul trattamento contro la varroa: ‐ Nome del prodotto /principio/i attivo/i ‐ Data/e del trattamento/i nel 2012 ‐ Modalità di applicazione • Campioni ‐ Campione di 300 api adulte da colonie selezionate casualmente da una o, meglio, da più favi di covata non opercolata (solamente durante la visita n. 1). • Osservazioni: compilare la scheda (XX) con i sintomi clinici di varroasi (fare riferimento a quanto indicato di seguito e alla scheda malattie) Analisi di Laboratorio Le varroe sono contate sui campioni di api interne seguendo il metodo diagnostico OIE. Il metodo consiste nel lavaggio delle api per staccare gli acari in fase foretica. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.02.07_VARR OASI.pdf Produzione dei dati Indicatori epidemiologici: • Tasso di infestazione: ‐ Rapporto fra numero di apiari risultati infestati da V. destructor durante la visita n. 1 e numero totale di apiari monitorati ‐ Rapporto fra numero di colonie risultate infestate da V. destructor durante la visita n. 1 e numero totale di colonie monitorate per apiario ‐ Numero di varroe / 100 api / colonia 9 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 2.3.2 Varroasi Definizione del caso Un apiario è considerato ‘positivo’ se in una o più colonie è stata diagnosticata la varroasi. Sospetto: Qualsiasi colonia con sintomi clinici, con o senza l’identificazione nella stessa colonia di parassiti, è sospetta di varroasi. ‐ ‐ ‐ o Sintomi clinici su api adulte: Presenza di varroe sulle api (varroa in fase foretica) Api con ali deformate e/o atrofizzate Api con addome piccolo ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ o Sintomi clinici sulla covata: Covata a mosaico Presenza di parassiti (femmine mature di color marrone, stadi bianchi immaturi) Opercolo con piccoli fori Larve morte di colore marrone o marrone chiaro (assenza di AFB, no larva filante) Larve morte secche Api morte con ali deformi in celle opercolate/ pupe morte/api morte pronte per lo sfarfallamento (solamente la testa con la ligula estroflessa) Cannibalismo di larve o pupe Note importanti: Alcuni sintomi clinici della varroasi assomigliano a quelli della peste o di Tropilaelaps spp. La relazione dei sintomi clinici osservati deve essere precisa e più completa possibile. Conferma: Una colonia è ‘positiva’ alla varroa se i sintomi clinici tipici (vedi scheda delle malattie) sono stati rilevati sul campo e/o se è stata diagnosticata da un laboratorio (vedi di seguito le procedure per il campionamento). Campioni e osservazioni ‐ Campioni di covata: si eseguono solo in casi di sintomi clinici osservabili sulla covata, ma senza riscontro di varroa durante l’osservazione (sospetto di altre malattie associate, per esempio peste, Tropilaelaps spp.): Campione di covata sintomatica (10 x 10 cm) Se tale campione compromettesse la sopravvivenza della colonia (per esempio: casi di limitaata presenza di covata), campionare gli elementi sintomatici con provetta Eppendorf (ad es.: larve malate) 10 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality • Osservazione: compilare il modulo (XX) inserendo le osservazioni realtive ai sintomi clinici Analisi di laboratoio La diagnosi di laboratorio della varroa segue un approccio sintomatico: osservazioni sul campo associate ad analisi di campioni di covata. Un’analisi complementare può essere eseguita per cercare eventuali malattie associate. Produzione di dati Indicatori epidemiologici: • la malattia varroasi è rilevata con l’indicatore: ‐ rapporto fra numero di apiari affetti dalla varroasi e numero totale di apiari monitorati 2.4 DWV, ABPV e indagine sui fattori di rischio associati alla mortalità invernale 2.4.1 DWV e ABPV Obiettivi ‐ Valutare l’infezione da ABPV e DWV nell’apiario prima della stagione invernale ‐ Valutare l’infezione da ABPV e DWV prima della stagione invernale nelle colonie all’interno degli apiari Definizione del caso Un apiario è considerato ‘positivo’ se si rileva il virus (DWV, ABPV) in almeno una delle colonie selezionate. Una colonia è considerata infetta da DWV o ABPV se la presenza del virus è rilevata da un laboratorio di analisi. Campioni e osservazioni I campioni di api sono uguali a quelli prelevati per il tasso d’infestazione della varroa. Un campione di 300 api adulte selezionate, in modo casuale, su uno o preferibilmente su più favi di covata non opercolata (solamente durante la visita n. 1). Analisi di laboratorio Rilevamento di DWV o ABPV usando la tecnica