CRD nell`allergia al veleno di imenotteri: marcatori primari di

Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
CRD nell’allergia al veleno di imenotteri: marcatori primari di
sensibilizzazione ape/vespa (Rassegna)
Valerio Pravettoni, Laura Primavesi
Unità Operativa Complessa di Allergologia e Immunologia Clinica, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale
Maggiore Policlinico, Milano
PRINCIPALI INSETTI PUNGITORI
Gli insetti aculeati principalmente coinvolti in reazioni
allergiche appartengono al numerosissimo ordine degli
Imenotteri (dal greco ymèn, membrana, e pteròn, ala) al
cui interno sono presenti diverse superfamiglie e famiglie.
Tra esse le famiglie degli Apidi e dei Vespidi sono le più
importanti in Europa1,2 (Fig. 1).
Tra gli Apidi la specie più studiata è sicuramente quella delle api (Apis mellifera), che vivono in colonie socialmente organizzate e rappresentano insieme ai bombi i
principali insetti impollinatori. Morfologicamente l’ape e il
bombo sono simili: entrambi pelosi con striature tendenti
al marrone. I bombi però sono generalmente più grossi e
pelosi, con bande di colore più larghe di cui una distintiva
di colore più chiaro sull’addome. Caratteristica peculiare
dell’ape è quella di avere un pungiglione seghettato che si
infigge nella carne della vittima portando alla morte per
eviscerazione l’ape che, allontanandosi, lascia pungiglione e vescicola velenifera. Tale sacrificio porta però anche
alla liberazione di un ferormone di allarme che richiama
altre api. Il bombo, al contrario, presenta un pungiglione
liscio come quello dei Vespidi, pertanto la puntura non
porta l’insetto a morte.
All’interno della superfamiglia dei Vespidi si distinguono principalmente la famiglia dei Vespini e quella dei
Polistini, che morfologicamente si differenziano per
l’aspetto del torace e dell’addome e per la diversa giunzione tra le due parti.
Tali distinzioni sono utili per l’identificazione dell’insetto
pungitore, anche se la pratica ambulatoriale insegna che
molto spesso la vittima di un attacco, specie se con conse-
guenze serie, difficilmente ricorda l’aspetto dell’insetto. La
diagnosi più spesso si avvale di altre informazioni, che
distinguono i diversi insetti, e che il paziente può ricordare
più facilmente (distacco del pungiglione, luogo e ora dell’attacco, numero delle punture, posizione del nido, etc.).
ALLERGENI PRESENTI NEL VELENO DI
IMENOTTERI
I componenti del veleno degli Imenotteri in grado di
indurre una reazione allergica sono generalmente glicoproteine aventi peso molecolare compreso tra 10 e 50
kDa3. Molti di questi allergeni sono noti e sequenziati da
tempo, alcuni sono già presenti in forma ricombinante. La
Tabella 1 mostra i principali allergeni per alcuni dei più
comuni Imenotteri. È possibile notare come proteine omologhe siano presenti in veleni di specie diverse.
Gli allergeni principali del veleno di ape sono la fosfolipasi A2 (Api m 1), isolata ed identificata anche nel bombo
(Bom p 1, Bom t 1), la ialuronidasi e la fosfatasi acida. La
fosfolipasi A2 possiede una struttura pressoché identica tra
api di diverse specie, mentre tra i bombi esiste una variabilità maggiore. Gli omologhi dei due insetti presentano
un’identità di sequenza del 53%, sono pertanto possibili e
frequenti casi di sensibilizzazione ad entrambe4,5.
Gli allergeni maggiori dei Vespidi sono: la fosfolipasi
A1; la ialuronidasi, che presenta circa il 50% d’identità di
sequenza con il suo omologo degli Apidi1; l’antigene 5, che
è presente nel veleno di tutti i Vespidi. Generalmente i
fenomeni di cross-reattività tra Vespa, Vespula e
Dolichovespula sono molto frequenti, mentre è minore la
cross-reattività tra Polistini e Vespini. Tra i Polistini la
Figura 1
Schema tassonomico semplificato degli Imenotteri di maggiore rilevanza allergologica.
