ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΣΙΠΣ Εισηγητής: Σταυρακάκης Αντώνης
by user
Comments
Transcript
ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΣΙΠΣ Εισηγητής: Σταυρακάκης Αντώνης
Α. ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ Ι∆ΡΥΜΑ ΚΡΗΤΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΣΠΟΥ∆ΩΝ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΣΙΠΣ Εισηγητής: Σταυρακάκης Αντώνης 1 Σπουδάστρια: Μάλλιαρη Αικατερίνη Α. ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ Ι∆ΡΥΜΑ ΚΡΗΤΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ ΣΠΟΥ∆ΩΝ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΚΕΥΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΤΣΙΠΣ Εισηγητής: Σταυρακάκης Αντώνης Σπουδάστρια: Μάλλιαρη Αικατερίνη 2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Για την εκπόνηση της πτυχιακής εργασίας θα ήθελα να ευχαριστήσω, για τη συµβολή τους, τους: κ. Σταυρακάκη Αντώνη, καθηγητής κ. Παπαχατζάκη Γιάννη, συµφοιτητής κ. Εµµανουηλίδη Εµµανουήλ, φίλος 3 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ..............................................................................................................6 2. ΓΕΝΙΚΑ....................................................................................................................8 2.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ..............................................................................8 2.2 MEMS ΓΙΑ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ........................................................9 2.3 ΠΡΟΚΛΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΠΑΡΟΧΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ................................................10 2.4 ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ......................................................................................................13 3. ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ........................................................................................................14 3.1 ΦΩΤΟΛΙΘΟΓΡΑΦΙΑ........................................................................................14 3.1.1 Επεξεργασία Πυριτίου (Silicon Processing)................................................16 3.1.2 Απαλή Λιθογραφία (Soft Lithography) ........................................................17 3.2 ΜΙΚΡΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ..................................................................19 3.2.1 H Μικροµηχανική Όγκου (Bulk Micromachining) .....................................19 3.2.2 Στη Μικροµηχανική Επιφάνειας (surface micromachining) .......................19 3.2.3 Η Μικροδιαµόρφωση (micro molding) .......................................................19 4. ΜΙΚΡΟΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΟΧΗΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ...21 4.1 ΒΙΟΚΑΨΟΥΛΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΜΟΡΙΑ............................................................21 4.2 ΜΙΚΡΟΒΕΛΟΝΕΣ ............................................................................................23 4.3 ΕΜΦΥΤΕΥΟΜΕΝΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ...................................................25 4.4 ‘ΈΞΥΠΝΑ’ ΟΛΟΚΛΗΡΩΜΕΝΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ..............................27 4.5 ΕΜΠΟΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ............................................................................30 5. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ .......................................................................................................33 5.1 ΜΙΚΡΟΑΝΤΛΙΕΣ .............................................................................................33 5.2 ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ ............................................................................................35 5.2.1 Εισαγωγή .....................................................................................................35 5.2.2 Πιεζοηλεκτρικοί Βιοαισθητήρες: Ιστορικό ..................................................36 5.2.3 Τύποι Βιοαισθητήρων..................................................................................38 5.2.3.1 Ιατρικοί Τηλε-Αισθητήρες.........................................................................38 5.2.3.2 Μικροπρόβολοι ........................................................................................41 5.2.3.3 Βιοαισθητήρας Για Την Ανίχνευση Καρκίνου Και Άλλων Ανωµαλιών.....42 5.2.3.4 Αισθητήρας Ως Ηλεκτρονική Μύτη...........................................................43 5.2.3.5 Μικροσκοπικές Συσκευές .........................................................................44 5.2.4 Βιοαισθητήρες Στην Ανάλυση DΝΑ.............................................................46 5.3 ΕΜΦΥΤΕΥΟΜΕΝΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΓΙΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΚΑΙ ΝΕΥΡΙΚΗ ΑΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ..............................................................................53 5.3.1 Παρακολούθηση Πίεσης Αίµατος Και Εγκεφάλου .......................................53 5.3.2 Παρακολούθηση Ενδοφθάλµιας Πίεσης. .....................................................54 5.3.3 Λειτουργική Νευρική Αποκατάσταση ...........................................................55 5.3.4 Ένα Μικροσύστηµα Στο Μάτι......................................................................56 5.3.5 Κατανεµηµένα Εµφυτεύµατα Και Ευφυή Ηλεκτρόδια..................................58 5.3.6 Βιοϋβριδικά Συστήµατα...............................................................................59 6. ΣΥΝΕΝΩΜΕΝΑ ΖΩΝΤΑΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ..........................................................................................61 6.1 TΙ ΕΙΝΑΙ ΕΝΑ ΒΙΟΤΣΙΠ (BIOCHIP); .............................................................63 6.1.1 Συνοπτικά Παραδείγµατα ............................................................................64 4 6.2 ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΤΩΝ ΤΣΙΠ................................................................................66 6.3 ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ......................................................................................70 6.3.1 Εισαγωγή .....................................................................................................70 6.3.2 Νανοαντλίες Για Προγραµµατιζόµενα Βιοτσιπς ..........................................71 6.4 ΡΕΥΣΤΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ...........................................................72 6.4.1 ∆ισδιάστατη Ρευστοµηχανική ......................................................................72 6.4.2 Η Απώτερη Πλευρά Της Μικρορευστοµηχανικής Τεχνολογίας....................73 6.5 ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ ............................................................................................75 6.5.1 Τσιπ Για Τη Παρακολούθηση Κάθε Βήµατος Μας (Περπάτηµα) Και Των Σωµατικών Υγρών Μας........................................................................................75 6.5.2 Εγχείρηση Εγκεφάλου Με ∆ιακόπτη On-Off................................................78 6.5.3 Επαναφορά Των Αισθήσεων .......................................................................78 6.5.4 ∆ιάγνωση Πάνω Σε Τσιπ ............................................................................81 6.6 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΩΝ ∆ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΙΣΤΩΝ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΤΡΙΧΟΕΙ∆ΙΚΑ ΤΣΙΠ ..............................................................................................83 6.6.1 Η Ανάγκη Για Συστήµατα Βασισµένα Σε Ιστούς..........................................83 6.6.2 Χαρακτηρισµός Κυττάρων Χωρίς Επισήµανση (Marker-Free Cell Characterization).................................................................................................84 6.6.3 Ευπαθή Και Αναπαραγόµενη Μέτρηση Της Αντίστασης ..............................85 6.6.4 Σχεδιασµός Της Μέτρησης Των Τριχοειδικών Κυττάρων............................86 6.6.5 Αξιολόγηση Αντικαρκινικών Θεραπειών .....................................................86 6.7 DNA CHIPS.......................................................................................................88 6.7.1 Κατασκευή ...................................................................................................88 6.7.2 Χρήση Των Τσιπ ..........................................................................................89 6.7.3 Ιδιαιτερότητα Στις Ασθένειες .......................................................................90 6.7.4 Γονιδιακή Έκφραση.....................................................................................92 6.7.5 Σχεδιασµός Φαρµάκων ...............................................................................93 6.8 GENE CHIP .......................................................................................................93 6.8.1 Τεχνολογία Των Gene Chip.........................................................................95 6.8.2 Χρήση Των Βιοτσιπ Στην Εξέταση Του Καρκίνου .......................................96 6.8.3 Η Χρήση Των Gene Chips Σύντοµα Θα Είναι Καθολική ............................97 6.8.4 Τα Βιοτσιπ Προκαλούν Κρίσιµα Ζητήµατα Για Την Προσωπική Ζωή.........97 6.9 LAB ON A CHIP...............................................................................................98 6.10 VERICHIP .....................................................................................................101 6.10.1 Τι Είναι Το Verichip, Και Πώς Εισάγεται ...............................................101 6.10.2 Άλλες Χρήσεις Του VeriChip ..................................................................101 6.10.3 Τεχνολογία Του VeriChip ........................................................................102 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ................................................................................................105 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ .....................................................................................................107 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ...................................................................................................107 ΕΝΤΥΠΗ ...............................................................................................................108 5 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Σκοπός της πτυχιακής εργασίας είναι η ανάλυση του θέµατος: Ιατρικές µικροσυσκευές και Μικροτσίπς. Στο κεφάλαιο 2 περιγράφονται κάποια γενικά πράγµατα για τα µικροηλεκτροµηχανικά συστήµατα (MEMS). Πρώτα γίνεται µια ιστορική ανασκόπηση για το πώς έχει εξελιχτεί η τεχνολογία στα τελευταία χρόνια. Η τεχνολογία ακολουθεί πάντα τις ανάγκες της κοινωνίας και κάθε τόσο εφευρίσκονται προϊόντα, εργαλεία, και µέθοδοι καινούργιες ειδικά στη κατασκευή των βιοµηχανικών προϊόντων. Αναφέρονται επίσης κάποιες προκλήσεις που έχουν να αντιµετωπίσουν οι ερευνητές προκειµένου να εντάξουν τη λειτουργία των µικροηλεκτροµηχανικών συστηµάτων στον µακρόκοσµο και να µπορέσουν να τα χειριστούν. Στο κεφάλαιο 3 αναλύονται οι µέθοδοι κατασκευής των MEMS. Οι τεχνικές που χρησιµοποιούνται για τη δηµιουργία τους είναι οι ίδιες σχεδόν µε αυτές που χρησιµοποιούνται για την κατασκευή των υπολογιστικών τσιπ. Οι τεχνικές αυτές προέρχονται από τη µικροηλεκτρονική βιοµηχανία ηµιαγωγών. Η κατασκευή τους βασίζεται στη συγχώνευση των µικροηλεκτρονικών κατασκευαστικών επεξεργασιών και των µικροµηχανικών τεχνικών έτσι ώστε να δηµιουργηθούν τα επιθυµητά µικροεξαρτήµατα. Οι κύριες κατηγορίες είναι δύο: η φωτολιθογραφία και οι µικροµηχανικές τεχνικές. Σε αυτό το κεφάλαιο αναλύονται λοιπόν λεπτοµερειακά οι διάφορες τεχνικές κατασκευής και οι επιµέρους υποκατηγορίες στις οποίες χωρίζονται. Στο κεφάλαιο 4 αναλύονται διεξοδικά τα συστήµατα χορήγησης φαρµάκων. Περιγράφονται οι συσκευές των bioMEMS της τωρινής γενιάς που χρησιµοποιούνται στις εφαρµογές παροχής φαρµάκων. Ανάµεσα τους είναι συσκευές όπως βιοκάψουλες και µικροµόρια, µικροβελόνες, εµφυτευόµενα µικροσυστήµατα και ‘έξυπνα’ ολοκληρωµένα µικροσυστήµατα εκ των οποίων όλα αναλύονται λεπτοµερώς. Επίσης στο τέλος του κεφαλαίου αναφέρονται κάποιες εµπορικές εφαρµογές οι οποίες είναι είτε ήδη χρησιµοποιούνται είτε είναι ήδη σε εξέλιξη. Στο κεφάλαιο 5 περιγράφονται βασικές εφαρµογές των MEMS. Το σηµαντικότερο τµήµα του κεφαλαίου ανήκει στους βιοαισθητήρες. οι τύποι των βιοαισθητήρων που αναλύονται είναι οι πιεζοηλεκτρικοί, οι ιατρικοί τηλε-αισθητήρες, οι µικροπρόβολοι, καθώς και κάποια συστήµατα για την παρακολούθηση της πίεσης του αίµατος και του εγκεφάλου, και της ενδοφθάλµιας πίεσης. Επιπλέον γίνεται αναφορά σε κατανεµηµένα εµφυτεύµατα- ευφυή ηλεκτρόδια και σε βιοϋβριδικά συστήµατα. Αναλύονται επίσης διεξοδικά οι χρήσεις των βιοαισθητήρων όσον αφορά την ανίχνευση του καρκίνου και άλλων ανωµαλιών, και την ανάλυση του DNA. 6 Στο κεφάλαιο 6 γίνεται ανάλυση για τα βιοτσιπς. Εξηγείται τι είναι το βιοτσιπ και αρχικά αναφέρονται παραδείγµατα τέτοιων τσιπ. Έπειτα ακολουθεί µια µικρή αναφορά στη νανοτεχνολογία και αναλύεται πιο λεπτοµερώς η ρευστοµηχανική τεχνολογία. Και οι δύο παίζουν σηµαντικότατο ρόλο για την διαµόρφωση των βιοτσιπ. Ακολουθούν κάποια παραδείγµατα και στη συνέχεια οι κυριότερες κατηγορίες των βιοτσιπ, η κάθε µια ανεπτυγµένη σε ξεχωριστή ενότητα. Τα κυριότερα βιοτσιπ που απασχολούν την ιατρική στις µέρες µας και που αναλύονται σε αυτό το κεφάλαιο είναι: το τριχοειδικό τσιπ, το DNA Chip, το Gene-Chip, το Lab-on-a-Chip και το VeriChip. Στο κεφάλαιο 7 αναφέρονται κάποια συµπεράσµατα που έχουν προκύψει από το σύνολο της πτυχιακής εργασίας. Στο κεφάλαιο 8 που είναι και το τελευταίο, αναφέρεται η βιβλιογραφία, έντυπη και ηλεκτρονική. 7 2. ΓΕΝΙΚΑ 2.1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Η τεχνολογία αυτές τις µέρες παρακολουθεί τις ανάγκες της κοινωνίας. Προϊόντα, εργαλεία και µέθοδοι εφευρίσκονται και τελειοποιούνται πριν πολύ συχνά µάθουµε την δυνατότητα εκµετάλλευσης τους. Αυτό είναι αλήθεια στα βιοµηχανικά προϊόντα, ειδικά στα ιατρικά προϊόντα. Οι ζωές εξαρτώνται από την συγκράτηση γερά δεµένων ανοχών σε µικρά όργανα. Από το 1960 οι επιστήµονες έχουν βρεί ότι διατάσσοντας ένα µεγάλο αριθµό µικροσκοπικών τρανζίστορ σε ένα µόνο τσιπάκι επέτρεπε την δηµιουργία µικροηλεκτρονικών κυκλωµάτων που ήταν µικρότερα, και περισσότερο λειτουργικά. Περισσότερο πρόσφατα, οι επιστήµονες έχουν χρησιµοποιήσει την ίδια θεωρία για να αναπτύξουν µικροκατασκευαστικές µεθόδους στο µικρό-επίπεδο, όχι τόσο µικρές όπως η νανοτεχνολογία (δισεκ. της µιας ίντσας) αλλά µικρότερες από τις ήδη συµβατικές και ταχείες υπάρχουσες. Τα Μικροηλεκτροµηχανικά Συστήµατα (MEMS) είναι ολοκληρωµένα συστήµατα που συνδυάζουν και ηλεκτρικά και µηχανικά εξαρτήµατα. Ανήκουν γενικά στη µικροσκοπική κλίµακα, αλλά µπορούν να είναι τόσο µεγάλα όσο µερικά χιλιοστά. Τα συστήµατα είναι κατασκευασµένα χρησιµοποιώντας τεχνολογίες ολοκληρωµένων κυκλωµάτων. Οι µηχανικές συσκευές απαιτούν τυπικά πιο πολύπλοκες µεθόδους από τις ηλεκτρικές. Έτσι υπάρχει µια συνεχή ανάγκη για µια δηµιουργική έρευνα σε µια προσπάθεια να ενσωµατωθούν και οι δύο τύποι εξαρτηµάτων. Από την στιγµή που τα MEMS είναι ένας σχετικά νέος τοµέας έρευνας, υπάρχει χώρος για αρκετή δηµιουργικότητα και ερευνητική προσπάθεια. Οι συσκευές MEMS µπορούν να χρησιµοποιηθούν σαν µικρογραφηµένοι αισθητήρες, ελεγκτές, ή ενεργοποιητές. Αλλά µέχρι τώρα υπάρχουν λίγες εφαρµογές στο εµπόριο. Μερικές που είναι αυτή την στιγµή στην αγορά είναι αισθητήρες πίεσης και ανιχνευτές συγκρούσεων (που χρησιµοποιούνται για την ανάπτυξη των αερόσακων). Πάντως υπάρχει ένα τεράστιο ποσό ερευνητικής προσπάθειας για να κάνει αυτούς τους τύπους των MEMS συσκευών διαθέσιµες για εµπορική χρήση: • Αισθητήρες: πίεσης, χηµικοί, κινήσεως, ροής υγρών και αερίων. • Αντλίες υγρών και βαλβίδες. • Μικρο-οπτική: οπτικούς ανιχνευτές και διατάξεις κατόπτρων. 8 Η χαµηλή τους µάζα και η γρήγορη τους απόκριση, τους δίνει ένα αισθητό πλεονέκτηµα για µια ποικιλία εφαρµογών όσον αφορά τα εµφυτευόµενα συστήµατα. Η µεγαλύτερη πρόκληση για την επιτυχή εµπορευµατοποίηση αυτής της επαναστατικής νέας τεχνολογίας είναι η αξιοπιστία και η ικανότητα ελέγχου της. Εικόνες 1,2,3: Φωτογραφίες µικροηλεκτροµηχανικών συσκευών. 2.2 MEMS ΓΙΑ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Τα µικροκατασκευαστικά συστήµατα λοιπόν, έχουν επιφέρει επανάσταση στη βιολογία και την ιατρική µε πολυάριθµες τεχνολογίες. Η πληθώρα των βιοϊατρικών µικροηλεκτροµηχανικών συστηµάτων (bioMEMS) που αναδύεται σήµερα κυµαίνεται από συναρπαστικούς µοριακούς κινητήρες που πλέουν µέσα στο κύτταρο αξιοποιώντας τα ενδοκυτταρικά πλούσια σε ενέργεια ATP µόρια µέχρι τις εξελιγµένες διαγνωστικές συσκευές, που είναι ικανές να προλέγουν την προδιάθεση του καθενός στις ασθένειες διαβάζοντας τις πληροφορίες που είναι κωδικογραφηµένες σε ένα µικρό τµήµα του DNA. Από συσκευές που κατευθύνουν µόρια σε συστήµατα που µπορούν να αναλύσουν ολόκληρη τη κυτταροπλασµατική περιεκτικότητα ενός ελεύθερου κυττάρου, Από εξαιρετικά ευαίσθητους αισθητήρες που µπορούν να ακολουθήσουν µαζικά ίχνη της τάξης του 10-18 µιας βιοχηµικής ουσίας µέχρι υψηλά ολοκληρωµένες µικροευµετάβλητες συσκευές που µπορούν να εκτελέσουν πολλαπλή σειριακή επεξεργασία σε δείγµατα έντασης εκατοµµυριοστά του λίτρου µε ένα αυτόµατο τρόπο. Με την επέλευση υπο- 9 εκατοµµυριοστόµετρων τεχνικών λιθογραφίας στη µικροηλεκτρονική βιοµηχανία, αυτές οι συσκευές bioMEMS θα βελτιώσουν την προσαρµοστικότητα, την αποδοτικότητα και την φιλικότητα τους προς τον χρήστη. Ένας από τους τοµείς όπου αυτές οι συσκευές προορίζονται να προσφέρουν οφέλη είναι η θεραπευτική. Γενικά το πεδίο των βιοϊατρικών εφαρµογών περιλαµβάνει διαγνωστικά όργανα, χειρουργικές διατάξεις ελέγχου ηλεκτρονικών συστηµάτων, τεχνητά όργανα και συσκευές παροχής φαρµάκων. ∆ύο πανταχού παρόν βιοϊατρικές συσκευές MEMS περιλαµβάνουν την αίσθηση της πίεσης και την επιτάχυνση. Τυπικά, το στοιχείο της αίσθησης αποτελείται από µια µικροµηχανική µεµβράνη, η οποία αποκλίνει σε αναλογία µε την µέτρηση. Ο βαθµός της παραµόρφωσης µετατρέπεται τότε σε ένα ηλεκτρονικό σήµα το οποίο έπειτα στέλνεται σε µια διάταξη κυκλωµάτων µικροεπεξεργασίας για περαιτέρω επεξεργασία ή απεικόνιση. Η πιο σηµαντική βιοϊατρική εφαρµογή για αισθητήρες πίεσης MEMS είναι η µέτρηση της πίεσης του αίµατος. Σε µια εφαρµογή ενός εξωτερικού καταγραφικού συστήµατος της πίεσης του αίµατος, ο αισθητήρας πιέσεως είναι ένα ενιαίο και αναπόσπαστο κοµµάτι ενός οργάνου που αποτελείται από ένα σωλήνα αλατούχου διαλύµατος, µε τον οποίο επισυνάπτεται ο αισθητήρας. Τα συστατικά στοιχεία συνδέονται τότε µε τον ασθενή για να παρέχουν σήµατα σε µια οθόνη. Υγρά περνούν από τον σωλήνα στον ασθενή και όταν η καρδιά χτυπάει, ένα κύµα πιέσεως κινείται κατά πάνω στη γραµµή κίνησης του υγρού και ανιχνεύεται από τον αισθητήρα. Σε άλλες εφαρµογές, ειδικά όταν η πίεση του αίµατος πρέπει να µετρηθεί εσωτερικά, το στοιχείο της αίσθησης επιστρώνεται µε ένα αδρανές τζέλ το οποίο µεταβιβάζει το σήµα πιέσεως, αλλά αποφεύγει την άµεση επαφή µεταξύ της συσκευής MEMS και των σωµατικών υγρών και ιστών. 2.3 ΠΡΟΚΛΗΣΕΙΣ ΣΤΗ ΠΑΡΟΧΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Οι µοντέρνες θεραπευτικές τεχνικές βασίζονται στο λογικό σχεδιασµό και στην υψηλής εστίασης χορήγηση συγκεκριµένων φαρµακευτικών συστατικών. Ενώ αυτές οι τεχνικές έχουν αποδειχτεί να είναι πολύ περισσότερο ανώτερες και αποτελεσµατικές απ’ ότι οι παραδοσιακές θεραπευτικές µέθοδοι που χρησιµοποιούν κοκτέιλ φαρµάκων, απαιτείται µια πιο διεξοδική προσπάθεια στο σχεδιασµό φαρµάκων, στο τοξικολογικό έλεγχο και στην επιλογή των κατάλληλων φορέων παροχής. Οι πρόοδοι στη µικροκατασκευή και στη βιοπληροφορική έχουν επιταχύνει σε µεγάλο βαθµό την εξέλιξη της χορήγησης 10 φαρµάκων τα τελευταία χρόνια εκσυγχρονίζοντας την διαδικασία αναγνώρισης µορίων στόχων και των ανταγωνιστών τους. Η ανάλυση των δεδοµένων του γονιδιώµατος και του mRNA µπορεί να παρέχει ενδείξεις που θα βοηθούσαν να αναγνωρίσουµε τα βιολογικά µόρια που σχετίζονται µε µια συγκεκριµένη ασθένεια. Οι συνδυαστικές προσεγγίσεις συσχετιζόµενες µε υψηλής εξόδου µέσα προβολής όπως µικροσύνολα πεπτιδίων και πρωτεϊνών έχουν οδηγήσει σε ένα τεράστιο κύµα δεδοµένων για να βοηθήσουν στην αναγνώριση των στόχων. Από την στιγµή που προσδιοριστεί ο µοριακός στόχος, συµβατικοί οργανικοί φορείς που περιλαµβάνουν τριχοειδή ηλεκτροφόρηση, φασµατόµετρα µάζας και NMR µπορούν να χρησιµοποιηθούν για να διευκρινίσουν το δευτεροταγές σύµπλεγµα και τις τριτοταγείς δοµές που σχετίζονται µε τις πρωτεΐνες στόχους. Αυτές οι δοµικές πληροφορίες των στόχων µπορούν τότε να χρησιµοποιηθούν για την αναζήτηση µέσω του ηλεκτρονικού αρχείου γνωστών φαρµακευτικών µορίων ή θα µπορούσαν να συνδεθούν µε συνθετικές βιοχηµικές µεθόδους για το προσδιορισµό πιθανών θεραπευτικών ουσιών. Αυτά τα βήµατα, απαιτούν τεράστιες επενδύσεις κεφαλαίων, υποδοµή και υψηλά εκπαιδευµένο προσωπικό. Αυτές οι προσπάθειες ανακάλυψης φαρµάκων εστιάζονται γενικά στο προσδιορισµό ένα συγκεκριµένο ζεύγος φαρµάκου-στόχου και σπανίως περιλαµβάνει τις τοξικολογικές πληροφορίες στη διαδικασία έρευνας. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ένα επαρκές ποσό τοξικολογικών πληροφοριών δεν έχει ακόµα συλλεχθεί για φαρµακευτικές ουσίες που έχουν συντεθεί πρόσφατα, κάνοντας έτσι δύσκολη την επιλογή ενός κατάλληλου µέσου χορήγησης. Για παράδειγµα, τα κυτοτοξικά φάρµακα που ήδη χρησιµοποιήθηκαν για τη θεραπεία ασθενειών όπως ο καρκίνος και η νόσος HIV είναι πολύ αποδοτικά στη καταστροφή των εισβαλλόµενων ιών και των καρκινικών κυττάρων, αλλά επίσης έχουν βρεθεί να προκαλούν απόπτωση στα γειτονικά φυσιολογικά κύτταρα. Ακόµα και τα φάρµακα µε χαµηλότερα επίπεδα κυτοτοξικότητας συχνά πρέπει να λειτουργούν µέσα σε ένα στενό θεραπευτικό πλαίσιο µε σκοπό να διατηρήσουν τη βιοδιαθεσιµότητα µεταξύ µιας ελάχιστου λειτουργικού ορίου συγκέντρωσης και της κρίσιµης τοξικής συγκέντρωσης πάνω από την οποία θα µπορούσε να συµβεί µη αναστρέψιµη βλάβη στα λειτουργικά όργανα. Στο µοριακό επίπεδο, τα φαρµακευτικά µόρια συχνά κατέχουν µη συγκεκριµένη συνάφεια προς τους υποδοχείς στην κυτταρική επιφάνεια εκτός από αυτή των πρωτεϊνών στόχων, η οποία µπορεί να οδηγήσει σε ανεπιθύµητες παρενέργειες όπως στη περίπτωση των ηρεµιστικών φαρµάκων και των αναστολέων ισταµίνης. Επιπλέον, η συγκέντρωση που είναι απαραίτητη για να επιφέρει µια επιθυµητή θεραπευτική αντίδραση σε ένα 11 συγκεκριµένο φάρµακο µπορεί να ποικίλει µεταξύ των ατόµων κάνοντας το ζήτηµα ακόµα πιο προβληµατικό. Η σταθερότητα και η βιοδιαθεσιµότητα είναι επίσης σηµαντικοί συντελεστές στο σχεδιασµό των συστηµάτων χορήγησης φαρµάκων, ειδικά για τα πρωτεϊνικά φάρµακα. Τέτοια φάρµακα πάσχουν από έναν αριθµό περιορισµών περιλαµβάνοντας τη διάσπαση από πρωτεολυτικά ένζυµα, τις ανοσο-αντιδράσεις και την έλλειψη ευελιξίας για κατασκευαστικές τροποποιήσεις. Πρόσφατα, έχει υπάρξει ένα µεγάλο ενδιαφέρον στη γονιδιακή/DNA θεραπεία για την επεξεργασία αρκετών κληρονοµικών ανωµαλιών. Εντούτοις, όπως και οι πρωτεΐνες, το γυµνό DNA είναι εξαιρετικά ασταθές και συνεπώς πρέπει να ολοκληρωθεί γρήγορα στο γονιδίωµα του ξενιστή για να είναι δραστικό. Οι ιοί σαν ξενιστές έχουν αποδειχτεί να είναι από τις πιο επιτυχηµένες µεθόδους παροχής DNA στα κύτταρα ξενιστές, αν και ακόµα χρειάζεται να επιληφθούν πολλά ζητήµατα ασφάλειας. ∆ιάφοροι τρόποι χορήγησης περιλαµβάνοντας διαδερµικές και πνευµονικές πορείες το στοµατικό, τον ενδοφλέβιο, τις µπορούν να χρησιµοποιηθούν για να εξασφαλίσουν επαρκή βιοδιαθεσιµότητα. Ωστόσο, πολλά φάρµακα επίσης απαιτούν ένα πιο ελεγχόµενο και συνεχές προφίλ διάχυσης. Ένα συνηθισµένο παράδειγµα για αυτή την εκδοχή είναι το συµπλήρωµα ινσουλίνης που δίνεται ως ενδοφλέβιες ενέσεις σε ασθενείς που πάσχουν από διαβήτη Τύπου 1. Ιδανικά, το χορηγούµενο συµπλήρωµα ινσουλίνης θα πρέπει να µιµείται στενά το προφίλ απελευθέρωσης της ινσουλίνης από τα παγκρεατικά νησίδια. Συνδυασµοί πολλαπλών δόσεων και αντλίες συνεχούς έγχυσης έχουν χρησιµοποιηθεί για τη κατόρθωση αυτού του στόχου, αλλά υπήρξε µόνο περιορισµένη επιτυχία στην απόκτηση ενός υψηλά ελεγχόµενου επιπέδου απελευθέρωσης. Μια άλλη εφαρµογή που απαιτεί ένα µη γραµµικό προφίλ απελευθέρωσης φαρµάκου είναι η αναγέννηση ιστού σε θύµατα µε έντονη οργανική αποτυχία ή µερική οργανική απώλεια, όπου οι παράγοντες ανάπτυξης πρέπει να χορηγηθούν µε ακρίβεια µε σκοπό να προάγουν την ανάπτυξη και το πολλαπλασιασµό του γηγενή ιστού και , εάν είναι απαραίτητο, να διευκολύνουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων στο κατάλληλο κυτταρικό τύπο µε µια χρονικά εξαρτώµενη µέθοδο. Όλες αυτές οι µέθοδοι χορήγησης φαρµάκων που απαιτούν περιορισµούς µε υψηλή ιδιαιτερότητα, διασφαλίζουν κατάλληλη βιοδιαθεσιµότητα των λειτουργικών φαρµάκων. Πρόσφατες τεχνολογικές πρόοδοι αρχίζουν να επιτρέπουν την ανάπτυξη συσκευών που είναι αρκετά ισχυρές για να παρέχουν στο έπακρο δραστικά φάρµακα µε ένα ακριβώς ελεγχόµενο τρόπο. Αυτές οι συσκευές θα είναι επίσης αρκετά έξυπνες ώστε να ανταποκρίνονται στη συµπεριφορά του περιβαλλόµενου φυσιολογικού περιβάλλοντος, 12 και αρκετά συνεπτυγµένες ώστε να εφαρµόζουν µέσα στα αιµοφόρα αγγεία. Τέτοιες συσκευές εµπεριέχουν πολύπλοκα συµπλέγµατα µικροσκοπικής κλίµακας ρευστών και ηλεκτρονικών συστατικών ικανών να χειριστούν µε ένα ολοκληρωµένο τρόπο. Αυτή η νέα γενιά των καινοφανών συσκευών παροχής φαρµάκων οφείλει πολλά από την ανάπτυξη του στις προόδους στη µικροκατασκευαστική και µικροµηχανική τεχνολογία για τη κατασκευή των µικρορευστοµηχανικών συστηµάτων. 2.4 ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ Μια από τις µεγαλύτερες προκλήσεις στα ΜΕΜS είναι ο σχεδιασµός του πώς θα µπορέσει το µικροσύστηµα να µεταχειριστεί στο µακροσκοπικό κόσµο. Θα ήταν αντιπαραγωγικό και δύσκολο να µειώσουµε κλιµακωτά την εισροή ενέργειας στην κλίµακα των MEMS. Aς φανταστούµε ένα σύστηµα τροχαλίας που µεταφέρει ενέργεια από µια µακροσκοπική τροχαλία σε µια µικροσκοπική. Οι δυνάµεις που µπορεί να αντέξει η µεγαλύτερη τροχαλία είναι πολύ µεγαλύτερες από αυτές που µπορεί η µικρότερη. Σαν αποτέλεσµα, είναι απαραίτητο να εκµεταλλευτούµε άλλες φυσικές αρχές για να παρέχουµε ενέργεια. Οι ηλεκροµαγνητικές δυνάµεις χρησιµοποιούνται συχνά, καθώς ηλεκτρικά µονοπάτια µπορούν να σχεδιαστούν εντός του συστήµατος στο µικροσκοπικό επίπεδο και τότε να διαβαθµιστούν στο σηµείο που οι τάσεις µπορούν να εφαρµοστούν από ένα µακροσκοπικό ελεγκτή. Ένα παράδειγµα αυτού είναι η συνήθη χρήση των πιεζοηλεκτρικών υλικών στις συσκευές MEMS. Αυτά τα υλικά αλλάζουν µέγεθος όταν εφαρµόζεται µια τάση, ή δηµιουργούν µια τάση εάν κάπως µεταβληθεί µηχανικά το µέγεθος τους. Ένας ελάχιστου πλήθους σπειρών MEMS κινητήρας είναι ένα απλό παράδειγµα του πως µπορούν να χρησιµοποιηθούν τα πιεζοηλεκτρικά υλικά. Σε µια τέτοια συσκευή, το πιεζοηλεκτρικό υλικό είναι προσκολληµένο σε δύο ολισθηρές ηλεκτρικές επαφές. Οι επαφές περιορίζονται στην ολίσθηση σε µια µόνο διεύθυνση, διατηρώντας έτσι επανάληψη. Κάθε επαφή είναι επίσης ικανή να µπορεί να καθηλωθεί στο κύριο πλακίδιο χρησιµοποιώντας ηλεκτροστατικές δυνάµεις. Το πλακίδιο φέρει µερικό αµιγές ηλεκτρικό φορτίο- όταν το αντίθετο φορτίο εφαρµόζεται σε µια από τις επιφάνειες, η ελκτική δύναµη µεταξύ της επιφάνειας και του πλακιδίου είναι αρκετή για εµποδίσει την επιφάνεια να κινηθεί. Η βασική διαδικασία για ένα µόνο βήµα µπροστά είναι να ακινητοποιήσουµε τη µια επαφή, να εφαρµόσουµε µια τάση κατά πλάτος του υλικού, να καθηλώσουµε την δεύτερη επιφάνεια, να ¨ξεκλειδώσουµε¨ την πρώτη επαφή, και τότε να αποµακρύνουµε την τάση. 13 3. ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ Η κατασκευή των συσκευών MEMS βασίζεται στη συγχώνευση των µικροηλεκτρονικών µεθόδων κατασκευής (µικροκατασκευή) και των µικροµηχανικών τεχνικών για να δηµιουργήσουν τα επιθυµητά µικροκατασκευαστικά στοιχεία. Οι µικρορευστές συσκευές γενικά παράγονται χρησιµοποιώντας µικροµηχανικές τεχνικές προσαρµοσµένες σε πρότυπη τεχνολογία επεξεργασίας ηµιαγωγών. Αυτές οι τεχνικές βασίζονται στη φωτολιθογραφία σαν το κυριότερο µέσο µεταβίβασης µε ακρίβεια λεπτοµερών γνωρισµάτων στην επιφάνεια του επιθυµητού υποστρώµατος. 3.1 ΦΩΤΟΛΙΘΟΓΡΑΦΙΑ Η φωτολιθογραφία είναι µια από τις παλιότερες και απλούστερες µεθόδους κατασκευής MEMS. Το πρώτο βήµα είναι να συρρικνώσουµε µια εικόνα σε ένα εκµαγείο. Το εκµαγείο τοποθετείται σε ένα υλικό που είναι καλυµµένο µε ένα χηµικό που λέγεται φωτοαντιδραστικό υλικό. Όταν αυτά µαζί εκτεθούν στο φως, τα χαρακτηριστικά στην προσωπίδα εµποδίζουν το φως από το να φωτίσει το φωτοαντιδραστικό αποκάτω. Οι περιοχές που φωτίζονται από φως τροποποιούνται χηµικά. Το φωτοαντιδραστικό υλικό καλείται αρνητικό εάν οι τροποποιηµένες περιοχές έχουν ενισχυθεί και θετικό εάν έχουν εξασθενήσει. Οποιεσδήποτε περιοχές είναι πιο αδύναµες θα µεταφερθούν στην ακόλουθη κατεργασία. Τα χηµικά που χρησιµοποιούνται σε αυτή την επεξεργασία πρέπει να συνταιριάζουν µε τον τύπο του φωτοπαθές υλικού που χρησιµοποιήθηκε έτσι ώστε µόνο οι εκτεθειµένες (θετικό φωτοαντιδραστικό) ή οι µη εκτεθειµένες (αρνητικό φωτοαντιδραστικό) περιοχές να µεταφερθούν. Το φωτοπαθές υλικό που είναι ακόµα ενεργεί σαν µάσκα για το υλικό που βρίσκεται αποκάτω. Εάν το υλικό τοποθετηθεί σε οξύ, το οξύ θα διαβρώσει µόνο τις περιοχές που δεν έχουν προστατευτικό στρώµα αντίστασης. Αυτό καταλήγει σε δοµές που φτιάχνονται µε τον ίδιο τρόπο που ένα ς καλλιτέχνης φτιάχνει ένα άγαλµα από µάρµαρο- ξεκινώντας από ένα τεµάχιο στερεού υλικού, τα χαρακτηριστικά σχηµατίζονται σπάζοντας επιλεκτικά περιοχές. Το φωτοπαθές υλικό είναι απλά ο οδηγός στο ποιες περιοχές θα αποµακρυνθούν. 14 Τα χαρακτηριστικά µπορούν να κατασκευαστούν στην αντίθετη κατεύθυνση εναποθέτοντας άλλο υλικό στην κορυφή του δείγµατος µετά αφού το φωτοαντιδραστικό έχει ήδη εκτεθεί στο φως. Εάν το φωτοαντιδραστικό µεταφερθεί, το εναποθετηµένο υλικό πηγαίνει µαζί του. Ωστόσο, στις περιοχές όπου το φωτοαντιδραστικό υλικό έχει ήδη αποµακρυνθεί από την αντίδραση µε το φως, το εναποθετηµένο υλικό θα µείνει πίσω. Επιλέγοντας προσεκτικά τις εικόνες που θα εισχωρήσουν στο φωτοπαθές υλικό, οι µηχανικοί Εικόνα 4: Απεικόνιση µερικών τυπικών µικροµηχανικών µεθόδων. (Α) Η φωτολιθογραφία χρησιµοποιείται αρχικά για τη µεταφορά µιας διαµόρφωσης στην επιφάνεια ενός υποστρώµατος επιστρωµένου µε φωτοευαίσθητη αντίσταση. Έπειτα, η αναπτυσσόµενη µέθοδος αποµακρύνει επιλεκτικά το φωτοαντιδραστικό υλικό, κάτι που εξαρτάται από το εάν ή όχι έχει εκτεθεί στο φως. Τα επακόλουθα βήµατα συνίστανται είτε στην εναπόθεση είτε στην αποµάκρυνση υλικού στις διαµορφωµένες περιοχές, µετά αφού το υπόλοιπο φωτοαντιδραστικό υλικό έχει αφαιρεθεί. (Β) Οι συσκευές που είναι βασισµένες σε πολυµερή παράγονται γενικά χρησιµοποιώντας µια µέθοδο ‘απαλής λιθογραφίας’, στην οποία παράγεται αρχικά ένας ‘αφέντης’ που περιλαµβάνει την αρνητικά εικόνα των επιθυµητών δοµών χρησιµοποιώντας τις µικροµηχανικές τεχνικές που περιγράφονται στο (Α). Αυτός ο ‘αφέντης’ τότε εξυπηρετεί σαν καλούπι που χρησιµοποιείται επακόλουθα (και ξαναχρησιµοποιείται) για την παραγωγή πανοµοιότυπων καλουπιών του αρχικού σχεδίου. µπορούν να δηµιουργήσουν περίπλοκες δοµές σε µια πολύ µικρή κλίµακα. Η φωτολιθογραφία από µόνη της έχει πολλές προκλήσεις. Χρησιµοποιώντας οξύ για να δηµιουργηθούν οπές είναι σχετικά ανακριβές- είναι απλά θέµα έκθεσης του υλικού στο οξύ και προσπάθειας υπολογισµού του κατάλληλου ποσού του χρόνου που θα πάρει το οξύ για να κάνει µια οπή αναγκαίου βάθους. Επιπρόσθετα, οι τοίχοι µιας τέτοιας οπής είναι πιθανό να µην είναι οµαλοί, µειώνοντας έτσι την ακρίβεια της σχισµής. Υπάρχουν έµφυτα προβλήµατα εντός της διαδικασίας που µόνο επιδεινώνουν την ήδη δύσκολη πρόκληση της µετατροπής των δύο διαστατών εικόνων σε τρεις διαστατές µηχανικές δοµές. 15 Ενώ πολλές από τις µεθόδους δανείζονται απευθείας στοιχεία από την ήδη υπάρχουσα τεχνολογία κατασκευής ηµιαγωγών, τα συστήµατα µικρορευστοµηχανικής παρουσιάζουν έναν αριθµό δικών τους µοναδικών προκλήσεων κατασκευής. Για παράδειγµα, το µέγεθος της κλίµακας των δοµών που υποβάλλονται σε µηχανουργική επεξεργασία είναι της τάξεως δέκατα των µικρών, ενώ αυτών των ηµιαγωγών είναι τυπικά της τάξεως των µικρών ή µικρότερες. Η κατάθεση χοντρών στρωµάτων υλικού απαραίτητων για να κατασκευαστούν αυτές τις δοµές εισάγουν δυσκολίες στη διατήρηση της οµοιοµορφίας της επιφάνειας εγκαρσίως της συσκευής και του/ή wafer, ενώ η αποµάκρυνση µεγάλων ποσών υλικού απαιτεί την χρήση µεθόδων χαρακτικής που επιτρέπουν την άσκηση ικανού ελέγχου σε τέτοια χαρακτηριστικά όπως η επιφανειακή τραχύτητα. Οι µικροκατασκευαστικές τεχνικές απαιτούν επίσης ρευστές διατάξεις κυκλωµάτων (αντλίες, βαλβίδες κλπ) για την ακριβή µέτρηση και τον έλεγχο της κίνησης των υγρών εντός ενός µικροδιαυλικού δικτύου, καθώς και µιας αποτελεσµατικής διασυνδετικής διάταξης Η/Υ µε το εξωτερικό περιβάλλον. Η επιτυχηµένη µικροµηχανική µέθοδος µπορεί επίσης να εφαρµοστεί για την παραγωγή συσκευών που θα ενσωµατώνουν πολύπλοκες δοµές πολλαπλών στοιβάδων. 3.1.1 Επεξεργασία Πυριτίου (Silicon Processing) Αυτή η µέθοδος καθρεφτίζει στενά τη κατασκευή ηµιαγωγών κάνοντας χρήση συµβατικών υποστρωµάτων από πυρίτιο και γυαλί. Σε αυτές τις συσκευές, οι δίαυλοι των ρευστών διαµορφώνονται εντυπώνοντας κατευθείαν στο υπόστρωµα είτε µε εµβάπτιση σε χηµικό διάλυµα (υγρή χάραξη) είτε µε έκθεση σε χηµικά αντενεργό πλάσµα (ξηρή χάραξη). Εδώ, το καµουφλαρισµένο στρώµα εξυπηρετεί διπλό σκοπό: καθορισµού του σχήµατος που χαράζεται και προστασίας του υποστρώµατος από διάσπαση σε περιοχές που δεν πρέπει να χαρακτούν. Οι µέθοδοι ξηρής χάραξης είναι γενικά ικανές να παράγουν βαθύτερα χαρακτηριστικά µε µεγαλύτερη οµοιοµορφία, ωστόσο απαιτείται ειδικός εξοπλισµός. Οι συσκευές υβριδικού γυαλιού/ γυαλιού και πυριτίου/ µόνο γυαλιού, στις οποίες οι χαραγµένοι σε γυαλί δίαυλοι ρευστών συνενώνονται σε υπόστρωµα επίπεδου γυαλιού ή πυριτίου, έχουν χρησιµοποιηθεί ευρέως σε µια σειρά µικρορευστοµηχανικών εφαρµογών. Επειδή οι διατάξεις των ηλεκτρονικών εξαρτηµάτων (ηλεκτρόδια, θερµαντήρες, αισθητήρες πιέσεως, φωτοανιχνευτές κλπ) µπορούν εύκολα να διαµορφωθούν σε µια πυριτική επιφάνεια, οι συσκευές γυαλιού/ πυριτίου είναι κυρίως θελκτικές σε εφαρµογές που απαιτούν ολοκληρωµένες ρευστές και ηλεκτρονικές διατάξεις κυκλωµάτων. 16 3.1.2 Απαλή Λιθογραφία (Soft Lithography) Μια δεύτερη κατασκευαστική προσέγγιση συνεπάγεται τη χρήση τεχνικών διαµόρφωσης ή αποτύπωσης για την κατασκευή ρευστών διαύλων σε πολυµερή υποστρώµατα. Η ευρεία έλξη των συσκευών που βασίζονται στα πολυµερή είναι κατά µεγάλο µέρος συνέπεια της άνεσης µε την οποία τα ρευστά συστατικά στοιχεία µπορούν να κατασκευαστούν µε ελάχιστη χρήση εξειδικευµένου εξοπλισµού. Ένας συντελεστής κλειδί είναι ο προσδιορισµός των πολυµερών υλικών µε ιδιότητες κατάλληλες για βιοχηµικές εφαρµογές όπως η βιοσυµβατότητα, η ηλεκτρική ουδετερότητα, και η οπτική διαφάνεια σε επιθυµητά µήκη κύµατος. Ενώ έχει χρησιµοποιηθεί επιτυχώς ένας αριθµός υλικών για τη κατασκευή µικρορευστοµηχανικών συσκευών, το PDMS poly(dimethyl [silicone elastomer siloxane)] έχει αναδειχθεί ως το ένα από τα πιο ευρέως χρησιµοποιούµενα. Εικόνα 5 : Η χαρτογράφηση του DNA είναι µεταξύ των προγενέστερων τεχνολογιών για τα βιοτσιπ. Σε αυτές οι µέθοδοι εκτελούν ένα πολύπλοκο µοριακό και βιολογικό έργο. Σε αυτή την περίπτωση η ανάγνωση ενός αγνώστου διαστήµατος γενετικού κώδικα, γίνεται διαχωρίζοντας το έργο σε πειθαρχηµένα βήµατα υψηλής καταλληλότητας για αυτοµατισµούς σε ένα τσιπ παρόµοιο µε αυτά των υπολογιστών. Εδώ το άγνωστο διάστηµα διαχωρίζεται σε µονούς κλώνους, τα οποία µε τη σειρά τους ανασχηµατίζονται (από µια πολυµεράση) στην παρουσία τεσσάρων τύπων δοµηµένων καλουπιών διαµόρφωσης, ή βάσεων τεχνητού DNA, κάθε ένα από τα οποία θα µπλοκάρει την διαδικασία σε µια συγκεκριµένη βάση (A, T, G, ή C). Η προκύπτουσα συλλογή τεµαχίων ταξινοµούνται κατά µέγεθος σε ηλεκτρικό πεδίο (τζέλ ηλεκτροφόρηση) από τα οποία µπορεί να διαβαστεί η ακολουθία. Σύντοµα η ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA θα µπορεί να εκτελείται από µικρορευστοµηχανικά βιοτσιπς. 17 Η κατασκευή των συσκευών βασισµένων στα πολυµερή ξεκινά τυπικά µε την κατασκευή ενός ‘κύριου οδηγού’ που περιέχει µια αρνητική απεικόνιση των επιθυµητών δοµών και τελικά θα εξυπηρετήσει ως πατρόν για τη παραγωγή των τελικών µικρορευστοµηχανικών συσκευών. Οι κύριοι οδηγοί συνήθως κατασκευάζονται από πυρίτιο ή παχύ φωτοαντιδραστικό υλικό, και παράγονται χρησιµοποιώντας συµβατικές τεχνικές επεξεργασίας πυριτίου. Άπαξ και ο κύριος οδηγός κατασκευαστεί, µπορεί τότε να χρησιµοποιηθεί για τη παραγωγή συσκευών χρησιµοποιώντας είτε τη µέθοδο της απαλής λιθογραφίας βάση της οποίας µίγµα σιλικονούχας ρητίνης και ενός προϊόντος διασταύρωσης εκχύνονται πάνω στον οδηγό και αφήνονται να τον απαλλάξουν από επιβλαβή στοιχεία, είτε τη µέθοδο αποτύπωσης βάση της οποίας ο οδηγός πιέζεται σε µια λεπτή µεµβράνη πολυµερούς που έχει µαλακώσει µε θέρµανση κάτω από το σηµείο τήξης του. Οι συσκευές πολυµερών έχουν το πλεονέκτηµα της απλότητας και της σχετικά φθηνής κατασκευής αφότου ένας οδηγός µπορεί να χρησιµοποιηθεί κατ’ επανάληψη για τη παραγωγή πολλών συσκευών. Επιπρόσθετα, η έµφυτη µηχανική ευελιξία των δοµών PDMS µπορεί να τιθασευτεί για τη κατασκευή αντλιών και βαλβίδων που λειτουργούν προκαλώντας παραµορφώσεις στο ίδιο το υπόστρωµα τους. Παρά το µειωµένο κόστο τους, οι βασισµένες σε πολυµερή συσκευές προσφέρουν µόνο περιορισµένη ικανότητα για την εµφύτευση ηλεκτρονικών διατάξεων. Συνεπώς, οι συσκευές από πυρίτιο παραµένουν ελκυστική και εφικτή εναλλακτική λύση εξαιτίας της ικανότητας να ολοκληρώνουν ηλεκτρονικά εξαρτήµατα απευθείας µέσα σε µικρορευστοµηχανικά συστήµατα. Για παράδειγµα, αυτή η προσέγγιση έχει χρησιµοποιηθεί για τη κατασκευή µιας συσκευής ικανής να εκτελεί διεύρυνση του DNA ακολουθούµενη από ανάλυση των προϊόντων της αντίδρασης µε ηλεκτροφόρηση µε τζέλ χρησιµοποιώντας εµφυτευµένες φωτοανιχνευτικές ηλεκτρονικές διατάξεις κυκλωµάτων για την απεικόνιση των περιοχών που έχουν αλλάξει θέση. Επιπλέον, πολύ από το πρόσθετο κόστος και τη πολυπλοκότητα που σχετίζονται µε τις συσκευές από πυρίτιο µπορεί να αντισταθµιστεί από τα οικονοµικά της κλίµακας της µικροσκοπικοποίησης. Χρησιµοποιώντας φωτολιθογραφικές τεχνικές, το κόστος της κατασκευής παραµένει ουσιαστικά αµετάβλητο ασχέτως του αριθµού των συσκευών που παράγονται σε ένα µόνο wafer. Συνεπώς, µε ένα τρόπο εντελώς ανάλογο των αναπτύξεων στη βιοµηχανία ηµιαγωγών, η επαρκή µικροσκοπικοποίηση θα µπορούσε τελικά να αποφέρει συσκευές βιολογικής ανάλυσης αρκετά µικρές για να είναι φορητές, αλλά και αρκετά φθηνές για να είναι διαθέσιµες για χρήση. 18 3.2 ΜΙΚΡΟΜΗΧΑΝΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Υπάρχουν τρεις κύριες κατηγορίες µικροµηχανικής: η µικροµηχανική όγκου, η µικροµηχανική επιφάνειας και η µικροδιαµόρφωση. Οι συσκευές MEMS τυπικά κατασκευάζονται χρησιµοποιώντας µια ή συνδυασµό αυτών των τεχνικών. 3.2.1 H Μικροµηχανική Όγκου (Bulk Micromachining) καθορίζει την τεχνική στην οποία ο όγκος του πυριτιούχου υποστρώµατος εντυπώνεται για να αφήσει επιθυµητά µικροµηχανικά στοιχεία. Οι διεργασίες υγρής και ξηρής χαρακτικής χρησιµοποιούνται σε συνδυασµό µε κατάλληλα εκµαγεία και αναστολείς χαρακτικής για να δώσουν σχήµα σε µια ποικιλία µικροδοµικών συστατικών από υποστρώµατα πυριτίου και/ ή γυαλιού όπως δοκίδες, διαφράγµατα και ακροφύσια. Το διαµορφωµένο υπόστρωµα θα µπορούσε να σχηµατίσει τη συσκευή MEMS από µόνο του. Εναλλακτικά, δύο ή περισσότερα διαµορφωµένα υποστρώµατα θα µπορούσαν να συνενωθούν µαζί για να κατασκευάσουν πολύπλοκα τρισδιάστατα µικροδοµικά στοιχεία. 3.2.2 Στη Μικροµηχανική Επιφάνειας (surface micromachining) το υπόστρωµα χρησιµοποιείται πρωτίστως σαν µηχανικό στήριγµα πάνω στο οποίο, εναλλακτικά στρώµατα δοµικών υλικών εναποθέτονται και διαµορφώνονται για να καταλάβουν µικροµηχανικές δοµές. Η µικροµηχανική επιφάνειας βασίζεται στη τοποθέτηση σε περίβληµα συγκεκριµένων τµηµάτων µιας συσκευής σε στοιβάδες ενός υλικού κατά την διάρκεια της διεργασίας κατασκευής. Το υλικό αυτό τότε διαλύεται σε µια χηµική ουσία που δεν προσβάλλει τα δοµικά τµήµατα για να πραγµατοποιήσει ελεύθερα συστατικά. Η µικροµηχανική επιφάνειας είναι υψηλά συµβατή µε µικροηλεκτρονικές κατασκευαστικές διαδικασίες και εξοπλισµό, και συνεπώς, επιτρέπει τη κατασκευή περίπλοκων, πολυσυστατικών, ολοκληρωµένων µικροµηχανικών δοµών που θα ήταν αδύνατες µε τη παραδοσιακή µικροµηχανική όγκου. 3.2.3 Η Μικροδιαµόρφωση (micro molding) αναφέρεται στη κατασκευή µικροδοµών χρησιµοποιώντας καλούπια για το προσδιορισµό της κατάθεσης του δοµικού στρώµατος. Μετά τη κατάθεση του δοµικού 19 στρώµατος, το καλούπι διαλύεται σε χηµική ουσία για να υλοποιήσει τα τελικά µικροκατασκευαστικά συστατικά. Το καλούπι µπορεί να πραγµατοποιηθεί χρησιµοποιώντας µια σειρά διεργασιών περιλαµβάνοντας τη λιθογραφία και τη χαρακτική. Μια ενδιαφέρουσα προσέγγιση για τη διαµόρφωση του καλουπιού χρησιµοποιεί υψηλής έντασης, χαµηλής απόκλισης, τραχείς ακτίνες X όπως η πηγή έκθεσης στη λιθογραφία. Αυτές οι ακτίνες Χ συνήθως παράγονται από ακτινοβολία σύγχροτρου για να σχεδιάσει πολυµεθυλµεθακρυλικά στρώµατα σε χαρακτηριστικά µε εξαιρετικά υψηλά κατά βάθος και πλάτος ποσοστά που δεν είναι πιθανό να χρησιµοποιήσουν οι συµβατικές µικροµηχανικές τεχνικές όγκου ή επιφάνειας. Μετά τη δηµιουργία του καλουπιού, οι είσοδοι στο σχήµα του καλουπιού επιµεταλλώνονται προνοµιακά µε µέταλλο (συνήθως νικέλιο ή χαλκό) για να αποδώσουν ένα υψηλής ακρίβειας συµπληρωµατικό αντίγραφο. Τελικά, το καλούπι διαλύεται για να αφήσει πίσω επιµεταλλωµένες µικροδοµές. Είναι επίσης πιθανό να χρησιµοποιηθούν οι επιµεταλλωµένες δοµές ως καλούπι για εύπλαστη διαµόρφωση εισαγωγής µε ψεκασµό (plastic injection molding) ή θερµή διακόσµηση µα ανάγλυφα (hot embossing). Μετά τη κούρα, το µεταλλικό καλούπι αποµακρύνεται αφήνοντας πίσω µικρο-αντίγραφα της αρχική µήτρας. 20 4. ΜΙΚΡΟΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΙΚΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΑΡΟΧΗΣ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Κατά την παρούσα περίοδο, αναπτύσσονται πολυάριθµα εξελιγµένα και δραστικά φάρµακα. Ωστόσο, οι συµβατικές µέθοδοι χορήγησης φαρµάκων έχουν περιορισµούς στην αποτελεσµατική χορήγηση αυτών των φαρµάκων στο ανθρώπινο σώµα. Για παράδειγµα, η στοµατική χορήγηση νέων πρωτεϊνούχων ή DNAούχων φαρµάκων δεν είναι γενικά εφικτή εξαιτίας της παραµόρφωσης των φαρµάκων στη γαστρεντερική οδό και στην εξουδετέρωση στο ήπαρ. Η συνηθισµένη εναλλακτική της στοµατικής χορήγησης, ενδοφλέβια ή ενδοµυϊκή ένεση, µπορεί να χορηγήσει αυτά τα φάρµακα σε µεγάλες ποσότητες, αλλά ο πόνος και ο τραυµατισµός των ιστών στους ασθενείς προκύπτουν συχνά από τη χρήση των βελόνων. Επιπλέον, η συµβατική ένεση είναι ανίκανη να παρέχει συνεχή απελευθέρωση, κάτι που µειώνει σε µεγάλο βαθµό τη δραστικότητα των φαρµάκων. Έχουν προταθεί πολλές θεωρήσεις για την αποτελεσµατική χορήγηση φαρµάκων στο ανθρώπινο σώµα. Αυτές οι νέες µέθοδοι µπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε τρεις κύριες οµάδες: 1) Βιοκάψουλες και µικροµόρια για ελεγχόµενη και/ ή ειδικής θέσης απελευθέρωσης φαρµάκων, 2) Μικροβελόνες για διαδερµική και ενδοφλέβια χορήγηση και 3) Εµφυτευόµενα µικροσυστήµατα. Τα µικροηλεκτρονικά µηχανικά συστήµατα (MEMS), ειδικά τα Bio-MEMS, έχουν βρεί πολυάριθµες εφαρµογές και στις τρεις οµάδες. 4.1 ΒΙΟΚΑΨΟΥΛΕΣ ΚΑΙ ΜΙΚΡΟΜΟΡΙΑ Οι βιοκάψουλες και τα µικροµόρια ερευνούνται έντονα ως νέα µέθοδος χορήγησης φαρµάκων. Με το να περιβάλλουµε τα φάρµακα µε κάψα σε βιοδιασπώµενο µικροσφαιρίδιο ή µικροµόριο, µπορεί να κατορθωθεί ένα προφίλ συνεχούς ή ελεγχόµενης απελευθέρωσης φαρµάκων. Η απελευθέρωση ειδικής θέσεως µπορεί να κατορθωθεί συνδέοντας υποκαταστάτες (ή συνδέτες: οργανικά µόρια τα οποία χορηγούν τα απαραίτητα ηλεκτρόνια για να σχηµατιστούν οµοιοπολικοί δεσµοί µε µεταλλικά ιόντα. Επίσης ιόντα ή µόρια τα οποία αντιδρούν για να σχηµατίσουν συµπλέγµατα µε άλλα µόρια) στην επιφάνεια των µικροµορίων µε σκοπό να στοχεύσουµε συγκεκριµένες θέσεις. Μέχρι τώρα, πολύ από την έρευνα που έχει διεξαχθεί σε αυτή τη περιοχή έχει 21 εστιαστεί στη αναζήτηση βιοδιασπώµενων και βιοσυµβατών πολυµερών υλικών για να δηµιουργηθούν τα µικροσφαιρίδια ή τα µικροµόρια. Η µικροκατασκευαστική τεχνολογία έχει χρησιµοποιηθεί πρόσφατα στη κατασκευή νανοπορώδων µεµβρανών για την Εικόνα 6 : Μια µικροκατασκευαστική βιοκάψουλα για in vivo έκκριση ινσουλίνης. περιβολή φαρµάκων µε κάψα, και µικροµορίων για ειδικής θέσεως στοµατική χορήγηση. Οι νανοπορώδεις µικροκατασκευής, όπως µεµβράνες παράγονται χρησιµοποιώντας τεχνολογία τη φωτολιθογραφία, εναποθέσεις λεπτών στοιβάδων και επιλεκτική χαρακτική, για τη δηµιουργία µεµβρανών που απαρτίζονται από πυρίτιο µε υψηλά οµοιόµορφους πόρους σε µέγεθος νανοµέτρων. Οι µικροκατασκευαστικές µεµβράνες παρέχουν αρκετά πλεονεκτήµατα υπέρ των πολυµερών υλικών: µικρότερο µέγεθος πόρων (10-100 nm εµβέλεια) , υψηλή οµοιοµορφία και λεπτότερο πάχος µεµβράνης. Επιπλέον, επειδή οι µεµβράνες µικροκατασκευής είναι κατασκευασµένες από πυρίτιο, είναι βιολογικά, χηµικά και µηχανικά σταθερές. Οι τεχνολογίες µικροµηχανικής επιφάνειας και όγκου (surface and bulk micromachining) ενσωµατώνονται στην επεξεργασία κατασκευής βιοκαψούλων, καταλήγοντας σε µεµβράνη διάχυσης µε οµοιόµορφου µεγέθους πόρων διανοµή καθώς και σε µηχανική και χηµική σταθερότητα, περιστοιχιζόµενη από ένα wafer που είναι 22 ανισοτροπικά χαραγµένο µε πυρίτιο, και που εξυπηρετεί σαν τη κοιλότητα που θα περιβληθεί από κάψα. Τα κύτταρα ινσουλινώµατος (συνήθως καλοήθης όγκος που όµως αποτελεί µια από τις κύριες αιτίες υπογλυκαιµίας) (4500 κύτταρα/ βιοκάψουλα) εσωκλείστηκαν µέσα σε αυτές τις βιοκάψουλες και απελευθερώθηκαν διαµέσου των ηµιπερατών νανοπορώδων µεµβρανών. Αυτή η έρευνα αποδεικνύει το εφικτό της χρησιµοποίησης µικροκατασκευαστικών βιοκάψουλων σαν εναλλακτική στις συµβατικές βιοκάψουλες βασισµένες στα πολυµερή, για πιθανή χρήση in vivo (εντός του ζώντος οργανισµού, σε φυσικό περιβάλλον) βιολογικού αντιδραστήρα κρυφής ινσουλίνης. Η µικροκατασκευαστική τεχνολογία έχει επίσης χρησιµοποιηθεί για τη δηµιουργία µικροµορίων για χορήγηση ειδικής θέσεως. Σε αντίθεση µε τα συµβατικά ιδιαίτερα συστήµατα χορήγησης φαρµάκων όπως τα πολυµερή µικροσφαιρίδια, τα µικροκατασκευαστικά µικροµόρια είναι λεπτές, σε σχήµα δίσκου δοµές. Αυτά τα µόρια µπορούν να σχεδιαστούν µε πάχος από 1-50 µm και διάµετρο από 1-100s µικρών. Τα µόρια µπορούν να σχεδιαστούν ασύµµετρα µε µόνο ένα ή πολλαπλά φαρµακευτικά αποθέµατα, και οι υποκαταστάτες που είναι δεσµευµένοι στη µια πλευρά µπορούν να στοχεύσουν συγκεκριµένες θέσεις. Τα µικροκατασκευαστικά µόρια µπορούν να συνδυάσουν εντερική ιστική επικάλυψη, βιοσυγκολλητικούς παράγοντες, ενισχυτική διείσδυση και ενζυµικούς αναστολείς σε µια µόνο πλατφόρµα παροχής φαρµάκων. Το µέγεθος και το σχήµα των µορίων µπορεί να ελεγχθεί εύκολα για να αποκτήσουµε ένα βέλτιστο προφίλ χορήγησης. Αυτές οι συσκευές είναι κατ’ εξοχήν αποτελεσµατικές για στοµατική χορήγηση πεπτιδικών και πρωτεϊνούχων φαρµάκων µέσα από το έντερο. 4.2 ΜΙΚΡΟΒΕΛΟΝΕΣ Η διαδερµική (δια µέσου του δέρµατος) χορήγηση φαρµάκων για παρατεταµένες περιόδους χρόνου είναι ένας βολικός, ελεγχόµενος τρόπος να παρέχουµε φαρµακευτική αγωγή. Συγκρινόµενη µε τη συµβατική στοµατική χορήγηση και ένεση, η διαδερµική χορήγηση φαρµάκων ξεπερνά τον περιορισµό της γαστρεντερικής παραµόρφωσης των φαρµάκων και εξαλείφει το πόνο και την ενόχληση της ενδοφλέβιας και ενδοµυϊκής ένεσης. Εντούτοις, η αποδοτικότητα της διαδερµικής χορήγησης φαρµάκων περιορίζεται σε µεγάλο βαθµό από τη χαµηλή διαπερατότητα του ανθρώπινου δέρµατος ειδικότερα τα εξωτερικά 10-20 µm του δέρµατος. Έχουν παρθεί µια σειρά από θεωρήσεις για την αύξηση του ρυθµού µεταφοράς κατά πλάτος του δέρµατος χρησιµοποιώντας, για παράδειγµα, χηµικές ενισχύσεις, ιοντοφόρηση (η εισαγωγή στο σώµα ιόντων διαλυτών αλάτων µε τη βοήθεια ηλεκτρικού ρεύµατος) ή υπέρηχους. 23 Μια καινοφανή προσέγγιση στη διαδερµική παροχή φαρµάκων χρησιµοποιεί µικροκατασκευαστικές διατάξεις µικροβελόνων οι οποίες είναι αρκετά µακριές και εύρωστες για να διαπεράσουν το εξωτερικό τµήµα του δέρµατος αλλά και αρκετά κοντές για να µην διεγείρουν τα νεύρα στους βαθύτερους ιστούς. ∆ιατάξεις από συµπαγείς µικροβελόνες από πυρίτιο µικροµηχανικής όγκου, κατασκευάστηκαν από µια µέθοδο χαρακτικής αντιδραστικών ιόντων και έδειξαν να αυξάνουν τη διαπερατότητα του δέρµατος για µια ποικοιλία από διάφορα µόρια κατ’ εντολήν των διαστάσεων. ∆ιατάξεις από κοίλες µικροβελόνες κατασκευάστηκαν επίσης χρησιµοποιώντας βαθιά χαρακτική αντιδραστικών ιόντων για να σχηµατίσουν τη µονάδα έντασης φωτός της βελόνας, ακολουθούµενη από µια µέθοδο χαρακτικής αντιδραστικών ιόντων για το σχηµατισµό του κωνικού τοιχώµατος των µικροβελόνων. Αυτές οι κοίλες µικροβελόνες µπορούν να αυξήσουν τη διαπερατότητα του δέρµατος ακόµα παραπέρα από τις συµπαγής µικροβελόνες. Οι µικροβελόνες µπορούν επίσης να ενσωµατωθούν µε µικροαισθητήρες ή µικροενεργοποιητές για να σχηµατίσουν εξειδικευµένα συστήµατα παροχής φαρµάκων. Πρόσφατα γνωστοποιήθηκε µια φορητή συσκευή παροχής φαρµάκων µε ενσωµατωµένες µικροβελόνες και µια µικροαντλία θετικής µετατόπισης µε MEMS τσιπ, για εφαρµογές συνεχούς χορήγησης φαρµάκων. Οι µικροβελόνες έχουν κατασκευαστεί χρησιµοποιώντας µια µέθοδο πολυπυριτικής διαµόρφωσης (polysilicon micromolding method). Η παραγωγή και η καθίζηση θερµικά παραγόµενων φυσαλίδων µε ροή που διορθώνεται από βαλβίδες κατευθυντήριου ελέγχου, χρησιµοποιούνται για τη κατόρθωση δικτύου αντλιών. Λήφθηκαν ρυθµοί ροής νερού κατά προσέγγιση 1.0 nl/s και κατορθώθηκε συνεχής άντληση για περισσότερες από 6 h. Άλλο ένα παράδειγµα είναι ένας πολυδιαυλικός καθετήρας από πυρίτιο για τη χορήγηση πολύ µικρών και επακριβών ποσών βιοενεργών συστατικών σε υψηλά εντοπισµένες περιοχές νευρικού ιστού ενώ ταυτόχρονα καταγράφονται ηλεκτρικά σήµατα από τους νευρώνες και διεγείρονται ηλεκτρικά οι νευρώνες in vivo. 24 Εικόνα 7: Μικροµηχανικός καθετήρας φαρµακευτικής χορήγησης νευρικού ιστού. Αριστερά: Σκίτσο ενός καθετήρα που διαθέτει τρία κανάλια χορήγησης µαζί µε καταγραφικά και διεγερτικά ηλεκτρόδια. ∆εξιά: Οπτική εικόνα ενός τέτοιου καθετήρα. Οι πολυδιαυλικοί νευρικοί καθετήρες έχουν υποβληθεί σε µικροµηχανουργική επεξεργασία µε πυρίτιο, χρησιµοποιώντας µια σειρά οξειδώσεων, διαχύσεων µε βόριο, και βήµατα υγρής χαρακτικής. Έχουν επίσης κατασκευαστεί ολοκληρωµένες συµπληρωµατικές µέταλλο-οξείδω-ηµιαγωγικές διατάξεις κυκλωµάτων (CMOS) και ηλεκτρόδια στο καθετήρα για νευρική διέγερση και καταγραφή. Μια πιο εξειδικευµένη συσκευή χορήγησης φαρµάκων που περιέχει ενσωµατωµένους µικροδιαύλους, καλώδια ρευστών, διηλεκτρικούς φράκτες πάνω στα στόµια των ενέσεων, και κινητά ροόµετρα για να επιβεβαιώνουν την προοριζόµενη δόση, µαζί µε τις ηλεκτρικές διατάξεις κυκλωµάτων καταγραφής και διέγερσης, µπορεί να κατορθώσει χρόνιες in vivo χορηγήσεις φαρµάκων στα νευρικά κύτταρα. 4.3 ΕΜΦΥΤΕΥΟΜΕΝΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ Οι εµφυτευόµενες συσκευές προτιµούνται για θεραπείες που απαιτούν πολλές ενέσεις καθηµερινά ή εβδοµαδιαία. Μπορούν είτε να εµφυτευτούν στο ανθρώπινο σώµα ή να τοποθετηθούν κάτω από το δέρµα, µειώνοντας συνεπώς το κίνδυνο µόλυνσης εξαλείφοντας την ανάγκη για συχνές ενέσεις. Τα περισσότερα εµφυτευόµενα µικροσυστήµατα δεν προκαλούν πόνο ή τραυµατισµό των ιστών εξαιτίας του µικρού τους µεγέθους και είναι συχνά ουσιαστικά αόρατα. Εκτός του ότι µειώνουν τον αριθµό των ενέσεων, τα εµφυτευόµενα συστήµατα χορήγησης φαρµάκων έχουν το πλεονέκτηµα ότι το επίπεδο της δόσης µπορεί να ρυθµιστεί µε ακρίβεια σύµφωνα µε τη θεραπεία και τις ειδικές ανάγκες του ασθενούς, κάτι που οφείλεται στην ελεγχόµενη φύση αυτών των 25 συσκευών. Τα συστήµατα MEMS συνδυάζουν το µικρό µέγεθος, τις χαµηλές ενεργειακές απαιτήσεις, και τη δυνατότητα της ακριβούς µέτρησης των υγρών δειγµάτων, όλα από τα οποία διευκολύνουν την εµφύτευση. Για αυτούς τους λόγους, τα µικροσυστήµατα που είναι βασισµένα στα MEMS ελκύουν τους υποψήφιους σαν Εικόνα 8: Ένα σταθερής κατάστασης πυριτιούχο µικροτσίπ για ελεγχόµενη απελευθέρωση. εµφυτευόµενα συστήµατα χορήγησης φαρµάκων. Μια µέθοδος για τη κατόρθωση πολύπλοκων διατάξεων απελευθέρωσης φαρµάκων προϋποθέτει τη χρήση µικροκατασκευαστικής τεχνολογίας για την ανάπτυξη ενεργών εµφυτευµένων µικρορευστοµηχανικών συσκευών που ενσωµατώνουν µικροαντλίες, βαλβίδες και κανάλια ροής για τη παροχή υγρών διαλυµάτων. Ένα από τα συστατικά ‘κλειδιά’ σε αυτές τις συσκευές είναι το µικροσκοπικό σύστηµα παροχής υγρών ή η µικροαντλία. Είναι διαθέσιµες διάφορες µέθοδοι άντλησης, περιλαµβάνοντας ηλεκτροοσµωτική άντληση για ιοντικά υγρά, αντλίες θετικής µετατόπισης που χρησιµοποιούν πιεζοηλεκτρικά στοιχεία, και πνευµατικές επιφανειακής τάσης αντλίες που βασίζονται σε διεπιφάνειες κινητών αερίων-υγρών για τη µετατόπιση των υγρών. Έχουν επίσης ερευνηθεί και άλλες εµφυτευόµενες συσκευές παροχής φαρµάκων εκτός από ενεργές συσκευές µικρορευστοµηχανικής. Αναπτύχθηκε ένα µικροτσίπ από στερεό και συµπαγές πυρίτιο για ελεγχόµενη απελευθέρωση µιας µόνο ή πολλαπλών χηµικών ουσιών κατά απαίτηση. 26 Ο µηχανισµός διάχυσης βασίζεται στην ηλεκτροχηµική λύση µικρού πάχους, θετικού φορτίου, χρυσών µεµβρανών που καλύπτουν µικροδεξαµενές γεµάτες µε χηµικά σε στερεή, υγρή ή τζέλ µορφή. Μια επακόλουθη µικροκατασκευαστική διαδικασία που περιλαµβάνει φωτολιθογραφία, χηµική εναπόθεση ατµού (CVD), εξάτµιση ηλεκτρονίων µε δέσµη και χαρακτική αντενεργών ιόντων (RIE) έχει χρησιµοποιηθεί για τη δηµιουργία 34 µικροδεξαµενών σε ένα τσιπ, και κάθε µια καλύπτεται από µια µικρού πάχους χρυσή µεµβράνη που λειτουργούν ως άνοδοι. Η χρυσή µεµβράνη µπορεί να διαλυθεί όταν εφαρµοστεί µια επιθυµητή τάση, και το φάρµακο στο εσωτερικό της διαχυθεί έξω στο υγρό που την περιβάλλει. 