PCR. Produzione di dati 11 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Indicatori epidemiologici: Numero di apiari infetti da DWV / numero totale di apiari monitorati Numero di colonie rilevate DWV positive / numero totale di colonie campionate per apiario (per valutare il tasso d’infestazione della colonia per apiario) Numero di apiari infetti da ABPV / numero di apiari monitorati Numero di colonie rilevate ABPV positive / numero di colonie campionate per apiario (per valutare il tasso d’infestazione della colonia per apiario) Commento: se lo Stato Membro non è in grado di eseguire lo studio di prevalenza (per DWV e ABPV), deve conservare il campione sistematico di api per eseguire un’indagine sui fattori di rischio in caso di elevata mortalità invernale. 2.4.2 Indagine sui fattori di rischio per mortalità invernale Obiettivi ‐ Identificare i fattori di rischio che determinano la mortalità invernale Tale identificazione è possibile con uno studio focalizzato su fattori rilevanti di rischio (per esempio: tasso d’infestazione da varroa, infezione da DWV e da ABPV e così via). Campioni e osservazioni I campioni sono gli stessi di quelli utilizzati per il calcolo del tasso d’infestazione da varroa. Un campione di 300 api adulte per colonie selezionate in modo casuale, su uno o preferibilmente su più favi di covata non opercolata (solamente durante la visita n. 1). I campioni devono essere conservati in modo corretto per successive analisi (dopo aver calcolato il tasso di mortalità invernale). Studio caso‐controllo Lo studio caso‐controllo può essere eseguito come riportato di seguito: 9 Eseguire un campionamento sistematico per la varroa durante la visita n. 1 (autunno); 9 I campioni sistematici di api provenienti dalla visita n. 1 vanno conservati; 9 Durante la visita n. 2 (all’inizio di primavera), rilevare le colonie morte. In seguito, analizzare le api adulte per indagare sui fattori di rischio (es.: DWV, ABPV) relativi a x colonie morte e x (lo stesso numero) di colonie sane dello stesso apiario con i campioni forniti dalla visita n. 1. 2.5 Nosemiasi Obiettivo ‐ Valutare la prevalenza clinica della malattia nosemiasi. 12 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Definizione del caso Un apiario è considerato ‘positivo’ se una colonia selezionata presenta i tipici sintomi clinicici e se è stata rilevata la presenza di Nosema spp. Sospetto: Qualsiasi colonia selezionata colpita da Nosema spp. con i tipici sintomi clinici si ipotizza sia affetta da nosemiasi. Sintomi: ‐ ‐ ‐ ‐ Api morte davanti all’alveare Api che si trascinano, api attaccate a fili di erba Tracce di diarrea fuori o all’interno dell’alveare Spopolamento. Nota importante: alcuni sintomi clinici sono simili ad altre malattie, in questo caso alla paralisi cronica (CBPV). Conferma: Una colonia è considerata ‘positiva’ alla nosemiasi se i tipici sintomi clinici (vedi modulo delle malattie) sono stati rilevati e sono state identificate e quantificate le spore di Nosema spp. Campioni/osservazioni I campioni dovranno essere eseguiti solo in caso di sospetta presenza clinica di nosemiasi (malattia). Deve essere campionato un minimo di 20 api sintomatiche o moribonde sul predellino. In assenza di un numero di api sintomatiche sufficiente (meno di 10) e presenza di api morte di recente (da meno di una settimana), queste ultime possono essere campionate e analizzate separatamente. Analisi di laboratoio Rilevamento e quantificazione di spore di Nosema spp. su api (metodo OIE) utilizzando il microscopio ottico : http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.02.04_NOSEMIASI.p df ) Nota importante: la diagnosi della nosemiasi va effettuata tenendo conto della sintomatologia clinica e dei risultati analitici per questa malattia. Produzione dati 13 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Indicatori epidemiologici: ‐ Numero di apiari affetti da nosemiasi / numero di apiari monitorati. 