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Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
Tabella 1
Allergeni presenti nel veleno di alcuni Imenotteri, secondo la classificazione IUIS (International Union of Immunological Societies - Allergen
Nomenclature Sub-Committee, www.allergen.org).
Insetto pungitore
Apis mellifera
Polistes spp.
Vespula spp.
Allergene
Nome Biochimico
Peso molecolare (kDa) in SDS-PAGE
Api m 1
Fosfolipasi A2
16
Api m 2
Ialuronidasi
39
Api m 3
Fosfatasi acida
43
Api m 4
Mellitina
3
Api m 5
Dipeptil-peptidasi IV
100
Api m 6
"-"
8
Api m 7
CUB serin proteasi
39
Api m 8
Carbossilesterasi
70
Api m 9
Serin-carbossipeptidasi
60
Api m 10
Icarapina variante 2
50-55
Pol a 1 Pol d 1
Fosfolipasi A1
34
Pol a 1
Ialuronidasi
38
Pol d 4
Serin proteasi
33
Pol a 5 Pol d 5
Antigene 5
23
Ves v 1
Fosfolipasi A1
34
Ves v 2
Ialuronidasi
38
Ves v 3
Dipeptil-peptidasi IV
100
Ves v 5 Ves g 5
Antigene 5
23
Vesp c 1
Fosfolipasi A1
34
Vesp c5
Antigene 5
23
Vespa crabro
cross-reattività è frequente per le diverse specie europee,
mentre è minore tra queste ultime e le specie americane2.
DIAGNOSI
La prima parte della diagnosi prevede la raccolta dell’anamnesi, al duplice scopo di cercare di identificare l’insetto responsabile e di valutare la gravità dei sintomi. Il
medico dovrà cercare di inquadrare il più possibile la reazione allergica, ad esempio indagando l’orario, le condizioni climatiche, il numero di punture, il tempo d’insorgenza
dei sintomi, l’eventuale trattamento farmacologico adottato, la presenza di altre allergopatie, l’anamnesi di precedenti punture, ecc.
La sintomatologia più frequentemente riportata è la
reazione locale estesa, mentre le reazioni sistemiche coinvolgono fino al 5% della popolazione europea e del nord
America6. Le prime sono definite come gonfiore loco regionale maggiore di 10 cm di diametro che insorge poco dopo
la puntura. Le reazioni sistemiche prevedono il coinvolgimento dei diversi organi bersaglio dell’anafilassi, quali la
cute e le mucose, il sistema gastrointestinale, respiratorio,
cardiovascolare. Nel corso degli anni sono state proposte
diverse classificazioni, in funzione della gravità dei sintomi; la più utilizzata resta comunque quella di Mueller7 (Tab.
2).
Parallelamente all’indagine anamnestica sono di notevole utilità anche alcuni test diagnostici, in particolare test
cutanei e test in vitro, che devono essere eseguiti ad almeno due - tre settimane di distanza dalla puntura, per evitare esiti falsamente negativi (periodo refrattario). Tali test
generalmente possono essere dirimenti quando l’insetto
pungitore non è ben identificato dal paziente ed essere
dunque decisivi nella scelta del veleno con cui condurre
un’eventuale immunoterapia specifica. I test cutanei d’elezione sono quelli intradermici, molto più sensibili dei prick
test anche a basse concentrazioni.
