Lieviti killer - Prof. C. Mazzoni

Lieviti killer
C. MAZZONI/BiotecnologieMicrobiche
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Fenomeno Killer
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Descritto per la prima volta nel 1963
Immunità
Sensibilità ad altre tossine killer
Vantaggi nella competizione per i nutrienti
Il fenomeno è molto diffuso tra i lieviti
Basi genetiche diverse
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Virus dsRNA in S. cerevisiae: i
satelliti L-A e quelli codificanti
la tossina M
 I ceppi di S. cerevisiae killer sono classificati in tre gruppi principali (K1, K2,
K28) ognuno dei quali un’unica tossina e uno specifico componente che li
rende immuni dalla stessa.
 La produzione di ogni tossina K1, K2 e/o K28 è associata con la presenza di
un virus satellite (ScV-M1, ScV-M2 o ScV-M28) che per essere stabilmente
mantenuto e replicato nella cellula ospite richiede la presenza del virus helper
L-A.
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Virus dsRNA in S. cerevisiae: i
satelliti L-A e quelli codificanti la
tossina M
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 Cellule contenenti solo L-A sono sensibili alle tossine e non-killer mentre quelle
contenenti anche ScV-M sono killer e immuni. I virus killer si autoselezionano
mediante l’uccisione dei segreganti privi di virus. I ceppi di lievito sensibili,
sopravvivono all’incrocio con un ceppo killer e le copie di virione multiple ScV-M
che si trovano nel citoplasma durante l’incrocio, non seguono un eredità mendeliana
nella successiva meiosi.
 I virus che codificano la tossina killer sono incompatibili a livello replicativo, si
escludono l’un l’altro è sono instabili come ceppi contenenti killer multipli.
 Questa esclusione indica che i virus rimangono isolati nell’ospite e può spiegare
perché i virioni ScV-M killer rimangono distinti e non sono mai stati trovati come
ricombinanti o ibridi.
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Virus dsRNA in S. cerevisiae: L-A
 L-A appartiene alla famiglia dei Totiviridae, non richiede la presenza di un
M-dsRNA per la sua replicazione ed il mantenimento, e non conferisce
nessun fenotipo evidente alla cellula.
 I virus di questa famiglia hanno un genoma incapsulato in una testa
icosaedrica costituito da un singolo segmento dsRNA che codifica una
proteina maggiore del rivestimento ed una RNA polimerasi RNA dipendente.
 Ogni particella L-A contiene una singola copia del genoma lineare di 4.6kb
L-A dsRNA, e l’elica codificante (L-A(+)ssRNA) ha due ORF che si
overlappano per 130 nucleotidi dove la ORF 3’ è nel frame –1 rispetto alla
ORF 5’. Quest’ultima codifica per la proteina maggiore del capside Gag (76kDa), necessaria per l’incapsulazione e responsabile per la struttura della
particella virale.
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Virus dsRNA in S. cerevisiae: LA
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 La ORF 3’ invece, codifica per una RNA polimerasi RNA-dipendente per ssRNA e
dsRNA. Tramite un evento di frameshift ribisomale –1, si crea la proteina di fusione
Gag-Pol.
 Gag-Pol è un componente chiave nella replicazione sia di L-A che di M. Attraverso il
dominio C-terminale Pol, essa riconosce un complesso segnale di incapsulazione di
strutture Stem and loop e una ripetizione diretta overlappante entro le 400 basi 3’terminali del L-A(+)ssRNA. Si presume che in dominio N-terminale di Gag entro il
complesso Gag-Pol/ssRNA inizi la polimerizzazione del capside.
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Virus dsRNA in S. cerevisiae: i
satelliti M
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 Ognuno dei tre genomi M-dsRNA contiene una singola ORF che codifica per
una proteina preprotossina (pptox) che rappresenta sia il precursore non
maturo della tossina killer secreta che il componente di immunità (non ancora
determinato).
 Le particelle L-A le particelle M contengono rispttivamente una due copie del
corrispondente genoma dsRNA. Ognuna contiene 120 copie della proteina
maggiore del capside Gag da 76-kDa e due copie della proteina di fusione
Gag-Pol da 171-kDa.
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 La coesistenza di virioni ScV-M non avviene in vivo in
quanto i genomi M si escludono a vicenda a livello
replicativo. E’ possibile ottenere l’espressione
simultanea nella stessa cellula mediante la coespressione di copie di cDNA di diversi geni pptox.