2.6 Paralisi cronica Obiettivi ‐ Valutare la prevalenza clinica della paralisi cronica Definizione del caso Un apiario è considerato ‘positivo’ se la paralisi cronica viene diagnostica in almeno una colonia. Sospetto: Una colonia infetta da CBPV con sintomatologia clinica specifica è considerata sospetta di paralisi cronica. Sintomi: ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ ‐ Api che tremano, api che si trascinano Api morte davanti all’alveare Piccole api nere lucide, prive di peli sul dorso, espulse dall’alveare Api respinte dalle api guardiane Predellino occupato da api malate Diarrea Conferma: Qualsiasi colonia con sintomi clinici ed infetta da CBPV con carica superiore a 108 copie di genoma virale per ape è considerata affetta da paralisi cronica. Campioni/osservazioni Almeno 20 api sintomatiche (tremanti) o moribonde sul predellino devono essere campionate. In mancanza di un sufficiente numero di api sintomatiche (meno di 10) e in presenza di api morte di recente (da meno di una settimana), queste ultime potranno essere campionate e analizzate separatamente. Analisi di laboratorio Rilevamento e quantificazione del carico virale per ape usando la PCR real time. Nota importante: la conclusione analitica dipende dal carico virale per ape e dalla presenza di sintomi clinici. 14 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Produzione di dati Indicatore epidemiologio: Numero di apiari affetti da paralisi cronica/numero di apiari monitorati Nota importante: sintomi clinici di paralisi cronica compaiono spesso in primavera e all’inizio dell’estate. Sono spesso sporadici e scompaiono rapidamente. È pertanto fondamentale che l’apicoltore osservi gli apiari per cogliere la sintomatologia. Il controllo dovrebbe avvenire con un rapido, ma attento, esame del predellino senza effettuare necessariamente una visita interna. 2.7 Peste americana e europea Obiettivi ‐ Valutare la prevalenza clinica della peste americana e della peste europea. 2.7.1 Peste americana Definizione del caso Un apiario è considerato ‘positivo’ se è stata diagnosticata la peste americana in almeno una colonia. Sospetto: Qualsiasi colonia selezionata con sintomi clinici di peste americana é considerata sospetta di peste americana. Sintomi: ‐ Covata a mosaico ‐ Opercoli di diversi colori /opercoli scuri e infossati/forati ‐ Larve filanti (test del fiammifero) ‐ Larve di colore marrone caffè ‐ Scaglie adese alla cella ‐ Tipico odore di larve malate. Conferma: Qualsiasi colonia selezionata con sintomi clinici e infestata da Paenibacillus larvae è da considerarsi affetta da peste americana. Campioni/osservazioni 15 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Campione di covata sintomatica (circa 10 x 10 cm) o, se tale campionatura dovesse mettere a rischio la sopravvivenza della colonia (piccola quantità di covata), eseguire un campione usando provette Eppendorf su elementi sintomatici di covata (larva malata). Analisi di laboratorio Controllare la presenza di Paenibacillus larvae applicando metodi batteriologici (microscopia ottica o coltura con terreni specifici). Se necessario, il controllo può essere completato usando la PCR per individuare l’agente patogeno della peste americana. Produzione dati Indicatore epidemiologico Numero di apiari affetti da peste americana / numero di apiari monitorati. 2.7.2 Peste europea Definizione del caso Un apiario è considerato ‘positivo’ se la diagnosi rileva almeno una colonia infetta da peste europea. Sospetto: Qualsiasi colonia selezionata che presenta sintomi clinici della peste europea va considerata sospetta di peste europea. Sintomi: ‐ Covata a mosaico ‐ Opercoli forati ‐ Larve afflosciate ‐ Larve che assumono una pigmentazione gialla/marrone (generalmente in covata non opercolata) ‐ Odore acre o di putrefazione delle larve. Conferma: Qualsiasi colonia selezionata che presenta i sintomi clinici ed è infetta da Melissococcus plutonius è da considerarsi affetta da peste europea. Campioni/osservazioni Campione della covata (circa 10 x 10 cm) o, se tale campionatura dovesse mettere a rischio la sopravvivenza della colonia (piccola quantità di covata), eseguire un campione usando provette Eppendorf solo su elementi sintomatici (larve malate). 16 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Analisi di laboratorio Controllare la presenza di Melissococcus plutonius usando metodi batteriologici (microscopio ottico o colture con terreni specifici). Se necessario, il controllo può essere completato con analisi PCR per individuare l’agente patogeno della peste europea. Produzionedi dati Indicatore epidemiologico Numero di apiari affetti da peste europea / numero di apiari monitorati. 2.8 Parassitosi esotica: Aethina tumida e Tropilaelaps spp. Obiettivo ‐ Garantire un sistema di allerta precoce per identificare i due artropodi esotici, Aethina tumida e Tropilaelaps spp. ‐ Censire gli apiari ad alto rischio di introduzione degli artropodi negli apiari. Per fare un censimento dell’alto rischio di introduzione degli artropodi esotici negli apiari, va valutata la presenza di un aeroporto internazionale o di un porto nelle vicinanze dell’apiario. Va considerata anche l’eventuale importazione di api regine. 