Tabella 2
Classificazione delle reazioni sistemiche a veleno di Imenotteri secondo Mueller. (Da Rif. 4)
Grado
Sintomi
I
orticaria generalizzata, malessere, ansia
II
i sintomi precedenti più angioedema, nausea, vomito, diarrea, addominalgia, vertigine, costrizione toracica
III
i sintomi precedenti più dispnea, stridore raucedine e sibilo da edema laringeo, disartria, astenia, confusione mentale,
sensazione di “morte imminente”
IV
i sintomi precedenti più ipotensione o shock con perdita di coscienza, incontinenza sfinterica, cianosi
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Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
FENOMENI DI CROSS-REATTIVITA’ E
SENSIBILIZZAZIONE MULTIPLA
Una percentuale molto elevata, fino al 50%, di pazienti con allergia ad Imenotteri presenta test positivi sia per
ape sia per vespa6,8. Tale fenomeno può essere indicativo
di una doppia sensibilizzazione, che tuttavia appare realistica solo in pochi casi. Altre possibili spiegazioni possono
essere una cross-reattività dovuta ad omologie di sequenza tra allergeni di veleni diversi, ma, soprattutto, la presenza di catene laterali oligosaccaridiche legate a residui di
asparagina definite Cross-reactive Carbohydrate
Determinants (CCD). I CCD sono ubiquitari, si ritrovano
nei pollini, negli alimenti ed anche nel veleno di imenotteri
e sono in grado di legare le IgE mediante almeno due siti
di legame. Circa il 5% di soggetti non allergici possiede
IgE anti-CCD, mentre tale percentuale sale al 10-15% in
soggetti allergici al polline di graminacee e fino al 60% in
pazienti con multiple pollinosi. Circa un paziente su quattro con allergia al veleno di ape e circa uno su dieci con
allergia al veleno di vespula presenta valori positivi di IgE
anti-CCD6. Inoltre alcuni allergeni contenuti nel veleno
degli Imenotteri, quali la ialuronidasi e la fosfolipasi A2,
sono glicosilati. In particolare gli N-glicani della ialuronidasi sono stati caratterizzati mediante cromatografia
HPLC/spettrometria di massa, evidenziando al loro interno
un core α-1,3 fucosio, che rappresenta la struttura chiave
responsabile dell’allergenicità9. Può dunque essere utile
dosare le IgE specifiche verso allergeni contenti CCD,
come ad esempio l’estratto intero di polline di codolina
(Phleum pratense), di lattice, oppure l’epitopo glicosilato
MUXF3 della bromelina. Tuttavia una positività ai CCD
non può di per sé escludere una doppia sensibilizzazione,
in quanto alcuni pazienti possono possedere sia IgE contro tali molecole sia verso gli epitopi proteici allergenici
specifici di un dato veleno6. Allo stesso modo test negativi
per i CCD non confermano la doppia sensibilizzazione, in
quanto pazienti con bassi valori di IgE anti-CCD presenta-
no un dosaggio delle IgE negativo per la bromelina9.
Per individuare quale veleno abbia rilevanza clinica e
pertanto sia quello da utilizzare per l’immunoterapia specifica, la metodica di maggiore utilizzo è la RAST inibizione,
cioè il dosaggio delle IgE specifiche per un dato veleno
dopo preincubazione del siero con concentrazioni scalari
dei diversi veleni che hanno dato una positività in vitro, con
conseguente inibizione del legame antigene-anticorpo10.
Si ottengono così delle curve di inibizione che sono funzione della concentrazione del veleno inibente. Generalmente, valori di inibizione superiori al 70% vengono considerati indicativi di una cross-reattività marcata, mentre valori
inferiori al 25% escludono fenomeni di cross-reattività6.
Questo test comunque non può risolvere tutti i dubbi ed
inoltre scarsamente si adatta alla routine ambulatoriale in
quanto è costoso, laborioso e necessita di personale qualificato per la metodica e la refertazione.
COMPONENT RESOLVED DIAGNOSIS
Attualmente, i metodi “classici” di diagnosi allergologica utilizzano estratti naturali interi di veleno purificato, contenenti una miscela standardizzata a 100 μg/mL di componenti allergeniche. L’impiego di singoli allergeni ricombinanti, seppure con una sensibilità a volte inferiore, consente una specificità più elevata. Molti studi hanno infatti
rilevato come tali molecole abbiano una maggiore capacità di evidenziare sensibilità specifiche rispetto agli allergeni naturali purificati, che in ogni caso contengono impurità
più o meno consistenti di altri allergeni11.