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Replicazione dei virioni L-A
 Dopo la trascrizione del templato dsRNA, l’elica codificante (+) viene estrusa
dalla particella al citoplasma, dove svolge due funzioni: 1) serve da mRNA
per la traduzione delle proteine Gag e Gag-Pol; 2) le molecole (+)ssRNA
sono impacchettate in nuove particelle virali. Una volta che è stato
completato l’assemblaggio del rivestimento, l’RNA polimerasi RNA
dipendente (Gag-Pol) agisce come replicasi, sintetizza l’elica – ed infine
genera il genoma dsRNA del virus maturo.
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Replicazione dei virioni M
 I virus M (codificanti la tossina) sono satelliti di L-A e utilizzano Gag e GagPol per la replicazione. Il ciclo di replicazione è analogo a quello di L-A con
una differenza: poiché il virione M maturo può contenere due copie del
genoma (più piccolo di quello di L-A), non tutte le eliche + sono estruse dalla
particella virale. Questo fenomeno, che si verifica anche nel caso dei virus
filamentosi, è chiamato replicazione “headful” per distinguerlo dalla “headful
packaging model” caratteristica di alcuni batteriofagi.
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Nature 4 (2006) 212-221
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Processamento della preprotossina e
secrezione della tossina
 Le tossine più studiate in S. cerevisiae sono quelle codificate da K1 e K28.
Sebbene differiscano nella sequenza aminoacidica e nel meccanismo molecolare
d’azione, condividono omologie nel processo di sintesi, maturazione e
secrezione. Ogni tossina è tradotta come preprotossina (pptox) con struttura
simile; successivamente vengono effettuate modificazioni post-traduzionali
(via reticolo endoplasmatico, apparato del Golgi e vescicole di secrezione) alla
fine delle quali si ottiene la secrezione di una tossina eterodimerica matura α/β
.
 La sequenza nucleotidica del cDNA di M28 ha rivelato la presenza di una
singola ORF che codifica per una preprotossina di 345aa con peso molecolare
di 37.6kDa. L’espressione del cDNA sotto un promotore forte (PGK) porta alla
formazione di una tossina attiva, come anche dell’immunità per la cellula ospite.
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Nature 4 (2006) 212-221
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Geni importanti per la secrezione di
tossine attive: KEX1 e KEX2
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 Kex2p è un endoproteasi subtilisina-simile che taglia le proteine
preferenzialmente dopo i dipeptidi Lys-Arg o Arg-Arg.
 Kex1p è una serina carbossipeptidasi che rimuove il dipeptide Cterminale basico esposto dall’azione di Kex2p.
 Entrambe gli enzimi sono ancorati alla membrana e sono localizzati nel
trans-Golgi, dove il sito attivo è nel lumen dell’organello.
 Substrati come il prepro-α-factor e le protossine K1, K2 e K28, sono
maturate nel Golgi durante il processo di secrezione in un modo del
tutto simile a quello osservato per la secrezione dell’ormone insulina
nelle cellule degli eucarioti superiori
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FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 257-276
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Meccanismo d’azione mediato da
recettori delle tossine killer K1 e
K28
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 Le tossine killer K1, K2 e K28 possiedono diversi modi d’azione, ma
tutte hanno in comune il fatto di uccidere un lievito sensibile in un
processo mediato da recettore in due tappe:
 1)
legame rapido e indipendente da energia della tossina ad un
recettore posto nella parete cellulare. Nel caso di K1 e K2 si tratta dei
β-1,6-D-glucani, mentre per K28 il recettore è una a-1,3-mannoproteina
ad alto peso molecolare. Si suppone che il legame ai recettori della
parete cellulare siano un modo per concentrare la tossina a livello della
parete o mediare un contatto più diretto tra la tossina la membrana
cellulare. Ceppi di lievito sensibili possono diventare resistenti alla
tossina killer in seguito a mutazioni di geni cromosomali coinvolti nella
biosintesi o struttura della parete cellulare (mutanti kre: killer
resistant) .