4.4 ‘ΈΞΥΠΝΑ’ ΟΛΟΚΛΗΡΩΜΕΝΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ Με σκοπό την ενεργοποίηση της παροχής των φαρµακευτικών συστατικών ή διαλυµάτων από τις διάφορες συσκευές που περιγράφηκαν παραπάνω, πρέπει να ληφθεί από το σύστηµα ένα σήµα το οποίο θα πυροδοτήσει τη λειτουργία του. Στις περισσότερες συµβατικές συσκευές, το σήµα θέτεται σε εφαρµογή χειροκίνητα. Ωστόσο, µπορούν να αναπτυχθούν συσκευές που λειτουργούν χωρίς την ανθρώπινη παρέµβαση, ενσωµατώνοντας σε αυτές χηµικούς αισθητήρες. Αυτή η ιδιοµορφία είναι απαραίτητη µε σκοπό να κάνουµε τις συσκευές παροχής φαρµάκων πραγµατικά εύρωστες. Τα συστήµατα θα ήταν ικανά να παρακολουθούν τη φυσιολογική κατάσταση του ασθενούς και αρκετά ‘έξυπνα’ για να χορηγήσουν τον απαραίτητο συνδυασµό φαρµάκων για να αντιµετωπίσουν την ασθένεια οποιαδήποτε στιγµή. Αυτό σηµαίνει ότι το σύστηµα παροχής φαρµάκων θα είναι ικανό να: 1) παρακολουθεί τις φυσιολογικές συνθήκες µέσα στο σώµα του ασθενή και να τις µετατρέπει σε ηλεκτρονικά σήµατα µέσω φυσικών και χηµικών µορφοµετατροπέων, 2) λάβει τα ηλεκτρονικά σήµατα, να τα αναλύσει, και να κάνει τις κατάλληλες ρυθµίσεις ελέγχου µε τη βοήθεια µικροελεγκτών και 3) απελευθερώσει το κατάλληλο ποσό φαρµάκων µέσω µικροενεργοποιητών. Έτσι, τα µελλοντικά συστήµατα χορήγησης φαρµάκων µπορεί να περιέχουν όχι µόνο τα εξαρτήµατα µικροενεργοποιητών όπως είναι οι µικροαντλίες, οι µικροβαλβίδες και οι ρυθµιστές ροής, αλλά επίσης φυσικούς και χηµικούς µικροαισθητήρες, και ηλεκτρονικά ελέγχου. Χρειάζονται επίσης ηλεκτρικές διασυνδέσεις, καλώδια, και στοιχεία πακεταρίσµατος για να αποκτήσουµε ένα πλήρως λειτουργικό, αυτόµατο, αυτορυθµιζόµενο µικροσύστηµα. Όλα αυτά τα στοιχεία πρέπει να ενσωµατωθούν σε µια µικροσκοπική συσκευή έτσι ώστε να αυξηθεί η αξιοπιστία και να µειωθεί το κόστος. 27 Από αυτή την άποψη, η λειτουργική ενσωµάτωση θα µπορούσε να είναι µια από τις πιο σηµαντικές απαιτήσεις για τα µελλοντικά συστήµατα παροχής φαρµάκων. Παρόλο που δεν είναι πλήρως ολοκληρωµένες τέτοιες συσκευές, η τεχνολογία που απαιτείται για τη κατασκευή ενός τέτοιου συστήµατος υπάρχει. Είναι υπό µελέτη παρόµοιες τεχνολογίες για πολυάριθµες άλλες εφαρµογές των bioMEMS. Για παράδειγµα, έχει αναπτυχθεί ένα µικρορευστό σύστηµα για γρήγορη χορήγηση µικρών ποσοτήτων δείγµατος σε βιοαισθητήρες, οι οποίοι µπορούν να αναλύσουν δείγµατα τα οποία έχουν παρθεί από διογκωµένη ροή. Έχουν επίσης αναπτυχθεί άλλες µικρορευστές συσκευές ανοσοπροσδιορισµού µε την ικανότητα της αυτοβαθµονόµησης. Έχουν αναπτυχθεί δίκτυα ρευστών µε ενσωµατωµένους ηµιαγωγικούς ανιχνευτές/ εκποµπούς για φασµατοσκόπηση φθορισµού σε µικρές ποσότητες δειγµάτων. Επακόλουθα έχουν πραγµατοποιηθεί κυτταρική λύση, πολυσύνθετη ενίσχυση PCR και ηλεκτροφορητική ανάλυση σε µια ολοκληρωµένη µονολιθική συσκευή. Έχει ακόµα δηµιουργηθεί ένας µικροκατασκευαστικός ηλεκτροφορητικός βιοεπεξεργαστής για ολοκληρωµένη αφαλάτωση δείγµατος DNA, αποµάκρυνση ιχνών, προ-συγκέντρωση, και τριχοειδική ηλεκτροφορητική (CE) ανάλυση. Εκτός από αυτές τις απλές προσπάθειες στην ενσωµάτωση, συνδυάζονται περισσότερα στοιχεία σε υψηλά ολοκληρωµένα µικρορευστής φύσεως Μικροσυστήµατα ανάλυσης DNA. Αυτά τα µικρορευστοµηχανικά συστήµατα έχουν βρεί πολλές δυνητικές ιατρικές εφαρµογές στη κλινική διάγνωση, στον ανοσοπροσδιορισµό, στο διαχωρισµό και ανάλυση του DNA και των πρωτεϊνών, στο χειρισµό και καλλιέργεια των κυττάρων, και στη παροχή φαρµάκων. Αυτές οι ποικίλες εφαρµογές αντιπροσωπεύουν τα πολλά πλεονεκτήµατα της επεξεργασίας των ρευστών συστηµάτων σε µικρές διαστάσεις: ακριβείς ποσότητες υγρών µπορούν να κινηθούν γρήγορα και αποδοτικά, η χηµική ανάλυση είναι κατ’ εξοχήν επακριβής- που οφείλεται σε µικρής ποσότητας δείγµατα και ευαίσθητες µεθόδους ανίχνευσης, και οι διαδικασίες διάγνωσης και χορήγησης µπορούν συχνά να ενσωµατωθούν σε µια µόνο συσκευή. Το τελευταίο χαρακτηριστικό είναι ιδιαίτερα σηµαντικό για τη κατασκευή ενός πλήρως ολοκληρωµένου συστήµατος παροχής φαρµάκων. Ένα παράδειγµα τέτοιου ολοκληρωµένου συστήµατος χηµικής ανάλυσης φαίνεται στη παρακάτω εικόνα. 28 Εικόνα 9: Σχήµα µιας ολοκληρωµένης µικρορευστοµηχανικής συσκευής για ανάλυση DNA. Αυτού του είδους των µικροκατασκευαστικών συσκευών συχνά αναφέρονται σαν ‘Labon-a-Chip’ συσκευές από τη στιγµή που προφανώς περιέχουν τα περισσότερα από τα κύρια εξαρτήµατα ενός χηµικού ή βιοχηµικού εργαστηρίου σε ένα µόνο υπόστρωµα. Η συσκευή που φαίνεται στην εικόνα έχει περιοχές που µετράνε και αναµιγνύουν µε ακρίβεια δείγµατα σε µέγεθος νανολίτρων, κυκλοποιούν θερµικά χηµικές ουσίες, και διαχωρίζουν και εντοπίζουν τα προϊόντα αυτών των αντιδράσεων. Όλα αυτά τα στοιχεία τοποθετούνται µαζί σε µια συσκευή που έχει διαστάσεις σχεδόν 1 cm2 συνολικά, και οι συσκευές αυτές κατασκευάζονται χρησιµοποιώντας συµβατικές φωτολιθογραφικές και µικροµηχανικές τεχνικές. Η συσκευή µπορεί να διασυνδεθεί και να ελεγχθεί από προσωπικό υπολογιστή. Επίσης, αφού στο τσιπ χρησιµοποιούνται µόνο χαµηλές τάσεις, θα µπορούσε να λειτουργήσει µε µπαταρίες, κάτι που είναι αναγκαίο για φορητή, χειροκίνητη λειτουργία. Η συσκευή ‘Lab-on-a-Chip’ που περιγράφηκε παραπάνω είναι ιδιαίτερα σηµαντική και σχετική µε τα συστήµατα παροχής φαρµάκων επειδή είναι ένα πλήρες λειτουργικό παράδειγµα ενός συστήµατος µε ενεργητική ευαισθησία σε ένα τσιπ. Όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, η χηµική ευαισθησία είναι ζωτική για την ανάπτυξη ενός πολύπλοκου συστήµατος χορήγησης φαρµάκων ικανού για αυτορυθµιζόµενη, κατανοητική λειτουργία. Το τσιπ χρησιµοποιεί αισθητήρες θερµοκρασίας για κλειστού κυκλώµατος έλεγχο των θερµικών αντιδράσεων όπως είναι η αντίδραση διεύρυνσης της αλυσίδας της DNA πολυµεράσης (PCR), η οποία απαιτεί περιοδική επανάληψη της θερµοκρασίας µεταξύ θερµοκρασιών µετουσίωσης, αρχικής ανόπτησης, και παράτασης. Οι οπτικοί ανιχνευτές φθορισµού επίσης συµπεριλαµβάνονται στη συσκευή ευαισθησίας κλασµατικού µεγέθους αντιδραστικών προϊόντων. Εµφυτεύονται δίοδοι στο υπόστρωµα 29 από πυρίτιο και καλύπτονται µε φίλτρο παρεµβολής. Όταν συνδέονται µε µια διεγερτική πηγή, είναι ικανές να ανιχνεύσουν µετακινηµένες ζώνες του DNA κατά τη διάρκεια του ηλεκτροφορητικού διαχωρισµού στο τσιπ. Αυτά είναι µόνο δύο παραδείγµατα των τύπων της ευαισθησίας που µπορούν να εκτελεστούν σε µια µικροκατασκευαστική συσκευή. Έχει δηµοσιευτεί επιπρόσθετη έρευνα σε άλλους χηµικούς αισθητήρες όπως η ηλεκτροχηµική ανίχνευση πάνω σε τσιπ. Αυτές, και ίσως άλλες πιο εξειδικευµένες µέθοδοι χηµικής ευαισθησίας, µπορούν να ενσωµατωθούν στα µελλοντικά συστήµατα παροχής φαρµάκων. Πέρα από τη σπουδαιότητα µικρορευστοµηχανικής των εφαρµογών ευαισθησίας, τα συστήµατα θα βοηθήσουν στη προαγωγή της λειτουργικότητας των συστηµάτων χορήγησης φαρµάκων. Εκµεταλλεύοντας την ικανότητα της αποθήκευσης υγρών σε δεξαµενές στο τσιπ µέχρι να απαιτηθεί συνδυασµός αυτών, είναι πιθανό να κατορθώσουµε πολύπλοκα προφίλ φαρµακευτικής διάχυσης, συνδυασµούς χορήγησης και χηµικές αντιδράσεις. Η χορήγηση πολλαπλών διαλυµάτων χωρίς συνδυασµό είναι επίσης πιθανή χρησιµοποιώντας ελασµατικά συστήµατα ροής. Τα στοιχεία που χρησιµοποιούνται σε τυπικές ‘Lab-on-a-Chip’ και άλλες παρόµοιες µικρορευστοµηχανικές συσκευές µπορούν να συνδυαστούν για το σχεδιασµό άλλων πολύπλοκων ολοκληρωµένων ρευστών συστηµάτων για εφαρµογές όπως η παροχή φαρµάκων, όλα µέσα σε µια υπερ- συνεπτυγµένου µεγέθους συσκευή που να µπορεί να παραχθεί σε χαµηλό κόστος µονάδας. 4.5 ΕΜΠΟΡΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Οι συσκευές χορήγησης φαρµάκων του µέλλοντος παίρνουν µερικά σηµαντικά υποδείγµατα από τις ολοκληρωµένες συσκευές µικρορευστοµηχανικής. Αυτή η πρόκληση της ενσωµάτωσης ενεργών στοιχείων ευαισθησίας µέσα σε συνεπτυγµένα, χαµηλής ενέργειας µικρορευστοµηχανικά συστήµατα παροχής φαρµάκων είναι ένα από αυτά που έχει απήχηση στις εταιρίες βιοτεχνολογίας, οι οποίες ψάχνουν να αναπτύξουν αυτορυθµιζόµενα µικροσυστήµατα ως την απόλυτα θεραπευτική λύση στις χρόνιες ασθένειες όπως ο διαβήτης ή το HIV. Προς το παρόν είναι υπό εξέλιξη µια ολοκληρωµένη, αυτορυθµιζόµενη αντιδραστική θεραπευτική συσκευή. 30 Εικόνα 10: Ένα σχηµατικό αυτορυθµιζόµενης ανταπόκρισης θεραπευτικό σύστηµα ενός ChipRx’s. Περιγράφεται ότι διαθέτει πλήρως ενσωµατωµένα βιοαισθητήρες, ηλεκτρονική ανάδραση και διάχυση φαρµάκων/ αντιµέτρων. Αυτή η συσκευή έχει σχεδιαστεί για να ανιχνεύει τα φυσιολογικά επίπεδα των µεταβολιτών, όπως η γλυκόζη. Όταν εντοπίζεται µια µεταβολή, στέλνεται ένα σήµα από τον αισθητήρα στις µπαταρίες, οι οποίες εκπέµπουν ηλεκτρικό φορτίο. Το ηλεκτρικό φορτίο τότε πυροδοτεί το άνοιγµα ενός αντιδραστικού υλικού, που επιτρέπει τη διάχυση του επιθυµητού θεραπευτικού παράγοντα (πχ. ινσουλίνη) από τη δεξαµενή. Όταν τα επίπεδα της γλυκόζης επιστρέψουν στα φυσιολογικά, ο αισθητήρας σταµατά την απελευθέρωση του ηλεκτρικού φορτίου από τη µπαταρία, κλείνοντας τη δεξαµενή και εµποδίζοντας τη διάχυση περισσότερης ινσουλίνης. Αυτός ο τύπος της συνεχόµενης απάντησης, των ολοκληρωµένων συστηµάτων χορήγησης θα επιφέρει πραγµατικά επανάσταση στη περίθαλψη του καθενός ασθενή. Η συσκευή που περιγράφηκε παραπάνω αναπτύχθηκε για χρήση εξωτερικών και εµφυτευµένων συστηµάτων για τη παροχή πρωτεϊνών , ορµονών, φαρµακευτικής αγωγής κατά του πόνου, και άλλων φαρµακευτικών συστατικών. Ένα µεγάλο πλεονέκτηµα αυτής της προσέγγισης είναι η ικανότητα αποθήκευσης και απελευθέρωσης πολλαπλών φαρµάκων ή χηµικών από µια µόνο συσκευή. Με αυξηµένη ενσωµάτωση, αυτές οι συσκευές υπόσχονται την ανάπτυξη τους µέσα σε µια έξυπνη συσκευή. Συνδυάζοντας τους µηχανισµούς διάχυσης κάθε αισθητήρα, µπορούν να επιτευχθούν εάν χρειάζεται περίπλοκα χηµικά σχήµατα διάχυσης. 31 Οι ερευνητές επίσης σχεδιάζουν τεχνολογία µικροβελόνων µε συστήµατα µικρορευστοµηχανικής για τη παραγωγή ενός ελάχιστου επεµβατικού συστήµατος κατάλληλης φαρµακευτικής έγχυσης επόµενης γενιάς. Κατά προσέγγιση στις ίδιες διαστάσεις ενός ασηµένιου νοµίσµατος δολαρίου, αυτό το λειτουργικό σύστηµα θα αποτελείται από αναλώσιµο πολυµερές υλικό που θα περιέχει το θεραπευτικό µίγµα και τις µικροβελόνες που θα κρατιούνται στο δέρµα µε συγκολλητική ουσία. Μια επαναχρησιµοποιήσιµη µονάδα που θα περιέχει µικροκατασκευαστικά λογικά, µετρητικά και διαβιβαστικά κυκλώµατα µπορεί να διασυνδεθεί µε το αναλώσιµο στοιχείο για να σχηµατίσει ένα εντελώς ενιαίο σύστηµα χορήγησης. Ενώ οι περισσότερες συσκευές ρευστών βασίζονται σε αντλίες για τη παροχή των υγρών, αυτή η συσκευή περιλαµβάνει µια δεξαµενή ρυθµιζόµενης πίεσης που χρησιµοποιείται για τη κίνηση του διαλύµατος διαµέσου ενός κλειστού ρευστού δικτύου, µέχρι να συµβεί ένεση κατά πλάτος των στρωµάτων του δέρµατος. Επιπρόσθετα, ένα µετρητικό σύστηµα ενσωµατώνεται στα ρευστά συστατικά για να εξασφαλίσει ακριβή παροχή. Όπως οι ‘Lab-on-a-Chip’ συσκευές, έτσι και αυτή επιχειρεί να σχεδιάσει µικρορευστοµηχανικά συστήµατα για φαρµακευτική χορήγηση υψηλής ενσωµάτωσης. 32 5. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ 5.1 ΜΙΚΡΟΑΝΤΛΙΕΣ ∆ιεξάγεται µεγάλη έρευνα του πώς να δηµιουργήσουν µικροαντλίες MEMS. Το περίπλοκο αυτών των συσκευών διευκρινίζουν εύστοχα τις πολλές φυσικές αρχές που µπορούν να κληθούν για τον έλεγχο των µικροσυσκευών. Για παράδειγµα, οι µικροαντλίες ελέγχου-βαλβίδων βασίζονται στη χρησιµότητα του πιεζοηλεκτρικού υλικού, το οποίο διαµορφώνει έναν από τους τοίχους της κοιλότητας της αντλίας. Όταν εφαρµόζεται τάση, το υλικό διαστέλλεται , και κάµπτεται προς την εξωτερική επιφάνεια. Αυτό αυξάνει την δύναµη της κοιλότητας της αντλίας. Εάν η βαλβίδα εισόδου είναι ανοιχτή, η κοιλότητα θα ρουφήξει επιπρόσθετο υγρό ισάξιο της επιπλέον δύναµης της κοιλότητας (δύναµη της διαδροµής εµβόλου). Εάν η βαλβίδα εισόδου έπειτα κλειστεί, το επιπλέον υγρό θα εξαναγκαστεί να βγει έξω. Επαναλαµβάνοντας αυτή την διαδικασία σε µια υψηλή συχνότητα καταλήγουµε σε µια σχετικά οµαλή ροή διαµέσου της αντλίας. Οι συσκευές θερµοπνευµατικής αντλίας λειτουργούν µε την ίδια αρχή, αλλά χρησιµοποιούν θερµότητα για να ελέγξουν την αλλαγή της δύναµης στην κοιλότητα. Σε αυτή την περίπτψση, µια µεµβράνη τοποθετείται µεταξύ της κοιλότητας της αντλίας και µιας δεύτερης κοιλότητας που είναι εντελώς σφραγισµένη. Όταν θερµαίνεται, ο αέρας στην δεύτερη κοιλότητα διαστέλλεται, αναγκάζοντας την µεµβράνη να καµφθεί µέσα στην πρώτη κοιλότητα και να σπρώξει έξω µια δύναµη υγρού ισάξια µε την δύναµη της διαδροµής εµβόλου. Ελέγχοντας την ροή της θερµότητας διαµέσου της σφραγισµένης κοιλότητας η µικροαντλία µπορεί να ελεγχθεί εύκολα. Το πρωταρχικό µειονέκτηµα αυτών των συσκευών είναι ότι η θερµική ενέργεια είναι σχετικά δύσκολο να ελεγχθεί. Πολλαπλές συσκευές MEMS συχνά συσκευάζονται πολύ στενά µαζί σε µια κάψα πυριτίου. Σε αυτές τις περιπτώσεις, µπορεί να είναι δύσκολο να κρατηθεί η θερµότητα περιορισµένη σε µια ξεχωριστή συσκευή, και άλλες συσκευές ίσως να ενεργοποιηθούν ενώ δεν σκοπεύεται. Οι περιστροφικές αντλίες κάνουν χρήση των ηλεκτροµαγνητικών δυνάµεων για να παρέχουν την δύναµη της αντλίας. Όταν ένας µαγνήτης τοποθετείται σε ένα µαγνητικό πεδίο, το δικό του µαγνητικό πεδίο θα ευθυγραµµιστεί µε το εξωτερικό πεδίο. Μια µικροτουρµπίνα που συνάπτεται σε ένα τέτοιο µαγνητικό εξάρτηµα θα στραφεί εάν τοποτετηθεί σε ένα εναλλασσόµενο µαγνητικό πεδίο. Καθώς η τουρµπίνα θα στριφογυρίσει, τα πτερύγια της αναγκάζουν το υγρό να περάσει µέσα από τον αυλό µε τον ίδιο τρόπο που ένας ανεµιστήρας φυσάει τον αέρα. 33 Εικόνα 11: Μικροµηχανική πυριτιούχα πιεζοηλεκτρική µικροαντλία. Αριστερά: φωτογραφία του τσιπ µικροαντλίας. ∆εξιά: οπτική εικόνα SEM της µεµβράνης της µικροαντλίας. Οι αντλίες MEMS είναι ένα παράδειγµα τυπικού προβλήµατος µε τις συσκευές αυτές: προϋποθέτουν κινούµενα µέρη, τα οποία είναι ιδιαίτερα ευάλωτα στο σπάσιµο. Σε πολλές περιπτώσεις, η ιδανική λύση είναι αυτή στην οποία δεν θα είναι απαραίτητα κινούµενα µέρη. Οι ηλεκτροδυναµικές αντλίες µπορούν να χρησιµοποιηθούν µε διηλεκτρικά υγρά, υγρά που δεν άγουν την ηλεκτρική ενέργεια. Από την στιγµή που είναι κακοί αγωγοί, αυτά τα υγρά µπορούν να κρατήσουν ηλεκτρικό φορτίο, το οποίο µπορεί να τα κινήσει αργά διαµέσου ενός διαύλου από ένα αντίθετο φορτίο που πάλλεται κατά µήκος του διαύλου. Αυτό οφείλεται στην ηλεκτροµαγνητική δύναµη που δηµιουργείται µεταξύ αντίθετων ηλεκτρικών φορτίων. Στις αντλίες σταδιακής µεταφοράς, οι θερµαντήρες προκαλούν την µετατροπή του υγρού σε αέριο. Το υγρό διαστέλλεται καθώς µετατρέπεται σε αέριο, σπρώχνοντας το υγρό προς το αέριο. Αντλίες χωρίς κινούµενα µέρη δεν υπάρχουν στο µακροσκοπικό κόσµο γιατί οι φυσικές αρχές που περιπλέκονται είναι σηµαντικά πιο αποδοτικές στο µικροσκοπικό κόσµο. Για παράδειγµα, είναι εύκολο να δηµιουργηθεί ένα αέριο σε ένα µικρό δίαυλο, αλλά η θέρµανση ενός µεγάλου διαύλου θα εξατµίσει το υγρό µόνο στα εξωτερικά άκρα. Σαν τέτοιες αυτέ οι αντλίες συνήθως λειτουργούν σε διαύλους της τάξης των 100 µικρά σε µέγεθος. Οι αντλίες χωρίς κινούµενα µέρη εµφανίζουν το πλεονέκτηµα και την δυσκολία του να δουλεύεις σε µικροσκοπική κλίµακα: µπορούν να χρησιµοποιηθούν µέθοδοι ενεργοποίησης που δεν είναι διαθέσιµες στον µακροσκοπικό κόσµο, αλλά η εξακρίβωση τους απαιτεί µεγάλη καταννόηση της φυσικής- δεν είναι τόσο ενορατικές όσο µπορούν να είναι οι σχεδιασµοί στον µακροσκοπικό κόσµο. 34 5.2 ΒΙΟΑΙΣΘΗΤΗΡΕΣ 5.2.1 Εισαγωγή Οι βιοαισθητήρες είναι χηµικοί ανιχνευτές που εκµεταλλεύονται την υψηλή επιλεκτικότητα και ευαισθησία των βιολογικά ενεργών υλικών. Πιο συγκεκριµένα, ένας βιοαισθητήρας είναι ένα αναλυτικό εργαλείο που αποτελείται από βιολογικά ενεργό υλικό και χρησιµοποιείται σε στενό συνδυασµό µε µια συσκευή που θα µετατρέψει ένα βιοχηµικό σήµα σε ένα ποσοτικό ηλεκτρικό σήµα. Οι βιοαισθητήρες έχουν πολλά πλεονεκτήµατα, όπως η απλή και χαµηλού κόστους εγκατάσταση, οι γρήγορης ανταπόκρισης χρόνοι, η προεπεξεργασία ελάχιστου δείγµατος και η υψηλή απόδοση δείγµατος. Αν και οι βιοαισθητήρες αρχίζουν να κινούνται προς το πεδίο έρευνας και εµπορευµατοποίησης στις ΗΠΑ, στην Ευρώπη και Ιαπωνία, σχετικά λίγοι έχουν εµπορευµατοποιηθεί. Αυξηµένη έρευνα σε αυτή την περιοχή απαιτεί την ανάπτυξη καινούργιων υλικών, νέων και καλύτερων τεχνικών, και νέων και πιο ανεπτυγµένων βιοαισθητήρων. Μερικές από τις πιθανές εφαρµογές των βιοαισθητήρων περιλαµβάνουν την κλινική διάγνωση και τις βιοϊατρικές εφαρµογές. Εικόνα 12: Σχηµατικό διάγραµµα µιας συσκευής βιοαισθητήρα. Ένας βιοαισθητήρας έχει δύο συστατικά: έναν υποδοχέα και έναν ανιχνευτή. Ο υποδοχέας είναι υπεύθυνος για την επιλεκτικότητα του αισθητήρα. Παραδείγµατα περιλαµβάνουν ένζυµα, αντισώµατα, και στρώµατα λιπιδίων. Ο ανιχνευτής δεν είναι επιλεκτικός. Για παράδειγµα, µπορεί να είναι ένα ηλεκτρόδιο του pH, ένα ηλεκτρόδιο οξυγόνου ή ένας πιεζοηλεκτρικός κρύσταλλος. Η εικόνα 1 περιγράφει µια τυπική 35 διάταξη βιοαισθητήρα που επιτρέπει την µέτρηση του επιδιωκόµενου αναλυτή χωρίς να χρησιµοποιεί αντιδραστήρια. Η συσκευή ενσωµατώνει ένα στοιχείο βιολογικής αισθαντικότητας µε ένα παραδοσιακό µορφοµετατροπέα. Το στοιχείο αυτό αναγνωρίζει επιλεκτικά ένα συγκεκριµένο βιολογικό µόριο διαµέσου µιας αντίδρασης, ειδικής προσρόφησης, ή άλλης φυσικής ή χηµικής διαδικασίας, και ο µορφοµετατροπέας µετατρέπει το αποτέλεσµα αυτής της αναγνώρισης σε ένα χρήσιµο σήµα, το οποίο µπορεί να προσδιοριστεί ποσοτικά. Τα συνηθισµένα συστήµατα µορφοµετατροπής είναι οπτικά, ηλεκτρο-οπτικά, ή ηλεκτροχηµικά: αυτή η ποικοιλία προσφέρει πολλές ευκαιρίες προσαρµογής των βιοαισθητήρων για ειδικές εφαρµογές. Για παράδειγµα, η συγκέντρωση της γλυκόζης σε ένα δείγµα αίµατος µπορεί να µετρηθεί αµέσως από έναν βιοαισθητήρα (ο οποίος είναι ειδικά φτιαγµένος για την µέτρηση της γλυκόζης) απλά βυθίζοντας τον αισθητήρα µέσα στο δείγµα. 5.2.2 Πιεζοηλεκτρικοί Βιοαισθητήρες: Ιστορικό Υπάρχουν δύο κατηγορίες διαφορετικών µεθόδων ανίχνευσης: η βίο-ελκτική αναγνώριση και η βίο-µεταβολική αναγνώριση. Και οι δύο διαδικασίες προϋποθέτουν την δέσµευση ενός χηµικού είδους µε ένα άλλο, το οποίο έχει µια συµπληρωµατική δοµή. Αυτό αναφέρεται σαν ειδικής µορφής δέσµευση. Στη βίο-ελκτική αναγνώριση, η δέσµευση είναι πολύ ισχυρή, και ο µορφοµετατροπέας ανιχνεύει την παρουσία του φραγµού του ζεύγους υποδοχέα-αναλυτή. Τα πιο συνηθισµένα είδη µεθόδων είναι η δέσµευση υποδοχέα-συνδέτη (ένα οργανικό µόριο το οποίο χορηγεί τα απαραίτητα ηλεκτρόνια για να σχηµατιστούν οµοιοπολικοί δεσµοί µε µεταλλικά ιόντα) και η δέσµευση αντισώµατος-αντιγόνου. Στην βίο-µεταβολική αναγνώριση, ο αναλυτής και άλλες ουσίες που µετέχουν σε χηµικές αντιδράσεις µεταβάλλονται χηµικά για να σχηµατίσουν παράγωγα µόρια. Τα βιουλικά που µπορούν να αναγνωριστούν από τα στοιχεία βίο-αναγνώρισης ποικοίλουν τόσο όσο και οι διαφορετικές αντιδράσεις που συµβαίνουν στα βιολογικά συστήµατα. O πίνακας 1 απαριθµεί έναν αριθµό από συνηθισµένους αναλυτές που θα µπορούσαν να αποδειχτούν θελκτικοί για την ανάπτυξη βιοαισθητήρων κατάλληλης ιδιαιτερότητας και ευαισθησίας. Σχεδόν όλοι οι τύποι βιολογικών αντιδράσεων, (χηµικές ή ελκτικές), µπορούν να εκµεταλλευτούν για τους βιοαισθητήρες. Η έννοια της ειδικής διαµόρφωσης αναγνώρισης χρησιµοποιείται συνήθως για να διευκρινίσει την υψηλή ευαισθησία και επιλεκτικότητα των βιολογικών µορίων, ειδικά τα συστήµατα αντιγόνου-αντισώµατος. Το µόριο του αναλυτή έχει 36 συµπληρωµατική δοµή προς το αντίσωµα, και το ζεύγος που προκύπτει είναι σε χαµηλότερη ενεργειακή κατάσταση από ότι είναι τα δύο χωριστά µόρια. Αυτή η ένωση είναι πολύ δύσκολο να σπάσει. Ο πίνακας 2 συνοψίζει µια σειρά συνδυασµών βιοσυστηµάτων και µορφοµετατροπέων σε σχέση µε τον µορφοµετατροπέα, την µέθοδο µέτρησης και την ενδεχόµενη εφαρµογή. Η αλληλεπίδραση των αντισωµάτων µε τα αντίστοιχα αντιγόνα είναι ένας θελκτικός λόγος για την απόπειρα της ανάπτυξης χηµικών βιοαισθητήρων βασισµένων στα αντισώµατα, πχ. ανοσοανιχνευτές. Θεωρητικά, εάν ένα αντίσωµα µπορεί να ανυψωθεί απέναντι σε έναν συγκεκριµένο αναλυτή, ένας ανοσοανιχνευτής θα µπορούσε να αναπτυχθεί για να το αναγνωρίσει. Παρά την υψηλή ιδιαιτερότητα και συνάφεια των αντισωµάτων προς τα συµπληρωµατικά µόρια συνδέτες, οι περισσότερες αλληλεπιδράσεις αντισωµάτων-αντιγόνων δεν προκαλούν µια Εικόνα 13: Σχηµατικό διάγραµµα µιας συσκευής ανοσοαισθητήρα. ηλεκτρονικά µετρήσιµη αλλαγή. Εντούτοις, η αξιοσηµείωτη επιλεκτικότητα των αντιγόνων έχει τροφοδοτήσει πολύ έρευνα για να αντιµετωπίσει αυτό το πρόβληµα. Το πιεζοηλεκτρικό φαινόµενο σε ποικίλες κρυσταλλικές ουσίες είναι µια χρήσιµη ιδιότητα που οδηγεί στην ανίχνευση των αναλυτών. Η εικόνα 13 δείχνει ένα σχηµατικό διάγραµµα µιας συσκευής ανοσοανιχνευτή. Ο πιεζοηλεκτρικός ανοσοανιχνευτής θεωρείται ένα από τα πιο ευαίσθητα αναλυτικά όργανα που έχουν αναπτυχθεί µέχρι σήµερα, και ο οποίος είναι ικανός να ανιχνεύει 37 αντιγόνα στη κλίµακα των πικογραµµαρίων (10-12 γραµµάρια). Επιπλέον, αυτός ο τύπος συσκευής πιστεύεται ότι έχει την δυνατότητα να ανιχνεύει αντιγόνα στην αέρια φάση όπως επίσης και στην υγρή. Σχεδόν όλες οι επίκαιρες µέθοδοι της διάγνωσης της φυµατίωσης (ΤΒ) έχουν µειονεκτήµατα. Τείνουν να είναι είτε µη ακριβείς είτε πολύ χρόνο-καταναλωτικές. Στις περισσότερες περιπτώσεις πνευµονικής και εξωπνευµονικής ΤΒ, η διάγνωση εξαρτάται από την καλλιέργεια του µυκοβακτηριακού οργανισµού, σε διαδικασία που απαιτεί 4-8 εβδοµάδες. Σηµαντική προσοχή έχει αφιερωθεί στην ανάπτυξη περισσότερο γρήγορων διαγνωστικών µεθόδων για την ΤΒ, αλλά µερικές από αυτές δεν έχουν την υψηλή ιδιαιτερότητα ή ευαισθησία που απαιτείται για την κατάλληλη διάγνωση. Ένας πιεζοηλεκτρικός ανιχνευτής που θα µπορούσε να ανιχνεύσει αξιόπιστα το αντιγόνο του µυκοβακτηρίου σε βιολογικά υγρά θα ήταν τεράστιας χρησιµότητας. Για παράδειγµα, η ανίχνευση του αντιγόνου στα πτύελα θα αποτελούσε µια µη επεµβατική µέθοδος προβολής στην οθόνη των υψηλού κινδύνου πληθυσµών. Ένας δοκιµασµένος ανιχνευτής πιεζοηλεκτρικού κρυστάλλου δίνει αποτελέσµατα µέσα σε κανα-δυό ώρες µετά την έκθεση του ηλεκτροδίου σε ένα υγρό που περιέχει το αντιγόνο. Η διάταξη θα είναι εντελώς φορητή, έτσι ώστε τα ανοσολογικά τεστ να εκτελούνται στην πραγµατικότητα παντού, και τα αποτελέσµατα να µπορούν να ληφθούν πολύ γρήγορα. Το εφικτό της χρήσης πιεζοηλεκτρικών ανοσοανιχνευτών για την διάγνωση της ΤΒ που βασίζεται στην ανίχνευση των µυκοβακτηριδιακών αντιγόνων στα υγρά εξαρτάται από το βαθµό της ευαισθησίας και της ιδιαιτερότητας που µπορεί να επιτευχθεί, και αφού αντιµετωπίσει οποιαδήποτε προβλήµατα που προκαλούνται από ουσίες που πιθανά παρεµβάλλονται στα βιολογικά υγρά. Η επίτευξη της ανίχνευσης της αέριας φάσης των αντιγόνων εξαρτάται από τους ίδιους παράγοντες, καθώς και από οποιεσδήποτε δυσκολίες που µπορούν να είναι µοναδικές στη σύλληψη της αέριας φάσης των αντιγόνων από τα αντισώµατα. 5.2.3 Τύποι Βιοαισθητήρων 5.2.3.1 Ιατρικοί Τηλε-Αισθητήρες Ένα τσιπάκι στο ακροδάχτυλο µας µπορεί κάποια µέρα να µετρά και να µεταδίδει δεδοµένα για την θερµοκρασία του σώµατος µας. Μια σειρά από τσιπάκια προσκολληµένα στο σώµα µας είναι πιθανό να παρέχουν επιπλέον πληροφορίες για την πίεση του αίµατος, το επίπεδο οξυγόνου, και τον ρυθµό παλµών. Αυτός ο τύπος ιατρικού 38 τηλε-αισθητήρα λειτουργιών σε θα αναφέρει µετρήσεις ζωτικών αποµακρυσµένα µηχανήµατα εγγραφής. Ο στόχος είναι να αναπτυχθεί µια σειρά από τσιπ που οµαδικά θα παρακολουθούν τις λειτουργίες του σώµατος. Εικόνα 14: Αυτός ο ‘ιατρικός τηλε-αισθητήρας’ πάνω στο δάχτυλο µπορεί να µετρήσει και να µεταδώσει τη θερµοκρασία του σώµατος. Ασύρµατες συσκευές καταγραφής προσκολληµένες στο σώµα θα µπορούσαν να παρέχουν πολύτιµη πληροφορία για την φυσιολογική κατάσταση ασθενών εντατικής φροντίδας στα νοσοκοµεία, για υψηλού κινδύνου εξωτερικούς ασθενείς, για βρέφη που κινδυνεύουν από το σύνδροµο του ξαφνικού βρεφικού θανάτου, και για το αστυνοµικό και πυροσβεστικό προσωπικό σε επικίνδυνες καταστάσεις. Το τσιπ της παραπάνω φωτογραφίας περιέχει έναν ανιχνευτή θερµοκρασίας σε ένα ολοκληρωµένο κύκλωµα, µια µπαταρία λιθίου στο πάχος ενός φιλµ που προµηθεύει το ελάχιστο επίπεδο ενέργειας που απαιτείται από το κύκλωµα και τα ηλεκτρονικά επεξεργασίας και µετάδοσης του σήµατος, και µια κεραία που στέλνει τα δεδοµένα µε ραδιοσήµατα (µετάδοση ραδιοσυχνότητας) σε µια διάταξη καταγραφής όταν το τσιπ ενεργοποιείται. Αυτός ο αισθητήρας συνηθίζεται να λέγεται ¨ιατρικός τηλε-αισθητήρας ASIC¨ επειδή χρησιµοποιεί ένα ειδικό ολοκληρωµένο κύκλωµα για τηλεµετρικήαυτόµατη µέτρηση και µετάδοση των δεδοµένων από αποµακρυσµένες πηγές σε αποδέκτες για καταγραφή και ανάλυση. Αναµένεται επίσης ότι µπορεί να αναπτυχθεί ένα τσιπ που θα µετράει τα επίπεδα οξυγόνου στο αίµα. Καθώς το επίπεδο οξυγόνου στο αίµα µεταβάλλεται, µεταβάλλεται και το χρώµα της αιµοσφαιρίνης στο αίµα. Ένα τέτοιο τσιπ θα έχει µια πηγή φωτός και ένα ανιχνευτή φωτός που θα µπορούσε να µετρήσει αλλαγές στο χρώµα της αιµοσφαιρίνης που µεταδίδεται όταν φωτίζεται από το φως. Τα αποτελέσµατα εκθέτονται από ασύρµατη τηλεµετρία. Η πίεση του αίµατος και ο ρυθµός των παλµών µπορούν να µετρηθούν από τσιπς που είναι σχεδιασµένα να ανιχνεύουν αλλαγές της πίεσης. Οι επιστήµονες ήδη δουλεύουν µε οπτικές ίνες κατασκευασµένες από σιλικόνη για να εκµεταλλευτούν τις µοναδικές ιδιότητες αυτής της ουσίας. Σε αντίθεση µε υάλινες ίνες, µια ίνα από σιλικόνη είναι 39 εύκαµπτη- µπορεί να συµπιεστεί ή να τεντωθεί, και το ποσό της συµπίεσης ή της διαστολής µπορεί να µετρηθεί από αλλαγές στη µετάδοση του φωτός διαµέσου της ίνας. Εάν µια ίνα σιλικόνης σε ένα τσιπ µπορεί να αισθανθεί την πίεση σε διάφορες θέσεις στο σώµα, µπορεί να χρησιµοποιηθεί για παρακολούθηση της πίεσης του αίµατος, του παλµικού ρυθµού, της αναπνοής (διαστολή του στήθους), της κάµψης του γονάτου κατά την διάρκεια της φυσικής αποκατάστασης, και της διανοµής της πίεσης του ποδιού. Καθώς µεγαλώνουµε, ασθένειες όπως ο διαβήτης και το αλτσχάιµερ, και διάφοροι χηµικοί συντελεστές προκαλούν µεταβολές στις συγκεντρώσεις των µεταλλικών ιόντων στο σώµα. Εάν αυτές οι αλλαγές µπορούσαν να ανιχνευτούν και να µετρηθούν, οι πληροφορίες θα παρείχαν ενδείξεις για µεταβολές σε καταστάσεις ασθένειας και για έκθεση σε τοξίνες. Εικόνα 15: Έχει αναπτυχθεί ένας ανιχνευτής ευαισθησίας για την παρακολούθηση των αλλαγών στις συγκεντρώσεις ιόντων ασβεστίου στο σώµα. Μπορεί να είναι χρήσιµο στη διάγνωση ασθενειών ή στην έκθεση χηµικών παραγόντων. Αυτός ο βιοαισθητήρας αποτελείται από µια οπτική ίνα στην οποία επισυνάπτεται ένα σύνθετο υβριδικό µόριο. Το ένα µισό του υβριδικού µορίου δεσµεύει τα ιόντα ασβεστίου και το άλλο µισό φθορίζει όταν τα ιόντα ασβεστίου δεσµεύονται στο µόριο. Έτσι έχει αναπτυχθεί ένας βιοαισθητήρας χρησιµοποιώντας µια υάλινη οπτική ίνα και ένα µόριο που έχει συντεθεί υβριδικά. Το ένα µισό του υβριδικού µορίου δεσµεύει τα ιόντα ασβεστίου και το άλλο µισό φθορίζει όταν ιόντα ασβεστίου δεσµεύονται στο µόριο. Όταν προσκολληθεί αυτό το µόριο στο άκρο µιας οπτικής ίνας πολύ µικρής διαµέτρου, µετριέται η συγκέντρωση των ιόντων ασβεστίου στο διάλυµα. 