2.8.1 Aethina tumida Definizione del caso Sospetto Rilevamento di coleotteri, uova o larve sospette. Criteri di sospetto: Rilevamento di coleotteri, uova o larve sospette durante la visita dell’alveare. Sintomi di infestazione del piccolo coleottero dell’alveare. Sono osservabili: ‐ coleottero adulto, larve o uova ‐ gallerie scavate all’interno dei favi ‐ covata distrutta ‐ variazione del colore del miele e sua fermentazione. Nota importante: questi sintomi clinici si manifestano in avanzata fase di infestazione. È pertanto fondamentale monitorare la presenza di coleotteri atipici, uova o larve. I controlli possono essere eseguiti negli alveari che ospitano le api e in alveari vuoti, essendo i coleotteri attratti dall’odore delle colonie di api. Conferma 17 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Identificazione di Aethina tumida a livello nazionale e conferma da parte del laboratorio di riferimento UE. Campioni/osservazioni Campione di coleottero, larva e uova di ogni esemplare sospetto. Nota importante: ogni Stato Membro dovrebbe applicare il regolamento della Commissione (UE) N. 206/2010 del 12 marzo 2010 per evitare l’introduzione dei due infestanti esotici, assicurando un sistema di allerta rapida in caso di introduzione. Analisi di laboratorio Si dovrebbe eseguire l’identificazione morfologica assieme a quella molecolare. I risultati andrebbero confermati dal laboratorio UE di riferimento. Nota importante: è opportuno attivare l’allerta a livello nazionale ed europeo, assieme all’attuazione di adeguate procedure di emergenza e restrizioni sanitarie sugli animali (le autorità competenti devono essere tempestivamente informate). Produzione di dati Indicatore epidemiologico Numero di focolai sospetti all’anno. Numero di focolai confermati all’anno. 2.8.2 Tropilaelaps spp. Definizione del caso Sospetto: Rilevamento di acaro/i macroscopicamente diversi dalla varroa su api, covata o fondo dell’alveare. Criteri di sospetto: Identificazione di acari sospetti/atipici diversi dalla varroa durante la visita della covata o sul fondo dell’alveare. Nota importante: i sintomi clinici dell’infestazione da acari Tropilaelaps sono simili a quelli della varroasi: ‐ ali delle api deformate, ‐ addome deformato, ‐ opercoli con piccolo fori, ‐ covata irregolare (a mosaico), ‐ covata morta. 18 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Si ricorda che questi sintomi compaiono in una fase avanzata dell’infestazione. È pertanto fondamentale individuare gli acari atipici. Conferma: Identificazione del Tropilaelaps spp. a livello nazionale e conferma da parte del laboratorio UE di riferimento. Campioni/osservazioni Eseguire campioni di qualsiasi esemplare di acaro sospetto. ‐ ‐ Si possono identificare acari sospetti durante il conteggio di varroa su campioni sistematici di api mellifere (vedi capitolo sulla varroa). In caso di elevato rischio di ingresso negli apiari degli artropodi: eseguire un campione su covata sintomatica (10 x 10 cm) verificare la presenza di acari sospetti sul fondo dell’alveare quando vi sono sintomi clinici di sindrome da acari parassiti. Tale condizione non esclude il controllo su altri acari inusuali, anche in caso di osservazione di varroa. Commento: Tropilaelaps spp. va ricercata anche in campioni di covata sintomatici per varroa (diagnosi differenziale). Nota importante: Ogni Stato Membro dovrebbe applicare il regolamento della Commissione (UE) n. 206/2010 del 12 marzo 2010 per evitare l’introduzione dei due infestanti esotici ed assicurare una rapida allerta in caso di introduzione. Analisi di laboratorio Identificazione di Tropilaelaps spp. mediante esame morfologico diretto su acari sospetti (NRL). I risultati dovrebbero essere confermati dal laboratorio UE di riferimento. Nota importante: Il livello di allerta nazionale ed europea andrebbe aumentato, ricorrendo anche a procedure di emergenza e controlli sanitari sugli animali (le autorità competententi devono essere informate tempestivamente). Produzionedi dati Indicatore epidemiologico: Numero di focolai sospetti all’anno. Numero di focolai effettivi all’anno . 