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Meccanismo d’azione mediato da
recettori delle tossine killer K1 e
K28
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 2) Questo step richiede energia e prevede la traslocazione della
tossina alla membrana citoplasmatica e l’interazione con un recettore
di membrana secondario. Per K28 è ancora sconosciuto (forse il
recettore Erd2p), mentre per K1 è Kre1, una proteina di superficie
cellulare O-glicosilata coinvolta anche nella biosintesi del recettore
di parete di K1 β-1,6-glucano.
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Meccanismo d’azione mediato da
recettori delle tossine killer K1 e
K28
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Dopo aver raggiunto il citoplasma, la tossina K1
esercita il suo effetto letale mediante la
formazione di canali ionici e la distruzione della
funzione della membrana citoplasmatica
K28 invece, rappresenta la prima tossina killer
che raggiunge la cellula bersaglio (lievito)
attraverso endocitosi.
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Meccanismo d’azione mediato da
recettori delle tossine killer K1 e
K28
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FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 257-276
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Trasporto retrogrado della
tossina K28
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 Una volta entrata nella cellula, la tossina attraversa il pathway di
secrezione in senso inverso (via Golgi e RE), entra nel citosol ed
infine trasduce il suo segnale tossico nel nucleo dove determina un
inibizione della sintesi del DNA ed un arresto del ciclo cellulare tra
le fasi G1/S. Il trasporto retrogado della tossina K28 dipende dal
motivo HDEL al C-terminale di β, che agisce come segnale per il
targeting intracellulare nel trans-Golgi. In questo modo viene
evitata la degradazione della tossina nel vacuolo.
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Trasporto retrogrado della
tossina K28
FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 257-276
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Similitudine tra tossine
microbiche e K28
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Il trasporto retrogrado della tossina K28 è
simile a quello osservato per altre tossine di
origine batterica, indicando che questa è una
strategia comune tra le tossine microbiche con
attività enzimatica o target intracellulari.
Anche nel caso di queste tossine microbiche, è
presente una sequenza simile al C-terminale.
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Similitudine tra tossine microbiche e
K28
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Tutte queste tossine si comportano in
modo simile (attacco al recettore di
superficie, ingresso per endocitosi,
uccisione della cellula tramite la modifica
di componenti essenziali nel citosol).
Inoltre, tutte queste tossine possiedono
ponti disolfuro la cui funzione
probabilmente è di assicurare il corretto
accesso del segnale K/HDEL al recettore
della corrispondente cellula target.
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 Una differenza tra le tossine batteriche e K28 è che quest’ultima è
prodotta all’interno della cellula di lievito quindi il segnale C-terminale
di localizzazione nel RE deve essere mascherato fino a quando la
tossina si trova nel pathway di secrezione. Una volta raggiunto il
compartimento trans-Golgi, la rimozione dell’Arginina C-terminale da
parte di Kex1p scopre il segnale di targeting intracellulare. E’ a causa
di questa strategia “intelligente” che i ceppi che producono la tossina
K28 sono in grado di evitare la ritenzione nel lume del RE.
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Retrotraslocazione di K28 e sua
tossicità
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Interazioni virus-ospite
I geni importanti per la propagazione del virus dsRNA
vengono suddivisi in due classi principali: i geni per il
mantenimento dei geni killer (MAK) ed i geni superkiller
(SKI).
Tra i 30 geni MAK finora isolati, solo 3 (MAK3, MAK10
e PET18) sono richiesti per il mantenimento sia di L-A
che M. Tutti gli altri geni MAK sono necessari solo per il
mantenimento dei satelliti M.
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Interazioni virus-ospite
 MAK3 codifica per una N-acetiltransferasi responsabile della Nacetilazione della proteina Gag. Senza questa acetilazione, le proteine
Gag non si assemblano e si perdono tutti i virus a dsRNA. Mak3
acetila anche tre proteine mitocondriali ed infatti il mutante mak3
cresce poco su fonti di carbonio respirabili.
 MAK10 codifica per una proteina richiesta per la crescita su fonti di
carbonio respirabili, Mak10p stabilizza le particelle virali contenenti
dsRNA e, insieme a Mak31p, si associa con Mak3p, e probabilmente
queste tre proteine formano un complesso.
 PET18 contribuisce alla stabilità dei virioni e Pet18p stessa potrebbe
essere associata alle particelle virali.
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Interazioni virus-ospite
 Per il mantenimento del satellite M sono stati descritti più di trenta
geni MAK.