40 5.2.3.2 Μικροπρόβολοι Μια ενδιαφέρουσα εναλλακτική πρόταση στην οπτική ίνα είναι ο µικροπρόβολος, ο οποίος µετράει την παρουσία ουσιών µε µη οπτικές µεθόδους. Μπορεί να δράσει σαν ένας φυσικός, χηµικός ή βιολογικός αισθητήρας ανιχνεύοντας αλλαγές στην κάµψη ή στη παλµική συχνότητα του προβόλου. Οι µικροπρόβολοι είναι εκατοµµύρια φορές µικρότεροι αλλά τα µόρια που προσροφούνται σε αυτούς προκαλούν αλλαγές της παλµικής συχνότητας. Το ιξώδες, η πυκνότητα, και ο ρυθµός ροής µπορούν επίσης να µετρηθούν ανιχνεύοντας τις αλλαγές στην παλµική συχνότητα. Άλλος τρόπος ανίχνευσης της προσρόφησης των µορίων είναι µετρώντας την συστροφή του προβόλου που οφείλεται στη προσρόφηση της έντασης στη µια άκρη του προβόλου. Εξαρτώµενη από τη φύση του χηµικού δεσµού του µορίου, η συστροφή µπορεί να είναι προς τα πάνω ή προς τα κάτω. Για παράδειγµα, εάν ο µικροπρόβολος είναι διµεταλλικός, ακριβώς όπως ο θερµοστάτης στο σπίτι αλλά ένα εκατοµµύριο φορές µικρότερος, µπορεί να µετρηθεί µια αλλαγή θερµοκρασίας τόσο µικρή όσο ένα εκατοµµυριοστό του βαθµού. Εικόνα 16: Σχήµα ενός αισθητήρα µικροπρόβολου, προσαρµοστεί φυσικής, οποίος µπορεί να για χηµικής, την ανίχνευση ή βιολογικής δραστηριότητας. Ο µικροπρόβολος είναι συνήθως κατασκευασµένος από ένα φύλλο πυριτίου µήκους 100 µικρόµετρα (mm), πλάτους 30 mm και πάχους 3 µε 4 mm (αυτές οι διαστάσεις είναι χονδρικές). Όταν προσθέτονται µόρια στην επιφάνεια του, ο βαθµός στον οποίο λυγίζει το φύλλο µπορεί να µετρηθεί ακριβώς προκαλώντας αναπήδηση µιας φωτεινής ακτίνας στην επιφάνεια και µετρώντας το βαθµό στον οποίο εκτρέπεται η φωτεινή ακτίνα. Η παλµική συχνότητα µπορεί να προκληθεί από πιεζοηλεκτρικούς µορφοµετατροπείς και να µετρηθεί µε την ίδια φωτεινή ακτίνα που µέτρησε την εκτροπή γιατί παράγει ένα εναλλασσόµενο ρεύµα στον ανιχνευτή. Η θερµοκρασία µετριέται επιστρώνοντας την επιφάνεια του πυριτίου µε χρυσό ή αλουµίνιο, τα οποία διαστέλλονται σε διαφορετικό ποσοστό από ότι το πυρίτιο. Επειδή η διαφορά στη θερµική διαστολή µεταξύ του πυριτίου και του χρυσού επηρεάζει την 41 κάµψη του µικροπρόβολου, µπορούν να µετρηθούν αλλαγές θερµοκρασίας ενός εκατοµµυριοστού του βαθµού. Οι χηµικές αντιδράσεις παράγουν θερµότητα, έτσι αυτή η συσκευή µπορεί να χρησιµοποιηθεί σαν µικροθερµιδόµετρο (όργανο µέτρησης της ειδικής θερµότητας των στερεών) για να µετρήσει την θερµότητα µιας ένζυµοκαταλυτικής αντίδρασης ή µιας χηµικής αντίδρασης σε δύναµη αντίδρασης του ενός µικρολίτρου (1µl). Aκόµα ένας άλλος µηχανισµός απόκρισης χρησιµοποιήθηκε για την µέτρηση πρωτεϊνών σε ένα διάλυµα. Αντισώµατα προσκολλήθηκαν ισοσθενώς στην επιφάνεια πυριτίου ενός προβόλου µε τέτοιο τρόπο που οι ισχύες που προκλήθηκαν στο αντίσωµα όταν αντέδρασε µε το αντιγόνο του ανιχνεύθηκαν. Η ανίχνευση των βιολογικών παραγόντων ή βακτηρίων και ιών στο νοσοκοµειακό εργαστήριο θα πρέπει να επιταχυνθεί µε αυτή την τεχνική. Επιπρόσθετα πειράµατα είναι σε εξέλιξη για να αποδείξουν την χρησιµότητα του µικροπροβόλου ως βιοαισθητήρα. Εξαιτίας του µικρού µεγέθους και της προσαρµοστικότητας του µικροπροβόλου, µπορούν κατασκευαστούν σειρές αισθητήρων µόνο σε ένα τσιπ για να µιµηθούν νοητικά τις πέντε αισθήσεις: όραση ακοή, όσφρηση, γεύση και αφή. 5.2.3.3 Βιοαισθητήρας Για Την Ανίχνευση Καρκίνου Και Άλλων Ανωµαλιών Ένας άλλος τύπος βιοαισθητήρα χρησιµοποιεί εξελιγµένη τεχνολογία για την ανίχνευση ενός ιδιαίτερου γνωρίσµατος µιας ανωµαλίας σε έναν ζωντανό οργανισµό. Από αυτούς τους βιοαισθητήρες, ο περισσότερο διαφηµισµένος είναι ο αισθητήρας οπτικής βιοψίας. Αυτός ο αισθητήρας µπορεί να πει εάν ένας όγκος στον οισοφάγο είναι καρκινογόνος ή καλοήθης. Στο παρελθόν, ο ακριβής καθορισµός του εάν ένας ασθενής έχει καρκίνο του οισοφάγου απαιτούσε χειρουργική βιοψία. Εντούτοις, η βασισµένη σε laser µέθοδος φθορισµού έχει εξαλείψει την ανάγκη για βιοψία, µειώνοντας τον πόνο και τον χρόνο ανάρρωσης των ασθενών. Λειτουργεί ως εξής: Φως laser του κατάλληλου µήκους κύµατος εστιάζεται στην εσωτερική στοιβάδα του οισοφάγου µέσω µιας συσκευής οπτικών ινών που καταπίνεται από τον ασθενή. Τα επιθηλιακά κύτταρα και ιστός µέσα στον οισοφάγο φθορίζουν όταν διεγείρονται από το φως του laser. Όταν το εσωτερικό του οισοφάγου φωτίζεται µε µπλε φως [410 νανόµετρα (nm)], ο φυσιολογικός ιστός εκπέµπει φως σε διαφορετικά µήκη κύµατος από αυτά που εκπέµπονται από τα καρκινικά κύτταρα. Οι φασµατικές ιδιότητες 42 του φωτός σε µήκη κύµατος που κυµαίνονται από 400 σε 700 nm µπορούν αν αναλυθούν σε διάφορες θέσεις στον οισοφάγο. Εκποµπές από φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα µπορούν να αναγνωριστούν µε αρκετή ακρίβεια. ∆οκιµές σε περισσότερους από 200 ασθενείς δείχνουν ότι, συγκρινόµενα µε τα αποτελέσµατα των χειρουργικών βιοψιών, η διάγνωση µε φθορισµό laser είναι ακριβή στο 98% των περιπτώσεων. Άλλος ένας βιοαισθητήρας παρέχει ένα τρόπο παρακολούθησης της κατάστασης του διαβήτη χωρίς να χρησιµοποιεί δείγµατα αίµατος. Σε αυτή την περίπτωση, χρησιµοποιείται φως για τον φωτισµό του βολβού του οφθαλµού και την διέγερση ορισµένων ουσιών, περιλαµβάνοντας πρωτεΐνες, για να εκπέµψουν φως που φθορίζει. Αυτός ο φθορισµός αλλάζει στην ένταση και στο µήκος κύµατος όταν αλλάζουν η διανοµή και κατάσταση των πρωτεϊνών στο µάτι. Αυτή η όντως µη επεµβατική µέθοδος εξαρτάται από µια σχετικά νέα εφεύρεση για την επιλογή του µήκους κύµατος του φωτός για φωτισµό. Αντί για πρίσµατα ή πλέγµατα για την διάθλαση του φωτός σε διαφορετικά µήκη κύµατος, χρησιµοποιείται µια συσκευή που λέγεται ακουστο-οπτικό τονικό φίλτρο (AOTF). Μια AOTF επιλέγει το µήκος κύµατος του φωτός για να φωτίσει το βολβό του οφθαλµού και ένα άλλο επιλέγει το µήκος κύµατος του φωτός φθορισµού που εκπέµπεται από τον οφθαλµό. Και τα δύο AOTF µήκη κύµατος ανιχνεύονται ταυτόχρονα χρησιµοποιώντας την τεχνική σύγχρονης φωτοβολίας που αναπτύχθηκε κατά το παρελθόν για περιβαλλοντολογικό έλεγχο. Οι AOTFs, οι οποίες χειρίζονται µε ένα σήµα ραδιο-συχνότητας, µπορούν να σαρώσουν ολόκληρο το ορατό φάσµα και τµήµατα του υπεριώδους και του υπέρυθρου φάσµατος σε µιλιδευτερόλεπτα για να επιλέξουν τα κατάλληλα µήκη κύµατος που χρησιµοποιούν για να φωτίσουν τον οφθαλµό. Μπορούν επίσης να επιλέξουν το σωστό µήκος κύµατος που χρησιµοποιούν για να διαβάσουν το σήµα φθορισµού από τον οφθαλµό του ασθενή στιγµιαία. Με αυτό τον τρόπο µπορούν να παρθούν πολλές σαρώσεις του φάσµατος και να εξαχθεί ο µέσος όρος τους σε έναν υπολογιστή για να αποκτήσουµε την ακρίβεια που απαιτείται για την µέτρηση της κατάστασης και των αλλαγών των πρωτεϊνών του οφθαλµού των διαβητικών. Είναι υπο έρευνα επίσης, τρόποι για να τεθούν σε εφαρµογή τεχνικές για την ανίχνευση καρκίνων του δέρµατος, του τράχηλου και του εντέρου. 5.2.3.4 Αισθητήρας Ως Ηλεκτρονική Μύτη Λίγα είναι γνωστά σχετικά µε το πώς λειτουργεί η αίσθηση της όσφρησης. Σκεφτόµενοι αυτό το πρόβληµα οι ερευνητές κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι, σε αντίθεση µε τις περισσότερες βιοχηµικές ενζυµικές αντιδράσεις, οι οποίες βασίζονται σε 43 ένα µηχανισµό ‘κλειδαριάς-κλειδιού’, η όσφρηση πρέπει να εµπεριέχει µια διαδικασία αναγνώρισης εκτεταµένου τύπου για να δοκιµάζει τις αναρίθµητες οσµές µε τις οποίες η µύτη µας βοµβαρδίζεται καθηµερινά. Εάν η φύση είχε αναπτύξει ειδικούς οσφρητικούς υποδοχείς για κάθε οσµή, οι σκύλοι δεν θα εκπαιδεύονταν να ανακαλύπτουν µε την όσφρηση κοκαΐνη ή εκρηκτικά σε σύντοµη µόνο χρονική περίοδο. Η πρόκληση ήταν να εφευρεθεί η χηµεία και ο τύπος αναγνώρισης λογισµικού/ ηλεκτροµηχανολογικού µέρους που χρειάζεται για τη παραγωγή ενός πολύ ανέξοδου τσιπ αναγνωρίσεως των οσµών. Η ιδέα που συνέλαβαν οι ερευνητές είναι η κατασκευή ενός τσιπ ‘ηλεκτρονικής µύτης’ από εν µέρει πριονισµένες αντιστάσεις που µπορούν να ανιχνεύσουν διαφορές µεταξύ ποικίλλων οσµών. Έτσι χρησιµοποίησαν µια ποικιλία αγώγιµων πολυµερών που αντιδρούν σε µόρια οσµών για να δηµιουργήσουν τη µύτη και τότε ‘εκπαίδευσαν’ έναν αλγόριθµο νευρικού δικτύου να αναγνωρίζει διαφορές σε τύπους που δηµιουργούνται από οσµές. Τέτοιες µύτες θα εξυπηρετούν σαν αισθητήρες και αρωµατικοί κριτές σε τόσες πολλές καταστάσεις που οι εκτεταµένες τους εφαρµογές ίσως µια µέρα να ανταγωνιστούν αυτές ενός τσιπ υπολογιστή. Στα χρόνια µας κατασκευάζονται τέτοια τσιπ τα οποία θα ενσωµατωθούν σε συστήµατα υποστήριξης ζωής διαστηµικών σταθµών για να ‘µυρίζονται’ ‘όταν κάτι δεν πάει καλά. Επίσης πολλά εργαστήρια εθνικής άµυνας δοκιµάζουν το εν λόγω τσιπ για χρήση σε αµυντικά συστήµατα, όπως είναι η ανίχνευση εκρηκτικών. Οι ερευνητές προβλέπουν ότι αυτοί οι ηλεκτρονικοί αισθητήρες θα χρησιµοποιηθούν για πολλούς σκοπούς στη βιοµηχανία. Για παράδειγµα, οι κατασκευαστές αυτοκινήτων ίσως χρησιµοποιήσουν το τσιπ για να εξασφαλίσουν ότι το δέρµα στα αυτοκίνητα τους µυρίζει το ίδιο σε όλα. Οι κατασκευαστές τυριών ή αρωµάτων ίσως χρησιµοποιήσουν την τεχνολογία για την διασφάλιση µιας σταθερής οσµής. Το τσιπ θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί για την προειδοποίηση διαρροής υγρών των φρένων, ανιχνεύοντας αλλαγές στη µυρωδιά των υγρών. Προβλέπεται επίσης πολλές µελλοντικές ιατρικές χρήσεις επίσης, περιλαµβάνοντας ανίχνευση ασθενειών µέσω της ανάλυσης της αναπνοής. 5.2.3.5 Μικροσκοπικές Συσκευές Άλλος ένας τύπος βιοαισθητήρα χρησιµοποιεί διάφορες τεχνικές για να µετατρέψει ένα βιολογικό σύστηµα σε µια µικροσκοπική ηλεκτρονική συσκευή, για την ανάλυση βιολογικών ή φυσιολογικών διαδικασιών, ή για την ανίχνευση και αναγνώριση 44 βακτηρίων. Μερικές από αυτές τις τεχνικές παράγουν ή διεξάγονται από µικροσκοπικές συσκευές. Η θέση για φωτοσύνθεση σε ένα πράσινο φύλλο περιέχει ένα περίπλοκο συγκρότηµα ενζύµων και πρωτεϊνών που συλλαµβάνουν την ενέργεια του φωτός και µετατρέπουν το διοξείδιο του άνθρακα σε ενώσεις που βοηθούν το φυτό να µεγαλώσει. Εάν ένα άλας λευκόχρυσου σε µια ορισµένη κατάσταση οξείδωσης χορηγηθεί σε ένα από δύο φωτοσυνθετικά συστήµατα στους φυτικούς χλωροπλάστες, το ένα φωτοσυνθετικό σύστηµα θα χρησιµοποιήσει φωτεινή ενέργεια για να παρέχει ηλεκτρόνια που θα ανάγει το λευκόχρυσο σε µεταλλική µορφή. Το µέταλλο εναποθέτεται στο συγκρότηµα ενζύµων για να σχηµατίσει ένα µικροσκοπικό κέντρο που µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε εξελιγµένα βασισµένα σε διόδους µικροηλεκτρονικά για µετρήσεις σε εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία, ευκρίνεια, και ταχύτητα. Οι ερευνητές έχουν κάνει δραµατική πρόοδο στη µικροσκοπικοποίηση κλινικών και χηµικών εργαστηρίων. Μια άλλη χρήσιµη µικροσκοπική συσκευή είναι ένα υπέρυθρο µικροφασµατόµετρο στο µέγεθος ενός κύβου ζάχαρης. Σµιλεµένη από στερεή µήτρα διαµόρφωσης από πλαστικό, η συσκευή εκτιµάται σε 1.5 εκατοστά κάθε πλευρά και δεν έχει κινούµενα µέρη. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί για χηµική ανάλυση αίµατος, ανάλυση των οκτανίων της βενζίνης, περιβαλλοντολογική εξέταση, εξέταση της φθοράς αεροσκαφών, και ανίχνευση χηµικών παραγόντων. Η πλαστική συσκευή χρησιµοποιεί µια πηγή φωτός για να διεγείρει ορισµένους τύπους ενώσεων στα αέρια, υγρά και στερεά. Αυτές οι διεγερµένες ενώσεις εκπέµπουν υπέρυθρο φως διαφόρων µηκών κύµατος. Το µικροφασµατόµετρο µπορεί να συγκεντρώσει το εκπεµπόµενο φως και να το διοχετεύσει σε µια οπτική ίνα για ανάλυση. Τα µετρούµενα εκπεµπόµενα µήκη κύµατος τροφοδοτούνται σε ένα µικροτσίπ, το οποίο αναγνωρίζει και προσδιορίζει τις συγκεντρώσεις των χηµικών σε ένα δείγµα. Η συσκευή είναι φθηνή και αποδίδει καλά σε διαφορετικές εξατοµικευµένες χρήσεις. Εικόνα 17: Το υπέρυθρο φασµατόµετρο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για χηµική ανάλυση αίµατος, ανάλυση των οκτανίων της βενζίνης, περιβαλλοντολογική παρακολούθηση, έλεγχο βιοµηχανικών επεξεργασιών, παρακολούθηση της διάβρωσης αεροσκαφών, και ανίχνευση χηµικών παραγόντων. 45 5.2.4 Βιοαισθητήρες Στην Ανάλυση DΝΑ Το DNA µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την αναγνώριση οργανισµών που κυµαίνονται από ανθρώπους µέχρι βακτήρια και ιούς. Η αναγνώριση αποτελείται από την ανάγνωση της αλληλουχίας των γραµµάτων του DNA (A, G, C και Τ) που συνθέτουν το αλφάβητο που χρησιµοποιείται για να περιγράψει τις βάσεις που συνάπτονται στο φωσφορικό πολυµερές δεσοξυριβόζης που αποτελεί το κύριο στήριγµα της έλικας του DNA. Οι βάσεις ενώνουν δύο κλώνους αυτού του πολυµερούς για να σχηµατίσουν µια ελικοειδή σκάλα, όπου οι βάσεις και οι δεσµοί υδρογόνου που τις ενώνουν είναι τα βήµατα στα σκαλιά. Ακριβώς όπως στο αλφάβητο, τα γράµµατα συνδυάζονται σε διάφορα σύνολα και ακολουθίες για να σχηµατίσουν λέξεις, προτάσεις και παραγράφους όπου οργανώνουν τις πληροφορίες µε ένα τρόπο που να µπορεί να διαβαστεί και να αξιοποιηθεί. Εποµένως, έχει γίνει πολύ προσπάθεια για να διαβαστούν οι αλληλουχίες των τεσσάρων γραµµάτων του DNA, και έχουν αναπτυχθεί σχετικά υποτυπώδεις µέθοδοι που είναι αξιόπιστες και χρήσιµες. Χρησιµοποιώντας µεθόδους για το σχηµατισµό σύντοµων αλληλουχιών του DNA, παράγονται τεµάχια DNA που έχουν ένα από τα γράµµατα στο άκρο τους και που διαφέρουν σύµφωνα µε το µέγεθος τους. Σαν αποτέλεσµα, µπορούν να δηµιουργηθούν µε ακρίβεια αλληλουχίες DNA που να περιέχουν 400 µε 600 γράµµατα. Εντούτοις, απαιτούνται πολλές ώρες για να ετοιµαστούν τα τεµάχια και να χωριστούν κατά µέγεθος (χρησιµοποιώντας τζέλ ηλεκτροφόρηση). Χρησιµοποιώντας αυτή την µέθοδο, έχουν προσδιοριστεί αλληλουχίες εκατοµµυρίων γραµµάτων DNA, επιτρέποντας την εξακρίβωση της θέσεως µιας γενετικής µεταλλαγής που προκαλεί ασθένειες όπως την δρεπανοκυτταρική αναιµία, την ασθένεια Huntington, το σύνδροµο fragile X (ένα σοβαρό τύπο πνευµατικής καθυστέρησης), και αρκετές εκατοντάδες άλλες κληρονοµικές ασθένειες ή χαρακτηριστικά. Επιπλέον, συνδυάζοντας ακολουθίες µε 400 γράµµατα την φορά, προσδιορίστηκε το 1996 ολόκληρο το γονιδίωµα της µαγιάς, ένα κρίσιµο επίτευγµα που οδήγησε στην αναγνώριση ενός ολόκληρου νέου συνόλου γονιδίων που δεν είχαν αναγνωριστεί προηγουµένως. Πολλά εργαστήρια που ασχολούνταν µε την προσπάθεια της αλληλουχίας έχουν τώρα στρέψει τη προσοχή τους στη µελέτη αυτών των νέων γονιδίων για να µάθουν τη λειτουργία τους και τη σηµασία τους. Το Human Genome 46 Project σχεδιάζει να πάει πέρα από την µαγιά και να προσδιορίσει την αλληλουχία όλων των γραµµάτων του DNA στο ανθρώπινο γονιδίωµα. Αναµφίβολα, αυτή η πληροφορία θα οδηγήσει στην ανακάλυψη πολλών νέων ανθρώπινων γονιδίων και σε µια πιο εξελιγµένη κατανόηση της κατάστασης της υγείας και των ασθενειών µας. Επειδή οι µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν για την ακολουθία του DNA της µαγιάς απαίτησαν τη συνεργασία ντουζινών εργαστηρίων στην Ευρώπη και τις ΗΠΑ για πολλά χρόνια για τον καθορισµό της συνολικής ακολουθίας, νέες και γρηγορότερες µέθοδοι για την ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA θα ήταν σαφώς επωφελείς. Εάν οι µέθοδοι ήταν γρηγορότερες και λιγότερο ακριβές, η πληροφορία της ακολουθίας του DNA θα ήταν τόσο συνήθη όσο ο τύπος αίµατος µας και πολύ περισσότερο ενηµερωτική. Θα µπορούσαµε να εξακριβώσουµε εάν είµαστε φορείς ενός γονιδίου µιας ασθένειας που γνωρίζουµε ότι υπάρχει στην οικογένεια µας, εάν το αίµα σε ένα έγκληµα ήταν του ύποπτου που συλλήφθηκε, ή εάν ένα επιβλαβές βακτήριο υπήρξε σε ένα πεδίο µάχης. Σε ορισµένες από αυτές τις περιπτώσεις, η ανάγκη να ξέρουµε την αλληλουχία του DNA µπορεί να είναι επείγων. Επειδή οι επίκαιρες µέθοδοι δεν είναι αρκετά γρήγορες για να ικανοποιήσουν τέτοιες ανάγκες, πολλά εργαστήρια, αναπτύσσουν γρηγορότερες µεθόδους. Εκτός των πληροφοριών της ακολουθίας, οι µέθοδοι αναπτύσσονται επίσης για να προσδιορίζουν την θέση που µια αλληλουχία DNA έχει υποστεί µετατροπές. Όταν ένα χηµικό αντιδράσει µε το DNA στον πυρήνα του κυττάρου, πιθανώς προκαλώντας βλάβη, σχηµατίζεται µια χηµική ουσία από την προσθήκη των δύο ειδών. Οι ερευνητές έχουν χρησιµοποιήσει τη φασµατοµετρία µάζας για να αναγνωρίσουν τις χηµικές ουσίες που προκύπτουν από αυτή τη προσθήκη. Έχουν καθορίσει και την ταυτότητα της χηµικής αυτής ουσίας και τη συγκεκριµένη θέση του DNA στην οποία έχει συµβεί. 47 Εικόνα 18: η laser mass spectrometry έχει χρησιµοποιηθεί για την ανίχνευση δίκλωνου και µονόκλωνου DNA και για τον καθορισµό της ακολουθίας των βάσεων στο µονόκλωνο DNA. Η αλληλουχία του DNA αποτελείται από ένα σύνολο χηµικών βάσεων, γνωστές ως A, T, C, και G, και το µόριο του DNA διπλώνεται, περιελίσσεται και σχηµατίζει βρόγχους µε διάφορους τρόπους. Για δίκλωνο DNA, ο κανόνας είναι η Α στον ένα κλώνο πρέπει να ταιριάξει µε την Τα στον άλλο, και η C πρέπει να ταιριάξει µε την G. Τα τελευταία χρόνια έρευνες έχουν δείξει ότι κοµµάτια DNA των 50 ή 75 νουκλεοτιδίων (βάσεις) µπορούν να διαδεχθούν για να διατηρήσουν τη τάξη των A, G, C, και Τ γραµµάτων. Επειδή η φασµατοµετρία µάζας πραγµατοποιεί το καθορισµό της ακολουθίας σε λιγότερο από δευτερόλεπτο, ατή η ταχύτητα αντικαθιστά αυτή της ηλεκτροφόρησης µε τζέλ όσον αφορά τη σπουδαιότητα. Μολοταύτα, η µέθοδος µε το τζέλ µπορεί να διεξάγει 400 µε 600 γράµµατα σε 50 δείγµατα τη φορά και δεν βρίσκεται σε κίνδυνο να αντικατασταθεί ακόµα. Άλλοι τρόποι χαρακτηρισµού του DNA αποτελούνται από τον προσδιορισµό του µεγέθους παράγονται των από τεµαχίων που ενδονουκλεάσες περιστολής, ένζυµα που κόβουν το DNA όταν βρίσκουν µια συγκεκριµένη ακολουθία γραµµάτων. Αυτά τα ένζυµα µπορούν να θεωρηθούν σαν ¨µαγικά ψαλίδια¨ επειδή όχι µόνο κόβουν το DNA αλλά το κάνουν τόσο αξιόπιστα σε µια θέση της ακολουθίας η οποία είναι συγκεκριµένη για κάθε ένα από τα ένζυµα περιστολής, τα οποία είναι πάνω από 400. Το σχήµα των µεγεθών αυτών των τεµαχίων DNA που παράγονται από αυτά τα µαγικά ψαλίδια µπορεί να είναι µοναδικός για το DNA κάθε βιολογικού είδους ή ακόµα κάθε ατόµου. Εικόνα 19: Εικόνα 2έχουν αναπτυχθεί σειρές ακινητοποιηµένων ολιγονουκλεοτιδίων για την ανάλυση αλληλουχιών του DNA. Στην εικόνα, η αλληλουχία του DNA είναι διευρυµένη, χαρακτηρισµένη, και αφηµένη να υβριδοποιηθεί µε την σειρά των ακινητοποιηµένων 48 ολιγονουκλεοτιδίων. Στα δεξιά, η αλληλουχία του DNA αποκρυπτογραφείται επικαλύπτοντας τις υβριδοποιηµένες σειρές παρόµοιας αλληλουχίας. Η τεχνική έχει εφαρµογές στην ιατρική, στην ιατροδικαστική, στην γεωργία, και στην περιβαλλοντολογική βιοαποκατάσταση Η ηλεκτροφόρηση µε τζέλ είναι η συνήθη µέθοδος για να χαρακτηρίσουµε το µέγεθος του σχήµατος αλλά η φασµατοµετρία µάζας µπορεί να το κάνει πολύ καλά, και ξανά σε πολύ συντοµότερο χρόνο. Εκτός από αυτή την µέθοδο, άλλες µέθοδοι αξιοποιούν τη χαρακτηριστική αντίδραση µεταξύ των δύο κλώνων του DNA. Ανακαλώντας ότι η Α ταιριάζει µε την Τα και η C µε την G στους αντίθετους κλώνους, ένας µικρός κλώνος DNA, που καλείται ολιγονουκλεοτίδιο, µε µια ακολουθία 5´-AGCTTTAACC θα συνδεθεί µε την 5´-GGTTAAAGCT αλλά όχι µε την 5´-GGTTAGGACT. Oι ερευνητές συνέθεσαν έναν αριθµό από διαφορετικές αλληλουχίες DNA κατευθείαν πάνω σε µια γυάλινη επιφάνεια και έδειξαν ότι η συµπληρωµατική ακολουθία του ελεύθερου DNA θα µπορούσε να αποκτηθεί καθορίζοντας µε ποια από τις αλληλουχίες θα δεσµευτεί. Το ελεύθερο DNA χαρακτηρίστηκε µε φώσφορο-32 έτσι ώστε η διαµόρφωση να µπορούσε να παρατηρηθεί µε ακτινογράφηση. Με άλλα λόγια τι γυαλί τοποθετήθηκε απέναντι από φωτογραφικό φιλµ για κάποιο χρόνο, µετά αφού είχε εµφανιστεί για να προσδιορίσουν τις θέσεις των ραδιενεργών κηλίδων. Σε αυτή την περίπτωση το ακινητοποιηµένο DNA περιείχε µόνο οχτώ βάσεις και έτσι θα µπορούσε να καθορίσει την ακολουθία µόνο οχτώ βάσεων στο ελεύθερο DNA. Μακρύτερα τµήµατα ακινητοποιηµένων DNA θα έδιναν µακρύτερες ακολουθίες στο ελεύθερο DNA. Αυτή η τεχνική συχνά καλείται αλληλουχία µε υβριδισµό (SBH). Παρουσιάζει ενδιαφέρον το γεγονός ότι οι κανόνες “το Α δεσµεύεται µε το Τ” και “το G δεσµεύεται µε το C” δεν είναι εντελώς αξιόπιστοι, αποτυχηµένοι συνδυασµοί µπορούν και όντως συµβαίνουν στα υβριδικά πειράµατα. Εάν ο αποτυχηµένος συνδυασµός είναι στο ή κοντά στο άκρο του κλώνου DNA, είναι πιο πιθανό να σπάσουν οι κανόνες απ’ότι εάν είναι σε µια εσωτερική θέση. Έτσι έχει αναπτυχθεί ένας αριθµός κανόνων που προβλέπουν πότε είναι πιθανό να συµβεί ένας κακός συνδυασµός. Εάν αυτοί οι κανόνες αγνοηθούν στην ερµηνεία των δεσµευµένων διαµορφώσεων, ο αναγνώστης θα µπορούσε να παραπλανηθεί όσο αφορά την πραγµατική ακολουθία των τµηµάτων DNA. Επειδή οι υβριδικές µέθοδοι είναι πολύ πιο γρήγορες απ’ότι η ηλεκτροφόρηση µε τζέλ για τον προσδιορισµό της των αλληλουχιών, είναι πιθανό ο υβριδισµός να γίνει η µέθοδος επιλογής για πολλές εφαρµογές χαρακτηριστικών γνωρισµάτων του DNA. Όταν ένα τµήµα DNA χαρακτηρισµένο από κασσίτερο υβριδοποιείται µε την ακολουθία του συµπληρωµατικού του DNA σε µια σειρά µικρών κοµµατιών DNA σε 49 µια επιφάνεια γυαλιού ή νάιλον, η θέση του τµήµατος καθορίζεται από ένα µικροκαθετήρα µε ιονισµό που προκαλείται από laser, που χρησιµοποιεί µια ακτίνα laser για να διαχωρίσει όλα τα άτοµα σε πολλές εκατοντάδες µονά επίπεδα της επιφάνειας του δείγµατος. Αυτά τα άτοµα που εµφανίζονται σαν ιόντα απορρίπτονται. Εντούτοις, τα ουδέτερα άτοµα ενός επιλεγµένου στοιχείου (σε αυτή την περίπτωση, ο κασσίτερος) µετατρέπονται σε ιόντα φωτίζοντας τα µε ένα laser που είναι συντονισµένο µε την κβαντική ενέργεια των ηλεκτρονίων του στοιχείου, προκαλώντας µόνο τον ιονισµό των ατόµων αυτού του στοιχείου. Τα ιόντα που παράγονται µε αυτό τον τρόπο εισάγονται σε ένα φασµατόµετρο µάζας, το οποίο τα διαχωρίζει σε ισότοπα σύµφωνα µε διαφορές στη µάζα και υπολογίζει την συγκέντρωση κάθε ενός ισοτόπου του κασσιτέρου. Εικόνα 20: Σειρές surface-enhanced Raman gene (SERG) µπορούν να εντοπίσουν ελεύθερα µόρια DNA που έχουν υβριδοποιηθεί µε άλλα που είναι στερεωµένα πάνω σε µια επιφάνεια. Η τεχνική έχει χρήσεις στην ιατρική, στην ιατροδικαστική, στην γεωργία, και στην περιβαλλοντολογική βιοαποκατάσταση. Μια άλλη µέθοδος υβριδισµού χρησιµοποιεί µια διαδικασία που λέγεται Raman ενισχυµένης φασµατοσκοπία επιφάνειας (SERS). Υβριδοποιηµένο DNA µεταφέρεται από την µεµβράνη νάιλον σε µια γυάλινη λωρίδα επιστρωµένη µε µικροσκοπικές ασηµένιες σφαίρες. Οι βαµµένες µα χρωστική ετικέτες που συνδέονται µε τις βάσεις του DNA έχουν µοναδικό Raman υπέρυθρο φάσµα. Αυτή η ενίσχυση επιτρέπει στις βάσεις του DNA να ανιχνευθούν σε επαρκή ευαισθησία για να είναι χρήσιµες για µελέτες της αλληλοδιαδοχής του DNA. Παλαιότερα, χρησιµοποιώντας την SERS, ανιχνεύθηκε µια φθορίζουσα καρκινογόνο ουσία στο DNA. Έπειτα, αποδείχτηκε η δύναµη της SERS για ανάλυση της αλληλουχίας του DNA. Πρόσφατα, αναπτύχθηκε σε µέθοδο υψηλής ευαισθησίας. Ακόµα µια προσέγγιση στην ανάλυση του DNA, είναι ο σχεδιασµός µιας σειράς ανιχνευτών διπλού ηλεκτρικού φορτίου συσκευών (CCD και ) και η σύναψη στην 50 επιφάνεια τους ειδικών αλληλουχιών DNA. Ελεύθεροι κλώνοι DNA χαρακτηρίζονται µε φθορίζοντα µόρια και υβριδοποιούνται στο δεσµευµένο DNA. Όταν φωτίζεται µε φως laser του σωστού µήκους κύµατος, τα φθορίζοντα άκρα του υβριδοποιηµένου DNA εκπέµπουν σήµατα φωτός που ανιχνεύονται από τους ατοµικούς ανιχνευτές CCD πίσω από κάθε θέση DNA. Επειδή κάθε pixel των CCD έχει διαφορετική αλλά γνωστή ακολουθία µικρού τµήµατος DNA δεσµευµένη σε αυτό, η ακολουθία του τµήµατος του µακρύτερου κλώνου DNA που υβριδοποιείται µε τον µικρό κλώνο µπορεί να αναγνωριστεί. Συναθροίζοντας όλες τις πληροφορίες από τα pixels, αποκτάται ένα µεγαλύτερο τµήµα αλληλουχίας DNA. Επειδή τα βακτήρια έχουν µοναδικές αλληλουχίες DNA, αυτές οι µέθοδοι υβριδισµού υπόσχονται πολλά για τις βάσεις νέων τεχνικών που θα αναλύουν γρήγορα το DNA, θα χαρακτηρίζουν την πηγή του, και θα αναγνωρίζουν τα βακτήρια. Μια διαφορετικού τύπου ανάλυση του DNA έχει να κάνει σχέση µε τα ένζυµα ¨µαγικά ψαλίδια¨, που περιγράφονται παραπάνω. Για παράδειγµα, το ένζυµο EcoRI κόβει το DNA η ακολουθία 5΄-GAATTC είναι στον ένα κλώνο του DNA και η συµπληρωµατική του 5´-CTTAAG στον άλλο. Η κοπή χωρίζει το G από το A και στους δύο κλώνους. Αυτή η σειρά συµβαίνει σχετικά συχνά στο DNA, έτσι το ένζυµο παράγει ένα µεγάλο αριθµό κοµµατιών. Το ένζυµο Not I απαιτεί οχτώ νουκλεοτίδια στην ακολουθία 5´GCGGCCGC και τη συµπληρωµατική της 5´-GCGGCCGC, µια τέτοια σειρά συµβαίνει σπάνια, οπότε παράγονται λιγότερα κοµµάτια DNA, και γενικά είναι µεγαλύτερα από αυτά που κόβονται από το EcoRI. Εξαιτίας της διαθεσιµότητας περισσοτέρων από 400 ενζύµων περιστολής που έχουν µοναδικές και γνωστές ακολουθιακές απαιτήσεις, τα σχήµατα των τεµαχίων του DNA που παράγονται από τα διάφορα ένζυµα µπορούν να χρησιµοποιηθούν για να χαρακτηρίσουν το DNA κάθε ανθρώπου. Αυτή είναι και η βάση για τα χαρακτηριστικά γνωρίσµατα του DNA που αποκτούνται µέσω διαχωρισµού κατά µέγεθος των τεµαχίων DNA µε ηλεκτροφόρηση µε τζέλ. Τέτοια χαρακτηριστικά γνωρίσµατα χρησιµοποιούνται ευρέως για στοιχεία στην έρευνα και στα δικαστήρια. Για να προσδιορίσουµε ποια κοµµάτια του DNA διαµορφώνουν ένα χαρακτηριστικό γνώρισµα, πρέπει να διαχωριστούν και να αναγνωριστούν. Το ¨lab on a chip¨ έχει διασκευαστεί για να εκτελεί τέτοιους διαχωρισµούς µέσα σε λίγα λεπτά-πολύ πιο γρήγορα από τις πρότυπες διαδικασίες µε τζέλ. Όπως τα µικροκυκλώµατα και οι υπολογιστές λειτουργούν παράλληλα, αυτά τα τσιπ χηµικού διαχωρισµού µπορούν να χρησιµοποιηθούν παράλληλα για ανάλυση DNA. Σε µια εφαρµογή, υγρά που περιέχουν DNA και ένα ένζυµο περιστολής εισάγονται µε ένεση σε διαφορετικούς θαλάµους που είναι χαραγµένοι στο τσιπ. Ηλεκτρικά πεδία διακινούν τα υγρά διαµέσου ενός 51 µικροσκοπικού καναλιού σε έναν αντιδραστικό θάλαµο, όπου το ένζυµο κόβει το DNA σε κοµµάτια διαφορετικού µήκους. Τότε τα µικροτεµάχια του DNA διακινούνται ηλεκτρικά σε ένα θάλαµο διαχωρισµού, όπου ενισχύονται µε βαφές φθορισµού για ανίχνευση. Τα τεµάχια DNA διαφόρων µεγεθών ταξινοµούνται σε ένα υγρό που περιέχει ινώδη νήµατα ενός πολυµερούς. Τα κοµµάτια του DNA µπερδεύονται µε τα νήµατα του πολυµερούς, τα οποία τα επιβραδύνουν καθώς διέρχονται µέσα από το υγρό. Τα µικρά κοµµάτια DNA βρίσκουν το δρόµο τους µέσα από το µπερδεµένο πλέγµα γρηγορότερα από τα µεγαλύτερα, οπότε έτσι προκύπτει ο διαχωρισµός. Καθώς τα κοµµάτια διαχωρίζονται, φωτίζονται µε φως από laser, προκαλώντας τον φθορισµό τους. Οι εντάσεις του ανιχνευόµενου φωτός τροφοδοτούνται σε ένα υπολογιστή, που ταξινοµεί τα σήµατα από τα διαχωρισµένα κοµµάτια για να παρέχει ανάλυση του δείγµατος. Για την εξάλειψη του χειροκίνητου χειρισµού του DNA, έχει προταθεί η κατασκευή ενός πιο αναλυτικού τσιπ το οποίο µπορεί να προετοιµάσει το DNA από ένα βιολογικό δείγµα λύνοντας τα κύτταρα, εξάγοντας το DNA, αφοµοιώνοντας το µε ένζυµα περιστολής, ενισχύοντας το µε την αλυσίδα αντίδρασης της πολυµεράσης, επισυνάπτοντας ετικέτες φθορισµού, και έπειτα αποκτώντας το ηλεκτροφορητικό χαρακτηριστικό γνώρισµα. Όλα τα βήµατα θα συνέβαιναν σε µια σειρά από µικροσκοπικούς θαλάµους στο τσιπ, και τα αποτελέσµατα θα αποκτούνταν σε λεπτά απ’ότι σε ώρες ή µέρες, όπως συµβαίνει τώρα. Έχει αναπτυχθεί µια τεχνική αποτύπωσης του DNA χρησιµοποιώντας µικροσκόπηση ατοµικού πεδίου (AFM) για τη µέτρηση του µήκους και του πλάτους των δίκλωνων µορίων DNA. Η AFM είναι µια ευαίσθητη συσκευή που σκιαγραφεί την επιφάνεια ενός υλικού, παράγοντας ένα τρισδιάστατο χάρτη. Ορισµένοι ιοί έχουν κυκλικό DNA γνωστών µεγεθών, καθώς χαρακτηρίζονται από διάφορες µεθόδους. Έχει αποδειχτεί ότι η τεχνική αυτή µπορεί να µετρήσει µεγέθη ιογενών γενετικών υλικών. Το ένζυµο ενδονουκλεάση περιστολής, κόβει µια αλληλουχία DNA κάθε φορά που συµβαίνει που απαντάται στο κλώνο. Αλλά το είδος της µετάλλαξης αυτού του ενζύµου απλά ενώνει, παρά σχίζει το κλώνο του DNA. Η τεχνική AFM µπορεί να αναπαραστήσει το δεσµό που προκύπτει, ή τη πρωτεϊνική ανωµαλία, που σχηµατίζεται στο νήµα του DNA. Οι ερευνητές µπορούν να αναγνωρίσουν τη θέση όπου το ένζυµο δεσµεύεται στο DNA µέσα σε 100 ζευγάρια βάσεων, που είναι µια πολύ υψηλή ανάλυση. Έχουν δείξει ότι η απόσταση από τη µια δέσµευση στην επόµενη, καθώς αναπαριστάνεται από την AFM, ήταν ακριβώς αυτή που προβλέφτηκε µε πειράµατα κοπής ενζύµων αναλυµένα µε ηλεκτροφόρηση µε τζέλ. 52 ∆ιαµέσου της γενετικής µηχανικής, θα µπορούσαν να αναπτυχθούν και άλλα ένζυµα και πρωτεΐνες που δεσµεύουν, παρά κόβουν, συγκεκριµένες αλληλουχίες DNA. Χρησιµοποιώντας την τεχνική AFM για να παρατηρήσουµε ένα κλώνο DNA που επεξεργάζεται µε διαφορετικά µηχανικά ένζυµα, µπορεί να είναι πιθανό να προσδιορίσουµε µια ορισµένη ακολουθία των χηµικών του βάσεων, µια ορισµένη θέση αποτύπωσης, ή µια αραίωση γονιδίων και άλλων βιοχηµικών γνωρισµάτων στα χρωµοσώµατα. Χρησιµοποιώντας αυτό τον βιοαισθητήρα, οι ερευνητές έχουν δείξει ότι η τεχνική AFM µπορεί να χαρακτηρίσει ένα κλώνο DNA σύµφωνα µε τις αποστάσεις µεταξύ συγκεκριµένων περιοριστικών δεσµευτικών θέσεων, εξαλείφοντας την ανάγκη της ενζυµατικής κοπής του DNA σε τεµάχια για διαχωρισµό µε ηλεκτροφόρηση µε τζέλ. Επειδή η µέθοδος µε AFM είναι γρηγορότερη απ’ότι η ηλεκτροφόρηση, η κοινότητα που ασχολείται µε την αλληλουχία του γονιδιώµατος αρχίζει ήδη να χρησιµοποιεί αυτή την τεχνική για το χαρακτηρισµό και τη αποτύπωση του DNA. 5.3 ΕΜΦΥΤΕΥΟΜΕΝΑ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΓΙΑ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΚΑΙ ΝΕΥΡΙΚΗ ΑΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗ Η παρακολούθηση των λειτουργιών του σώµατος είναι ένα ουσιαστικό µέσο στην ιατρική διάγνωση.