19 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 3 Metodo pratico per l’attuazione del protocollo 3.1 Campionatura e monitoraggio della colonia 3.1.1 Numero di colonie da campionare Le colonie selezionate (y) per apiario permettono di identificare una determinata prevalenza (z %) all’interno dell’apiario. L’obiettivo è identificare una delle sopracitate malattie. Se nessuna colonia è affetta da malattia, la prevalenza di malattia all’interno dell’apiario sarà considerata inferiore a una data soglia di prevalenza (z %). Numero totale di colonie fino nell’apia a 19 rio selezion ato 20 80 100 110 120 140 150 170 190 220 300 500 Da ispezion are 19 26 31 35 38 40 42 45 46 47 48 49 54 56 tut ti 30 40 50 60 70 50 51 52 Table 1: Numero di colonie da ispezionare per individuare una prevalenza pari al 5% Numero totale di colonie all’interno dell’apiario selzionato Fino a 15 20 30 40 50 60 70 90 110 160 280 900 11 Da ispezionare Tutti 13 16 19 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Table 2: Numero di colonie da ispezionare per individuare una prevalenza pari al 10% Numero totale di colonie all’interno dell’apiario selezionato Fino 9 10 12 14 17 20 40 60 80 100 120 200 400 1000 a 8 Da ispezionare tutti 8 9 10 11 12 13 16 17 18 18 19 19 20 20 Table 3: Numero di colonie da ispezionare per individuare una prevalenza pari al 15% 20 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Numero totale di colonie all’interno dell’apiario selezionato Fino a 7 8 10 12 16 22 33 59 190 1000 6 Da ispezionare Tutti 6 7 8 9 10 11 12 13 14 14 Tabella 4: Numero di colonie da ispezionare per individuare una prevalenza pari al 20% 3.1.2 Selezione delle colonie • Numero di apiari ispezionati nell’area di sorveglianza: x apiari La dimensione del campione va fissata in base alla prevalenza e al livello di precisione attesi. Nota importante: probabilmente sarà maggiore la precisione stimata per la varroasi (prevalenza attesa elevata) che per le malattie virali e la nosemiasi caratterizzati da una prevalenza inferiore. • Campione casuale di colonie Alla prima visita (autunno), le colonie sono selezionate casualmente in funzione del numero totale di colonie nell’apiario. Secondo l’apicoltore queste colonie sono vitali e in grado di superare l’inverno. Le colonie selezionate casualmente vanno sorvegliate durante le tre ispezioni. Per ragioni pratiche, la visita primaverile va eseguita prima del periodo di transumanza. • Rilevamento di colonie sintomatiche durante la visita esterna L’identificazione si basa su sintomi clinici/anomalie rilevati sul predellino: mortalità, api con anomalie morfologiche (malformazioni, ali atrofizzate, colore nero, perdita di pelo e così via), anomalie nel comportamento (tremori, trascinamento / api incapaci di volare, appese a fili d’erba, respinte dalle api guardiane), tracce di diarrea sull’alveare, ridotta attività all’ingresso dell’alveare. Alcune colonie possono essere esaminate tenendo conto delle dichiarazioni dell’apicoltore (per esempio: colonie che durante le precedenti ispezioni presentano sintomi clinici della peste americana). 3.2 Calendario delle ispezioni È necessario eseguire la prima visita alla fine della stagione attiva, prima del periodo invernale. La seconda visita va fatta dopo il periodo invernale. La terza visita va eseguita durante la stagione attiva, in tarda primavera/inizio estate. 21 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Nota importante: Il periodo andrebbe scelto/selezionato dallo stato Membra in base alle caratteristiche climatiche locali e al calendario di transumanza. È necessario eseguire le ispezioni di tutti gli apiari entro un mese per disporre di dati comparabili. 3.3 Sintomi clinici, campioni e richieste analitiche La tabella 4 presenta i campioni, l’analisi e il coinvolgimento dei laboratori. L’analisi dell’infestazione della Varroa destructor, di DWV e ABPV sarà effettuata in modo sistematico durante la prima visita. Altri campionamenti saranno effettuati solo in presenza di sintomi clinici. L’ispettore indicherà le analisi da compiere secondo i sintomi clinici rilevati. La diagnosi della varroasi potrebbe essere eseguita direttamente sul campo da un esparto ispettore senza validazione laboratoriale secondo i sintomi clinici rilevati. Nota importante: il campionamento sarà effettuato in ogni colonia malata. Durante la prima visita, prelevare una porzione di covata dalla colonia potrebbe influire negativamente sulla sua sopravvivenza. Campioni eseguiti su elementi anormali o malati (larve, pupe, presenza di peste, e così via) potrebbero essere gestiti in provette Eppendorf. Tutti i campioni devono essere identificati correttamente e riferiti alla registrazione delle osservazioni cliniche (importanza della formazione dell’ispettore). La tabella 5 presenta le tecniche analitiche per la diagnosi delle malattie e degli agenti patogeni. 