La Component-Resolved Diagnosis (CRD) valuta la
positività anticorpale a singoli marcatori molecolari, consentendo una diagnosi altamente specifica e la definizione
per ciascun paziente di un profilo di reattività individuale,
distinguendo le molecole del singolo veleno realmente
coinvolte nella reazione allergica da quelle cross-reattive.
Al momento vari sono gli allergeni ottenuti in forma
ricombinante (Tab. 3), espressi in differenti organismi (E.
Tabella 3
Allergeni ricombinanti di Imenotteri. (Da Rif. 11 e 12)
Specie
Apis mellifera
Vespula vulgaris
D. maculata
Polistes annularis
P. dominulus
Solenopsis invicta
Allergene
Vettore di espressione
Api m 1 **
E. coli
Api m 2
E. coli / cellule infettate da Baculovirus
Api m 3
cellule infettate da Baculovirus
Ves v 1 *
E. coli
Ves v 2
E. coli
Ves v 5 *
E. coli /lievito
Dol m 1
E. coli
Dol m 2
E. coli
Dol m 5
E. coli
Pol a 5
E. coli / cellule infettate da Baculovirus
Pol d 5 *
procariota
Sol i 2
eucariota
Sol i 3
eucariota
**disponibile in commercio anche la molecola naturale glicosilata
* disponibile in commercio per diagnostica
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Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
coli, cellule infettate da Baculovirus, etc.)11,12. Studi comparativi sull’attività allergenica delle singole molecole naturali e ricombinanti hanno evidenziato come in alcuni casi il
vettore di espressione abbia un ruolo decisivo. Ad esempio la fosfolipasi di ape (PLA2) espressa in E. coli è deglicosilata; un recente studio ha dimostrato come le cutireazioni eseguite con nPLA2, rPLA2 e nPLA2 deglicosilata
diano risultati assolutamente comparabili. In questo caso
la glicosilazione, modifica post-trasduzionale della proteina non supportata da E. coli, ha poca importanza nel legame con le IgE. Al contrario, per la ialuronidasi di ape (HYA)
è stata necessaria l’espressione in un altro vettore (cellule
infettate da Baculovirus), affinchè avvenissero le corrette
modifiche post-trasduzionali in quanto la molecola rHYA
espressa in E. coli, non glicosilata, possedeva un’attività
allergenica molto inferiore (30%) rispetto al corrispettivo
naturale purificato13.
La possibilità di avere singole componenti allergeniche
pertanto comporta notevoli vantaggi, tra cui quello di attuare un’accurata scelta del veleno da utilizzare per l’immunoterapia specifica nei casi dubbi con doppia sensibilizzazione ape/vespa. Più che indagare molteplici allergeni è utile
testare molecole che rappresentino dei marcatori di sensibilizzazione per uno specifico veleno. Tali molecole dovranno dunque rispondere ad alcuni requisiti, soprattutto essere allergeni maggiori e specie-specifici, dunque strutturalmente poco simili ad altri allergeni di veleni diversi.
Per quanto riguarda i marcatori primari di sensibilizzazione ape/vespa, la HYA è stata a lungo considerata un
allergene maggiore dell’ape e della vespa, responsabile di
molte doppie positività, in quanto tra i due allergeni omologhi esiste il 50% di identità di sequenza.