Η επαναλαµβανόµενη µέτρηση της πίεσης του αίµατος σε µικρά χρονικά διαστήµατα είναι υποχρεωτική για ορισµένες ασθένειες. Πολύ συχνά αυτές οι µετρήσεις συνοδεύονται από διαδικασίες που µπορούν να αγχώσουν τους ασθενείς και συνεπώς να παραποιήσουν τα αποτελέσµατα ή να εµποδίσουν τους ασθενείς από το να κοιµηθούν όταν χρειάζεται κατά την διάρκεια µιας 24ωρης παρακολούθησης. Σαν αποτέλεσµα, αλλαγές µπορούν µόνο να ανιχνευτούν όταν τα όργανα έχουν ήδη φθαρεί. Τα µικροσυστήµατα προσφέρουν την δυνατότητα να ελαχιστοποιήσουν τα λειτουργικά εξαρτήµατα και να ολοκληρώσουν την απόκτηση των δεδοµένων και την µετάδοση τους σε µικροηλεκτρονική διάταξη κυκλωµάτων. Εάν αυτά τα µικροσυστήµατα γίνουν εµφυτεύµατα, η συνεχόµενη µέτρηση θα ήταν δυνατή αµέσως µετά από µια χειρουργική επέµβαση, η οποία θα µπορούσε να είναι µια ελάχιστου µεγέθους επεµβατική χειρουργική διαδικασία. Τέτοιες µικροσυσκευές είναι και οι παρακάτω: 5.3.1 Παρακολούθηση Πίεσης Αίµατος Και Εγκεφάλου Ένα επεµβατικό σύστηµα για παρακολούθηση ενδοσωµατικής πιέσεως αποτελείται από ένα αισθητήρα ο οποίος συνδέεται σε µια τηλεµετρική µονάδα. Ένα βασικό 53 εµφυτευόµενο µικροσύστηµα για τον έλεγχο της πίεσης έχει αναπτυχθεί σε µια µελέτη συναρµογής για ένα εµφυτευόµενο τηλεµετρικό ενδοσύστηµα (ITEMS). Εικόνα 21: Εµφυτευόµενο τηλεµετρικό ενδοσύστηµα για την παρακολούθηση της πίεσης, για παράδειγµα, ενδοφλέβια. Αριστερά: σχηµατική εικόνα. ∆εξιά: στοιχεία του πρωτότυπου. Η τεχνική σύλληψη βασίζεται στην επαγωγική τηλεµετρική µετάδοση της ενέργειας σε ένα εµφύτευµα , και στην µεταβίβαση των δεδοµένων µέσα από το δέρµα σε µια εξωτερική µονάδα ελέγχου και καταχώρησης δεδοµένων, χρησιµοποιώντας µια διαµορφωµένη µέθοδος παθητικής απορρόφησης. Η χρήση εξειδικευµένων ολοκληρωµένων κυκλωµάτων βασίστηκε σε τεχνολογία ηµιαγωγών από πυρίτιο. Αυτός ο σχεδιασµός εξαλείφει την ανάγκη για µια ενεργή πηγή ενέργειας όπως η µπαταρία, η οποία περιορίζει την διάρκεια ζωής του εµφυτεύµατος. Το µειονέκτηµα της επαγωγικής µετάδοσης είναι η µικρή χειρουργική απόσταση των λίγων µόνο mm, που είναι απευθείας αποτέλεσµα της µαγνητικής επίδρασης κοντινούπεδίου. O αισθητήρας πίεσης που αναπτύχθηκε στο σχέδιο αυτό, σχεδιάστηκε σαν ένας αισθητήρας χωρητικής πίεσης ο οποίος πρέπει να συνδεθεί σε ένα ηλεκτρονικό τσιπάκι που απαιτεί ένα τηλεµετρικό τσιπάκι για να το συνδέσει στο ITEMS. 5.3.2 Παρακολούθηση Ενδοφθάλµιας Πίεσης. Ένας από τους µεγαλύτερους παράγοντες της τύφλωσης στη ∆ύση είναι η παθολογική αύξηση της ενδοφθάλµιας πίεσης, το κατά γενικό κανόνα γλαύκωµα. Η απώλεια της όρασης προκαλείται από τον θάνατο των νευρικών ινών από τα γαγγλιακά κύτταρα οπτικού ερεθισµού, που είναι αποτέλεσµα ανεβασµένης ενδοφθαλµιακής πίεσης. Το γλαύκωµα δεν προκαλεί συνήθως πόνο ή κάποιο άλλο σύµπτωµα εκτός από την απώλεια της όρασης στα τελευταία στάδια. Εποµένως το γλαύκωµα έχει τυπικά ήδη καταστρέψει περισσότερο από το 80% των νευρικών ινών 54 πριν ανιχνευθεί. Χρησιµοποιώντας τεχνολογία µικροσυστηµάτων µερικές οµάδες ερευνητών έχουν δουλέψει πάνω σε αισθητήρες ενδοφθάλµιας πίεσης οι οποίοι κατασκευάστηκαν σαν εµφυτεύµατα στο σχήµα ενός τεχνικού ενδοφθάλµιου φακού. Εικόνα 22: Εµφυτευόµενος αισθητήρας πίεσης µε τηλεµετρικό σύστηµα σε τεχνητό ενδοφθάλµιο φακό. Αριστερά: γενική επισκόπηση. ∆εξιά: το εµφυτευόµενο σύστηµα. Αυτά τα εµφυτευόµενα συστήµατα υποβάλλονται ήδη σε κλινικές δοκιµές σαν µακροπρόθεσµα εµφυτεύµατα σε ζώα. Η συνεχόµενη παρακολούθηση της πίεσης επιτρέπει τον αντικειµενικό έλεγχο θεραπευτικών στρατηγικών στο γλαύκωµα και ίσως να δώσει διορατικότητα στον µηχανισµό του γλαυκώµατος. 5.3.3 Λειτουργική Νευρική Αποκατάσταση Η νευρική αποκατάσταση είναι ένα άλλο πεδίο εφαρµογών για εµφυτευόµενες µικροσυσκευές. Ασθένειες και τραυµατικά περιστατικά µπορεί να οδηγήσουν σε φθορά ή κακώσεις στο κεντρικό ή περιφερικό νευρικό σύστηµα. Όταν η πληροφορία ρέει ανάµεσα στον εγκέφαλο, τον νωτιαίο µυελό, τα νεύρα , σε βιολογικούς αισθητήρες, και παρεµβάλλονται µύες, οι αισθητήριες είσοδοι υστερούν και η όραση ή η ακοή χάνονται. Εάν οι κινητικές εντολές από τον εγκέφαλο δεν φτάσουν τους µύες, συµβαίνει παράλυση. Η επιδίωξη της νευρικής αποκατάστασης είναι η αποκατάσταση των χαµένων λειτουργιών χρησιµοποιώντας θεραπευτικά προγράµµατα και τεχνική βοήθεια. Εξαιτίας της τεράστιας πολυπλοκότητας του ανθρώπινου νευρικού συστήµατος , η τεχνική βοήθεια οδηγεί µόνο σε περιορισµένη αποκατάσταση στη λειτουργία. 55 Τα νευρικά τεχνητά τµήµατα (προσθέσεις) είναι µια οµάδα τεχνικής βοήθειας. Αυτά είναι τεχνικά συστήµατα που διασυνδέονται µε νεύρα και µύες για να καταγράψουν βιοηλεκτρικά σήµατα ή να διεγείρουν ηλεκτρικά τα νεύρα και τους µύες. Εµφυτευµένοι διεγέρτες και ηλεκτρόδια αυτού του τύπου έχουν εδραιωθεί για περισσότερο από δύο δεκαετίες. Καρδιακοί και διαφραγµατικοί βηµατοδότες µπορούν να επαναφέρουν τις ζωτικές λειτουργίες και η νευροµυική διέγερση µπορεί να βοηθήσει παράλυτους ανθρώπους να ξεπεράσουν κάποια προβλήµατα. Αισθητήριες νευρικές προσθέσεις όπως το κοχλιακό εµφύτευµα χρησιµοποιούνται στην κλινική πρακτική και η ηλεκτρική διέγερση συνιστάται για την µετρίαση του χρόνιου πόνου ή για την καταστολή του τρέµουλου στην ασθένεια Parkinson. Μέχρι στιγµής έχουν αναπτυχθεί τα παρακάτω εµφυτευµένα συστήµατα: • Ηλεκτρόδια για την διέγερση των νεύρων και των µυών • Περιβληµένα εµφυτεύµατα µε µια πηγή ενέργειας και µικροηλεκτρονική για έλεγχο • Μακριά καλώδια για να διασυνδέσουν όλα τα ηλεκτρόδια από ένα κεντρικό εµφύτευµα. Χρησιµοποιώντας ακριβή µηχανισµούς, τα εµφυτεύµατα φτιάχνονται να είναι εύρωστα , σταθερά και λειτουργικά για µεγάλη χρονική διάρκεια. Ωστόσο, καταναλώνουν χώρο, και η πολυπλοκότητα του εµφυτεύµατος και ο αριθµός των ηλεκτροδίων περιορίζονται από τους περιορισµούς της σαφής µηχανικής τεχνολογίας και τους χωρικούς και βιολογικούς περιορισµούς µικροσυστηµάτων ενεργά του ανθρωπίνου εµφυτεύµατα που σώµατος. έχουν Με έναν την τεχνολογία υψηλότερο βαθµό ελαχιστοποίησης και έναν αυξηµένο βαθµό ηλεκτροδίων είναι τώρα εφικτά. Τα εµφυτεύµατα δεν πρέπει µόνο να είναι βιοασφαλή και βιοσταθερά όσον αφορά την κυτταροτοξικότητα και την διάσπαση, πρέπει επίσης να ικανοποιούν τα διαλύµατα των βιολογικών συστηµάτων µε εκτίµηση στις οµαλές άκρες, το χαµηλό βάρος και την υψηλή ευελιξία για να εµποδίσουν τον µηχανικό νευρικό τραυµατισµό. 5.3.4 Ένα Μικροσύστηµα Στο Μάτι Ένας µεγάλος αριθµός ασθενών υποφέρουν από εκφυλισµένες ατέλειες του αµφιβληστροειδή. Υπάρχει µια προοδευτική απώλεια των φωτουποδοχέων ραβδίων και κωνίων . Εντούτοις, το γαγγλιακό κυτταρικό στρώµα, το οποίο σχηµατίζει το οπτικό νεύρο και τα επακόλουθα τµήµατα του οπτικού συστήµατος, παραµένει άθικτο. Μια µελέτη έχει αποδείξει ότι η τοπική ηλεκτρική διέγερση του αµφιβληστροειδικού 56 γαγγλιακού κυτταρικού στρώµατος σε τυφλούς ασθενείς απέφερε χρήσιµες, εντοπισµένες οπτικές αισθήσεις. Αυτά τα υποκειµενικά αισθήµατα φωτός φάνηκαν σαν κουκίδες ή γραµµές σε προσδιορισµένες τοποθεσίες στο οπτικό διάστηµα. ∆ύο διαφορετικές περιοχές εµφύτευσης και διέγερσης είναι υπό έρευνα για µια συσκευή που απευθείας θα διεγείρει τον αµφιβληστροειδή: µια υποαµφιβληστροειδική περιοχή µε διατάξεις φωτοδιόδων στην περιφέρεια των εκφυλισµένων φωτουποδοχέων, και µια επιαµφιβληστροειδική τοποθεσία για την διέγερση των γαγγλιακών κυττάρων µε συµβατικές διεγερτικές επαφές. Το σύστηµα αµφιβληστροειδικού εµφυτεύµατος περιλαµβάνει αρκετές λειτουργικές µονάδες. Εικόνα 23: Απεικόνιση του αµφιβληστροειδικού εµφυετυόµενου συστήµατος για τη διέγερση των γαγγλιακών κυττάρων. Το εξωτερικό τµήµα περιλαµβάνει µια υψηλής ταχύτητας κάµερα για να παράγει τις εικόνες. Στέλνει τα δεδοµένα σε ένα φορητό κουτί που περιέχει παροχή ενέργειας που κινείται µε αναφορτίσιµες µπαταρίες και µια µονάδα επεξεργασίας του σήµατος, τον κωδικοποιητή του αµφιβληστροειδή χιτώνα. Αυτός ο κωδικοποιητής χρησιµοποιείται για να εξοµοιώνει τις χωρο-χρονικές ιδιότητες των διαφορετικών στρωµάτων του αµφιβληστροειδή χιτώνα και επεξεργάζεται τα σήµατα τα σήµατα από την κάµερα και παράγει πρότυπα ερεθίσµατα για τα γαγγλιακά κύτταρα. Αυτά τα δεδοµένα οδηγούνται σε µια τηλεµετρική µονάδα για µετάδοση στο εµφυτευόµενο τµήµα του συστήµατος. Μέσα στο µάτι, ένας τηλεµετρικός δέκτης είναι τοποθετηµένος σε ένα τεχνητό ενδοφθάλµιο φακό (7 mm διάµετρο) αποκωδικοποιεί τα δεδοµένα και τα ηλεκτρόδια θα είναι χωρο-χρονικά επιλεγµένα για την διέγερση των γαγγλιακών κυττάρων. 57 H πιο πρόσφατη έρευνα πάνω στα κατανεµηµένα νοήµοντα εµφυτεύµατα και βιουβριδικά συστήµατα, έχει να κάνει σχέση µε συνδυασµό µικροσυστηµάτων µε κύτταρα και ιστούς. ∆ύο από τις πιο πρόσφατες εφευρέσεις είναι µια κατανεµηµένη νευροπρόσθεση για την αποκατάσταση της λειτουργίας των σκελετικών µυών και ένα βιουβριδικό σύστηµα για λειτουργική νευρική αποκατάσταση. 5.3.5 Κατανεµηµένα Εµφυτεύµατα Και Ευφυή Ηλεκτρόδια Οι περισσότερες νευρικές προσθέσεις αποτελούνται από ένα κεντρικό εµφύτευµα συνδεδεµένο διαµέσου ενός περιορισµένου αριθµού καλωδίων στα ηλεκτρόδια µαγνητοσκόπησης και διέγερσης. Για πολλές εφαρµογές όπως η ικανότητα να πιάσεις κάτι ή να σηκωθείς και να περπατήσεις, θα ήταν καλύτερο να υπάρχει ένας αριθµός κατανεµηµένων εµφυτευµάτων τα οποία είναι εµφυτευµένα σε διαφορετικές θέσεις στο σώµα. Είναι προτιµότερο να ελέγχονται αυτά τα εµφυτεύµατα χρησιµοποιώντας µια ασύρµατη διασύνδεση παρά καλώδια, η οποία θα αυξήσει το επίπεδο της ύπαρξης χειρουργικών περιπλοκών και τον κίνδυνο σπασίµατος των καλωδίων. Οι χειρουργικές επεµβάσεις αυξάνουν τον κίνδυνο της µόλυνσης, και οι διαδικασίες στο νωτιαίο µυελό ή στον εγκέφαλο όπως η εµφύτευση ενός διεγέρτη στο εµπρόσθιο τµήµα του ιερού οστού αυξάνει τον κίνδυνο διαρροής του εγκεφαλονωτιαίου υγρού. Για αυτούς τους λόγους, είναι υπό ανάπτυξη ένας σχεδιασµός κατανεµηµένων εµφυτευµάτων τα οποία να µπορούν να ελεγχθούν από µια εξωτερική µονάδα ελέγχου. Εάν χρησιµοποιείται µια µόνο εξωτερική µονάδα για την µετάδοση της ενέργειας και των δεδοµένων διαµέσου ενός επαγωγικού συνδέσµου στα διαφορετικά εµφυτεύµατα, είναι απαραίτητο να παράγουµε ένα µαγνητικό πεδίο αρκετής δύναµης µέσα από το πηνίο κάθε εµφυτεύµατος. Αυτό σηµαίνει ότι δύο ή περισσότερα µικρότερα εξωτερικά πηνία ή ένα µεγαλύτερο εξωτερικό απαιτούνται για να παράγουν ένα κατάλληλο µαγνητικό πεδίο. Αυτός ο τύπος συστήµατος χρειάζεται µια µεγάλη ποσότητα ενέργειας και δεν είναι βολική για τον ασθενή να την φοράει. Για να λυθεί αυτό το πρόβληµα, µπορεί να παρέχεται ένας ¨οδηγός¨ για το µαγνητικό πεδίο. ∆ηλαδή το πηνίο του εξωτερικού συστήµατος τοποθετείται στη περιοχή της µπροστινής κοιλιακής χώρας για να εξασφαλίσει µια άνετη εγκατάσταση χωρίς να προκαλεί πολύ πίεση στο δέρµα. Ένα εµφυτευόµενο πηνίο τοποθετείται υποδόρια κάτω από το εξωτερικό πηνίο για να διασφαλίσει µια καλή µαγνητική σύζευξη. Το υποδόριο πηνίο συνδέεται µε δορυφορικά εµφυτευµένα πηνία διαµέσου καλωδίων. Αυτά τα 58 δορυφορικά πηνία βρίσκονται κοντά στα ενεργά εµφυτεύµατα για να παρέχουν ένα επαγωγικό σύνδεσµο. Στο άλλο άκρο των εµφυτευµένων διεγερτών, ο αριθµός των καλωδίων συχνά περιορίζει τον αριθµό των ηλεκτροδίων από την µια θέση επαφής στο νεύρο. Εξαιτίας αυτού του περιορισµού, γεννήθηκε η ιδέα ενός ευφυούς ηλεκτροδίου µε ενιαία νοηµοσύνη. Στη πρώτη σχεδίαση ενός τέτοιου συστήµατος που αποτελείται από πρότυπα συναρτησιακά στοιχεία, ένα 18-πολικό υβριδικό ηλεκτρόδιο συνδέθηκε µε µια µικρογραφηµένη πολυσύνθετη διάταξη κυκλωµάτων που µείωσε τον αριθµό των καλωδίων από δώδεκα σε τέσσερα. Μια τέτοια διάταξη βλέπουµε στην παρακάτω εικόνα: 5.3.6 Βιοϋβριδικά Συστήµατα Ο συνδυασµός µικροσυστηµάτων µε βιολογικά κύτταρα και ιστούς, γνωστά ως βιουβριδικά συστήµατα, έχει γίνει µια ενδιαφέρουσα περιοχή έρευνας. Αυτά τα συστήµατα έχουν βοηθήσει την αύξηση της κατανόησης των βιοηλεκτρονικών µηχανισµών και την ανάπτυξη νέων αναλυτικών συστηµάτων και θεραπειών για ασθένειες, που µέχρι τώρα, δεν ήταν θεραπεύσιµες, για παράδειγµα, οι περιφερικές νευρικές κακώσεις που καταλήγουν σε αδύναµη παράλυση. Η πρόσφατη έρευνα στα βιουβριδικά συστήµατα στοχεύει στο να προσφέρει λειτουργική νευρική αποκατάσταση µετά από περιφερικές νευρικές κακώσεις. Η τραυµατική κάκωση ενός περιφερικού νεύρου διακόπτει τις µεταδόσεις βιοηλεκτρικών σηµάτων των και οδηγεί σε παράλυση και σε εκφυλισµό των ακρωτηριασµένων νευρίτων στο περιφερικό κολοβωµένο νεύρο. Η επούλωση µιας κάκωσης αυτού του τύπου µπορεί να συµβεί κάτω από ευνοϊκές συνθήκες και αφορά την απόφυση των νευρίτων από το άµεσο κολοβωµένο νεύρο, αναπτυσσόµενη κατά µήκος του περιφερικού κολοβωµένου νεύρου, και την επανανεύρωση των επιδιωκόµενων µυών. Για περιπτώσεις που η φυσική ή η νευροχειρουργικής φύσεως (αρωγή) θεραπεία δεν είναι επιτυχής, εµβρυϊκά κύτταρα νωτιαίου µυελού έχουν µεταµοσχευτεί σε ένα σκεύος που είναι φτιαγµένο από ένα κοµµάτι νεύρωσης, το οποίο είναι τοποθετηµένο στο περιφερικό νευρικό κολόβωµα για να επαναφέρει την λειτουργία του σκελετικού µυός. Ένα επιθυµείται έλεγχος των επενανευρωµένων µυών, τεχνικά συστήµατα µπορούν να βοηθήσουν να διεγείρουν ηλεκτρικά τους νευρώνες. 59 Μια βιουβριδική νευροπρόσθεση που πραγµατοποιήθηκε για την αποκατάσταση της λειτουργίας των σκελετικών µυών µετά από περιφερικές νευρικές κακώσεις βλέπουµε παρακάτω. Η νευρική µικροσκοπική µύλη έχει διάµετρο 2mm και αποτελείται από µια µικροκατασκευασµένη εύκαµπτη δοµή από πολυϊµίδιο µε µικροηλεκτρόδια και ολοκληρωµένα βιολογικά κύτταρα (¨φιλοξενούµενοι¨ νευρώνες και νευρογλοιακά κύτταρα). Αυτό το µικροσύστηµα προορίζεται να εµφυτευτεί στο περιφερικό νευρικό κολόβωµα. Οι νευρίτες των ¨φιλοξενούµενων¨ νευρώνων θα αναπτυχθούν µέσα από τις οπές του πολυϊµιδικού ηθµού στο περιφερικό νευρικό κολόβωµα για να επανανευρώσουν τον µύ. Σήµατα από τους νευρίτες των ¨φιλοξενούµενων¨ νευρώνων θα καταγραφούν από τα ηλεκτρόδια δακτυλιοειδής µορφής που περιβάλλουν µερικές από τις οπές στο πολυϊµιδικό ηθµό. Η σύζευξη µεταξύ των ηλεκτρονικών και βιολογικών συστηµάτων χρησιµοποιεί µια βιουβριδική προσέγγιση: την σύνδεση των δακτυλιοειδών µικροηλεκτροδίων και νευρίτων από ειδικούς πρότυπους νευρώνες, που κατορθώνουν την σύνδεση στον εστιασµένο µύ. Έτσι, οι ¨φιλοξενούµενοι¨ νευρώνες χρησιµεύουν σαν µεσολαβητές για µια µακροπρόθεσµη, λειτουργική σύνδεση µεταξύ των µικροηλεκτροδίων και των προορισµένων µυών. Η βιοσυµβατότητα σε χρόνιες εµφυτεύσεις έχει αποδειχθεί στο άµεσο νευρικό κολόβωµα ενός ακρωτηριασµένου, δηλαδή, το νευρικό κολόβωµα πάνω από την θέση της κάκωσης. Η ηλεκτροφυσιολογική αξιολόγηση του περιφερικού νεύρου διεξάχθηκε 11 εβδοµάδες µετά την εµφύτευση. Έχουν καταγραφεί από τα ηλεκτρόδια στον ηθµό πολλαπλά δυναµικά νευρικής επίδρασης µετά από διέγερση του µυός σε κοντινή περιοχή του νωτιαίου µυελού. Αργότερα, ηλεκτρικό ερέθισµα εκ νέου στα ηλεκτρόδια του ηθµού προκάλεσε την εκδήλωση σωµατοαισθητήριων-προκαλούµενων δυναµικών τα οποία καταγράφηκαν µε υποδόρια τοποθετηµένα ηλεκτρόδια µορφής βελόνας. Η έρευνα που βρίσκεται σε εξέλιξη θα συγκεντρωθεί στη σύζευξη κυττάρωνηλεκτροδίων για την παρακολούθηση της κυτταρικής συµπεριφοράς και την διέγερση αναπλασµένων νευρίτων. 60 6. ΣΥΝΕΝΩΜΕΝΑ ΖΩΝΤΑΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ Οι µικροκατασκευαστικές τεχνικές που έχουν επιφέρει επανάσταση στην ηλεκτρονική βιοµηχανία είναι έτοιµες να κάνουν το ίδιο και στις φαρµακευτικές, βιοτεχνολογικές, και βιοϊατρικών συσκευών βιοµηχανίες. Η φωτολιθογραφία, οι τεχνικές χαρακτικής, και οι µέθοδοι εναπόθεσης µπορούν να δηµιουργήσουν µεγάλα νούµερα µικροσκοπικών χαρακτηριστικών στα υποστρώµατα από πυρίτιο ή γυαλί. Ανάµεσα σε αυτά τα γνωρίσµατα βρίσκονται θάλαµοι βιοχηµικών αντιδράσεων, κανάλια βιοδιαχωρισµού, διατάξεις βιολογικών µορίων, ολοκληρωµένα µικροηλεκτρονικά, µικροαντλίες και µικροβαλβίδες για τον έλεγχο της κίνησης των υγρών, και πολλά άλλα στοιχεία. Αυτά τα γνωρίσµατα µπορούν επίσης να συνδυαστούν για να δηµιουργήσουν πλήρως ολοκληρωµένες συσκευές που εκτελούν προετοιµασία του δείγµατος, διαχωρισµό, ανίχνευση και/ ή ανάλυση, καθώς και χορήγηση φαρµάκων και µηχανικούς αισθητήρες στη φυσιολογική τους θέση. Οι δύο πιο σηµαντικές εφαρµογές της µικροκατασκευής στη βιολογία είναι: α) το ‘genes-on-a-chip’ για τη παρακολούθηση του επιπέδου έκφρασης του δυναµικού όλων των γονιδίων στα ανθρώπινα ή διάφορα µοντέλα συστηµάτων και οργανισµών ταυτόχρονα και β) οι συσκευές τύπου ‘lab-on-a-chip’ για την εκτέλεση βιοχηµείας στους µικροθαλάµους. Εξίσου ενδιαφέρον είναι η βιοϊατρική χρήση των µικροκατασκευαστικών συσκευών δεν είναι πλέον περιορισµένη σε µη ζωντανά συστήµατα, όπως τα genes-on-achip και lab-on-a-chip. Πρόσφατες πρόοδοι στη κατανόηση της κυτταρικής συµπεριφοράς στα µικροπεριβάλλοντα κατευθύνονται προς την ανάπτυξη ζωντανών µικροσυσκευών. Η κυτταρική συµπεριφορά επηρεάζεται ή υπαγορεύεται σηµαντικά από τα χαρακτηριστικά του τοπικού περιβάλλοντος: τη παρουσία και θέση άλλων κυττάρων, τη χηµεία, σύνθεση και ιδιοσυστασία της εξωκυτταρικής µεσοκυττάριας ουσίας, και τη σύνθεση και χρονική διακύµανση των διαλυτών παραγόντων. Η πρωταρχική πρόκληση για τη βιολογία κυτταρικών στελεχών είναι ο καθορισµός των βιολογικών και φυσικών προτύπων που οδηγούν στη διαφοροποίηση αυτών των κυττάρων σε λειτουργικές ιστικές µονάδες. Οι µικροκατασκευαστικές συσκευές καλλιέργειας κυττάρων θα παρέχουν µέσα για µηχανικά ελεγχόµενα κυτταρικά περιβάλλοντα, περιλαµβάνοντας µικροιδιοσυγκρασία, χηµεία, και φυσικές δυνάµεις, για να βοηθήσουν στη παραγωγή πληροφοριών για τις συνθήκες που οδηγούν στη διαφοροποίηση των κυτταρικών στελεχών σε λειτουργικέ ιστικές µονάδες. Οι 61 µικροκατασκευαστικές δοµές χρησιµοποιούνται επίσης για τη µέτρηση µηχανικής ατοµικών κυττάρων σε ένα πληθυσµό κυττάρων διέρχονται µέσα από µικροφραγµούς. Οι ίδιες έννοιες µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν για το διαχωρισµό κυττάρων, βασισµένο σε σχήµα και µέγεθος, ή βασισµένο στην έκφραση διαφόρων επιφανειακών υποδοχέων, επιστρώνοντας τους µικροφραγµούς µε µόρια διαφορετικού κυτταρικού δεσµού. Μια άλλη πρόσφατη καινοφανής εφαρµογή των µικρορευστοµηχανικών συστηµάτων είναι η ανάπτυξη του επονοµαζόµενου ‘reproductive chip’. Καθώς αυτή η τεχνολογία εξελίσσεται, θα γίνει πιθανή η µετακίνηση θηλαστικών ωοκυττάρων και εµβρύων µέσω διαφόρων µικροδιαύλων για την εκτέλεση ενός πλήθους διαδικαστικών βηµάτων, όπως η µικροέγχυση σπέρµατος για τη γονιµοποίηση ενός ωοκυττάρου µε σκοπό τη βελτίωση της εµβρυϊκής επώασης, χωρίς την ανάγκη διαδικασιών βραδυκίνητων µεθοδεύσεων που απαιτεί µια κλινική διάταξη. Οι βιοαισθητήρες που ενσωµατώνουν ζωντανά κύτταρα έχουν το επιπρόσθετο πλεονέκτηµα της γρήγορης παρακολούθησης της παρουσίας τοξικών µορίων ή περιβαλλοντικών ρυπαντικών ουσιών, περιλαµβάνοντας βιοχηµικούς και χηµικούς παράγοντες. Η µικρο-διαµόρφωση παρέχει την ικανότητα της σύστασης ενός κυτταρικού δικτύου, όπως οι νευρώνες, για την έρευνα των επιπτώσεων που έχουν οι ρυπαντικές ουσίες στην οµαδική συµπεριφορά των κυττάρων. Οι βιοαισθητήρες που βασίζονται σε κύτταρα επιτρέπουν τη παρακολούθηση της φυσιολογικής συµπεριφοράς ενός αναλυτή. Καθώς µπαίνουµε στη µεταγονιδιακή περιοχή στην οποία έχει συγκεντρωθεί ένα τεράστιο ποσό δεδοµένων που αφορούν το περίπλοκο γενετικό µηχανισµό, µπαίνουµε στην ευθεία για να αποκρυπτογραφήσουµε τη πολυπλοκότητα τις ιεραρχικές αντιδράσεις που κρατούν ένα οργανισµό σε οµοιόσταση. Η καλύτερη προσέγγιση για να κατορθώσουµε αυτό το σκοπό είναι ολοκρατική, παρά γενικευµένη, προσέγγιση που ελέγχει τη συµπεριφορά των κυττάρων και των γονιδίων τους σε πραγµατικό χρόνο κάτω από πολλαπλές συνθήκες, όπως είναι ασθένειες, τραύµατα, ανάπτυξη κλπ. Τα κυτταρικά τσιπ αναπτύσσονται για να παρακολουθούν ταυτόχρονα τη συµπεριφορά των ζωντανών κυττάρων τα οποία εκθέτονται σε µια πληθώρα περιβαλλοντικών συνθηκών χρησιµοποιώντας µικρορευστές και µικροσυνδυαστικές τεχνικές. Τα ίδια συστήµατα θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν για την επιτήρηση της κυτταρικής µεταβολικής δραστηριότητας. Έτσι, είναι προβλεπόµενο ότι οι επιστήµονες σύντοµα θα είναι ικανοί να παρατηρούν ταυτόχρονα τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων και το µεταβολισµό τεράστιων παράλληλων κυτταρικών διατάξεων. Οι αισθητήρες που είναι βασισµένοι σε µεγάλου πλήθους παράλληλα κύτταρα θα χρησιµοποιούνται επίσης για να ελέγχουν µεγάλες ποσότητες φαρµάκων γρήγορα, κάτι που θα επιταχύνει δραµατικά τη διαδικασία 62 ανακάλυψης φαρµάκων, και που θα βασίζεται πολύ λιγότερο σε πρότυπα ζώων. Αυτά τα συστήµατα θα εµπεριέχουν αναπόφευκτα γενετικά κατασκευασµένα κύτταρα για τον έλεγχο προφίλ έκφρασης γονιδίων σε απόκριση της έκθεσης σε διάφορα φάρµακα και τοξίνες. Ο κλάδος αυτός της τεχνολογίας θα περιλαµβάνει επίσης πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους για τη διερεύνηση περίπλοκων αλληλεπιδράσεων µεταξύ των κυττάρων από διάφορους ιστούς. Η ικανότητα της χρήσης ζωντανών κυττάρων θα προάγει επίσης δραµατικά το βιολογικό περιεχόµενο της προβολής. Είναι ήδη διαθέσιµη µια µεγάλη βιβλιοθήκη µοριακών καθετήρων για τη παρακολούθηση της κυτταρικής λειτουργίας, της γονιδιακής έκφρασης, των πρωτεϊνικών επιπέδων, και των υποκυτταρικών δοµών. Είναι προβλεπόµενο ότι ένα καλό τµήµα προκλινικών και κλινικών δοκιµών θα εκτελούνται σύντοµα χρησιµοποιώντας τις επονοµαζόµενες συσκευές τύπου ‘mouse-ona-chip’ ή ‘human-on-a-chip’. Αυτές οι εξειδικευµένες µικροσυσκευές θα περιέχουν µικροκατασκευασµένες µε µηχανικό τρόπο µονάδες ιστών, συνδεόµενες µεταξύ τους µε πολύπλοκα δίκτυα συστηµάτων µικρορευστοµηχανικής. Τα συνδυαστικά συστήµατα µικρορευστοµηχανικής θα ρυθµίζουν επίσης µε ακρίβεια τη σύνθεση και συγκέντρωση των φαρµάκων που θα εξετάζονται και θα µειώνουν το κόστος της φαρµακευτικής ανάπτυξης στη φαρµακευτική βιοµηχανία. Αυτή η συνοπτική γενική επισκόπηση περιγράφει µερικά από τα βασικά πλεονεκτήµατα και προκλήσεις που σχετίζονται µε την ερχόµενη συγχώνευση της µικροκατασκευαστικής τεχνολογίας και των ζωντανών κυττάρων και µιας δειγµατοληψίας ευρείας γκάµας συναρπαστικών ευκαιριών και υποσχέσεων στη βιολογία και την ιατρική. 6.1 TΙ ΕΙΝΑΙ ΕΝΑ ΒΙΟΤΣΙΠ (BIOCHIP); Βιοτσιπ είναι µια συλλογή µικρογραφηµένων θέσεων εξέτασης (µικροσειρές, µικροδιατάξεις) ταξινοµηµένες σε ένα στερεό υπόστρωµα που επιτρέπει την εκτέλεση πολλών τεστ την ίδια στιγµή µε σκοπό τη επίτευξη υψηλότερου συνολικού όγκου έργου και ταχύτητας. Τυπικά, η επιφανειακή περιοχή ενός βιοτσιπ δεν είναι µεγαλύτερη από ένα νύχι. Όπως ένα τσιπ ηλεκτρονικού υπολογιστή µπορεί να εκτελέσει εκατοµµύρια µαθηµατικών πράξεων σε ένα δευτερόλεπτο, ένα βιοτσιπ µπορεί να εκτελέσει χιλιάδες βιολογικές αντιδράσεις, όπως είναι η αποκρυπτογράφηση των γονιδίων, σε λίγα δευτερόλεπτα. Το τσιπ ηλεκτρονικού υπολογιστή εκτελεί λογικές πράξεις σε σειρές ηλεκτρονικών µηδενικών και µονάδων. Το βιοτσιπ εκτελεί βιοχηµικές αντιδράσεις. Το πρώτο είναι κατασκευασµένο από πυρίτιο. Το βιοτσιπ µπορεί να κατασκευαστεί σε µια 63 ολισθητική γυάλινη επιφάνεια, ή ακόµα µέσα σε πορώδες τζέλ. Το τσιπ ενός υπολογιστή µπορεί να εξυπηρετήσει µια τεράστια γκάµα σκοπών, κάτι που εξαρτάται από τις οδηγίες που επιβάλλονται απ’ έξω. Τα πρόσφατα βιοτσιπς είναι το κάθε ένα σχεδιασµένο να εκτελεί αποκλειστικά µια συγκεκριµένη λειτουργία, όπως είναι ο προσδιορισµός µιας µετάλλαξης σε ένα γονίδιο ή η ανίχνευση ενός βακτηριακού αντιγόνου σε ένα δείγµα νερού. Ένα βιοτσιπ που κατασκευάστηκε να εκπληρώνει οποιοδήποτε τέτοιο σκοπό δεν µπορεί να προγραµµατιστεί για κάποιον άλλον. Μερικά βιοτσιπς µπορούν να επαναχρησιµοποιηθούν για λίγες φορές, ενώ άλλα όχι. Ένα γενετικό βιοτσιπ είναι σχεδιασµένο να ‘παγώνει’ στη στιγµή τις δοµές πολλών µικρών κλώνων του DNA (δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ), τη βασική χηµική εντολή που καθορίζει τα χαρακτηριστικά ενός οργανισµού. Χρησιµοποιείται σαν ένα είδος ‘σωλήνα δοκιµών’ για αληθινά χηµικά δείγµατα. Ένα ειδικά σχεδιασµένο µικροσκόπιο µπορεί να προσδιορίσει που διασταυρώνεται το δείγµα µε τους κλώνους του DNA πάνω στο βιοτσιπ. Τα βιοτσιπς βοήθησαν στη δραµατική επιτάχυνση της αναγνώρισης των υπολογισµένων 80.000 γονιδίων στο ανθρώπινο DNA, µια παγκόσµια ερευνητική συνεργασία που βρίσκεται υπό εξέλιξη, και είναι ως Σχέδιο Ανθρώπινου Γονιδιώµατος (Human Genome Project). To µικροτσίπ περιγράφεται σαν ένα είδος λειτουργίας ‘παγκόσµιας έρευνας’ που µπορεί να βρεί γρήγορα την αλληλουχία του DNA. Εκτός από τις γενετικές εφαρµογές, το βιοτσιπ χρησιµοποιείται στη τοξικολογική, πρωτεϊνική, και βιοχηµική έρευνα. Τα βιοτσιπς µπορούν επίσης να χρησιµοποιηθούν για τη γρήγορη ανίχνευση χηµικών παραγόντων που χρησιµοποιούνται σε βιολογικούς πολέµους έτσι ώστε να ληφθούν αµυντικά µέτρα. 6.1.1 Συνοπτικά Παραδείγµατα Είδαµε λοιπόν ότι τα βιοτσιπς συνδυάζουν την τριάδα των µικρο-ηκεκτρο-µηχανικών, βιοχηµικών, και φωτονικών τεχνολογιών. Ο όρος βιοτσιπ για µια σειρά εννοιών. Στη πιο γενική έννοια, οποιαδήποτε συσκευή ή εξάρτηµα που περιλαµβάνει βιολογικά (ή οργανικά) υλικά- είτε είναι αποσπώµενα από βιολογικά είδη είτε παραγόµενα συνθετικά σε εργαστήριο- σε στερεό υπόστρωµα µπορεί να θεωρηθεί ως βιοτσιπ. Σε πρακτικούς όρους, ωστόσο, τα βιοτσιπς συχνά εµπεριέχουν αµφότερες τη µικροσκοπικοποίηση, συνήθως σε µορφή µικροδιάταξης, και τη δυνατότητα της µαζικής παραγωγής χαµηλού κόστους. Μερικά παραδείγµατα που απαντούν αυτές τις προϋποθέσεις περιλαµβάνουν την ηλεκτρονική µύτη ή τσιπ τεχνητής µύτης, την ηλεκτρονική γλώσσα, το τσιπ για τις αντιδράσεις της αλυσίδας της πολυµεράσης, το τσιπ µικροδιατάξεων για το DNA 64 (GeneChip), το πρωτεϊνικό τσιπ, και το βιοχηµικό lab-on-a-chip. Οι πιο δυναµικές έρευνες στα βιοτσιπς έχουν γίνει στο GeneChip και στο πρωτεϊνικό τσιπ. Ένα GeneChip αναφέρεται σε µια δισδιάστατη σειρά κυττάρων µικρής αντίδρασης (καθένα της τάξεως των 100x100µm) που έχει χαλκευτεί σε στερεό υπόστρωµα. Το στερεό υπόστρωµα µπορεί να είναι wafer πυριτίου, λεπτό στρώµα γυαλιού, πλαστική ή νάιλον µεµβράνη. Σε κάθε αντιδραστικό κύτταρο, ακινητοποιούνται τρισεκατοµµύρια πολυµερισµένων µορίων από τεµάχιο µονόκλωνου DNA ενός συγκεκριµένου είδους. Τα τεµάχια του DNA µπορούν είτε να είναι κοντές (περίπου 20 µε 25) σειρές βάσεων (A,T,G, και C) ή µακρύτεροι κλώνοι συµπληρωµατικού DNA (cDNA). Η συγκεκριµένη ακολουθία βάσεων (για παράδειγµα, CTATGC...) σε κάθε κύτταρο είναι προεπιλεγµένη ή σχεδιασµένη στηριζόµενη στη προοριζόµενη εφαρµογή. Οι γνωστές αλληλουχίες τεµαχίων µονόκλωνου DNA που ακινητοποιούνται στο υπόστρωµα συχνά καλούνται πρόβολοι (probes). Όταν άγνωστα τεµάχια δειγµάτων µονόκλωνου DNA, που καλούνται στόχος, αντιδρούν (ή διασταυρώνονται) µε τους προβόλους στο τσιπ, σχηµατίζονται τεµάχια δίκλωνου DNA εκεί όπου ο στόχος και ο πρόβολος είναι συµπληρωµατικοί σύµφωνα µε το κανόνα των ζευγών των βάσεων (η Α ζευγαρωµένη µε τη Τα, και η G µε τη C). Για να διευκολύνουµε τη διάγνωση ή ανάλυση στο διασταυρωµένο τσιπ, τα δείγµατα του στόχου συχνά χαρακτηρίζονται µε ετικέτες, όπως είναι µόρια που φθορίζουν, βαφές, ή µόρια ραδιο-ισοτόπων. Όταν οι στόχοι περιέχουν περισσότερους Εικόνα 24: Τα συστατικά και οι σχετιζόµενοι τεχνικοί τοµείς που εµπλέκονται στη τεχνολογία των βιοτσιπ. 