Studio funzionale e farmacologico di mutazioni del canale al cloro

Research Day 2014
Dipartimento di Farmacia-Scienze del Farmaco
Sezione di Farmacologia
Studio funzionale e farmacologico di mutazioni
del canale al cloro hClC-1 identificate in
pazienti affetti da Miotonia Congenita
Bari, 28 Febbraio 2014
Concetta Altamura
Dottoranda
Miotonia Congenita
Gene
CLCN1
Canale al cloro ClC-1
Miotonia (rigidità muscolare) e
Ipertrofia
Assenza di distrofia
Frequenza: 1/30 000 nati
Inizio sintomi entro 10 anni
Canale hCLC-1
- Codificata dal gene CLCN1 sul cromosoma 7;
- Proteina-canale omodimerica di circa 990 aminoacidi
espressa soprattutto nel muscolo scheletrico;
- E’ un canale voltaggio dipendente;
Ruolo fisiologico del ClC-1
ClC 1
Stabilità del potenziale di
membrana
Ripolarizzazione al termine
del potenziale d’azione
Perdita di funzione
Ipereccitabilità del sarcolemma
Miotonia
Caratterizzazione funzionale e
farmacologica dei mutanti responsabili
di Miotonia Congenita
G355R
F167L
G190S
G284R
R105C
Y686X
A531V
P558S
Collaborazione con il Prof. A. Toscano (Dipartimento di Neuroscienze,
Psichiatria e Anestesia-Università di Messina-Messina)
Metodi
MUTAGENESI SITO-SPECIFICA
pRc/CMV hClC-1
TRASFEZIONE TRANSIENTE
EPPENDORF 1:
Vettore plasmidico
pRc/CMV hClC-1
mutato
Plasmide + cDNA
per CD8
Sperma di salmone
Soluzione CaCl2
Ab antiantiCD8
EPPENDORF 2:
soluzione
HEBS
Cellule tSA
(confluenza
del 4040-50 % )
Metodi
PATCH CLAMP
Caratterizzazione funzionale hClC-1
Riduzione
Riduzione dell’
dell’ampiezza della
corrente
hClChClC-1 A531V
Assenza
Assenza di corrente
hClChClC-1 G284R
hClChClC-1 Wild type
Alterazione
Alterazione della voltaggiovoltaggiodipendenza
hClChClC-1 G190S
Nessun
Nessun effetto
hClChClC-1 F167L
120
0
-200
-105
Caratterizzazione funzionale: Densità di corrente e Po
1500
Steady-State Current (pA/pF)
0
-500
-1000
F167L (n=36)
A531V (n=10)
G190S (n=15)
WT (n=15)
-1500
-200
-100
0
100
F167L (n=36)
A531V (n=10)
G190S (n=15)
WT (n=15)
1000
500
0
-500
-2000
-200
200
-100
0
100
Membrane Potential (mV)
Membrane Potential (mV)
F167L (n=36)
A531V (n=10)
G190S (n=15)
WT (n=15)
1.0
0.8
Apparent Po
Instantaneous Current (pA/pF)
500
0.6
0.4
0.2
0.0
-200
-100
0
100
Membrane Potential (mV)
200
200
I = N Po i
N= numero di canali
Po: probabilità
probabilità di apertura
i: permeabilità
permeabilità
A531V
A531V
- Riduzione della densità di
corrente
-Po simile a WT
G190S
G190S
R105C
R105C
G284R
G284R
G355R
G355R Nessuna corrente
Y686X
Y686X
- Shift della Po di 180-200 mV
G270V
G270V
- Shift della Po di 160-170 mV
P558S
P558S
- Ridotta densità di corrente
- Alterazione della voltaggio
dipendenza
F167L
F167L
T82A
T82A
R453W
R453W
Simili al WT
-Po simile al WT
-Densità di corrente in
basso Cl- inferiore al WT
Terapia nella MC
• Mexiletina ( 150-200 mg /1-4 volte al giorno)
Canali al sodio
ATTUALMENTE NON C’E’ ALCUN
FARMACO
CHE
AGISCE
SELETTIVAMENTE SUI CANALI
hClC-1 !!!
Aumento della corrente al ClEffetto indiretto mediato dalla
variazione del pH
Effetto dell’ACTZ sul canale al cloro mutato G190S
hClChClC-1 G190S
F167L (n=36)
A531V (n=10)
G190S (n=15)
WT (n=15)
1.0
Apparent Po
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-200
-100
0
100
Membrane Potential (mV)
200
Effects of acetazolamide on muscle membrane excitability
Icom
+
current
clamp
AD
-
KCitrate
Em
KCl
Two-intracellular microelectrodes
current-clamp
Unpublished results
increased resting chloride conductance
decreased excitability
•
•
Definire la relazione genotipogenotipo-fenotipo
in quelle mutazioni che non alterano le
correnti al cloro nel sistema di
espressione eterologa:
-Esperimenti di coco-trasfezione
-CoCo-espressione di mutazioni mediante
l’utilizzo di cDNA dimerico
-Saggi su biopsie muscolari dei pazienti
Identificare nuovi farmaci
– Attivatori
– Chaperone
Ringraziamenti
SEZIONE DI FARMACOLOGIA
• Prof. Jean-François Desaphy
• Dott. Gianluca Gramegna
• Dott.ssa Maria Maddalena
Dinardo
• Dott.ssa Paola Imbrici
• Dott.ssa Sabata Pierno
• Prof.ssa Diana Conte Camerino
UNIVERSITA’ CATTOLICA DEL S. CUORE
•Prof. Mauro LoMonaco
UNIVERSITA’ DI MESSINA
•Prof. Antonio Toscano