 MAK1 codifica per una DNA topoisomerasi I
 MAK11 codifica per una proteina essenziale associata alla membrana
con pattern di sequenza β-transducin.
 MAK16 codifica per una proteina essenziale per l’uscita dalla fase G1
 La maggior parte degli altri geni MAK codificano per proteine
ribosomali e mutazioni in questi geni riducono il numero delle
subunità ribosomali 60S libere o indeboliscono l’associazione tra le
subunità ribosomali.
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Interazioni virus-ospite
 Mutazioni in tutti i sei geni SKI sopprimono le mutazioni mak.
 SKI2,3,6,7,e 8 sono richiesti per la repressione di poly-(A)-RNAs
mentre SKI1 (XRN1) codifica per una 5’-esoribonucleasi coinvolta
nella degradazione ed il turnover degli RNA.
 SKI2 codifica per una RNA elicasi della famiglia DEVH-box
 SKI3 codifica per una nucleoproteina
 SKI8 codifica per una proteina con domini β-transducin.
 Queste tre proteine potrebbero formare un complesso
(Ski2cp) che agisce da RNA elicasi e/o cofattore dell’esosoma
attraverso l’interazione con Ski7p.
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Interazioni virus-ospite
 La funzione precisa in vivo dei geni SKI in lievito e negli eucarioti
superiori è ancora controversa. Da una parte i geni SKI potrebbero
rappresentare un sistema di difesa antivirale la cui funzione principale
sarebbe quella di diminuire il numero delle copie dsRNA e reprimere
l’espressione dei non-poly(A)mRNAs, come quelli di L-A e M, che
mancano sia di 3’-poly(A) che di 5’ cap.
 D’altra parte, le proteine ski (come ski6/Rpr41) fanno parte
dell’esosoma e funzionano nella degradazione al 3’ degli mRNAs. Le
proteine Ski sono quindi parte di un sistema cellulare generale che
controlla la stabilità, la struttura e la degradazione degli mRNA.
 Nei mutanti ski, la perdita di queste funzioni determina un incremento
della produzione e secrezione di tossina che porta ad un fenotipo
superkiller, che ha dato il nome a questi geni.
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Modello per la funzione dei geni SKI
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Virus killer del lievito nonconvenzionale Kluyveromyces lactis
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 Tra i sistemi killer virali dei lieviti non convenzionali, il più
studiato è senza dubbio quello del lievito Kluyveromyces
lactis.
 In questo lievito il sistema killer è costituito da due
plasmidi lineari a DNA, k1 e k2, prevalentemente localizzati
nel citoplasma e presenti in un numero che varia tra le 50 e
le 100 copie per cellula. La eso-zimotossina prodotta dai
ceppi killer è in grado di inibire in modo irreversibile la
crescita di vari generi di lievito (incluso Saccharomyces)
tramite un blocco del pre-Start della fase G1.
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Virus killer del lievito nonconvenzionale Kluyveromyces lactis
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Le estremità del DNA presentano delle ripetizioni invertite
il cui 5’ è bloccato con una proteina attaccata ed
inaccessibile agli enzimi. Queste molecole lineari si replicano
attraverso un meccanismo di strand displacement tipico
degli adenovirus e batteriofagi a DNA F 29.
 Nel plasmide più grande k2, è presente una RNA polimerasi essenziale per
questo sistema che non ha accesso all’apparato trascrizionale nucleare. Per
questo motivo, il mantenimento di k1 dipende dalla presenza di k2. Inoltre,
questo sistema di trascrizione è specifico per i geni del plasmide lineare,
che hanno dei segnali di controllo propri costituito da una sequenza di 7
nucleotidi conservata (UCS).
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Virus killer del lievito nonconvenzionale Kluyveromyces lactis
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 Infatti, i geni nucleari non vengono riconosciuti da questo
sistema. Se si trasferiscono i geni dei plasmidi lineari su un
plasmide circolare, questi sono trascritti dal sistema
trascrizionale cromosomale in modo aberrante e solo a
basso livello; inoltre, il basso livello d’espressione è anche
dovuto ad un codon bias sfavorevole.
 Le subunità della tossina killer α, β e γ, come anche il
determinante di resistenza, sono codificate da k1. La
subunità α codifica per una chitinasi che aiuterebbe la
tossina nell’ingresso nella cellula bersaglio.