65 από ένα τύπους δειγµάτων, το καθένα χαρακτηρίζεται µε τη δική του ξεχωριστή ετικέτα. Εξαρτώµενο από το µέγεθος της διάταξης, αυτό το είδος DNA τσιπ παρέχει µια πλατφόρµα όπου ο άγνωστος στόχος ή στόχοι µπορούν πιθανά να αναγνωριστούν µε πολύ υψηλή ταχύτητα και υψηλό συνολικό όγκο έργου συνδυάζοντας δεκάδες χιλιάδες διαφορετικού τύπου προβόλους µέσω υβριδοποίησης εκ παραλλήλου. Τα συστατικά που εµπλέκονται στην έρευνα και ανάπτυξη της τεχνολογίας των βιοτσιπ, και που συνδυάζονται µε τεχνικές αγωγές φαίνονται στη παρακάτω εικόνα. Η τεχνολογία των βιοτσιπ είναι φυσικά διεπιστηµονική: είναι απαραίτητη µια συνεργασία επιστηµόνων και µηχανικών διαφορετικών τοµέων γνώσεων για να ωθήσουν αυτή τη καινοφανή τεχνολογία από µια απλή εργαστηριακή περιέργεια σε πρακτικές συσκευές και συστήµατα. Σχεδόν όλες οι εφαρµογές της βιοτεχνολογίας ή της γενετικής µηχανικής που βασίζονται σε πληροφορίες σχετικές µε τις ακολουθίες του DNA θα ωφεληθούν από τη τεχνολογία του GeneChip. Πρόσφατη έρευνα και ανάπτυξη αυτής της τεχνολογίας έχει επικεντρωθεί σε εφαρµογές όπως η πρόγνωση και διάγνωση των γενετικών ασθενειών, ο σχεδιασµός φαρµάκων, οι δοκιµές αποτελεσµατικότητας των φαρµάκων, η τοξικολογία, και τα γενετικά γεωργικά προϊόντα. 6.2 ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΤΩΝ ΤΣΙΠ Έχουν προκύψει τρεις γενικές κατηγορίες βιοτσιπ: διατάξεις DNA βασισµένες σε πλάκες (plate-based DNA arrays), διατάξεις DNA βασισµένες σε τζέλ (gel-based DNA arrays) και τα βιοτσιπ µικρορευστοµηχανικής (microfluidic biochips). Τα δύο πρώτα χρησιµοποιούν ουσιαστικά τις ίδιες αρχές για να κατορθώσουν τον ίδιο σκοπό. Σε ένα υπόστρωµα όπως είναι µια γυάλινη πλάκα ή ένα πορώδες τζέλ, ο κατασκευαστής ακινητοποιεί τους προβόλους του βιοτσιπ, ένα µεγάλο σύνολο µονόκλωνων νουκλεϊνικών οξέων, καθένα από τα οποία µεταφέρει µια γνωστή γενετική ακολουθία. Στη πλάκα, για παράδειγµα, οι κλώνοι είναι καθέτως µπηγµένοι, ο ένας δίπλα στον άλλο σε ένα ευθύγραµµο πλέγµα. Στη συνέχεια προστίθεται ένα δείγµα προς εξέταση. Θα µπορούσε να είναι DNA αποµονωµένο (και διαχωρισµένο σε µονούς κλώνους) από ιστό, τροφή, έδαφος, αέρα, ή νερό, η σύνθεση του οποίου είναι άγνωστη. Σε ορισµένες θέσεις µέσα στο πλέγµα, συµβαίνουν διασταυρώσεις. Η ανάγνωση της εξόδου του βιοτσιπ είναι στην ουσία µια λίστα αυτών των περιπτώσεων. Κάθε περίπτωση κατοχυρώνει τη ταυτότητα ενός µικρού ζεύγους του κώδικα του άγνωστου DNA. Η τοποθεσία του ζεύγους µέσα στο DNA 66 παραµένει ακαθόριστη. Οι πρόβολοι, ωστόσο, έχουν επιλεχτεί για την εξέταση αλληλεπικαλυµµένων ακολουθιών. Έτσι όταν τα δεδοµένα του υβριδισµού ρυθµίζονται για µέγιστη αλληλοεπικάλυψη (από το λογισµικό ενός υπολογιστή), µπορεί να συναχθεί η ταυτότητα µιας πλήρης ακολουθίας. Εικόνα 25: Το βιοτσιπ σειρών DNA είναι στην ουσία µια µήτρα περιορισµένου µήκους, ακινητοποιηµένων, µονόκλωνων νουκλεϊνικών οξέων, κάθε ένα µε µια προκαθορισµένη θέση στη σειρά. Από το σχήµα των δεσµών από το ένα στο άλλο ανάµεσα σε αυτά τα οξέα, ένα δείγµα DNA άγνωστης σύνθεσης ίσως να αποκαλύψει την ίδια του την σύνθεση. Για µια συγκεκριµένη µεγάλου µήκους ακολουθία, το βιοτσιπ απαιτεί σειρές µε αλληλοεπικαλυπτόµενες ακολουθίες (στο πάνω τµήµα της εικόνας). Αυτές που φαίνονται είναι σχεδιασµένες να ταιριάξουν τις βάσεις 6 µε 11, 7 µε 12 κλπ. Για την δοκιµή όλων των πιθανών παραλλαγών των ελεύθερων βάσεων µιας φυσιολογικής ακολουθίας, χρειάζεται µια διαφορετική περίσσεια (στο κάτω τµήµα). Οι σειρές των ακολουθιών που απεικονίζονται συνδυάζουν την 6 στην 11 ακολουθία εκτός από το να έχουν όλες τις πιθανές βάσεις στην θέση 9. Επίσης ελέγχουν για διαγραφή της βάσης 9, δεδοµένου ότι η τελευταία σειρά αποτελείται από τις βάσεις 6 µε 12 µε την ένατη να λείπει. Για απλότητα, επίσης, φαίνεται µια µόνο σειρά από κάθε τύπο. Σε ένα πραγµατικό βιοτσιπ, ακινητοποιούνται πολλές πανοµοιότυπες σειρές νουκλεϊκών οξέων σε κάθε θέση της διάταξης. Τα επίκαιρα βιοτσιπ έχουν δεκάδες χιλιάδες προβόλους, ο καθένας µε µήκος των 10 µε 15 βάσεων. Μια τέτοια σειρά είναι επαρκή για την εξέταση ενός ξεχωριστού γονιδίου, όλου ή τµήµατος του µήκους του για παραλλαγές µιας µόνο βάσης από τη συνηθισµένη ακολουθία του γονιδίου. Συγκεκριµένα, τα GeneChips ανιχνεύουν παραλλαγές µιας µόνο βάσης στα ανθρώπινα γονίδια BRCA1 και BRC2 (σχετιζόµενα µε το καρκίνο του στήθους), p53 (γονίδιο καταστολής όγκων µεταλλαγµένο σε πολλές µορφές καρκίνου), και P450 (κωδικοποιεί ένα βασικό ηπατικό ενζυµικό σύστηµα που µεταβολίζει φάρµακα). Άλλα GeneChips αναλύουν το γονιδίωµα του HIV (ιός της ανθρώπινης ανοσο-ανεπάρκειας) για παραλλαγές εντός του κώδικα της ιογενής πρωτεάσης και της 67 ανάστροφης τρανσκριπτάσης. Ο σκοπός είναι να προβλέψουµε τις φαρµακευτικές αντοχές ενός δεδοµένου ιογενούς στελέχους ενός ασθενούς. Οι πρόβολοι στα βιοτσιπ σειρών DNA χρειάζονται για να επικαλύψουν το µήκος των εξεταζόµενων γονιδίων. Για την ανίχνευση παραλλαγών µονών βάσεων, πρόσθετος πλεονασµός. Για αυτό το σκοπό, οι πρόβολοι παρέχονται σε σετ των πέντε, στο οποίο οι πρόβολοι είναι πανοµοιότυποι µεταξύ τους εκτός από µια περιοχή µόνο κατά µήκος του µήκους τους, όπου ένας πρόβολος εξετάζεται για την Α, ο δεύτερος για την Τα, ο τρίτος για τη G, ο τέταρτος για τη C, και ο πέµπτος για κανένα νουκλεοτίδιο. Στην ουσία, λοιπόν, ένα τέτοιο βιοτσιπ δεν διεξάγει πραγµατικά ακολουθιακές αντιδράσεις. Αντί γι’ αυτό, εξετάζοντας ένα συγκεκριµένο γονίδιο, µπορεί να εξετάσει ταυτόχρονα µυριάδες παραλλαγές στο φυσιολογικό γονίδιο. Μια άλλη πιθανή µορφή ανάλυσης είναι να διερευνήσουµε τα σχήµατα της γονιδιακής έκφρασης απ’ την αρχή µέχρι το τέλος ενός γονιδίου. Για αυτό το σκοπό, οι πρόβολοι επιλέγονται να µην καλύπτουν το µήκος ενός ατοµικού γονιδίου αλλά να έχουν χαρακτηριστικές ακολουθίες διαφορετικών γονιδίων. Οποτεδήποτε ένα γονίδιο είναι ενεργό, κ κώδικας του αντιγράφεται σε µονόκλωνα αγγελιοφόρα µόρια RNAs, µέσω των οποίων το γονίδιο µεταδίδει τις εντολές του για τη κυτταρική βιοσύνθεση µιας συγκεκριµένης πρωτεΐνης. Συνεπώς το κυτόπλασµα ενός κυττάρου περιέχει µια ποικοιλία αγγελιοφόρων, κάτι που εξαρτάται από το ποια γονίδια κατά τη παρούσα περίοδο σε έργο. Οι διασταυρώσεις των αγγελιοφόρων µε µια ή άλλη χαρακτηριστική τµηµατική αλληλουχία σε ένα βιοτσιπ µπορεί να εξυπηρετήσει στη αποκάλυψη τέτοιων σχηµάτων. Η δοκιµή µπορεί να διευκολυνθεί µε ανάλυση των αντιπροσωπευτικών διαφορών, που συνδυάζει τα αποτελέσµατα δύο δειγµάτων ιστών. Η αφαίρεση του ενός συνόλου αποτελεσµάτων από το άλλο δείχνει ποια γονίδια είναι ενεργά στο ένα δείγµα αλλά λιγότερο ενεργά ή εντελώς ανενεργά στο άλλο. Η σύγκριση µπορεί να είναι µεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων, ή µεταξύ µεταστατικών και µη µεταστατικών καρκίνων. Με αυτό τον τρόπο, η εκτίµηση µπορεί να εντοπίσει µε ακρίβεια έναν ανώµαλο κυτταρικό µηχανισµό να συµβαίνει κυρίως ή αποκλειστικά σε άρρωστα κύτταρα. Η εκτίµηση µπορεί έτσι να εξυπηρετήσει όχι µόνο σαν διαγνωστικό µέσο αλλά επίσης σαν µέσο αναγνώρισης θεραπευτικών στόχων. Ο τύπος των βιοτσιπ που εναποµένει, το τσιπ µικρορευστοµηχανικής, είναι διαφορετικός από το προηγούµενο. Αντί να παρέχει προβόλους νουκλεϊνικού οξέος, προσφέρει κανάλια µέσω των οποίων µπορούν να ρέουν τα υγρά, τυπικά κάτω από την ώθηση ενός εφαρµοσµένου ηλεκτρικού πεδίου. Επίσης επιτρέπει τη µίξη των υγρών, 68 τυπικά σε ποσότητες νανολίτρων. ∆ύο υγρά µπορεί, για παράδειγµα, µπορεί να συγκλίνουν κατά µήκος των βραχέων βραχιόνων ενός συνόλου καναλιών σε σχήµα Y. Εκεί όπου συναντούνται, συµβαίνει µια αντίδραση, και τα προϊόντα ρέουν κάτω το άκρο του Y, για να εντοπιστούν στο µακρινό άκρο του καναλιού. Εναλλακτικά, το προκύπτων υγρό µπορεί να συναντήσει ένα δεύτερο αντιδραστήριο επιδιδόµενο σε µια επακόλουθη συνένωση και να υποβληθεί σε παραπέρα αντίδραση. Τα υγρά µπορούν να είναι διαλύµατα νουκλεϊνικών οξέων, τα οποία, όντας αρνητικά φορτισµένα, είναι υψηλής καταλληλότητας για προώθηση από ηλεκτρικά πεδία. Πράγµατι, τέτοια ώθηση θέτει την ηλεκτροφόρηση µε τζέλ ουσιαστική για επίκαιρες µεθόδους ανάλυσης της αλληλουχίας του DNA. Κατ’ αρχήν, εποµένως, η µικρορευστοµηχανική τεχνολογία θα µπορούσε από µόνη της να άγει στην ανάλυση Εικόνα 26: Η ενίσχυση του DNA µε PCR (polymerase chain reaction) αποδεικνύει την υψηλή ιδιαιτερότητα των αλληλεπιδράσεων των κλώνων νουκλεϊκών οξέων. Η µέθοδος θέτει σε εφαρµογή κυκλική θέρµανση και ψύξη σε ένα δείγµα δίκλωνου DNA, στην παρουσία µονόκλωνων ουσιών πρώτης επίχρυσης (primers) και µιας πολυµεράσης επιµήκυνσης του DNA. Κατά την διάρκεια κάθε 69 θέρµανσης, όλοι οι διπλοί κλώνοι διαχωρίζονται. Κατά την διάρκεια κάθε ψύξης, οι primers δεσµεύονται στους χωριστούς κλώνους, εφ’ όσον το DNA έχει αλληλουχίες χηµικά συµπληρωµατικές σε αυτές των primers. H πολυµεράση τότε µπορεί να ολοκληρώσει την αποκατάσταση των διπλών κλώνων. Η απεικόνιση δείχνει έναν ολοκληρωµένο πρώτο κύκλο, ο οποίος φτιάχνει δύο αντίγραφα του αρχικού DNA, και έπειτα ένα δεύτερο κύκλο, ο οποίος φτιάχνει τέσσερα αντίγραφα από δύο. Η PCR σύντοµα θα είναι εκτελέσιµη από τα βιοτσιπς. της ακολουθίας του DNA. Μπορεί επίσης να οδηγήσει σε PCR ενίσχυση του DNA. Προς τέτοιους στόχους, γίνονται προσπάθειες να επινοηθούν βιοτσιπς που θα ελέγχουν όχι µόνο τις ροές των αντιδραστηρίων αλλά επίσης τη θερµοκρασία (πχ τις περιοδικές θερµάνσεις και ψύξεις που απαιτούνται για την PCR) Οι ερευνητές ονειρεύονται ένα βιοτσιπ που θα µπορεί να µεγεθύνει το DNA και να προσδιορίζει την αλληλουχία του ή να το υποβάλλει σε άλλες δοκιµές. Τα νουκλεϊκά οξέα δεν είναι, ωστόσο, οι µόνες πιθανές ουσίες που ελέγχονται από ένα τσιπ µικρορευστοµηχανικής. Για παράδειγµα, µπορούν να διερευνηθούν και οι πρωτεΐνες. Έτσι η µικρορευστοµηχανική τεχνολογία µπορεί να ελέγξει κατά πόσο το αίµα ενός ασθενή περιέχει ένα συγκεκριµένο αντιγόνο ή κατ πόσο ένα αντιγόνο ενώνεται µε µια συγκεκριµένη πρωτεΐνη. Ανάµεσα σε τωρινούς τύπους βιοτσιπ, τα µικρορευστοµηχανικά τσιπ είναι τα µόνα που είναι ήδη ικανά για τέτοιες λειτουργίες. Ωστόσο, οι διατάξεις που βασίζονται σε τζέλ µπορεί σύντοµα να γίνουν ικανές για µη DNA εφαρµογές. Μια πιθανότητα που ήδη επιδιώκεται είναι µια πρωτεϊνική διάταξη σχεδιασµένη για την ανάλυση της δραστηριότητας ενός ενζύµου, ή της αλληλεπίδρασης ενός φαρµάκου µε προοριζόµενους (και απροµελέτητους) στόχους, ή των ιδιαιτεροτήτων ενός αντιγόνου. Τέτοιες αναλύσεις µπορεί να εξυπηρετήσουν όχι µόνο διαγνωστικές εξετάσεις αλλά επίσης την ανάπτυξη των φαρµάκων. 6.3 ΝΑΝΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ 6.3.1 Εισαγωγή Η Μητέρα Φύση είναι άριστη νανοτεχνολόγος και αυτό το βλέπουµε στο ότι το γενετικό υλικό (DNA) να αυτοσυγκεντρώσει µηχανισµούς σε νανοκλίµακα και να αποθηκεύσει Gbits πληροφοριών σε ένα µόνο κύτταρο. Για να τιθασεύσουµε αυτή την ενέργεια για νέες εφαρµογές στη νανοτεχνολογία χρειαζόµαστε ένα νανο/ βιο µόριο στη µακροδιασύνδεση. Η νανοτεχνολογία έχει εφαρµογές σε: α)Χηµικά εργοστάσια σε ένα τσιπ -Εκατοµµύρια εφικτά βήµατα σύνθεσης 70 -Θα µπορούσαν να αντικαταστήσουν τη σύνθεση εξετάσεων σε δοκιµαστικό σωλήνα β)DNA τσιπς -Γονιδιωµατικά -Προφίλ µονο-νουκλεοτιδικού πολυµορφισµού -Πρωτεϊνικά γ)Νανο-συναρµολόγηση -‘Πάντρεµα’ προσεγγίσεων στη νανοτεχνολογία -Μόριο προς µόριο κατασκευή νέων νανο-δοµών 6.3.2 Νανοαντλίες Για Προγραµµατιζόµενα Βιοτσιπς Μια πρωτότυπη τεχνολογία ενσωµατώνει αντλίες και βαλβίδες χωρίς κινούµενα µέρη πάνω στην επιφάνεια ενός τσιπ. Χρησιµοποιώντας αυτά τα οικοδοµήµατα που µπορούν να συνδυαστούν µε ένα συγκεκριµένο τρόπο, οι βιοχηµικές αντιδράσεις στο τσιπ µπορούν να ελεγχθούν ηλεκτρονικά. Εντούτοις, η συνέχιση της µικροσκοπικοποίησης απαιτεί ένα µεγάλο βήµα: Τη διάβαση του ορίου µεταξύ του ‘µακρο’ και ‘µικρο’. Εδώ, νέα φυσικά φαινόµενα, που είναι αµελητέα στο κόσµο της καθηµερινής ζωής γίνονται όλο και περισσότερο κυρίαρχα. Η επιφανειακή τάση για παράδειγµα υπερτερεί της βαρύτητας. Συµπιεσµένο µέσα σε σωλήνες µικροµεγέθους, το νερό ξαφνικά εµφανίζεται ηµίρρευστο όσο και το µέλι, κάνοντας τον έλεγχο των αντλιών δύσκολο ζήτηµα. Η ανάµειξη δύο υγρών στο µικρόκοσµο µοιάζει µε τη ζύµωση της ζύµης. Οι µηχανικοί έχουν προσπαθήσει να νικήσουν τους νόµους της φύσης στο κόσµο της µικρορευστοµηχανικής για λίγο. Ωστόσο, αυτοί οι νόµοι είναι πολύ ανθεκτικοί και πολλά νανο-υδραυλικά προβλήµατα παραµένουν άλυτα µέχρι τώρα. Υπάρχει όµως και µια διαφορετική στρατηγική: εάν δεν µπορείς να τα νικήσεις, συναρµόσου µαζί τους! Οι κυρίαρχες δυνάµεις στο νανόκοσµο θα πρέπει να είναι φίλοι και όχι εχθροί. Η αυτοοργάνωση και η αυτοσυναρµολόγηση είναι οι κύριες έννοιες για αυτή τη νέα γενιά των µικρορευστοµηχανικών συσκευών. Μικρά ποσά υγρών που κρατούνται σε κατοπτρικά πειραµατικά γυάλινα δοχεία µεταφέρονται κατά πλάτος της επιφάνειας ενός τσιπ, οδηγούµενα από επιφανειακά ακουστικά κύµατα. Είναι η επιφανειακή τάση που συγκρατεί τα αντιδραστήρια σε µικροσκοπικά σταγονίδια που σχηµατίζουν αυτά τα γυάλινα δοχεία. Ας σκεφτούµε ένα πλυντήριο αυτοκινήτων για συλλάβουµε αυτό το φαινόµενο: καθώς το αυτοκίνητο µας περνά µέσα από το 71 στεγνωτήρα ζεστού αέρα σχηµατίζονται σταγόνες στο καπό του αυτοκινήτου που γλιστράνε ολότελα µέχρι το πορτ-µπαγκάζ χωρίς να διαλυθούν. 6.4 ΡΕΥΣΤΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ 6.4.1 ∆ισδιάστατη Ρευστοµηχανική Η αυτογενής διαµόρφωση των σταγονιδίων για µικρά ποσά ρευστών προωθείται από την επιφανειακή τάση από τη µια πλευρά, από την άλλη όµως το µέγεθος και σχήµα τους ελέγχεται από τις χηµικές και φυσικές ιδιότητες της επιφάνειας πάνω στην οποία σχηµατίζονται. Οι αραχνοειδής ιστοί το καλοκαιρινό πρωινό είναι ένα άριστο παράδειγµα: Κάθε νήµα καλύπτεται µε µια σειρά δροσοσταλίδων, παρέχοντας τους κανόνες για το σχηµατισµό καλο-καθορισµένων µεγεθών. Σε αντιστοιχία προς το σχηµατισµό µιας µικρορευστοµηχανικής συσκευής, είναι έργο του επιστήµονα να κατασκευάσει µηχανικά σκοπίµως τις επιφανειακές ιδιότητες ενός τσιπ. Χρησιµοποιώντας τεχνάσµατα όπως η αυτοσυναρµολόγηση µονών στοιβάδων συγκεκριµένων χηµικών, ή δηµιουργώντας µια συγκεκριµένη νανο-δοµή στην επιφάνεια, µπορούµε να αρχίσουµε τη κατασκευή ρευστοµηχανικών αποτυπωµάτων, σαν την αποτύπωση κυκλωµάτων σε ηλεκτρονικό πίνακα. Με αυτό τον τρόπο, συγκεκριµένες περιοχές της επιφάνειας του τσιπ µπορούν να φτιαχτούν υδροφιλικές ή υδροφοβικές. Οι λιθογραφικές τεχνικές γνωστές από τη κατασκευή των ηµιαγωγών µπορούν να χρησιµοποιηθούν για να δώσουν σε αυτά τα αποτυπώµατα πιο επιθυµητό σχήµα. Μπορούν να δηµιουργηθούν βιβλιοθήκες τεχνικών µελετών-δοµηµένες µήτρες διαµόρφωσης για πολύπλοκα δισδιάστατα δίκτυα ρευστών. Σε αυτά τα αποτυπώµατα περικλείονται µικρά ποσά αντιδραστηρίων, χωρίς τους µηχανικούς φραγµούς που χρησιµοποιούνται στη συµβατική µικρορευστοµηχανική. Επιπλέον, τέτοιες δισδιάστατες υγρής κατάστασης δοµές είναι πολύ εύκολο να κατασκευαστούν σε χαµηλό κόστος, παράγοντας κλειδί για εµπορευµατοποίηση. Οι συµβατικές αντλίες, φυσικά, είναι ανώφελες να ενεργοποιήσουν το υγρό στην ευρεία αυτή έκταση των δισδιάστατων εργαστηρίων. Οι ερευνητές διατύπωσαν µια τελείως διαφορετική ιδέα: την ενσωµάτωση των µικροαντλιών σε υπόστρωµα ίδιο µε αυτό του τσιπ. Χρησιµοποιώντας ένα πιεζοηλεκτρικό υλικό για τσιπ παράγουν τα επονοµαζόµενα επιφανειακά ακουστικά κύµατα (SAW) εφαρµόζοντας σήµατα ραδιοσυχνότητας σε ειδικά σχεδιασµένα ηλεκτρόδια. Αυτά τα κύµατα διαδίδονται κατά µήκος του υποστρώµατος όπως κάνουν οι σεισµοί, µεταφέροντας υγρή και στερεά ύλη στην επιφάνεια του τσιπ. Οι συσκευές SAW υπάρχουν στις τηλεπικοινωνιακές διατάξεις 72 κυκλωµάτων για χρόνια, κάθε κινητό τηλέφωνο έχει φίλτρα που χρησιµοποιούν το φαινόµενο. Ένα ηλεκτρικό σήµα που τροφοδοτείται σε µορφοµετατροπείς στην επιφάνεια του τσιπ, µετατρέπεται σε παραµόρφωση του κρυστάλλου που βρίσκεται από κάτω. ∆ίνοντας τη σωστή συχνότητα του σήµατος, προωθείται κατά µήκος του τσιπ ένα µηχανικό κύµα. Έχοντας µήκη κύµατος λίγων µικρών και εύρος του ενός µόνο νανόµετρου, οι δυνάµεις εντός του νανοσεισµού είναι αρκετές για να έχουµε µια µακροσκοπική επίδραση. Οποιοδήποτε κοµµάτι ύλης στην επιφάνεια κατά µήκος της διαδροµής τους υφίσταται τη παλλόµενη τους δύναµη: ηµίρρευστα υλικά όπως τα υγρά απορροφούν πολύ από την ενέργεια τους. Χαµηλής ενέργειας SAW προκαλεί µια εσωτερική ροή µέσα στις ποσότητες των αντιδραστηρίων, SAW µεγαλύτερου εύρους κινούν τα σταγονίδια ολόκληρα. 6.4.2 Η Απώτερη Πλευρά Της Μικρορευστοµηχανικής Τεχνολογίας Τέτοιες νανο-αντλίες που βασίζονται στη SAW τεχνολογία δεν έχουν κινούµενα µέρη. Μπορούν να κατασκευαστούν µε µια απλή λιθογραφική επεξεργασία, περίπου όπως είναι η µεταλλοποίηση των τσιπ για υπολογιστές. Η ίδια τεχνολογία µπορεί να χρησιµοποιηθεί για το προσδιορισµό των ρευστών αποτυπωµάτων. Η παρακάτω εικόνα απεικονίζει το βασικό µηχανισµό πίσω από τη προκαλούµενη ροή των SAW ενός υγρού στην επιφάνεια ενός τσιπ. Στη παρακάτω εικόνα βλέπουµε τρία στιγµιότυπα ενός σταγονιδίου που µεταφέρεται από ένα νανο-σεισµό κατά µήκος του τσιπ. Η ποσότητα αυτού του σταγονιδίου είναι περίπου 50 νανόλιτρα (10-9 λίτρα). Τα κύµατα SAW µας επιτρέπουν να κατασκευάσουµε τους µικρότερους αναµικτήρες στο κόσµο επίσης. Σε χαµηλά επίπεδα ενέργειας, τα SAW µετατρέπονται σε µια εσωτερική ροή µέσα στο σταγονίδιο. Κυρίως, εάν η συχνότητα του SAW αλλάξει κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, προκύπτουν και υπερθέτονται διαφορετικά σχήµατα ροής, κάτι που οδηγεί σε εν µέρει χαοτική µίξη. Αυτή είναι µια σηµαντική ανακάλυψη στο πεδίο της µικρορευστοµηχανικής: η ανάµειξη και η ανάδευση, όσο απλό και αν ακούγεται, είναι µια από τις µεγαλύτερες προκλήσεις. Ντουζίνες διαφορετικών τεχνικών έχουν σχεδιαστεί για να ξεπεράσουν τους κανόνες στο µικρόκοσµο. Ωστόσο, οι περισσότερες αναµείξεις των υγρών χαµηλής ποσότητας έχουν µείνει ακόµα στη διάχυση, µια αργή µάλλον διαδικασία, όπως ξέρει ο οποιοσδήποτε που έχει περιµένει ποτέ τη ζάχαρη να διαλυθεί στο καφέ του από έλλειψη κουταλιού. Στη παρακάτω εικόνα βλέπουµε µια χρονο-σειρά ενός τέτοιου αναδευτήρα εν λειτουργία: Μια φθορίζουσα 73 βαφή στην επιφάνεια ενός τσιπ καλύπτεται µε ένα µικρό σταγονίδιο νερού. Κάτω από την επιρροή του SAW η βαφή διαλύεται γρήγορα φωτίζοντας το σταγονίδιο οµοιογενώς. Εικόνα 27: Συνδυασµός νανόλιτρων: ρευστοποιηµένη φθορίζουσα βαφή ενααποθετηµένη στην επιφάνεια του τσιπ. Συνδυασµός του ρευστού που προκαλείται ακουστικά οδηγεί σε οµογενές µίγµα του wafer και της βαφής. Μια πρώτη εφαρµογή για τη µετάδοση της κίνησης των µικρορευστοµηχανική SAW είναι στη η ‘ArrayBooster’, ένας σταθµός υβριδισµού µικροσυνόλων. Φέρνει πρότυπο DNA η µικροσύνολα πρωτεϊνών σε στενή επαφή µε ένα τσιπ ανάµειξης SAW κυµάτων. Η αποδοτική αναταραχή του υγρού δείγµατος κατά τη διάρκεια της εκκόλαψης επιταχύνει σηµαντικά τον υβριδισµό. Επιπλέον, η οµοιογένεια των φθοριζόντων σηµάτων κατά µήκος ιδιαίτερων θέσεων ενισχύεται σε µεγάλο βαθµό, και οι διακυµάνσεις από σηµείο σε σηµείο µειώνονται. Το όργανο προβλέπεται για ελάχιστη ποσότητα δείγµατος µέχρι 10 µικρόλιτρα. Ο συνδυασµός της πλευρικής διαµόρφωσης των ιδιοτήτων υγρής κατάστασης της επιφάνειας ενός τσιπ και της ενεργοποίησης των SAW αποτελεί µια εφικτή τεχνολογία για µεγάλη ποικιλία πιθανών εφαρµογών στη βιολογική ή χηµική έρευνα. Η εικόνα που βλέπουµε στη συνέχεια περιγράφει ένα υπερµικροσκοπικό πανοµοιότυπο διανεµητή. Μια λειτουργική, δοµή σε στιλ άβακα σε ένα τµήµα της επιφάνειας διαχωρίζει πολύ µικρά ποσά υγρών [20 πικόλιτρα (10-12 λίτρα) σε αυτή τη περίπτωση] από µια µεγαλύτερη ποσότητα [50 νανόλιτρα (10-9 λίτρα)] που ωθείται κατά µήκος του άβακα από τα SAW κύµατα. Μια πολύ ακριβής διαµόρφωση υπερµικρών σταγονιδίων αφήνεται πίσω στο τσιπ, έτοιµη για παραπέρα αντιδράσεις. 74 Τα λειτουργικά µπλόκα του δισδιάστατου ρευστοµηχανικού δικτύου µπορούν εύκολα να συναρµολογηθούν επεξεργαστών για τη ρευστοµηχανικής. κατασκευή πολύπλοκων, ∆ιαφορετικά προγραµµατιζόµενων αντιδραστήρια αναµιγνύονται, διαχωρίζονται ή κινούνται σε διαφορετικές θέσεις αντίδρασης. Ακόµα και ξεχωριστά κύτταρα µπορούν να ελεγχθούν από µικροαντλίες, µέσω ελέγχου από ένα υπολογιστή. Σαν πρώτο παράδειγµα ένας τέτοιος µικρορευστοµηχανικός επεξεργαστής φαίνεται στην επόµενη εικόνα. Εδώ, απεικονίζεται ένα νανο-τσιπ τιτλοποίησης, πάνω στο οποίο ένα µικρό τµήµα άγνωστου τιτλοποιού (πράσινο) προσθέτεται στον αναλύτη (κόκκινο). Από τη στιγµή που θα προσεγγιστεί µια συγκέντρωση κρίσιµης µάζας, µπορεί να ανιχνευθεί, για παράδειγµα από µια αλλαγή χρώµατος του αναλύτη, ή µια αλλαγή της αγωγιµότητας. Αυτό θα µπορούσε να µετρηθεί εύκολα από ένα αισθητήρα ενσωµατωµένο στο ίδιο τσιπ. Εικόνα 28: Απεικόνιση ενός νάνο τσιπ τιτλοποίησης (προσδιορισµός δεδοµένου συστατικού διαλύµατος µε προσθήκη υγρού αντιδραστηρίου γνωστής ισχύος, µέχρις ότου ληφθεί το τελικό σηµείο, όταν όλο το συστατικό έχει καταναλωθεί µε την αντίδραση του µε το αντιδραστήριο). Στο ρευστό κύκλωµα ένα µικρό τµήµα διαλύµατος τιτλοποίησης ( πράσινο0 διαχωρίζεται από ένα µεγαλύτερης ποσότητας. Ένα SAW µεταφέρει αυτή την ποσότητα προς τον αναλύτη (κόκκινο) στην θέση αντίδρασης. Οι δοµές στην περιφέρεια του τσιπ αντιπροσωπεύουν τους µορφοµετατροπείς, ενεργώντας σαν µικροαντλίες χωρίς κινούµενα µέρη. 6.5 ΠΑΡΑ∆ΕΙΓΜΑΤΑ 6.5.1 Τσιπ Για Τη Παρακολούθηση Κάθε Βήµατος Μας (Περπάτηµα) Και Των Σωµατικών Υγρών Μας Οι ιατρικοί ερευνητές δουλεύουν για την ενσωµάτωση τσιπ και ανθρώπων εδώ και πολλά χρόνια, συχνά παίρνοντας τµήµατα από γνωστές ηλεκτρονικές συσκευές. Έχουν 75 χρησιµοποιήσει αντιστάσεις ευαίσθητες στη πίεση όπως αυτές που βρίσκονται στα κουµπιά φούρνων µικροκυµάτων σαν χρονοδιακόπτες. Αυτό που έχουν κάνει είναι να τοποθετήσουν ένα αισθητήρα στη φτέρνα ενός παπουτσιού, και ένα άλλο σε ένα δάχτυλο του ανθρώπινου ποδιού, έπειτα πρόσθεσαν έναν υπολογιστή στον αστράγαλο για να υπολογίσουν τη διάρκεια κάθε δρασκελισµού. Νέα, υγιή άτοµα µπορούν να ρυθµίσουν τη διάρκεια κάθε βήµατος µε µεγάλη ακρίβεια. Αλλά ασθενείς µεγαλύτερης ηλικίας επιρρεπείς σε συχνές πτώσεις έχουν εξαιρετικά µεταβλητούς χρόνους βηµατισµού, ένας δείκτης που θα µπορούσε να δείχνει ανάγκη για περισσότερο ενδυναµωτικές ασκήσεις ή αλλαγή φαρµακευτικής αγωγής. Το σύστηµα αυτό χρησιµοποιείται επίσης για το καθορισµό της επιτυχίας µιας θεραπείας για συµφορητική καρδιακή ανεπάρκεια. Παρακολουθώντας τον αριθµό των βηµατισµών που κάνει ένα άτοµο, οι ερευνητές µπορούν να µετρήσουν απ’ ευθείας το επίπεδο δραστηριότητας του ασθενούς, παρακάµπτοντας τη συχνά ατελή εκτίµηση που γίνεται από τον ίδιο τον ασθενή. Κάποια από αυτά τα τσιπ είναι εξωτερικά αλλά έχει προταθεί και ένα τσιπ (S4MS) το οποίο θα είναι εισαγόµενο κάτω από το δέρµα. Το τσιπ θα επιτρέψει στους διαβητικούς να παρακολουθούν εύκολα το επίπεδο της γλυκόζης στο αίµα τους. Οι διαβητικοί κατά τη παρούσα περίοδο χρησιµοποιούν ένα επιδερµικό σηµάδι κεντραρίσµατος και ένα τεστ αίµατος που το κρατούν στα χέρια τους, και τότε χορηγούν στον εαυτό τους ινσουλίνη ανάλογα µε το αποτέλεσµα. Το σύστηµα είναι απλό και δουλεύει καλά, αλλά η ανάγκη της εξαγωγής αίµατος σηµαίνει ότι οι περισσότεροι διαβητικοί δεν εξετάζουν τους εαυτούς τους τόσο συχνά όσο θα έπρεπε. Αν και ίσως να τη γλιτώσουν µε αυτό βραχυπρόθεσµα, αργότερα στη ζωή αυτοί που ελεγχόντουσαν σποραδικά υποφέρουν από τύφλωση, απώλεια της κυκλοφορίας του αίµατος, και άλλες επιπλοκές. Η λύση είναι πιο συχνός έλεγχος, χρησιµοποιώντας µια λιγότερο επεµβατική µέθοδος. Πολλές εταιρίες προσπαθούν να εξάγουν το απαιτούµενο σωµατικό υγρό, χρησιµοποιώντας είτε ηλεκτρικό ρεύµα ή ένα µικροσκοπικό πόρο προκαλούµενο από laser ή µια µικρή βελόνα. Όλες αυτές οι προσεγγίσεις βελτιώνουν την άντληση του αίµατος, αλλά ακόµα απαιτούν χειρισµό του δέρµατος, και το δέρµα µπορεί να αναστατωθεί. Το S4MS τσιπ, ωστόσο, θα εφαρµόσει κάτω από το δέρµα, θα εντοπίσει το επίπεδο της γλυκόζης, και θα στείλει το αποτέλεσµα πίσω έξω µε επικοινωνία ραδιοσυχνοτήτων. Μια δίοδος εκπεµπόµενου φωτός (LED) αρχίζει τη διαδικασία ανίχνευσης. Το φως που παράγει προσκρούει µια χηµική ουσία που φθορίζει: η οποία απορροφά το εισερχόµενο φως και το ξανα-εκπέµπει σε µεγαλύτερο µήκος κύµατος. Το µεγαλύτερο µήκος κύµατος φωτός τότε ανιχνεύεται, και το αποτέλεσµα στέλνεται σε ένα ταµπλό ελέγχου έξω από το σώµα. Η γλυκόζη ανιχνεύεται επειδή η ζάχαρη µειώνει το ποσό του 76 φωτός που ξανα-εκπέµπει η φθορίζουσα χηµική ουσία. Το S4MS αναπτύσσει ακόµα το τέλειο φθορίζων χηµικό, αλλά το ‘κλειδί’ στο καινοτοµικό σχεδιασµό του S4MS τσιπ έχει υπολογιστεί πλήρως. Η ιδέα είναι απλή: το LED βρίσκεται σε µια µεγάλη ποσότητα φθοριζόντων µορίων. Στους περισσότερους ανιχνευτές η πηγή φωτός είναι µακριά από τα φθορίζοντα µόρια, και η µειονεκτικότητα που εµπίπτει µε αυτό σηµαίνει περισσότερη ενέργεια και µεγαλύτερες συσκευές. Το πρωτότυπο S4MS τσιπ χρησιµοποιεί ένα 22µW LED, σχεδόν σαράντα φορές λιγότερο ισχυρό από τα µικροσκοπικά ενεργειακά κουµπιά στο πληκτρολόγιο ενός υπολογιστή. Οι χαµηλές ενεργειακές απαιτήσεις σηµαίνουν ότι η ενέργεια µπορεί να προµηθευτεί από έξω, από µια διαδικασία που λέγεται επαγωγή. Η φθορίζουσα ανίχνευση από µόνη της δεν καταναλώνει χηµικά ή πρωτεΐνες, έτσι η συσκευή είναι αυτοσυντηρούµενη. Εικόνα 29:Το S4MS τσιπ για την ανίχνευση οξυγόνου και γλυκόζης. Φως που παράγεται από την εκπεµπόµενου φωτός δίοδο (LED) προκαλεί το φθορισµό των περιβαλλόντων µορίων. Το φως που αναδύεται έχει νέο µήκος κύµατος, και µόνο αυτό το φως περνά µέσα από το φίλτρο για να ανιχνευτεί από τη φωτοδίοδο. Το οξυγόνο ή η γλυκόζη µειώνει το φθορισµό των µορίων στη κορυφή του ‘αποθέµατος’ . Υπάρχει επίσης ένα µοντέλο αισθητήρα οξυγόνου που χρησιµοποιεί την ίδια διάταξη. Με την τωρινή του διάταξη κυκλωµάτων είναι περίπου στο µέγεθος ενός µεγάλου κουµπιού από πουκάµισο, αλλά το τελικό wafer πυριτίου θα είναι λιγότερο από ένα µιλιµετρικό τετράγωνο. Ο αισθητήρας οξυγόνου θα είναι χρήσιµος όχι µόνο για τη παρακολούθηση της αναπνοής σε µονάδες εντατικής φροντίδας, αλλά επίσης για τον έλεγχο των πακέτων τροφής, ή δοχείων ηµιαγωγών που φυλάσσουν αέριο αζώτου. Αναπτύσσεται ακόµα ένα τσιπ που να ανιχνεύει το οξυγόνο, αλλά αυτή η εκδοχή στέλνει 77 φωτεινούς παλµούς στο σώµα. Το φως απορροφάται σε διάφορες ευρύτητες, κάτι που εξαρτάται από το πόσο οξυγόνο µεταφέρεται στο αίµα, και το τσιπ ανιχνεύει το φως που παραµένει. Ανιχνεύονται επίσης οι συρροές αίµατος που αντλούνται από τη καρδιά, έτσι το ίδιο τσιπ είναι και όργανο παρακολούθησης των παλµών. 6.5.2 Εγχείρηση Εγκεφάλου Με ∆ιακόπτη On-Off Οι καρδιακοί βηµατοδότες χρησιµοποιούν την εξής προσέγγιση: µεγάλα έντονα ξαφνιάσµατα ηλεκτρισµού για να συγχρονιστεί η άντληση της καρδιάς. Οι ηλεκτρικοί παλµοί του εµφυτεύµατος Activa κατευθύνονται όχι στη καρδιά αλλά στον εγκέφαλο. ∆ιακόπτουν τα εγκεφαλικά σήµατα που προκαλούν τις ανεξέλεγκτες κινήσεις, ή ρίγη, που σχετίζονται µε ασθένειες όπως αυτή του Parkinson. Η φαρµακευτική θεραπεία για την ασθένεια του Parkinson στοχεύει στην αντικατάσταση του εγκεφαλικού αγγελιοφόρου ντοπαµίνης, ένα προϊόν των εγκεφαλικών κυττάρων που πεθαίνουν. Αλλά τελικά οι φαρµακευτικές επιδράσεις υφίστανται βαθµιαία φθορά, και οι σπασµωδικές κινήσεις επανέρχονται. Μια άλλη δυνατότητα είναι η αποµάκρυνση ενός τµήµατος του θαλάµου, µια εγκεφαλική δοµή που πυροδοτεί τα ρίγη. Το εµφύτευµα, είναι µια νέα εναλλακτική που χρησιµοποιεί ηλεκτρικούς παλµούς υψηλής συχνότητας για να αποµονώσει αντιστρεπτά τον θάλαµο. Έχει τα ίδια οφέλη µε τη θαλαµοτοµή (την εγχείρηση εγκεφάλου) χωρίς τα ρίσκα. Η εγχείρηση εµφύτευσης είναι πολύ λιγότερο τραυµατική από την θαλαµοτοµή, και εάν υπάρξουν µετεγχειρητικά προβλήµατα ο διεγέρτης (παράγοντας που προκαλεί λειτουργική δραστηριότητα) µπορεί εύκολα να διακοπεί. 