22 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Visita n. 1 prima del periodo invernale Campioni Campioni sistematici • Api vive all’interno dell’alveare (300) Colonie da campionare • Tutte le colonie andrebbero campionate Indagini • Laboratori coinvolti Infestazione da Varroa destructor Rilevamento di acari Tropilaelaps spp. DWV e ABPV • laboratori MS • • Varroasi / Tropilaelaps spp Peste • laboratori MS • • • • Varroasi / Tropilaelaps spp Nosemiasi CBPV Identificazione di Tropilaelaps spp Identificazione di Aethina tumida • laboratori MS • • laboratori MS Validazione da parte dell’EURL • • Campioni su colonie sintomatiche • • • • • Campione di covata sintomatica (10 x 10 cm) e/o campione su elementi sintomatici nelle provette Eppendorf campioni sintomatici di api (30) • Esemplare di acaro sospetto (simile a Tropilaelaps spp.) Esemplare di coleottero, larve o uova sospette • Visita n. 2 Campioni su colonie sintomatiche • Campione sintomatico di covata (10 x 10 dopo cm) l’inverno e • e/o campione solo su elementi visita n. 3 sintomatici in provette Eppendorf durante la • Campioni sintomatici di api (30) stagione attiva • • Esemplare di acaro sospetto (simile a Tropilaelaps spp.) Esemplare di coleottero, larve o uova sospette • Colonie con sintomi clinici su covata proveniente da campioni di colonie selezionate casualmente Colonie con sintomi clinici in api adulte da colonie selezionate in modo casuale Ogni colonia con sintomi sospetti • • Colonie con sintomi clinici su covata da colonie selezionata in modo casuale • • Varroasi / Tropilaelaps spp Peste • laboratori MS • Colonie con sintomi clinici su api adulte da colonie selezionate in modo casuale Ogni colonia con elementi sospetti • • • • Varroasi / Tropilaelaps spp Nosemiasi CBPV Identificazione di Tropilaelaps spp Identificazione di Aethina tumida • laboratori MS • • laboratori MS Validazione da parte di EURL • • Tabella 5: campioni ed analisi da eseguire in funzione della visita 23 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Malattie Patogeno Tecniche (principio, bibliografia) • Apiario infestato da Varroa destructor V. destructor Varroasi V. destructor Peste americana P. larvae Peste europea Nosemosi Paralisi cronica M. plutonius Individuazione e conteggio di Varroa destructor mediante il lavaggio di api adulte (OIE) • Api vive interne (>300) • Ricerca dei sintomi +/‐ presenza del parassita (OIE) • Covata sintomatica + api adulte • Diagnosi batterioscopica (OIE) • • +/‐ identificazione mediante PCR Covata sintomatica (10 x 10 cm) o campioni in tubi Eppendorf • Diagnosi batterioscopica (OIE) • • +/‐ identificazione mediante PCR Covata sintomatica (10 x 10 cm) o campioni in tubi Eppendorf • 20 api adulte sintomatiche • Individuazione e quantificazione di spore di Nosema spp. Mediante microscopia ottica (OIE) • Diagnosi molecolare: individuazione e quantificazione (RT‐qPCR secondo le raccomandazioni del EU‐RL) N. apis e N. ceranae CBPV Matrice • (o in assenza di api sintomatiche 20 api morte) NB: non mescolare api sintomatiche e api morte • 20 api adulte sintomatiche • (o in assenza di api sintomatiche 20 api morte) NB: non mescolare api sintomatiche e api 24 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality morte DWV ABPV DWV ABPV • • • A. tumida / Piccolo coleottero dell’alveare Diagnosi molecolare: identificazione e / o quantificazione Identificazione dei coleotteri mediante esame morfologico diretto (OIE) A. tumida • Richiesta la validazione analitica del EU RL • Identificazione durante il lavaggio delle api Identificazione durante l’esame di campioni di covata sintomatica Identificazione dei coleotteri mediante esame morfologico diretto (OIE) Richiesta la validazione analitica del EU RL • Tropilaelaps spp. Diagnosi molecolare: identificazione e / o quantificazione Tropilaelaps spp. • • • Api interne (sistematico) • Api interne (sistematico) • Campioni di coleottero, larve e uova sospette • • • Api interne (>300) Campioni di acari sospetti Covata sintomatica Tabella 6: analisi di laboratorio da eseguire durante il progetto di sorveglianza 25 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 3.4 Corso pratico per la visita 3.4.1 Visita n. 1 prima del periodo invernale 1. Indicare gli obiettivi e le modalità di sorveglianza. Raccogliere i dati relativi alle pratiche dell’apicoltore, la località/ubicazione degli alveari e informazioni sull’ambiente circostante (vedere il modulo relativo alla visita). 