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Virus killer del lievito nonconvenzionale Kluyveromyces lactis
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 Come prima cosa è stato necessario inserire un marcatore
di selezione. A questo scopo sono state costruite fusioni
delle UCS con geni marker per lievito (per avere
un’espressione efficiente) e inserito delle sequenze
fiancheggianti omologhe a geni di k1 o k2. Con la tecnica del
gene replacement questi marcatori sono stati inseriti nel
gene strutturale per le subunità α, β. L’efficienza di
ricombinazione omologa è altissima (vicina al 100%). La
possibilità di manipolare geneticamente questi plasmidi è
interessante soprattutto per la produzione di proteine
eterologhe in questo lievito.
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 Nel corso degli ultimi venti anni, intensi studi del sistema killer
hanno apportato progressi sostanziali nella conoscenza in molti
campi della biologia, svelando aspetti importanti della biologia
cellulare degli eucarioti, delle interazioni virus-ospite e della
virologia dei lieviti.
 Inoltre, poiché le tossine killer assomigliano alle glicoproteine
secrete naturalmente, l’analisi dettagliata della produzione delle
tossine killer ha fornito nuovi modelli per delucidare i meccanismi di
processamento post-traduzionale delle pre-proteine nel pathway di
secrezione eucariotica. Infine, l’analisi delle tossine killer e il
meccanismo d’azione mediato dai recettori, ha fornito un mezzo per
investigare la struttura molecolare e l’assemblaggio in vivo della
parete cellulare di lieviti e funghi, fornendo quindi nuove
informazioni importanti per combattere infezioni causate da lieviti
patogeni quali Candida albicans e Sporothtrix schenkii.
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APPLICAZIONI
 Le tossine killer secrete e i lieviti killer hanno trovato varie applicazioni. Per
esempio, nell’industria alimentare e delle fermentazioni i lieviti killer sono
stati usati per combattere le contaminazioni da lievito selvatico che possono
avvenire durante la produzione di vino, birra e pane. I lieviti killer sono stati
usati anche come agenti di bio-controllo nella conservazione del cibo, nella
bio-tipizzazione di lieviti o funghi lievito-simile importanti in medicina in
quanto patogeni, nello sviluppo di nuovi antifungini per il trattamento di
infezioni a danno di animali o persone ed, infine, nel campo del la tecnologia
del DNA ricombinante.
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Lieviti killer nella
fermentazione del vino
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 Sono stati costruiti lieviti starter killer che si
sono dimostrati capaci di competere con altre
specie contaminanti quali Candida, Hanseniaspora,
Kloeckera e Pichia
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Tossine killer come antifungini
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 Proteine antifungine molti efficaci sono prodotte naturalmente da diversi tipi di
organismi quali batteri, funghi, insetti, invertebrati, vertebrati e piante. All’interno di
questo gruppo, le tossine killer secrete da lieviti non-Saccharomyces mostrano un largo
spettro di attività contro molti patogeni di uomo e piante.
 Nella ricerca per nuovi e più potenti antifungini, i componenti della parete cellulare di
funghi e lieviti rappresentato dei bersagli attraenti in quanto queste strutture non
sono presenti nelle cellule di mammifero. La parete cellulare di lievito consiste di uno
strato esterno di mannoproteine, uno scheletro di glucani formato da β-1,3- e β -1,6-Dglucani lineari e ramificati e chitina. Poiché ognuno di questi componenti funziona da
sito di legame primario e recettore per diverse tossine killer di lievito, la ricerca
medica è interessata alle tossine killer come nuovi antifungini.
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Tossine killer come antifungini
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 E’ stato dimostrato che le tossine secrete da vari ceppi di Hansenula non solo
si legano a componenti della parete, ma inibiscono la biosistesi dei β-1,3-Dglucani. Per questo motivo, le tossine killer potrebbero rappresentare per i
funghi quello che sono gli antibiotici diretti contro la parete cellulare dei
batteri.
 Il fatto che molte proteine killer di lievito esibiscano la loro citotossicità
solo in un ristretto range di pH ed a temperature comprese tra 20°C e 30°C,
ne fanno un prodotto non somministrabile per endovena, ma solo mediante un
trattamenti topico e quindi limitato al trattamento di lesioni superficiali.