Uno studio recentissimo9 ha tuttavia evidenziato come
il legame tra HYA e IgE specifiche sia in realtà dovuto ai
CCD, indagando la reale positività a tale allergene in soggetti allergici unicamente al veleno di Vespula (Yellow yacket, YJ) oppure aventi una doppia positività in vitro per ape
e Vespula. Tra i soggetti monosensibilizzati alla Vespula (n
= 31) solo un paziente ha legato YJ-HYA, a differenza dei
pazienti con doppia positività (n = 105), nei quali il legame
con YJ-HYA si è verificato nell’87% dei casi. Le inibizioni
condotte nello studio (n = 83) hanno inoltre evidenziato
che il 65% dei pazienti reagiva a YJ-HYA a seguito di legami con i CCD, il 27% marcava sia i CCD sia gli epitopi peptici di YJ-HYA e solamente l’8% reagiva unicamente al
peptide YJ-HYA. Tale studio, fortemente innovativo, ha
dunque rimodellato la funzione di YJ-HYA nell’allergia alla
Vespula, stabilendo come tale allergene possa essere
considerato un allergene minore, in quanto riconosciuto
solo dal 10-15% dei soggetti allergici. Al contrario l’antigene 5 (Ves v 5) e la fosfolipasi A1 (Ves v 1) sono stati riconosciuti da circa il 90% dei pazienti di entrambi i gruppi, ed
insieme hanno identificato il 97% dei pazienti realmente
sensibili a YJ. Jin e coll. concludono affermando che la
CRD svolta con l’antigene 5 (Ves v 5) e la fosfolipasi A1
(Ves v 1) è virtualmente in grado di identificare i pazienti
allergici al veleno di Vespula.
Un altro recente studio14 ha ribadito l’importanza dell’allergene Ves v 5, come marcatore specie-specifico nell’allergia al veleno di vespula. Tale allergene è stato infatti
riconosciuto dall’87% dei pazienti allergici al veleno di
vespula e solo dal 17% dei soggetti allergici all’ape. Gli
Autori hanno anche indagato la positività a rApi m 1 non
glicosilata, evidenziando come tale allergene sia riconosciuto dal 97% dei soggetti allergici all’ape e solo dal 17%
dei soggetti allergici alla vespula. Pertanto, rApi m 1 può
essere considerato marcatore primario di allergia al veleno di ape. La possibilità di poter indagare la positività alla
fosfolipasi A2 non glicosilata ha consentito di ovviare al
problema della positività in vitro dovuta ai CCD.
Attualmente in commercio è disponibile anche la fosfolipasi A2 naturale glicosilata (nApi m 1); la determinazione del
titolo di IgE specifiche verso entrambe le forme di tale
allergene è di sicuro aiuto nella valutazione di un legame
anticorpale verso la componente peptidica rispetto alla
componente glicosilata (CCD). Il gruppo di Müller ha inoltre evidenziato che una doppia positività ape/vespula in
vitro accade più frequentemente nei soggetti allergici
all’ape rispetto ai soggetti sensibilizzati alla vespula; probabilmente a causa della maggior glicosilazione degli
Figura 2
Component-Resolved Diagnosis: approccio diagnostico per l’identificazione dell’insetto responsabile.
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Component Resolved Diagnosis (CRD): l’utilizzo dei componenti molecolari nella diagnostica allergologica in vitro
allergeni maggiori dell’ape (fosfolipasi A2, ialuronidasi,
fosfatasi acida).
Nonostante lo studio partisse da due popolazioni (n =
100) selezionate di soggetti allergici all’ape o alla vespula,
numerose doppie positività sono state comunque riscontrate, di cui il 56% dovute ai CCD. Gli Autori concludono
che una doppia positività in vitro per Api m1 e Ves v5 indica una reale doppia sensibilizzazione clinica e, pertanto, la
necessità di una immunoterapia specifica con entrambi i
veleni.
Per distinguere una sensibilizzazione a polistini piuttosto che a vespule, è necessario ricordare come gli allergeni maggiori di questi due veleni sono, seppur omologhi,
notevolmente distanti a livello filogenetico15. Sembra possibile dunque stabilire la reale sensibilizzazione dosando
le IgE specifiche verso l’antigene 5 dei due veleni: Ves v 5
e Pol d 5.