2. Selezione delle colonie con procedura casuale a. Selezionare in modo casuale le colonie da monitorare successivamente b. Codificare le colonie (riferimento individuale: compilare il modulo). 3. Ispezionare il campione casuale delle colonie a. Ispezionare ogni colonia del campione casuale esterno ed interno ‐ Approccio esterno alle colonie: osservare ogni colonia per identificare malattie/sintomi clinici sul predellino o nelle immediate vicinanze dell’alveare ‐ Visita interna. Commento: Se la colonia selezionata dovesse essere estinta, sceglierne un’altra in modo casuale così da garantire la numerosità campionaria delle colonie selezionate. In ogni altro caso (colonia debole) mantenere la colonia come campione. Nota importante: l’esame non deve compromettere la sopravvivenza della colonia. b. Procedere al campionamento (vedi sopra) ‐ Sulle colonie selezionate con procedura casuale, campionare le api vive all’interno dell’alveare per valutare il tasso d’infestazione dell’apiario da Varroa destructor, assieme alle virosi da DWV e ABPV. Nota importante: questi campioni potranno essere conservati per analisi successive (per esempio, in uno studio caso‐controllo per ABPV e DWV se durante la seconda visita, dopo il periodo invernale, viene rilevata mortalità invernale). In tal caso, le api vanno lavate con alcool puro (99%) per poter utilizzare ancora i campioni. ‐ Sulle colonie sintomatiche selezionate con procedura casuale: campione di covata sintomatica/selezione delle api in base alle sintomatologie osservate. c. Indicare nel modulo le osservazioni, i campioni e le relative richieste di analisi. 4. Confezionare i campioni e inviarli al laboratorio di competenza con copia del modulo (vedi Allegato 1: istruzioni per comporre, identificare, imballare, conservare e spedire i campioni). 3.4.2 Visita n. 2 dopo il periodo invernale 1. Fornire le informazioni relative al progetto di sorveglianza e compilare la sezione semplificata con informazioni generali sull’apiario. 26 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 2. Approccio esterno all’apiario: Identificare le colonie con malattie/sintomi clinici presenti sul predellino o vicino all’alveare. Con riferimento alle colonie selezionate alla prima visita: a. Controllare le colonie e annotare la mortalità invernale (colonie morte, vedi definizione del caso), b. Specificare il numero di colonie vendute, affidate, spostate nel periodo tra le due ispezioni e il numero di colonie riunite (specificare il motivo), c. Campionare le covate sintomatiche / api in base ai sintomi clinici, d. Annotare nel modulo le osservazioni, i campioni e le relative richieste di analisi. 3. Confezionare/imballare i campioni e inviarli al laboratorio di competenza con copia del modulo (vedi Allegato 1: istruzioni per configurare, identificare, imballare, conservare e spedire i campioni). 3.4.3 Visita n. 3 durante la stagione attiva 1. Fornire informazioni riguardanti il progetto di sorveglianza e compilare la sezione semplificata fornendo informazioni generali sull’apiario. 2. Approccio esterno all’apiario: Identificare le colonie con malattia / segni clinici presenti sul predellino o vicino all’alveare. 3. Sulle colonie selezionate durante la prima visita: a. Controllare le colonie e annotare l’eventuale mortalità stagionale (colonie morte, vedi definizione del caso), b. Specificare il numero di colonie vendute, affidate, spostate nel periodo tra le due ispezioni e il numero di colonie riunite (specificare il motivo), c. Campionare le covate sintomatiche / api in base ai sintomi clinici, d. Annotare nel modulo le osservazioni, i campioni, i campioni e le relative richieste analitiche. 4. Confezionare/imballare i campioni e inviarli al laboratorio di competenza con copia del modulo (vedi Allegato 1: istruzioni per configurare, identificare, imballare, conservare e spedire i campioni). 