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Espressione delle tossine killer
in piante transgeniche
 E’ stato inserito il gene che codifica per una
tossina killer del lievito Ustilago maydis nel
tabacco. Problemi di livello di espressione nel
caso di KP6, mente nel caso di KP4 si è ottenuta
una pianta resistente a funghi fitopatogeni.
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Secrezione di proteine eterologhe via i
segnali di secrezione e maturazione di
pptox
 S. cerevisiae e S. pombe, oltre a fornire un modello di cellula
eucariotica, sono stati utilizzati per la produzione di proteine
eterologhe in alternativa ai sistemi procariotici.
 Altri lieviti utilizzati a questo scopo sono: Pichia pastoris, Yarrowia
lipolytica, Hansenula polymorpha, e Kluyveromyces lactis.
 Le proteine che vengono secrete contengono una sequenza segnale posta
all’N-teminale che la dirige verso l’ingresso nel pathway di secrezione,
dove le tappe più critiche sono l’ingresso nel lume del RE e l’uscita dal
network del Golgi.
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Secrezione di proteine eterologhe via i
segnali di secrezione e maturazione di
pptox
 Durante gli ultimi dieci anni, un numero crescente di proteine di
secrezione di interesse medico e/o farmaceutico sono state espresse
come proteine extracellulari mediante il proprio segnale di secrezione o
quello derivato da invertasi, fosfatasi acida, a-factor, o dalla tossina del
killer di K. lactis (antitrombina III e albumina umana, α-amilasi di topo o
fosfatasi alcalina della placenta).
 E’ stato anche dimostrato che il segnale di secrezione e maturazione del
killer di S. cerevisiae K28 è funzionale nel lievito S. pombe e può essere
usato per dirigere la secrezione di proteine eterologhe.
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Uso dei segnali di secrezione e
maturazione di K28 per la produzione
di proteine eterologhe
In questo caso è stato usato il promotore del gene NMT1,
inducibile da tiamina
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Uso dei segnali di secrezione e
maturazione del killer di K. lactis per la
produzione di proteine eterologhe
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Uso lieviti killer nella
prevenzione del
deterioramento dei silage
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 I batteri acido lattici (LAB) sono gram + anaerobi facoltativi che
convertono più del 50% dello zucchero in acido lattico.
 Consistono di 12 generi tra i quali Lactobacillus, Streptococcus,
Lactococcus, Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc e
Bifidobacterium
 Il foraggio viene stoccato per l’inverno nei silage dove i LAB
effettuano una fermentazione in condizioni anaerobie.
 L’ ambiente anaerobio e acido (pH 4) mantengono i silage a lungo senza
avere contaminazioni
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Uso lieviti killer nella prevenzione del
deterioramento dei silage
 Non appena i silage sono esposti all’aria, avviene subito la
contaminazione da parte di lieviti dei generi Pichia e Candida, che
utilizzano l’acido lattico come substrato
 Questa contaminazione va evitata in quanto porta a malattie negli
animali che se ne cibano
 Per prevenire il deterioramento dei silage esistono varie tecniche:
l’inoculo con LAB (non efficiente per le condizioni di aerobiosi), il
trattamento con acido propionico (costoso, corrosivo e
relativamente inefficiente), l’uso di microrganismi che controllino il
processo di fermentazione.
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Uso lieviti killer nella prevenzione del
deterioramento dei silage
 Ceppi killer di S. cerevisiae e K. lactis hanno un largo spettro d’azione
verso i lieviti inquinanti.
 K. lactis ha il vantaggio di poter utilizzare il lattosio come fonte di
carbonio.
 Si può quindi pensare di inoculare il silage con un ceppo killer di K.
lactis in presenza di siero di latte (liofilizzato), uno scarto
dell’industria lattiero-casearia.
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Uso lieviti killer nella prevenzione del
deterioramento dei silage
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 PROBLEMA: anche il lievito killer può usare
l’acido lattico come substrato
 SOLUZIONE: costruzione di un lievito
ingegnerizzato che non è più in grado di
utilizzare l’acido lattico.
Disruption della fosfenolpiruvato
carbossichinasi (KlPCK1)
Pyruvate Carboxylase
PEP Carboxykinase
O!
O
C
O!
O
C
C
ATP ADP + Pi
C
CH3
HCO3!
GTP GDP
CO2
O
C
C
C
O
pyruvate
O
CH2
O
O!
O
!
oxaloacetate
OPO32!
CH2
PEP
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