6.5.3 Επαναφορά Των Αισθήσεων Το εµφύτευµα Activa προκαλεί περισπασµό σε ασυνήθιστη εγκεφαλική λειτουργικότητα. Οι πιο φιλόδοξοι βιοµηχανικοί προσπαθούν να επαναφέρουν εγκεφαλικές λειτουργίες, αποκαθιστώντας την όραση και την ακοή εκεί όπου υπήρχε σκοτάδι και σιωπή. Το επιτυχηµένο επίτευγµα σε αυτό το πεδίο είναι το κοχλιακό εµφύτευµα. Οι περισσότερες ακουστικές βοήθειες προσδίδουν υπερβολική αίγλη στους ενισχυτές, αλλά το κοχλιακό εµφύτευµα είναι για ασθενείς που έχουν χάσει τα τριχοειδή κύτταρα που εντοπίζουν τα ακουστικά κύµατα. Για αυτά τα άτοµα, κανένα ποσό ενίσχυσης δεν είναι αρκετό. 78 Εικόνα 30: Το κοχλιακό εµφύτευµα Clarion. Ο ήχος λαµβάνεται από ένα µικρόφωνο, το οποίο επεξεργάζεται από ένα µίνιο-υπολογιστή (δεν φαίνεται στην εικόνα), και τότε µεταδίδονται ηλεκτρικά σήµατα στο εµφύτευµα µέσω µετάδοσης µε ραδιοσυχνότητα. Μετά την αποκρυπτογράφηση του σήµατος, τα σύνθετα ηλεκτρόδια ενεργοποιούν κατ’ ευθείαν τα νευρικά κύτταρα που µεταδίδουν τις ηχητικές πληροφορίες στον εγκέφαλο Το κοχλιακό εµφύτευµα χορηγεί ηλεκτρικούς παλµούς απευθείας στα νευρικά κύτταρα του κοχλία, την ελικοειδής διαµόρφωσης δοµή που µεταφράζει τον ήχο σε νευρικούς παλµούς. Σε άτοµα φυσιολογικής ακοής, τα ακουστικά κύµατα δηµιουργούν δονήσεις στα τοιχώµατα του κοχλία, και τα τριχοειδή κύτταρα ανιχνεύουν αυτές τις δονήσεις. Θόρυβοι υψηλής συχνότητας (βαθιές νότες) δονούν τη βάση του κοχλία, ενώ οι νότες χαµηλής συχνότητας δονούν πιο κοντά στη κορυφή του κοχλία. Το εµφύτευµα µιµείται τη δουλειά των τριχοειδών κυττάρων. Προκαλεί διάσπαση των συχνοτήτων των εισερχόµενων θορύβων σε έναν αριθµό καναλιών (τυπικά οχτώ), και τότε διεγείρει το κατάλληλο τµήµα του κοχλία. Τα δύο πιο επιτυχηµένα εµφυτεύµατα είναι το Clarion(αναπτύχθηκε από το πανεπιστήµιο της Καλιφόρνια στο San Francisco) και το Nucleus (αναπτύχθηκε από το πανεπιστήµιο της Μελβούρνης στην Αυστραλία). Οι αναβαθµίσεις εστιάζονται σε µεγάλο βαθµό στη βελτίωση του λογισµικού επεξεργασίας του λόγου, το οποίο χειρίζεται 79 από ένα µίνι υπολογιστή που φοριέται στη ζώνη του ασθενούς. Θεωρητικά, αυξάνοντας τον αριθµό των καναλιών (και των ηλεκτροδίων) θα µπορούσε να βελτιωθεί η αντίληψη του λόγου. Αλλά ο λόγος αντιλαµβάνεται σε µια περιοχή του κοχλία µόνο 14 mm µήκους, και η τοποθέτηση των ηλεκτροδίων πολύ κοντά το ένα µε το άλλο προκαλεί την αιµορραγία των σηµάτων από το ένα κανάλι στο άλλο. Το αποτέλεσµα είναι µια διαφορετική απόδοση του λόγου (κάτι σαν εκτεταµένο βούρτσισµα). Ενώ µερικοί παραλήπτες των συσκευών αναφέρουν ήχους που να µοιάζουν µε λόγο, πολλοί χαρακτηρίζουν το καινούργιο τους κόσµο σα να κατοικείται από πλήθη παπιών που κράζουν ή σα βροντοχτύπηµα από κονσερβοκούτια. Αλλά η επιτυχία είναι αναµφισβήτητη. Τα δύο τρίτα των ασθενών (µε πιο πρόσφατα µοντέλα) µπορούν να καταλάβουν τον λόγο χωρίς να διαβάζουν τα χείλη. Με τη µερική τουλάχιστον υπερνίκηση της κώφωσης, ο επόµενος λογικός στόχος είναι το µάτι. Αρκετές οµάδες δουλεύουν σε εµφυτευόµενα τσιπ που µιµούνται τη δράση των φωτουποδοχέων, τα κύτταρα που ανιχνεύουν το φως στο πίσω µέρος του οφθαλµού. Οι φωτουποδοχείς έχουν χαθεί τόσο στην αµφιβληστροειδίτιδα (φλεγµονή του αµφιβληστροειδή), µια γενετική ασθένεια, όσο και στον εκφυλισµό της κηλίδας από τη πάροδο του χρόνου, η πιο συνηθισµένη αιτία απώλειας της όρασης στον αναπτυγµένο κόσµο. Οι ερευνητές έχουν φτιάξει ένα τσιπ του 1mm2 µε 20 ηλεκτρόδια, και το εµφύτευσαν στο πίσω τµήµα του οφθαλµού κουνελιών. Το αυθεντικό τσιπ, πάχους µιας ανθρώπινης τρίχας, βάζει πολύ ένταση στο µάτι, έτσι ώστε η νέα απόδοση είναι δέκα φορές πιο λεπτή. Το τελικό στήσιµο θα περιλαµβάνει µια µικροσκοπική κάµερα τοποθετηµένη σε ένα ζευγάρι γυαλιά. Η κάµερα θα ανιχνεύει και θα κρυπτογραφεί το σκηνικό, τότε θα το στέλνει µέσα στο µάτι σαν παλµό laser, µε το laser να παρέχει επίσης την ενέργεια για το χειρισµό του τσιπ. Οι ερευνητές έχουν επιβεβαιώσει ότι αυτή η µικρή διάταξη των υποδοχέων φωτός (φωτοδιόδων) µπορεί να παράγει αρκετό ηλεκτρισµό για να λειτουργήσει το τσιπ. Έχουν επίσης βρεί ότι το ποσό του ηλεκτρισµού που χρειάζεται για τη διέγερση ενός νευρικού κυττάρου σε δράση είναι περίπου 100 φορές χαµηλότερη στο µάτι από ότι στο αυτί, έτσι τα ρεύµατα µπορούν να είναι µικρότερα, και τα ηλεκτρόδια πιο κοντά τοποθετηµένα. Προς το παρόν η παροχή ενέργειας προέρχεται από ένα καλώδιο που εισάγεται κατευθείαν µέσα στο µάτι και, χρησιµοποιώντας αυτή τη συσκευή, οι ερευνητές έχουν ανιχνεύσει σήµατα που φτάνουν τον εγκέφαλο. Ξέρουν ότι µπορούν να πάρουν οπτικές πληροφορίες στον εγκέφαλο, λένε, αλλά δεν ξέρουν τι είδους όραση θα καταλήξει αυτό. 80 Η προσέγγιση υπό τον αµφιβληστροειδή πιο στενά µιµείται τη δράση των χαµένων φωτουποδοχέων. Το τσιπ παραδίνει το µήνυµα του στη πηγή, πριν κάνουν κάποια πολύπλοκη επεξεργασία παρεµβαίνοντα στρώµατα αµφιβληστροειδικών νευρικών κυττάρων. Πιστεύεται ότι ο υλικός εξοπλισµός του τσιπ θα είναι ικανός να αντισταθµίσει αυτούς τους υπολογισµούς. Η πρώτη µεγάλη επίδειξη δοκιµής ότι µια συσκευή ελάχιστης ενέργειας µπορεί να δώσει αληθινά οπτικά σήµατα είναι έτοιµη να γίνει. 6.5.4 ∆ιάγνωση Πάνω Σε Τσιπ Ένα µικροσκοπικό βιοτσιπ που σχεδιάστηκε τον προηγούµενο χρόνο θα βοηθήσει τους ερευνητές στη Νικαράγουα να καταλάβουν και να ελέγξουν µια τροπική ασθένεια που επιφέρει αναπηρία σε 100 εκατοµµύρια ανθρώπους κάθε χρόνο. Με τη συγχώνευση της µικροβιολογίας και των µικροδιατάξεων κυκλωµάτων έχει δηµιουργηθεί ένας ανοσοαισθητήρας σχήµατος τετραγώνου των 2mm ο οποίος παρέχει ένα γρήγορο και φθηνό τεστ για τον ιό του ∆άγγειου πυρετού (µια λοιµώδης εξανθηµατική εµπύρετος ιογενής νόσος των τροπικών περιοχών, µεταδίδεται µε τους κώνωπες Aedes), γνωστός συνήθως ως ‘break-bone fever’, ακόµα και εάν το πλησιέστερο κλινικό εργαστήριο βρίσκεται εκατοντάδες µίλια µακριά. Στον τρίτο κόσµο δεν υπάρχουν πολλά ειδικευµένα εργαστήρια που µπορούν να εξετάσουν αυτά τα δείγµατα αίµατος, πολλές περιοχές δεν έχουν ούτε τη ποιότητα νερού που χρειάζεται για τα παραδοσιακά τεστ. Η λύση ήταν να τοποθετηθεί το εργαστήριο πάνω στο τσιπ, σε κόστος λιγότερο του 1$ το καθένα. Στη πραγµατικότητα, αυτό το διάστηµα έχουν ετοιµαστεί 1.000 ανοσοαισθητήρες για να αποσταλούν στη Νικαράγουα για να προλάβουν το ∆άγγειο πυρετό. ∆ιαδιδόµενος από κουνούπια, ο ∆άγγειος πυρετός προκαλεί έντονους πονοκεφάλους, σφοδρό πυρετό, εξανθήµατα, και σε νήπια κίνδυνο θανάτου. Κατά τη παρούσα περίοδο, ασθένειες όπως ο ∆άγγειος ιός ανιχνεύονται µε ένα τεστ που καλείται ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), το οποίο εντοπίζει αντιγόνα και αντισώµατα στο αιµατολογικό δείγµα. Τα αντισώµατα διαµορφώνονται στο σώµα σε απάντηση των αντιγόνων- µορίων, συχνά άγνωστα, τα οποία το ανοσολογικό σύστηµα αναγνωρίζει σαν απειλή. Για κάθε αντιγόνο, υπάρχει ένα αντίσωµα που δεσµεύεται σε αυτό. Είναι αυτή η βιοχηµική αντίδραση που σηµατοδοτεί το ανοσολογικό σύστηµα να αρχίσει να καταπολεµά µια ασθένεια. Με το ELISA, προστίθεται στο δείγµα ένα ένζυµο που ενεργοποιεί µια ορατά χρωµατισµένη βαφή στη παρουσία ενός συγκεκριµένου αντιγόνου ή αντισώµατος. 81 Στη θέση των ρυπαρών ενζύµων και βαφών, ο ανοσοαισθητήρας χρησιµοποιεί µαγνητισµό και µικροηλεκτρονική. Εικόνα 31: Αυτή η απεικόνιση περιγράφει πώς τα αντιγόνα δεσµεύονται επίσης στα µαγνητικά σταγονίδια και στους µαγνητικούς αισθητήρες, που λέγονται αισθητήρες Hall, στην επιφάνεια του τσιπ. Πρώτα, µια σταγόνα αίµατος τοποθετείται σε ένα φρεάτιο, µεγέθους της τάξεως του εκατοµµυριοστόµετρου, πάνω στο τσιπ. Εκεί, αναµιγνύεται µε µικροσκοπικά µαγνητικά σταγονίδια του ίδιου µεγέθους, προ-επιστρωµένα µε ένα αντίσωµα που συνενώνεται στο ενδεικτικό αντιγόνο µιας συγκεκριµένης νόσου. Εάν τα αντιγόνα είναι στο αιµατολογικά δείγµα, τα σταγονίδια γραπώνονται πάνω τους. Τότε, η βαρύτητα προκαλεί τη πτώση των σταγονιδίων πάνω σε µια µικροσκοπική διάταξη 256 µαγνητικών αισθητήρων στο βάθος του φρεατίου. Η διάταξη των αισθητήρων είναι επίσης επιστρωµένη µε το συγκεκριµένο αντίσωµα που δεσµεύεται στο αντιγόνο της νόσου. Αφού τα σταγονίδια καθιζάνουν, εφαρµόζεται µαγνητικό πεδίο. Τα σταγονίδια που δεν έχουν καθηλωθεί από το αντιγόνο στην επιφάνεια του τσιπ αποµακρύνονται από τη διάταξη των αισθητήρων. Αυτή η µέθοδος συνηθίζεται να καλείται ‘µαγνητική πλύση’. Τελικά, η διάταξη των αισθητήρων ενεργοποιείται. Η ηλεκτρική αντίσταση της διάταξης αντιστοιχεί στον αριθµό των σταγονιδίων τα οποία είναι ακινητοποιηµένα στους αισθητήρες χάρη στο δεσµό αντισώµατος- αντιγόνου. Η ανίχνευση των 82 ακινητοποιηµένων σταγονιδίων σηµαίνει ότι το συγκεκριµένο αντιγόνο είναι παρών και ότι το άτοµο του οποίου το αίµα εξετάστηκε πολύ πιθανόν είναι µολυσµένο µε τον ιό του ∆άγγειου πυρετού. Ολόκληρη η µέθοδος διαρκεί λίγο περισσότερο από ένα λεπτό. Τώρα, το τσιπ συνδέεται σε ένα συµβατικό φορητό µικροϋπολογιστή που λειτουργεί το λογισµικό του ανοσοαισθητήρα το οποίο παρέχει τα δεδοµένα στο πρόσωπο που διαχειρίζεται το τεστ. Το επόµενο βήµα, είναι να γίνουν τα τσιπ ασύρµατα και να τεθεί το λογισµικό σε µια υπολογιστική πλατφόρµα στο µέγεθος της παλάµης µας, αυξάνοντας έτσι ακόµα περισσότερο την κινητικότητα τους. Εν τω µεταξύ, οι ερευνητές δουλεύουν για την ανάπτυξη ενός HIV τεστ που θα µπορεί επίσης να λειτουργήσει σε µια πλατφόρµα ανοσοαισθητήρα. Μπορούµε να φανταστούµε µεγάλες ποσότητες τέτοιων τσιπ, όλα επιστρωµένα µε διαφορετικά αντισώµατα έτσι ώστε όχι µόνο να µπορεί να ανιχνευθεί στη στιγµή εάν κάποιος είναι άρρωστος, αλλά και να µπορεί να βρεθεί ακριβώς τι ασθένεια έχει. 6.6 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΩΝ ∆ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΙΣΤΩΝ ΒΑΣΙΣΜΕΝΩΝ ΣΕ ΤΡΙΧΟΕΙ∆ΙΚΑ ΤΣΙΠ 6.6.1 Η Ανάγκη Για Συστήµατα Βασισµένα Σε Ιστούς Στην ιατρική χρειάζονται αρκετά συστήµατα εξέτασης βασισµένα σε κύτταρα και ιστούς για την αξιολόγηση νέων θεραπειών, για το καθορισµό ατοµικών θεραπειών, για τη διαγνωστική και για ποιοτικό έλεγχο στις µεθόδους κυτταρικής θεραπείας. Κάθε ασθενής αντιδρά διαφορετικά σε µια θεραπεία. Για τη βέλτιστη θεραπεία των ασθενειών, η επιλεγµένη θεραπεία πρέπει να βασίζεται στις συνθήκες του ασθενούς. Μια θεώρηση για το καθορισµό της βέλτιστης θεραπείας για έναν ασθενή είναι η αναγνώριση µικρών παραλλαγών στο DNA του ασθενούς , δηλαδή, η πολυµορφική ανάλυση ελεύθερων νουκλεοτιδίων. Ωστόσο, αυτή απλά ανιχνεύει παραλλαγές της ασθένειας βασισµένες στις ανοχές του γονιδιώµατος. Το γονιδίωµα είναι, κατ’ αρχήν, µια καθορισµένη και στατική ποσότητα. Εντούτοις, οι ασθένειες προκαλούνται σε τελική ανάλυση από την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών. Όλες οι πρωτεΐνες που συνθέτονται σε ένα κύτταρο κάτω από συγκεκριµένες περιβαλλοντολογικές συνθήκες λέγονται πρωτεΐνωµα (proteome). Σε αντίθεση µε το γονιδίωµα, το οποίο είναι πανοµοιότυπο στα διαφορετικά κύτταρα του σώµατος, το πρωτεΐνωµα διαφέρει σύµφωνα µε τις περιβαλλοντολογικές συνθήκες όπως η θερµοκρασία, το θρεπτικό περιβάλλον και οι επιδράσεις του άγχους ή των φαρµάκων. Για να προσδιορίσουµε τη καλύτερη θεραπεία για έναν ασθενή, θα πρέπει να ληφθούν υπόψη οι αλληλεπιδράσεις όλων των πρωτεϊνών ενός πρωτεϊνώµατος. 83 Ο µόνος τρόπος για να γίνει αυτό είναι δοκιµάζοντας πιθανές θεραπευτικές δυνατότητες κατευθείαν πάνω στα κύτταρα ή τους ιστούς του ασθενούς. Έχει αποδειχτεί ότι η πρωτεϊνική διαµόρφωση συγκεκριµένου κυττάρου µένει σταθερή ακόµα και κάτω από υψηλά τεχνητές συνθήκες µιας in vitro (εντός δοκιµαστικού σωλήνα) καλλιέργειας. Εποµένως, είναι θεωρητικά πιθανό η δοκιµή θεραπευτικών δυνατοτήτων in vitro σε κύτταρα που έχουν παρθεί από τον ασθενή. Γι’ αυτό απαιτείται η ανάπτυξη ενός αποδοτικού συστήµατος εξετάσεων βασισµένου σε µικροηλεκτροµηχανικά συστήµατα. Αυτά τα συστήµατα εξετάσεων πρέπει να είναι ικανά να προσδιορίσουν µη επεµβατικά και σε σύντοµο χρονικό διάστηµα, τα αποτελέσµατα πολλών θεραπευτικών δυνατοτήτων σε έναν αριθµό κυτταρικών παραµέτρων. Τα αποτελέσµατα πιθανών θεραπειών µπορούν να υποβληθούν σε δοκιµή απευθείας σε κυτταρικά ή ιστολογικά δείγµατα που έχουν παρθεί από τον ιστό του ασθενούς. Επιπρόσθετα, θα µπορούσε να είναι πιθανή η καλλιέργεια και ο πολλαπλασιασµός των κυττάρων του ασθενούς για τη παραγωγή ειδικών κυτταρικών και ιστολογικών προτύπων του ασθενούς για αξιολόγηση της θεραπείας. 6.6.2 Χαρακτηρισµός Κυττάρων Χωρίς Επισήµανση (Marker-Free Cell Characterization) Ένα πρόβληµα µε τις τωρινές τεχνικές για το χαρακτηρισµό των ιστών είναι ότι τα κύτταρα χαρακτηρίζονται έµµεσα χρησιµοποιώντας χηµικές ουσίες επισήµανσης. Οι χρήση τέτοιων ουσιών απαιτεί πολυέξοδη και χρονοβόρα προ-θεραπευτική αγωγή, επηρεάζει τη κυτταρική φυσιολογία και ο λειτουργικός χαρακτηρισµός του κυττάρου µπορεί να επιτευχθεί µόνο µε µεγάλη προσπάθεια. Οι µικροτεχνολογίες προσφέρουν νέες ευκαιρίες για την υλοποίηση συστηµάτων χωρίς σήµανση. Οι τεχνικές αυτές χαρακτηρίζουν ένα φυσιολογικό/ παθολογικό περιστατικό στα βιολογικά συστήµατα µετρώντας µια φυσική ποσότητα που συσχετίζεται µε το εν λόγω περιστατικό. Τα φυσιολογικά/ παθολογικά περιστατικά µπορούν να προσδιοριστούν, για παράδειγµα, µετρώντας διαφοροποιήσεις στη τιµή του pH που σχετίζεται µε το κυτταρικό µεταβολισµό ή στις ηλεκτρικές ιδιότητες που προκαλούνται από αλλαγές στις κυτταρικές µεµβράνες και στα κυτταρικά οργανύλλια (εξειδικευµένη δοµή κυττάρου). Αυτή η φυσική ποσότητα µετατρέπεται από ένα σύστηµα µορφοµετατροπέα σε σήµα το οποίο µπορεί να επεξεργαστεί παραπέρα, και τελικά ηλεκτρικό σήµα. Κατά τη παρούσα περίοδο, τα περισσότερα από τα διαθέσιµα συστήµατα εξετάσεων βασίζονται σε δισδιάστατες (2D) κυτταρικές στοιβάδες. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις απαιτούνται 84 τρισδιάστατα (3D) µοντέλα ιστών ή δείγµατα ιστών για τη µίµηση in vivo (εντός του ζώντος οργανισµού, σε φυσικό περιβάλλον) καταστάσεων. Οι ηλεκτρικές και διηλεκτρικές ιδιότητες ενός ιστού καθορίζονται από τις φυσιολογικές και µορφολογικές ιδιότητες του. Επειδή οι ηλεκτρικές και διηλεκτρικές ιδιότητες ενός δείγµατος µπορούν να προσδιοριστούν καταγράφοντας την ηλεκτρική του αντίσταση πάνω από ένα φάσµα συχνοτήτων (φασµατοσκοπία αντίστασης), τα φυσιολογικά γεγονότα και οι µορφολογικές ιδιότητες των βιολογικών ιστών είναι προσδιορίσιµα από τη φασµατοσκοπία ηλεκτρικής αντίστασης. Ένα τριχοειδικό σύστηµα µέτρησης αντίστασης έχει αναπτυχθεί για χωρίς επισήµανση, µη επεµβατικό και γρήγορο χαρακτηρισµό µικρών ιστολογικών δειγµάτων όπως οι βιοψίες και 3D ιστολογικά µοντέλα µε τη φασµατοσκοπία αντίστασης. Ο ιστολογικός χαρακτηρισµός µπορεί να διαρκέσει από αρκετά δευτερόλεπτα µέχρι αρκετά λεπτά και εξαρτάται, για παράδειγµα, από τις µεθόδους που χρησιµοποιούνται για τη µέτρηση της αντίστασης. Ο χρόνος που απαιτείται τυπικά για κλασικό χαρακτηρισµό ιστοπαθολογικού και ιστοχηµικού ιστού κυµαίνεται από ώρες µέχρι ηµέρες. 6.6.3 Ευπαθή Και Αναπαραγόµενη Μέτρηση Της Αντίστασης Για τη µέτρηση της αντίστασης ενός βιολογικού δείγµατος, απαιτούνται τουλάχιστον δύο ηλεκτρόδια σε ηλεκτρολυτικό περιβάλλον, δηλαδή, ένα ηλεκτροχηµικό κύτταρο µε ένα βιολογικό δείγµα. Τα βασικά συστατικά ενός µοντέλου ισοδύναµου κυκλώµατος ενός ηλεκτροχηµικού κυττάρου είναι η διαχωριστική εµπέδηση ηλεκτροδίου-ηλεκτρολύτη, η συνολική αντίσταση του ηλεκτρολυτικού διαλύµατος, η εµπέδηση του βιολογικού δείγµατος, µια αντίσταση διακλάδωσης και µια τυχαία χωρητικότητα. Για αξιόπιστη και ευαίσθητη µέτρηση της εµπέδησης, στη πράξη, πρέπει να εκπληρώνονται οι παρακάτω συνθήκες: • Η αντίσταση της πορείας διακλάδωσης πρέπει να είναι υψηλή και σταθερή • Η εµπέδηση της διαχωριστικής επιφάνειας ηλεκτρόδιου-ηλεκτρολύτη πρέπει να είναι χαµηλή σε σύγκριση µε την εµπέδηση του ιστού • Η τυχαία χωρητικότητα του µετρούµενου κυττάρου πρέπει να είναι χαµηλή Κανονικά, όταν είναι να µετρηθεί η εµπέδηση µικρών δειγµάτων, χρειάζονται µικρά ηλεκτρόδια. Το πρόβληµα της χρήσης µικρών ηλεκτροδίων σε ένα ηλεκτροχηµικό κύτταρο είναι ότι η υψηλή τους εµπέδηση διαχωρισµού µπορεί να υπερισχύσει της 85 συνολικής εµπέδησης των µετρούµενων κυττάρων. Εάν έχουµε µια τέτοια περίπτωση, η εµπέδηση ενός δείγµατος µέσα σε ένα µετρούµενο κύτταρο είναι προσδιορίσιµη µόνο µε χαµηλή ευαισθησία. 6.6.4 Σχεδιασµός Της Μέτρησης Των Τριχοειδικών Κυττάρων Για να ικανοποιηθούν οι προαναφερθείσες συνθήκες, έχει σχεδιαστεί και κατασκευαστεί ένα τριχοειδικό µετρούµενο κύτταρο. Το ιστολογικό δείγµα τοποθετείται υδροδυναµικά σε ένα κάθετο τριχοειδές µέτρησης µε χοανοειδή εισόδους. Η διάµετρος του τριχοειδούς είναι σταθερή στη τοποθετούµενη περιοχή του ιστολογικού δείγµατος. ∆ύο ηλεκτρόδια ρυθµίζονται πάνω και κάτω από τις χοανοειδής εισόδους. Για τη µέτρηση της εµπέδησης, χορηγείται ρεύµα στα εξωτερικά ηλεκτρόδια και η επακόλουθη πτώση τάσης καταγράφεται µέσω των εσωτερικών ηλεκτροδίων, παρέχοντας έτσι µέτρηση σε διάταξη τεσσάρων ηλεκτροδίων. Αυτή η διάταξη ηλεκτροδίων και η γεωµετρία του τριχοειδούς µετρητικού κυττάρου επιτρέπουν µετρήσεις εµπέδησης µε αµελητέα επίδραση των εµπεδήσεων των ηλεκτροδίων: η έκταση των ηλεκτροδίων µπορεί να επιλεχθεί ανεξάρτητα από το µέγεθος του δείγµατος και η µέτρηση µπορεί να εκτελεστεί σε µια τεσσάρων ηλεκτροδίων διάταξη. Η αντίσταση της διακλάδωσης είναι υψηλή επειδή το δείγµα περιβάλλεται από τα τοιχώµατα του τριχοειδούς, και σταθερή επειδή ο τοµέας του τριχοειδούς στον οποίο είναι τοποθετηµένο το δείγµα έχει σταθερή διάµετρο. 6.6.5 Αξιολόγηση Αντικαρκινικών Θεραπειών Οι πρώτες εφαρµογές του τριχοειδικού µετρητικού κυττάρου είναι η εκτίµηση νέων αντικαρκινικών θεραπειών χρησιµοποιώντας 3D in vitro ιστολογικά µοντέλα. Φάσµατα εµπεδήσεων καταγράφονται από µοντέλα νεοπλασµάτων, τα οποία ελίσσονται µε µια αντικαρκινική θεραπευτική γονιδιακή δοµή και σε διαφορετικές δόσεις ακτινοβόλησης. Οι παράµετροι ενός ισοδύναµου µοντέλου κυκλωµάτων για τα νεοπλασµατικά µοντέλα καθορίζονται από τα δεδοµένα της εµπέδησης. Στη περίπτωση αντικαρκινικής θεραπείας, η µείωση της εξωκυττάριας αντίστασης έχει ήδη δείξει ότι η θεραπεία έχει το επιθυµητό αποτέλεσµα. αυτή η παράµετρος σχετίζεται µε το εξωκυτταρικό ποσοστό όγκου του ιστού (ποσοστό του όγκου του εξωκυτταρικού χώρου προς τον όγκο του εσωκυτταρικού χώρου). Ο στόχος µιας αντικαρκινικής θεραπείας είναι να σταµατήσει το πολλαπλασιασµό των κυττάρων και να προκαλέσει απόπτωση. Και τα δύο φαινόµενα οδηγούν σε αύξηση του εξωκυτταρικού ποσοστού όγκου και συνεπώς σε µείωση της εξωκυτταρικής αντίστασης. 86 Το ηλεκτροχηµικό κύτταρο µέτρησης δεν είναι µόνο κατάλληλο για ιστολογικό χαρακτηρισµό µε τη φασµατοσκόπηση εµπέδησης, αλλά και για καταγραφή δυναµικών πεδίων ηλεκτροφυσιολογικών ενεργών διαλυµάτων όπως δείγµατα καρδιοµυϊκού ιστού ή ιστολογικά µοντέλα νευρώνων. Σε αυτές τις εφαρµογές, τα ηλεκτρόδια του µετρητικού κυττάρου συνδέονται µε ένα καταγραφικό σύστηµα ηλεκτρικού δυναµικού αντί ενός αναλυτή εµπέδησης. Στη πρώτη εκτίµηση του σχεδιασµού του ελεύθερου τριχοειδικού µετρητικού κυττάρου , χρησιµοποιήθηκε ένα πρωτότυπο από γυαλί. Ωστόσο, έχει αναπτυχθεί επίσης ένα τριχοειδικό τσιπ µε 16 καθέτως διευθετηµένα µετρητικά τριχοειδή και ενσωµατωµένα ηλεκτρόδια σε πλαστικό χρησιµοποιώντας διαµόρφωσης τεχνολογία µε µικροεµψεκασµό (microinjection-moulding technology). Εικόνα 32: Τριχοειδικό τσιπ. Ανώτερο πλαίσιο: Σχήµα ενός τµήµατος. Μεσαίο πλαίσιο: ολόκληρο το τσιπ. Κατώτερο πλαίσιο: Φωτογραφία κοµµένου τσιπ µε άνοιγµα των τριχοειδών, των ηλεκτροδίων και των διασυνδεόµενων γραµµών. Για µη επεµβατικό και ευαίσθητο χαρακτηρισµό ενός βιολογικού δείγµατος, η διάµετρος του τριχοειδούς θα πρέπει να ταιριάζει µε το βιολογικό δείγµα. Εάν η διάµετρος του τριχοειδούς είναι πολύ µικρή, το δείγµα παραµορφώνεται, εάν είναι πολύ µεγάλη, η αντίσταση διακλάδωσης είναι πολύ µικρή. Το τριχοειδές τσιπ µπορεί να περιέχει τριχοειδή διαµέτρου µέχρι 100µm. 87 6.7 DNA CHIPS 6.7.1 Κατασκευή Για υψηλή ανάλυση µεγάλου αριθµού γονότυπων µε την µία, η τεχνική της φωτολιθογραφικής µικροκατασκευής (από τεχνολογία ηµιαγωγών) έχει συνδυαστεί µε αυτή της χηµείας ολιγονουκλεοτικής σύνθεσης για τη παραγωγή µιας µικροσκοπικής διάταξης για την παρουσίαση µεγάλων αριθµών προκαθορισµένων οργάνων σε γονιδιωµατικό DNA. Τα τσιπς κατασκευάζονται επικαλύπτοντας πρώτα µια επιφάνεια όπως γυαλί ή πυρίτιο µε ένα κολλώδες χηµικό. Τότε σε καθορισµένες θέσεις, προσκολλούνται νουκλεοτίδια. Αυτά περιλαµβάνουν τις τέσσερις βάσεις αδενίνη (Α), κυτοσίνη (C), γουανίνη (G) και θυµίνη (Τ). τα νουκλεοτίδια τότε συνδέονται για να σχηµατίσουν µικρές αλυσίδες µε διαφορετικές ακολουθίες. Εικόνα 33: Η ελικοειδή µορφή του DNA. Μερικοί κατασκευαστές φτιάχνουν πρώτα το τσιπ και έπειτα τα συγκολλούν στην επιφάνεια, ενώ άλλοι τα κατασκευάζουν προσθέτοντας µόρια ένα-ένα. Όταν τελειώσουν, η µικροδιάταξη διαστίζεται από νουκλεοτίδια, που κυµαίνονται από λίγες ντουζίνες σε δεκάδες χιλιάδες µικρών κλώνων νουκλεοτιδίων. Αυτό το ρεπερτόριο των ακολουθιών αφήνει το DNA chip να κάνει τη δουλειά τουτην αναζήτηση συγκεκριµένων ακολουθιών από το γονιδίωµα ενός οργανισµού. Η µέθοδος δουλεύει επειδή το DNA αποτελείται από δύο κλώνους κατά µήκος των οποίων η ‘Α’ στον ένα κλώνο δεσµεύεται µε την ‘Τ’ στον άλλον και η ‘G’ στον ένα κλώνο δεσµεύεται πάντα µε τη ‘G’ στον άλλον. Αυτό δίνει στην διπλή έλικα µια ‘συµπληρωµατική φύση’. Για την επιλογή ενός γονιδίου, τα νήµατα του DNA πάνω στο DNA τσιπ δεν χρειάζεται να είναι πολύ µακρά. Ένα τυπικό γονίδιο µπορεί να περιέχει 10.000 ζευγάρια νουκλεοτιδίων, ή περισσότερα. Αλλά µέσα στην αλυσίδα ενός γονιδίου υπάρχει συνήθως µια µικρή ακολουθία, όχι περισσότερες από 25 βάσεις σε µήκος, µοναδική για αυτό το γονίδιο. Κρυπτογραφώντας αυτή την µικρή, µοναδική αλυσίδα σε ένα τσιπ, οι γενετιστές µπορούν να αναπαριστάνουν ολόκληρο το γονίδιο. Αυτή η στενογραφία κάνει ολόκληρη τη διαδικασία κατορθωτή. 88 6.7.2 Χρήση Των Τσιπ Για τη χρησιµοποίηση του τσιπ, ένας φυσικός ή τεχνικός εργαστηρίου εξάγει δείγµα DNA ενός οργανισµού από λίγο αίµα ή ιστό. Το DNA καθαρίζεται, αντιγράφεται, χωρίζεται σε µονούς κλώνους και τελικά διασπάται από ένζυµα σε µικρά κοµµάτια. Κάθε κοµµάτι έπειτα τιτλοφορείται µε ένα φθορίζον µόριο. Εικόνα 34: DNA Chip Παλιότερα αυτή τη δουλειά την έκαναν οι τεχνικοί, αλλά σήµερα όλες αυτές οι διαδικασίες γίνονται σε αντιδραστικούς θαλάµους που ελέγχονται από υπολογιστή. Αυτό το µείγµα έπειτα αφήνεται πάνω στο τσιπ. Εάν ένας κλώνος του DNA µέσα στο σύνολο κοµµατιών συναντήσει ένα συµπληρωµατικό οµόλογο στο τσιπ, τα ταιριαστά τµήµατα ‘κουµπώνονται’ µαζί για να σχηµατίσουν ένα διπλό κλώνο. Όσο καλύτερο είναι το ταίριασµα, τόσο περισσότεροι είναι οι δεσµοί µεταξύ των κλώνων, και τόσο δυνατότερη η σύνδεση. Η διάταξη τότε ξεπλένεται µε ένα χηµικό διάλυµα που διασπά όλους τους διπλούς κλώνους που δεν έχουν συνδεθεί καλά. Στη θεωρεία, το ζευγάρι που παραµένει είναι το τέλειο ταίριασµα. Στη πράξη, ωστόσο, υπάρχει ένα ποσοστό λάθους 5%. Έτσι ένα τυπικό τσιπ έχει εντοιχισµένες περισσευούµενες δοκιµαστικές θέσεις µε το ίδιο µοναδικό κοµµάτι DNA, κάθε µια προσφέροντας µια δεύτερη γνώµη στα αποτελέσµατα των άλλων. Οι περισσότερες προσπάθειες στην ανίχνευση µεταλλαγών χρησιµοποιώντας τα DNA τσιπ αναφέρουν µη ψευδή θετικά και µόνο τα σποραδικά ψευδή αρνητικά, έτσι η τεχνική αναφέρεται ότι έχει >90% ευαισθησία και γύρω στα 100% ιδιαιτερότητα. Ωστόσο, η έµφυτη δυσκολία στη τελειοποίηση στη µέθοδο υβριδισµού ίσως κάνει δύσκολη την ολοκληρωτική εξάλειψη των λαθών (ειδικά σε αυτή τη µικρή κλίµακα) και αυτό ίσως να θέσει ένα όριο στις χρήσεις των ολιγο-διατάξεων σε διαγνωστικό πλαίσιο. Όταν το ξέπλυµα τώρα ολοκληρωθεί, ένα υπολογιστής διαβάζει τη τοποθεσία οποιωνδήποτε φθοριζόντων σηµείων που λάµπουν από την επιφάνεια του τσιπ και ταιριάζει αυτές τις θέσεις στο αρχείο του των νουκλεοτιδικών αλυσίδων που είναι εναποθετηµένες σε αυτά τα σηµεία. Το αποτέλεσµα είναι µια έκθεση πλήρους καταλόγου όλων των γενετικών συστατικών. 89 Τα DNA τσιπς χρησιµοποιούνται για έναν αριθµό χρήσεων, αρκετές από τις οποίες έχουν ήδη αναπτυχθεί αποτελεσµατικά: Εύρεση της αλληλουχίας του DNA και πληθυσµιακές µελέτες: Η ανάγνωση ολόκληρης της µιτοχονδριακής γονιδιωµατικής αλληλουχίας και το επακόλουθο σκορ πολυµορφισµών σε ασθενείς και σε αντικείµενα µελέτης αποδεικνύει τη προοπτική των DNA τσιπς για αµφότερες διαγνωστικές εφαρµογές και για µελέτη πληθυσµιακών παραλλαγών. Η εκτεταµένη µεταβλητότητα στα γονιδιώµατα γρήγορα εξελισσόµενων παθογόνων όπως ο HIV έχει επίσης διευθετηθεί µε τη τεχνολογία των τσιπ. Μελέτες έκφρασης γονιδίων: ολίγο-cDNA σειρές δείχνουν να είναι ένα ευαίσθητο σύστηµα ανίχνευσης για απόλυτα και σχετικά επίπεδα µέσων καταγραφής, και έχουν χρησιµοποιηθεί για τη µέτρηση παραλλαγών γονιδιακής έκφρασης σε καρκινικούς ιστούς. Χαρτογράφηση του γονιδιώµατος: όργανα που αναγνωρίζουν ένα µεγάλο σύνολο γνωστών µονοβασικών πολυµορφικών επισυναπτικών ουσιών µπορούν να διευθετηθούν πάνω στα τσιπ και να χρησιµοποιηθούν σαν ένα επιπλέον εργαλείο για τη χαρτογράφηση του γονιδιώµατος, καθώς και για συνδετικές (σύνδεση: η σύνδεση γονιδίων που εντοπίζονται στο ίδιο χρωµόσωµα, µε αποτέλεσµα την τάση µιας οµάδας τέτοιων µη αλληλόµορφων γονιδίων να κληρονοµούνται από κοινού) και απλοτυπικές (απλότυπος: η οµάδα των αλληλόµορφων συνδεδεµένων γονιδίων) µελέτες. Η πιο ελκυστική προοπτική για εφαρµογή των DNA τσιπ είναι πιθανό να είναι στο πεδίο του εντοπισµού των παραλλαγών, µε την αυξανόµενη γκάµα των γενετικών ανωµαλιών για την οποία έχει καθοριστεί ένα ευρύ φάσµα µοναδικών µεταλλαγών. Η κυριότερη προσπάθεια σε αυτή τη κατεύθυνση µέχρι τώρα έχει γίνει για το BCRA1 γονίδιο, όπου ένα πλέγµα πάνω από 96.000 ολίγων έχει εντοπίσει επιτυχώς γνωστές µεταλλαγές των 11 στους 15 ασθενείς µε καρκίνο του στήθους. 