27 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 4 APPENDICE 1: Istruzioni per eseguire, identificare, confezionare, conservare ed inviare i campioni Esecuzione del campione • • Api Conteggio di Varroa + identificazione dell’acaro Tropilaelaps + identificazione di DWV e ABPV: o Campionare 300 api vive interne su uno o due favi (preferibilmente) su covata non opercolata. Se nella colonia dovessero essere riscontrate malattie: o Campionare prioritariamente api vive con sintomatologia o comportamento anomalo (almeno 20 api), o Con un numero molto basso di api sintomatiche (meno di 10) o in mancanza di sintomatologia specifica e/o in caso di mortalità, si possono eseguire campioni su api morte di recente (meno di una settimana). Le api morte saranno analizzate separatamente da quelle sintomatiche. La qualità del risultato non dovrebbe essere pregiudicata. Raccogliere un campione compreso fra 20 e 60 api morte di recente (è preferibile la numerosità maggiore). Nota importante: ‐ Fare attenzione a come è conservato il campione di api morte: se le api si seccano e vanno in putrefazione, l’analisi non potrà essere eseguita. ‐ Se possibile, separare i campioni di api che manifestano sintomatologie diverse (nel modulo, specificare i sintomi). ‐ Prelevare una porzione di favo di covata della dimensione 10 x 10 cm con almeno 15 larve e/o ninfe di aspetto anomalo. ‐ Oppure, campionare le larve / ninfe sintomatiche o altri elementi in provette Eppendorf (è utile una descrizione dettagliata del campione). Parassiti sospetti • Campionare ogni esemplare sospetto. Identificazione del Campione Numero dell’apicoltore / A12 (per l’autunno 2012) / N° della colonia / Matrice + Numero (= 1, 2, 3…) Abbreviazioni della matrice: Api = HB, Covata = BR, Parassita = PAR, campione sistematico di api = SYS Es: 26001926/A12/7/HB1 28 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality Per il primo campione di api prelevate dalla colonia numero 7 durante la prima visita (autunno 2012). Nota importante: se vi sono apiari che appartengono allo stesso apicoltore, ogni apiario sarà identificato con il numero 100 aggiunto al numero della colonia Esempio 26001926/A12/107/HB1 Per il primo campione di api prelevate dalla colonia numero 7 del primo apiario durante la prima visita (autunno 2012). 26001926/A12/207/HB1 Un’ulteriore identificazione potrebbe essere: Numero individuale dell’apiario / A12 / N° della colonia / Matrice + Numero Confezionamento • • • • Api: Api sintomatiche: sistemare i campioni in un imballaggio pulito (barattolo di 50 mL) con riferimenti sul sigillo. Api interne: usare sacchetti con i barattoli. Evitare il più possibile di schiacciare le api. Covata: Usare cartone o scatole di plastica Per elementi piccoli, usare provette Eppendorf. Nota importante: si consiglia l’uso del vetro o della carta per l’imballaggio piuttosto che sacchetti di plastica, in modo da evitare la putrefazione. • Esemplari di parassiti sospetti: Porre gli esemplari sospetti in un barattolo di vetro perfettamente sigillato con alcool puro al 99%. Gestire i campioni in base alle raccomandazioni di laboratorio • • • Predisposto il campione, si consiglia di usare un contenitore refrigerato per il trasporto. La conservazione dovrà seguire le raccomandazioni del laboratorio: o Sistema di conservazione a freddo, congelare i campioni. Porre particolare attenzione alla catena del freddo che non dovrà essere interrotta fino all’arrivo al laboratorio. Una volta congelato, il campione non deve essere scongelato fino all’arrivo al laboratorio. o Sistema di conservazione con etanolo. Allegare il modulo della visita alla spedizione (é importante la lista dei campioni eseguiti nell’apiario). 29 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality • Adattare il corriere alle pratiche locali. Con la posta ordinaria il rischio di scongelamento potrebbe aumentare. Nota importante: I campioni dovranno essere spediti al laboratorio in scatole rigide per evitare che si schiaccino. 30 / 31 EU pilot program on the surveillance of honeybee colony mortality 5 APPENDICE 2: elenco dell’equipaggiamento per le visite • • • GPS Tuta da apicoltore pulita Materiale per il campionamento: o Sacchetti Kraft e barattoli per campionare le api o Cucitrice per chiudere i sacchetti o Coltello/bisturi per campionare la covata (porzione di favo) o Scatole per i c ampioni di covata o Provette per alcol puro (99%) per parassiti sospetti o Provette Eppendorf e stick in plastica monouso per campionare la covata o Materiale per identificare i campioni (pennarelli indelebili, etichette, ecc.) o Materiale per l’identificazione degli alveari (pennarelli indelebili o placche) o Disinfettante 31 / 31