In conclusione, la CRD applicata alla diagnostica allergologica per veleno di Imenotteri sembra virtualmente in
grado di risolvere in modo rapido ed efficace tutti quei casi
di multipla sensibilizzazione (Fig. 2):
• l’allergene non glicosilato rApi m 1, riconosciuto dal
97% dei soggetti allergici all’ape e dal 17% degli allergici alla Vespula, è il marcatore specie-specifico ideale
per l’allergia al veleno di ape;
• gli allergeni Ves v 1 e Ves v 5, identificati dal 97% dei
soggetti allergici alla Vespula, sono i marcatori primari
dell’allergia alla vespula;
• la determinazione delle IgE specifiche per allergeni
contenti N-glicani, quali la bromelina, MUXF3 (epitopo
glicosilato della bromelina) oppure nApi m 1, identifica
la presenza di anticorpi per i CCD, responsabili di circa
il 50% delle doppie positività in vitro per ape e Vespula.
4.
Stapel SO, Waanders-Lijster de Raadt J, van
Toorenenbergen AW, et al. Allergy to bumblebee
venom. II. IgE cross-reactivity between bumblebee and
honeybee venom. Allergy. 1998; 53: 769-77
5.
de Groot H. Allergy to bumblebees. Curr Opin Allergy
Clin Immunol 2006; 6: 294-7
6.
Jappe U, Raulf-Heimsoth M, Hoffmann M, et al. In
vitro hymenoptera venom allergy diagnosis: improved by
screening for cross-reactive carbohydrate determinants
and reciprocal inhibition. Allergy 2006; 61: 1220-9
7.
Mueller HL. Diagnosis and treatment of insect sensitivity. J Asthma Res 1966; 3: 331-3
8.
Hemmer W, Focke M, Kolarich D, et al. Antibody binding to venom carbohydrates is a frequent cause for double positivity to honeybee and yellow jacket venom in
patients with stinging-insect allergy. J Allergy Clin
Immunol 2001; 108: 1045-52
9.
Jin C, Focke M, Léonard R, et al. Reassessing the role
of hyaluronidase in yellow jacket venom allergy. J
Allergy Clin Immunol 2010; 125: 184-90
10.
Hamilton RG, Adkinson NF. 23. Clinical laboratory
assessment of IgE-dependent hypersensitivity. J Allergy
Clin Immunol 2003; 111: S687-701
11.
Müller UR. New developments in the diagnosis and treatment of hymenoptera venom allergy. Int Arch Allergy
Immunol 2001; 124: 447-53
12.
Müller UR. Recent developments and future strategies
for immunotherapy of insect allergy. Curr Opin Allergy
Clin Immunol 2003; 3: 299-303
13.
Müller UR. Recombinant Hymenoptera venom allergens. Allergy 2002; 57: 570-6
14.
Müller UR, Johansen N, Petersen AB, et al.
Hymenoptera venom allergy: analysis of double positivity to honey bee and Vespula venom by estimation of IgE
antibodies to species-specific major allergens APi m 1
and Ves v 5. Allergy 2009; 64: 543-8
15.
Hoffmann DR. Hymenoptera venom allergens. Clin Rev
Allergy Immunol 2006; 30: 109-28
BIBLIOGRAFIA
1.
Biló BM, Rueff F, Mosbech H, et al. Diagnosis of
Hymenoptera venom allergy. Allergy 2005; 60:1339-49
2.
Fernández J. Distribution of vespid in Europe. Curr
Opin Allergy Clin Immunol 2004; 4: 319-24
3.
King TP, Spangfort MD. Structure and biology of stinging insect venom allergens. Int Arch Allergy Immunol
2000; 123: 99-106
Per corrispondenza:
Dott. Valerio Pravettoni
UOC di Allergologia e Immunologia Clinica
Fondazione IRCCS Ca’ Granda
Ospedale Maggiore Policlinico
Via Pace 9 - 20122 Milano
Tel.: 0255036259 - Fax: 0255033122
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