6.7.3 Ιδιαιτερότητα Στις Ασθένειες Τα τσιπ µπορούν επίσης να εξειδικευτούν σε ιδιαίτερες παθήσεις, κατασκευάζοντας πανοµοιότυπο µικρού αριθµού συγκεκριµένων γονιδίων που εµπλέκονται σε µια ιδιαίτερη ασθένεια από την αρθρίτιδα µέχρι το HIV. Για παράδειγµα, µελετούνται τα ανθρώπινα γονίδια BRCA1 και BRCA2, τα οποία εµπλέκονται σε κληρονοµικό καρκίνο του στήθους. Όταν εµφανίζεται καρκίνος του στήθους σε µια οικογένεια, τουλάχιστον το 80% των γυναικών που έχουν προσβληθεί δείχνουν µεταλλαγές σε κάποιο από τα δύο ή 90 και στα δύο αυτά γονίδια. Οι µεταλλαγές κάνουν τη πιθανότητα των γυναικών να αναπτύξουν καρκίνο τόσο υψηλή όσο το 85%. Οι ερευνητές δοκιµάζουν τσιπ που διατάσσουν τη πλήρη ακολουθία των ‘υγιών’ γονιδίων BRCA1 και BRCA2- 5.000 και 10.000 ζεύγη βάσεων αντίστοιχα. Πληµµύρισαν, λοιπόν, ένα τσιπ µε το δείγµα των BRCA γονιδίων από µια γυναίκα της οποίας η οικογένεια έχει ιστορικό της ασθένειας. Εάν το γενετικό της δείγµα ταιριάξει σηµείο προς σηµείο, δηλαδή εάν οι συµπληρωµατικές ακολουθίες συνδεθούν σε όλα τα νήµατα της µικροδιάταξης, έχει φυσιολογικά BRCA γονίδια και δεν θα πρέπει να ανησυχεί στη ζωή της. Εάν όµως υπάρχουν αποτυχηµένοι συνδυασµοί, δηλαδή, ένα ή περισσότερα νήµατα δεν βρίσκουν συµπληρωµατικά ταίρια, κινδυνεύει να αναπτύξει την ασθένεια. Χωρίς τα τσιπς, είναι σχετικά εύκολο να ελέγξεις µια µεταλλαγή όταν ξέρεις που να την αναζητήσεις. Αλλά τα πρόβληµα είναι ότι το BRCA1 έχει περισσότερες από 500 γνωστές µεταλλαγές και συνεχώς βρίσκονται περισσότερες. Οι περισσότεροι ερευνητές αισθάνονται ότι χρησιµοποιώντας συµβατικές µεθόδους, κάποιος τείνει να µελετήσει µόνο αυτές τις θέσεις, όπου αναµένεται να βρεθεί µια µεταλλαγή. Αλλά, χρησιµοποιώντας τα DNA τσιπς, κάποιος µπορεί να πάρει ολόκληρη έκθεση δεδοµένων ενός δείγµατος DNA και να καθορίσει εύκολα τη θέση της µεταλλαγής και ακόµα τους παράγοντες, που θα µπορεί να έχουν επηρεάσει τη παραλλαγή. Αυτή η ικανότητα θα πρέπει να βοηθήσει στη προσαρµογή φαρµάκων για το συγκεκριµένο γενετικό χαρακτήρα κάθε ατόµου. Στα σηµερινά χρόνια οι βιολόγοι έχουν ολοκληρωµένη ιδέα του µέσου όρου της γενετικής διαµόρφωσης των ανθρώπινων όντων. Αλλά συγκεκριµένες παραλλαγές από το φυσιολογικό είναι συχνά κρίσιµες για το καθορισµό της ευαισθησίας ενός ατόµου στην ασθένεια ή στην αντίδραση του στα φάρµακα. Τα τσιπς θα επιτρέψουν στους γιατρούς να πάρουν ένα γρήγορο στιγµιότυπο των γονιδίων ενός ατόµου για να δουν ποια θεραπεία είναι η καλύτερη και ποια φάρµακα να αποφύγουν. Το DNA τσιπ θα είναι ένα ισχυρό µέσο για τη κατανόηση τύπων της γενετικής έκφρασης στα κύτταρα. Ένα γονίδιο εκφράζει τον εαυτό του όταν ενεργεί σαν πατρόν για να φτιάξει τη χαρακτηριστική του πρωτεΐνη. Η δύναµη της έκφρασης ενός γονιδίου εξαρτάται από το πόσο πολύ από αυτή τη πρωτεΐνη προκαλείται να φτιαχτεί. Η ύπαρξη ενός εύκολου τρόπου για τη µέτρηση της δύναµης της έκφρασης ενός γονιδίου θα ήταν εξαιρετικά χρήσιµη στους βιολόγους. Αλλά ένα γονίδιο δεν φτιάχνει τη πρωτεΐνη του κατ’ ευθείαν. Αντί γι’ αυτό, το κύτταρο αποσπά τις πληροφορίες που χρειάζεται για να φτιάξει µια πρωτεΐνη και τις στέλνει σε περιοχές πρωτεϊνικής σύνθεσης στη µορφή του 91 RNA. Το ποσό της πρωτεΐνης που κατασκευάζεται είναι απευθείας ανάλογο της µετάφρασης του RNA. 6.7.4 Γονιδιακή Έκφραση Για τη µέτρηση της γονιδιακής έκφρασης σε ένα τσιπ, οι σχεδιαστές ρύθµισαν µικροτεµάχια DNA στο wafer που ταιριάζουν σε διάφορα γονίδια. Αυτή τη φορά, ωστόσο, κάθε γονίδιο αντιπροσωπεύεται από χιλιάδες πανοµοιότυπα νήµατα. Οι ερευνητές τότε αποµόνωσαν το RNA από το δείγµα ενός ασθενούς, το τεµάχισαν, το τιτλοφόρησαν µε µια φθορίζουσα ‘σηµαία’, και το άφησαν πάνω στο τσιπ. Κάθε τεµάχιο RNA δεσµεύεται στο κλώνο του γονιδίου από τον οποίο δηµιουργήθηκε. Έτσι, εάν ένα γονίδιο εκφράζεται έντονα, τα τεµάχια του RNA µπορεί να δεσµευτούν στους περισσότερους κλώνους που αντιπροσωπεύουν αυτό το γονίδιο στη σειρά, ενώ αυτά ενός γονιδίου που εκφράζεται ασθενώς θα συγκεντρώσουν µόνο λίγα µικροτεµάχια RNA. Με αυτό τον τρόπο, οι βιολόγοι µπορούν να υπολογίσουν τις αναλογίες κάθε εκδοχή αναπαράστασης RNA και να µάθουν πόσο έντονα εκφράζεται το κάθε γονίδιο. Μπορούµε, για παράδειγµα, να χρησιµοποιήσουµε την έκφραση των γονιδίων για να µελετήσουµε τι κάνει το σώµα για να πολεµήσει µια βακτηριακή µόλυνση- ή τι κάνουν τα βακτήρια για να επιβιώσουν µέσα στον ξενιστή. Το τσιπ δίνει επεξεργασµένα δεδοµένα γενετικών προτύπων στις φυσιολογικές και µολυσµένες καταστάσεις 100 µε 1000 φορές γρηγορότερα από τις συµβατικές µεθόδους. Μας λέει ποια από τα γονίδια είναι ενεργά κατά τη διάρκεια της µολυσµατικής διαδικασίας και επίσης τα γονίδια τα οποία επιτίθενται στα βακτήρια για να αποτρέψουν την ανάπτυξη τους. επίσης δείχνει την ισχυρότερη αντίδραση που παρουσιάζεται από το σώµα του ξενιστή. Με αυτό τον τρόπο θα βοηθήσει στη µελέτη του µηχανισµού δράσης του ξενιστή και του παθογόνου οργανισµού κατά τη διάρκεια της πορείας µιας µόλυνσης. Η ικανότητα της ανάγνωσης των προτύπων έκφρασης επιτρέπει επίσης στους επιστήµονες να διακρίνουν ανθρώπους µε προφανώς πανοµοιότυπες ασθένειες. Η µελέτη των προτύπων έκφρασης δεκάδων χιλιάδων γονιδίων, ασθένειες όπως το Λέµφωµα (οποιαδήποτε νεοπλασία του λεµφοειδούς ιστού), µπορεί να διακριθεί αποκαλύπτοντας υποσύνολα ασθενών µε διαφορετικούς τύπους γονιδιακής έκφρασης. Μικροσκοπικές διαφορές µπορεί να είναι θέµα ζωής και θανάτου, δεδοµένου ότι κάθε υποσύνολο µπορεί να ανταποκριθεί διαφορετικά στην ίδια θεραπευτική αγωγή. Με τη κατανόηση της 92 γενετικής συµπεριφοράς µιας συγκεκριµένης µορφής µιας ασθένειας και της αντίδρασης της σε διαφορετικές αγωγές, οι θεραπείες µπορούν να σχεδιαστούν πιο προσεκτικά για κάθε ασθενή. Οι ερευνητές χρησιµοποιούν τους τύπους έκφρασης για να καθορίσουν εάν οι ασθενείς είναι σε υψηλό κίνδυνο και χρειάζονται γρήγορη και ριζική αγωγή ή λιγότερο δραµατική θεραπεία για µακρύ χρονικό διάστηµα. Νέες εφευρέσεις οι οποίες έχουν προβλεφθεί σε σχέση µε τα τσιπ περιλαµβάνουν την ανάπτυξη ολοκληρωµένων συστηµάτων πολλαπλών συστατικών (πχ το ‘lab-on-a-chip’) τα οποία αναζητούν τη µικροσκοπικοποίηση και τη κατηγοριοποίηση τέτοιων διαδικασιών όπως την αφοµοίωση ενζύµων περιστολής, τη PCR, και τη τριχοειδική ηλεκτροφόρηση σε µια µοναδική λειτουργική συσκευή. Και τη τεχνική της ‘µινιαλληλοδιαδοχής’ η οποία ανιχνεύει µεταλλαγές όχι µε υβριδοποίηση αλλά µε επιµήκυνση µιας σταθερής συµπληρωµατικής ακολουθίας σε µια αµέσως γειτονική σε µια γνωστή πολυµορφική θέση (µέχρι στιγµής εφαρµόσιµη µόνο σε γυάλινα υποστρώµατα, αλλά θεωρητικά προσαρµόσιµα σε πυριτιούχα τσιπ) και η οποία επικαλείται να προσφέρει εντονότερη διάσπαση οµοζυγωτικών και ετεροζυγωτικών µεταλλαγµένων γονότυπων απ’ ότι είναι πιθανή µε τις ολίγο-διατάξεις. 6.7.5 Σχεδιασµός Φαρµάκων Τα τσιπ θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν σχεδιασµοί φαρµάκων και για ιατρική διάγνωση. Οι φαρµακευτικές εταιρίες δοκιµάζουν τεράστιο αριθµό ενδεχόµενων φαρµάκων ενάντια σε ένα φάσµα βιοχηµικών για να καθορίσουν τις αλληλεπιδράσεις τους. επίσης δοκιµάζουν χιλιάδες παραλλαγές οποιοδήποτε υποσχόµενου συστατικού για να δουν τα µέγιστα οφέλη του και τις ελάχιστες παρενέργειες τους. τα τσιπ µπορεί να επιταχύνουν αυτές τις διαδικασίες ελέγχου. 6.8 GENE CHIP Πολλές ακαδηµίες και βιοµηχανικά ινστιτούτα έχουν συνεργαστεί για να αναπτύξουν βιοτσιπ που είναι προσιτά οικονοµικά και που ανιχνεύουν γρήγορα λοιµώξεις που είναι απειλητικές για τη ζωή όπως το HIV και η φυµατίωση σε πρώιµο στάδιο. Η έγκαιρη ανίχνευση είναι ένα από τα σηµαντικότερα ‘κλειδιά’ στην επιτυχή αντιµετώπιση των περισσότερων µολυσµατικών νόσων. Κατά τη χρονική περίοδο της λοίµωξης ένα ολόκληρο φάσµα γονιδίων, ειδικά αυτά του ανοσολογικού συστήµατος, είτε 93 ενεργοποιούνται είτε καταστέλλονται. Αυτά πρέπει να αναγνωριστούν. Οι πληροφορίες που εξάγονται από τη τεχνολογία αυτού του τσιπ παρέχει στους κλινικούς γιατρούς ένα ολότελα νέο και πολύ αποτελεσµατικό διαγνωστικό µέσο. Ένα τέτοιο ανοσοτσιπ µπορεί να χρησιµοποιηθεί στη κλινική για τη προσεκτική εξέταση ενός ασθενούς για συγκεκριµένες ασθένειες. Για να ανιχνευθεί η δραστηριότητα του ανοσολογικού συστήµατος ενός ασθενούς, το RNA του ασθενούς (αγγελιοφόρα µόρια που λένε στο κυτταρικό µηχανισµό πόσο και από ποια πρωτεΐνη να φτιάξει) αποµονώνεται από ένα αιµατολογικό δείγµα, µετατρέπεται σε εκατοµµύρια µόρια DNA, επισυνάπτεται µε µια φθορίζουσα ουσία και φέρεται σε επαφή µε το DNA στο τσιπ. Προϊόντα ενεργών γονιδίων από τον ασθενή αναγνωρίζουν τους συµπληρωµατικούς τους παρτενέρ πάνω στο τσιπ και ενώνονται µαζί τους, παράγοντας ένα χαρακτηριστικό πράσινο, κόκκινο ή κίτρινο φθορίζων σήµα. Εικόνα 35: Μικροσταγονίδια που εξυπηρετούν σαν µικροσκοπικοί δοκιµαστικοί σωλήνες. Επεξεργάζονται µε ένα πατενταρισµένο λεπτό στρώµα επικάλυψης που επιτρέπει στους επιστήµονες να επισυνάψουν πιο αποδοτικά εκατοµµύρια DNA, RNA, πρωτεΐνες ή φαρµακευτικά µόρια στην επιφάνεια του τσιπ. Πώς µπορούµε να χρησιµοποιήσουµε ένα τέτοιο βιοτσιπ για να ψάξουµε στα γονίδια ενός ατόµου; Το µόνο που έχουµε να κάνουµε είναι να λάβουµε λίγο από το DNA του ατόµου, πχ από ένα αιµατολογικό δείγµα ή ακόµα και από λίγες τρίχες. Στη συνέχεια να ρίξουµε το υγρό που περιέχει το DNA στην επιφάνεια του βιοτσιπ. Κάθε σηµείο που το DNA έχει ένα γονίδιο που να ταιριάζει σε έναν από τους κλώνους του βιοτσιπ, θα συγκολληθεί σε αυτό µε έναν τρόπο που ο υπολογιστής µπορεί να ανιχνεύσει. Πρόσφατα ανακοινώθηκε ότι έχει ουσιαστικά ολοκληρωθεί κατά το 90% ο προσδιορισµός της ακολουθίας του DNA. Ήδη οι ερευνητές είναι απασχοληµένοι µε τη σύγκριση της, κατά γενική τους παραδοχή, ‘ακολουθία αναφοράς’ µε το DNA διαφόρων ατόµων, και την επισήµανση των διαφορών που εντοπίζουν. Καλούµενες µοναδικοί νουκλεοτιδικοί πολυµορφισµοί, ή SNPs (προφέρονται ‘snips’), αυτές οι διαφορές στη ταυτότητα συγκεκριµένων νουκλεοτιδίων επισηµαίνουν κάθε τρόπο µε τον οποίο ένα συγκεκριµένο νουκλεοτίδιο διαφέρει από τη ακολουθία αναφοράς. Μερικά SNPs προκαλούν ασθένειες όπως τη κυστική ίνωση ή τη δρεπανοκυτταρική αναιµία. Άλλα µπορεί να µας δώσουν κόκκινα µαλλιά ή αυξηµένη χοληστερόλη στο αίµα µας. Καθώς το σχέδιο του Ανθρώπινου Γονιδιώµατος ολοκληρώνεται, οι ερευνητές του 94 συγκεντρώνουν ένα τεράστιο ηλεκτρονικό αρχείο από SNPs. Η έρευνα δείχνει ότι τα SNPs είναι αναµενόµενο να συµβούν σε συχνότητα του ενός στα χίλια νουκλεοτίδια, διασκορπισµένα τυχαία πάνω στα χρωµοσώµατα. Καθένας από µας, ωστόσο, διαφέρει από τον πρότυπο ‘τύπο αλληλουχίας’ σε αρκετές χιλιάδες νουκλεοτιδικά SNPs. Κάθε τι γενετικό πάνω µας που διαφέρει από ένα ξένο που συναντούµε προκαλείται από λίγες χιλιάδες SNPs, διαφορετικά θα ήµασταν πανοµοιότυποι µε αυτό τον ξένο. 6.8.1 Τεχνολογία Των Gene Chip Τα GeneChips είναι νουκλεοτιδικές µικροδιατάξεις οι οποίες έχουν ακολουθίες των 10-25 ζευγών βάσεων που αντιπροσωπεύουν κάθε γονίδιο ενός συγκεκριµένου γονιδιώµατος. Αυτές οι διατάξεις επιτρέπουν στους ερευνητές να αναγνωρίσουν γενετικές παραλλαγές σε µεγάλη και µικρή κλίµακα µέσω αξιοποίησης της ανάλυσης ολόκληρου του γονιδιώµατος. Με την ακρίβεια και την αναπαραγωγή του GeneChip, είναι πιθανό να παρακολουθήσουµε τη πορεία των δραστηριοτήτων χιλιάδων γονιδίων ταυτόχρονα. Πριν τη τεχνολογία των µικροδιατάξεων, οι ερευνητές ήταν περιορισµένοι στη παρατήρηση λίγων γονιδίων τη φορά. Με την ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώµατος, είναι πιθανός ο εντοπισµός των κρίσιµων γονιδίων που εµπλέκονται σε µια συγκεκριµένη διαδικασία. Αυτό συµπτύσσει σηµαντικά την έρευνα των διερευνητών, εξοικονοµώντας χρόνο και χρήµα. Εικόνα 36: GeneChip Οι µικροδιατάξεις των GeneChips κανονικά χρησιµοποιούνται για την ανίχνευση των mRNAs που µεταγράφονται από τα γονίδια για να κρυπτογραφήσουν τις αντίστοιχες πρωτεΐνες. Το συνολικό RNA εξάγεται από πολλά κύτταρα ενός µόνο τύπου, µετατρέπεται σε cDNA, και τότε ενισχύεται. Το ενισχυµένο cDNA µετατρέπεται τότε σε cRNA, το οποίο τότε τεµαχίζεται και υβριδοποιείται πάνω σε ένα GeneChip. Το τσιπ πλένεται, χρωµατίζεται µε µια φθορίζουσα ουσία, και ανιχνεύεται. Τα αποτελέσµατα µιας ανίχνευσης αναλύονται από ένα ή περισσότερα προγράµµατα. Η εικόνα που παράγεται από το GeneChip αποκαλύπτει πρόσφατα µεταγραµµένα ή ‘εκφρασµένα’ γονίδια. Κάθε σηµείο που µοιάζει µε pixel αντιπροσωπεύει µια µήλη, η οποία είναι ένα συγκεκριµένο σηµείο πάνω σε ένα γονίδιοένα σύνολο τέτοιων µηλών είναι το άθροισµα των µήλων σε ένα γονίδιο. Η διευκόλυνση της γονιδιακής έκφρασης έχει τώρα τη ικανότητα της χρήσης ενός παράλληλου επιπέδου τεχνολογίας για τη διεξαγωγή πειραµάτων µε DNA. Μελέτες σύνδεσης, χρωµοσωµική ανάλυση, απώλεια της ετεροζυγωτίας, και πληθυσµιακές 95 µελέτες είναι πιθανές µε πειραµατισµό που αρχίζει µε υψηλής ποιότητας DNA και τελειώνει σε υβριδοποιηµένο σύνολο SNP. Με αµφότερα RNA και DNA τσιπς, χρησιµοποιείται ένα πρόγραµµα ανάλυσης δεδοµένων για τη µετάφραση των εντάσεων των µηλών, η οποία γίνεται διαφορετικά από κάθε πρόγραµµα. Η διευκόλυνση της γονιδιακής έκφρασης χρησιµοποιεί ένα συνδυασµό διαθέσιµων προγραµµάτων για να εξασφαλίσει τη πιο ακριβή ερµηνεία των δεδοµένων. 6.8.2 Χρήση Των Βιοτσιπ Στην Εξέταση Του Καρκίνου Μια από τις µεγαλύτερες αποφάσεις που αντιµετωπίζει ένας ογκολόγος (γιατρός ειδικευµένος στο καρκίνο) για την αντιµετώπιση ενός όγκου είναι η επιλογή της κατάλληλης θεραπείας. Τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα µοιάζουν να είναι παρόµοια, παρόλο που οι όγκοι µπορούν στη πραγµατικότητα να προκληθούν από διαφορετικές µορφές καρκίνου. Εάν ο ογκολόγος µπορούσε ξεκάθαρα να προσδιορίσει το καρκίνο, θα µπορούσε να ήταν δυνατή η ύπαρξη συγκεκριµένων θεραπειών. Ωστόσο επειδή είναι ανίκανοι να πουν τη διαφορά µε σιγουριά, δεν το ρισκάρουν. Οι όγκοι αντιµετωπίζονται µε θεραπεία που προσβάλλει όλους τους καρκίνους, συνήθως µε αρκετές παρενέργειες. Πρόσφατα οι ερευνητές έκαναν ένα µεγάλο βήµα απέναντι στην αντιµετώπιση του καρκίνου, χρησιµοποιώντας τεχνολογία DNA για να ανακαλύψουν τις διαφορές µεταξύ διαφορετικών µορφών ενός θανάσιµου καρκίνου του ανοσολογικού συστήµατος. Ο τρόπος να πεις τη διαφορά µεταξύ δύο ειδών καρκίνου είναι να συγκρίνεις τις µεταλλαγές που οδηγούν στον καρκίνο κατά πρώτο λόγο. Οι βιολόγοι καλούν αυτές τις γονιδιακές αλλαγές µεταλλάξεις. Οι µεταλλάξεις που προκαλούν πολλούς καρκίνους του πνεύµονα προκαλούνται από µια τροποποίηση, που προκαλείται από τη νικοτίνη, σε ένα µόνο νουκλεοτίδιο του DNA σε ένα γονίδιο. Τέτοιες διαφορές µεταξύ της παραλλαγής ενός γονιδίου που έχουν δύο άτοµα, ή που έχει ένας καρκινοπαθής, είναι παραδείγµατα τέτοιων SNPs. Σε ένα πείραµα οι ερευνητές πήραν κύτταρα από µυελό των οστών από ασθενείς δύο τύπων λευχαιµίας (καρκίνος των λευκών αιµοσφαιρίων του αίµατος), και εκθέσανε DNA από το καθένα σε βιοτσιπς που περιείχαν όλα τα γνωστά ανθρώπινα γονίδια, 6.817 συνολικά. Χρησιµοποιώντας υπολογιστικά προγράµµατα υψηλής ταχύτητας εξέτασαν κάθε µια από τις 6.817 θέσεις στο τσιπ. Οι δύο µορφές λευχαιµίας έδειξαν η κάθε µια γονιδιακές αλλαγές από το φυσιολογικό, αλλά οι αλλαγές ήταν διαφορετικές σε κάθε περίπτωση! Κάθε µια είχε το δικό τους χαρακτηριστικό SNP. Έτσι τα βιοτσιπ µπορούν να προσφέρουν γρήγορο και αξιόπιστο τρόπο για την αναγνώριση κάθε τύπου καρκίνου. 96 6.8.3 Η Χρήση Των Gene Chips Σύντοµα Θα Είναι Καθολική Η τεχνολογία των βιοτσιπ αναµένεται να κυριαρχήσει στην ιατρική, µια προοπτική συναρπαστική αλλά και τροµακτική. Οι ερευνητές έχουν ανακοινώσει σχέδια για τη κατάρτιση ενός ηλεκτρονικού αρχείου εκατοντάδων χιλιάδων SNPs στα επόµενα δύο χρόνια. Ο έλεγχος των SNPs και η σύγκριση τους µε γνωστά αρχεία SNP σύντοµα θα επιτρέψει στους γιατρούς να εξετάζουν τον καθένα από µας σε αντίγραφα γονιδίων που οδηγούν σε γενετικές ασθένειες. Πολλές γενετικές ασθένειες σχετίζονται µε τα SNPs, περιλαµβάνοντας την κυστική ίνωση και την µυϊκή δυστροφία. 6.8.4 Τα Βιοτσιπ Προκαλούν Κρίσιµα Ζητήµατα Για Την Προσωπική Ζωή Το τροµαχτικό µέρος στα τσιπς είναι τα SNPs. Οι ερευνητές έχουν προσδιορίσει 300.000 διαφορετικά SNPs, όλα εκ των οποίων θα µπορούσαν να εδρεύουν σε ένα µόνο βιοτσιπ. Όταν το DNA κάποιου ρέεται σε ένα SNP βιοτσιπ, οι ακολουθίες που φωτίζουν θα αποκαλύψουν στιγµιαία το SNP προφίλ του. Τα γενετικά χαρακτηριστικά που κάνουν κάποιο να είναι αυτός που είναι, γονίδια που ίσως επηρεάσουν την υγεία του, τη συµπεριφορά του, όλα είναι εκεί για να διαβαστούν από οποιονδήποτε αρκετά έξυπνο να ερµηνεύσει αυτό το προφίλ. Σε τι βαθµό είµαστε τα γονίδια µας; Οι επιστήµονες τσακώνονται για αυτή την ερώτηση, και κανένας πραγµατικά δεν ξέρει την απάντηση. Είναι προφανές ότι πολύ από αυτό που ο καθένας µας είναι, επηρεάζεται έντονα από τη γενετική µας διαµόρφωση. Οι ερευνητές έχουν αποδείξει πέρα από κάθε πραγµατική αντιπαράθεση ότι η νοηµοσύνη και πρωτεύοντα γνωρίσµατα της προσωπικότητας όπως η επιθετικότητα και η περιέργεια είναι περίπου 80% κληρονοµήσιµες (δηλαδή, το 80% της παραλλαγής σε αυτά τα γνωρίσµατα αντιπροσωπεύουν παραλλαγή στα γονίδια). Το SNP προφίλ µας θα αντιπροσωπεύσει όλη αυτή τη παραλλαγή, ένας πίνακας περιεχοµένων των χρωµοσωµάτων µας, ένα µοριακό παράθυρο στο ποιοι είµαστε. Όταν εκατοµµύρια τέτοιων SNP προφίλ έχουν συλλεχτεί στα ερχόµενα χρόνια, οι υπολογιστές θα είναι ικανοί να αναγνωρίσουν άλλα άτοµα µε προφίλ σαν το δικό µας, και, εξετάζοντας µητρώα της υγείας µας, πρότυπα τεστ προσωπικότητας, θα αντιστοιχίζουν τµήµατα του προφίλ µας µε συγκεκριµένα χαρακτηριστικά γνωρίσµατα. Ακόµα τα χαρακτηριστικά της συµπεριφοράς που αφορούν πολλά γονίδια, τα οποία µέχρι τώρα 97 έχουν θεωρηθεί πολύ πολύπλοκα για να αναλυθούν, δεν µπορούν να αντισταθούν σε µια καθορισµένη εφόρµηση από υπολογιστή που συγκρίνει SNP προφίλ. Ένα βιοτσιπ είναι µια διακεκριµένη συλλογή γονιδιακών τεµαχίων σε ένα τσιπ στο µέγεθος γραµµατοσήµου το οποίο µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον έλεγχο της παρουσίας συγκεκριµένων γονιδιακών παραλλαγών. Τα βιοτσιπς επιτρέπουν γρήγορο έλεγχο των γονιδιακών προφίλ, ένα µέσο που υπόσχεται να έχει επαναστατικό αντίκτυπο στην ιατρική και τη κοινωνία. 6.9 LAB ON A CHIP Ένα πολλά υποσχόµενο αναλυτικό εργαλείο για την ανάλυση των πρωτεϊνών και πρωτεϊνικά πολυµερή στο βιολογικό εργαστήριο του µέλλοντος είναι µια µικρορευστοµηχανική συσκευή που κατά γενικό κανόνα καλείται ‘Lab-on-a-chip’. Εικόνα 37: Απεικόνιση των Lab-on-a-chips Αυτά τα ‘εργαστήρια’ κατασκευασµένα φωτολιθογραφικές είναι χρησιµοποιώντας διαδικασίες αναπτυγµένες στη µικροηλεκτρονική βιοµηχανία για τη δηµιουργία κυκλωµάτων από µικροσκοπικούς θαλάµους και κανάλια σε τσιπ από χαλαζία, πυρίτιο ή γυαλί. Αυτά τα τσιπ κατευθύνουν τη ροή των υγρών, χηµικών αντιδραστηρίων ακριβώς όπως οι ηµιαγωγοί κατευθύνουν τη ροή των ηλεκτρονίων. Αυτά τα αντιδραστήρια µπορούν να αραιωθούν, να συνδυαστούν, να αντιδράσουν µε άλλα αντιδραστήρια, ή να διαχωριστούν µε τριχοειδική ηλεκτροφόρηση ή µε ηλεκτροχρωµατογράφηση – όλα σε ένα µοναδικό τσιπ. Αυτά τα µικρορευστοµηχανικά κυκλώµατα µπορούν να σχεδιαστούν για να προσαρµόσουν ουσιαστικά οποιαδήποτε βιοχηµική επεξεργασία. Για παράδειγµα, ένα labs-on-a-chip για ανοσολογικές αναλύσεις πιθανών να ενσωµατώνει εισαγωγή δείγµατος, αραίωση, αντίδραση, και διαχωρισµό, ενώ κάποιο το οποίο είναι σχεδιασµένο για τη χαρτογράφηση ενζυµικών τεµαχίων περιστολής ίσως να έχει ένα θάλαµο ενζυµικής αφοµοίωσης ακολουθούµενος από µια σχετικά µακρά στήλη διαχωρισµού. Πολλά χαρακτηριστικά αυτών των lab-on-a-chip τα κάνουν ταιριαστά για αναλύσεις υψηλού έργου. Το µικρό τους µέγεθος µειώνει τους χρόνους επεξεργασίας και το ποσό των αντιδραστηρίων που είναι απαραίτητα για µια ανάλυση, µειώνοντας σηµαντικά τις δαπάνες. Ακριβώς όπως οι µικροηλεκτρονικές συσκευές µπορούν να κατασκευαστούν µε 98 πολλά στοιχεία σε ένα µόνο τσιπ, οι µικρορευστοµηχανικές συσκευές µπορούν να κατασκευαστούν µε πολλά κανάλια, επιτρέποντας τεράστια ποσότητα παράλληλων χηµικών αναλύσεων σε λογικό κόστος. Ταιριάζουν µοναδικά σε αναλύσεις µικρής κλίµακας, οι δειγµατικές ποσότητες για ένα µόνο πείραµα συχνά είναι στη κλίµακα των νανολίτρων (10-9 λίτρα) και πικολίτρων (10-12 λίτρα ), ανοίγοντας έτσι τη πόρτα στη πιθανότητα της ανάλυσης συστατικών ελεύθερων κυττάρων. Το lab on a chip, λοιπόν, θα βοηθήσει τους γιατρούς να κάνουν γρηγορότερες και ακριβέστερες διαγνώσεις καθώς και θα υποδείξουν φθηνότερες και πιο αποτελεσµατικές θεραπείες. Όλα αυτά χάρη στη πρόοδο των πυριτιούχων τσιπ και της δύναµης των υπολογιστών. Το lab on a chip κάτω από ανάπτυξη θα επιτρέψει στους γιατρούς να προσδιορίζουν γοργά και µε ακρίβεια νόσους, ενώ ταυτόχρονα θα παίρνουν τις απαραίτητες πληροφορίες για τον ασθενή για να προσαρµόσουν την καλύτερη δυνατή θεραπεία για αυτόν. Εικόνα 38: Βιοτσιπς (αριστερά) θα επιτρέψουν στους γιατρούς να προσδιορίζουν τις ασθένειες γρήγορα, ενώ εξελιγµένα όπως το νευροτσιπ (δεξιά) µπορούν να µετρήσουν σήµατα που εκπέµπονται από ζωντανά νευρικά κύτταρα. Για παραπέρα βελτίωση της τεχνολογίας των πρωτεϊνικών τσιπ, µια µέθοδος γνωστή ως γηγενής στιγµατισµός (native spotting) είναι ήδη προς ανάπτυξη. Ο γηγενής στιγµατισµός προϋποθέτει τη προσκόλληση των πρωτεϊνών στην επιφάνεια του τσιπ στη ‘γηγενή’ ή φυσική τους κατάσταση. Η φυσική κατάσταση των πρωτεϊνών, ωστόσο, είναι σε υδατοειδές περιβάλλον. Εποµένως, οι ερευνητές έχουν χρησιµοποιήσει τη πατενταρισµένη νανοτεχνολογία, γνωστή ως lab-on-a-chip για να βυθίσει τις σταθερές πρωτεΐνες σε µικροσταγονίδια. Αυτά τα µικροσταγονίδια όχι µόνο κρατούν τις πρωτεΐνες στο τσιπ στη γηγενή τους κατάσταση, αλλά επίσης βελτιώνουν τα αποτελέσµατα των εξετάσεων. Τα µικροσταγονίδια ενεργούν σαν µίνι δοκιµαστικοί σωλήνες χωρίς τοιχώµατα, µειώνοντας έτσι την απώλεια πολύτιµης πρωτεΐνης από τον ασθενή, εξαιτίας της απορρόφησης του υλικού του δοκιµαστικού σωλήνα. 99 Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις µπορούν να είναι χρήσιµες, όχι µόνο για τη έγκαιρη διάγνωση πολλών ασθενειών, αλλά επίσης και για τη µελέτη του µηχανισµού της φαρµακευτικής δράσης στο σώµα ή για το προσδιορισµό της προσωπικής προδιάθεσης ορισµένων ασθενών στις παρενέργειες των φαρµάκων και στις αλλεργίες. Όταν τα σωµατικά υγρά ενός ασθενούς όπως είναι το σάλιο ή το αίµα έρθουν σε επαφή µε το βιοτσιπ, µόρια ρέουν µέσα στα φρεάτια, τα οποία έχουν µέσα τους ειδικά µόρια ‘ανίχνευσης’- όπως αισθητήρες. Εάν µια ορισµένη πάθηση είναι παρούσα στα µόρια του ασθενούς, οι αισθητήρες εκπέµπουν φως. Για παράδειγµα, εάν ένας γιατρός θέλει να εξετάσει έναν ασθενή για συµπτώµατα πυρετού, θα είναι ικανός να εξετάσει το σάλιο ή το αίµα του ασθενούς χρησιµοποιώντας ένα βιοτσιπ ‘πυρετού’ το οποίο, µε τη σειρά του, εξετάζει τις πιθανές αιτίες του πυρετού. Μετά το τεστ, ο γιατρός µπορεί να εξετάσει τη διαµόρφωση του φωτός του τσιπ για να επιβεβαιώσει την ανάλυση του. Καθώς τα διαφορετικά φρεάτια στο βιοτσιπ αντιδρούν µε διαφορετικές γενετικές παθήσεις, ένας ασθενής που πάσχει από σφοδρό και οξύ αναπνευστικό σύνδροµο (Sars) θα παρουσιάσει µια διαφορετική διαµόρφωση φωτός από κάποιον που πάσχει από γρίπη. Εκτός από διάγνωση, τα βιοτσιπ µπορούν επίσης να προσδιορίσουν τη γενετική διαµόρφωση του ασθενούς όπως έχω ήδη αναφέρει. Το οργανικό προσχέδιο θα επιτρέψει στο γιατρό να εκτιµήσει πόσο καλά ένας ασθενής θα ανταποκριθεί σε διάφορες θεραπείες. Αυτό σηµαίνει ότι οι θάνατοι λόγω αλλεργίας σε φάρµακα, µια από τις πρώτες 10 αιτίες θανάτου στο κόσµο σήµερα, θα ανήκει στο παρελθόν. Και πλέον δεν θα ξανακούσουµε τον γιατρό να µας λέει να γυρίσουµε σε µια βδοµάδα εάν τα χορηγούµενα φάρµακα δεν φέρουν τα επιδιωκόµενα αποτελέσµατα. Θα ξέρει ήδη στα σίγουρα τη θεραπεία στην οποία ανταποκρινόµαστε καλύτερα. Σχετικά απλά labs-on-a-chip χρησιµοποιούνται ήδη για ορισµένες αναλύσεις νουκλεϊκού οξέος και πρωτεϊνών, αλλά η τεχνολογία ρευστοµηχανικών σύντοµα θα επιτρέψει την εκτέλεση ανά ηµέρα εκατοµµυρίων αυτόµατων βιοχηµικών πειραµάτων χρησιµοποιώντας µικροσκοπικές ποσότητες αντιδραστηρίων. Τελικά, η ατοµική ανάλυση ίσως να αντικατασταθεί από πρωτόκολλα στα οποία δεκάδες χιλιάδες αναλυτικές µετρήσεις θα παριστάνονται παράλληλα είτε στο ίδιο είτε σε πολλαπλά δείγµατα. 100 6.10 VERICHIP 6.10.1 Τι Είναι Το Verichip, Και Πώς Εισάγεται Το VeriChip είναι ένα αδρανές, περιβαλλόµενο από κάψα µικροτσίπ που ηλεκτροδοτείται και µεταδίδει τις πληροφορίες του όταν ενεργοποιείται από έναν αναγνώστη VeriChip. Επειδή το VeriChip είναι πολύ µικρό είναι ουσιαστικά µη ανιχνεύσιµο και πρακτικά άφθαρτο άπαξ και εισαχθεί κάτω από το δέρµα. Το τσιπ έχει µια ειδικά κάψα από πολυαιθυλένιο που βοηθά το δέρµα να συγκολληθεί σε αυτό – έτσι παραµένει στη θέση του. Εφόσον το τσιπ δεν έχει µπαταρία, δεν υπάρχουν χηµικά για να ανησυχήσουµε και το τσιπ ποτέ δεν ‘εξασθενεί’, η προσδοκούµενη ζωή του φτάνει τα 20 χρόνια. Το τσιπ εισάγεται κάτω από το δέρµα στο εύσαρκο µέρος (στο εσωτερικό τµήµα) του άνω βραχίονα. Ο ειδικός εισαγωγέας και το τσιπ προ-συγκεντρώνονται και αποστειρώνονται για την ασφάλεια µας. Ο εισαγωγέας έπειτα από την εισαγωγή πετιέται, είναι δηλαδή µιας χρήσεως. Κατά την εισαγωγή υπάρχει µια πολύ µικρή δυσφορία, µικρότερη από αυτή που έχουµε όταν µας κάνουν µια ένεση. Η διαδικασία που γίνεται είναι η εξής: ένα άτοµο αγοράζει το τσιπ από την εταιρία στην τιµή των $200. το άτοµο που αναζητά την εµφύτευση παίρνει τη µικροσκοπική συσκευή- στο µέγεθος ενός κόκκου ρυζιού, στο γιατρό του, ο οποίος µπορεί να την εισάγει µε την κατάλληλη βελόνα. Ο γιατρός παρακολουθεί τη συσκευή µέσω οθόνης για αρκετές εβδοµάδες για να βεβαιωθεί ΄ότι δεν κινείται και ότι δεν αναπτύσσει µόλυνση. Η συσκευή αντί για ενέργεια, περιέχει ένα µαγνητικό πεδίο µήκους 1 mm το οποίο ενεργοποιείται όταν µια συσκευή ανίχνευσης διατρέχει το δέρµα πάνω από αυτό. Ένας µικροσκοπικός ποµπός εκπέµπει τα δεδοµένα. 6.10.2 Άλλες Χρήσεις Του VeriChip Το VeriChip προωθείται ως παγκόσµιο µέσο αναγνώρισης. Προσδοκάται να χρησιµοποιηθεί σε ποικοιλία εφαρµογών περιλαµβάνοντας χρηµατοοικονοµική και µεταφορική ασφάλεια, αστική και εµπορική πρόσβαση σε κτίρια, στρατιωτική και κυβερνητική ασφάλεια. 101 6.10.3 Τεχνολογία Του VeriChip Οι περισσότεροι άνθρωποι είναι εξοικειωµένοι µε τους σαρωτές laser στα µαγαζιά που σκανάρουν γραµµοκώδικες και αναγνωρίζουν τα αγαθά για να αγοραστούν. Οι γραµµοκώδικες χρησιµοποιούνται επίσης από τη ταχυδροµική υπηρεσία για την αυτόµατη αναγνώριση δεµάτων και γραµµάτων, όπως και από πολλές άλλες υπηρεσίες. Το σύστηµα ηλεκτρονικής αναγνώρισης παρέχει ουσιαστικά την ίδια δυνατότητα για την αναγνώριση των ανθρώπων, όπου ένα ID σύστηµα που χρησιµοποιεί ετικέτες δεν είναι πρακτικό. Το VeriChip σε σχήµα αγωγού περιλαµβάνει µια µνήµη που κρατά 128 χαρακτήρες πληροφοριών, µια ηλεκτροµαγνητική σπείρα για την εκποµπή δεδοµένων και ένα πυκνωτή συντονισµού, όλα περιβαλλόµενα από κάψα σιλικόνη και γυαλί. Η παθητική RF µονάδα, που λειτουργεί στα 125 KHz, ενεργοποιείται µετακινώντας ένα ειδικά σχεδιασµένο σαρωτή. Αυτή η µετακίνηση διεγείρει το πηνίο και ‘ξυπνάει’ το τσιπ, επιτρέποντας την εκποµπή δεδοµένων. Τα τσιπ θεωρούνται ότι είναι παρόµοια µε αυτά που ήδη έχουν εµφυτευτεί σε εκατοµµύρια σκύλους και γάτες για να επιτρέψουν στους ιδιοκτήτες τους να αναγνωρίσουν και να ανακτήσουν κατοικίδια που έχουν προσωρινά χαθεί. Τα ανθρώπινα τσιπ διαφέρουν κυρίως στο βιοσυµβατό στρώµα επικάλυψης που χρησιµοποιείται για να εµποδίσει το σώµα να απορρίψει το εµφυτευόµενο τσιπ. Το VeriChip πιστεύεται ότι είναι το πρώτο τσιπ σχεδιασµένο για την ανθρώπινη αναγνώριση. Υπάρχουν δύο βασικές διαφορές µεταξύ της ηλεκτρονικής εξακρίβωσης και της τεχνολογίας γραµµοκώδικα: στο πως ο αριθµός ID διαβάζεται και στο πως αποθηκεύεται. Η ηλεκτρονική εξακρίβωση χρησιµοποιεί ένα συνηθισµένο ασύρµατο σήµα χαµηλής ενέργειας για την ανάγνωση ενός αριθµού ID που είναι αποθηκευµένος σε ένα µικροσκοπικό ηλεκτρονικό κύκλωµα, παρά ένα φως laser για την ανάγνωση µιας ετικέτας. Η ηλεκτρονική ID βασισµένη σε αυτά τα ασύρµατα σήµατα αναφέρεται επίσης και σαν αναγνώριση ραδιοσυχνότητας, ή RFID. Αυτά τα κύµατα χαµηλής ραδιοσυχνότητας, σε αντίθεση µε το φως, µπορεί να διαπεράσει όλα τα συµπαγή αντικείµενα εκτός από το µέταλλο. Εποµένως, η χρήση ηλεκτρονικής ID εκθέτεται σε απώλεια και σε τροποποίηση, εκτός θέας, ή να φορεθεί όπως για παράδειγµα, θα µπορούσε να γίνει ένα εξωτερικό βραχιόλι. Η µικροσκοπική ηλεκτρονική συσκευή που χρησιµοποιείται για την αποθήκευση του 102 Εικόνα 39: Veri Chips ηλεκτρονικού αριθµού ID καλείται εκποµπός (transponder). Ο εκποµπός εισάγεται εύκολα, παρόµοια µε τη δηµιουργία µιας ενδοφλέβιας χαρακιάς. Η συσκευή που παραµένει µέσα στο άτοµο, όπου παρέχει ένα µοναδικό αριθµό ID κάθε φορά που σαρώνεται από ένα συµβατό ηλεκτρονικό σύστηµα ανάγνωσης ID. Τα συστήµατα ανάγνωσης των VeriChip, ή σαρωτές, στέλνουν ένα σήµα χρησιµοποιώντας µια συχνότητα στα 125 KHz, πολύ χαµηλότερη από τις συχνότητες που χρησιµοποιούνται στη εκποµπή µεσαίων κυµάτων AM. Η ενέργεια του ασύρµατου σήµατος που εκπέµπεται από τον σαρωτή είναι λιγότερη του ενός χιλιοστού του Watt ( ένα Οι εκποµποί των VeriChip είναι παθητικές συσκευές, εννοώντας ότι δεν µεταφέρουν µπαταρία και παραµένουν ανενεργοί το περισσότερο χρόνο. Το µικροσκοπικό ηλεκτρονικό κύκλωµα του εκποµπός ενεργοποιείται από τη χαµηλής ενέργειας ασύρµατη δέσµη που στέλνεται από µια συµβατή συσκευή ανάγνωσης. Ο εκποµπός στέλνει τον αριθµό ID σαν ασύρµατο σήµα πίσω στον σαρωτή, ο οποίος τότε αποκρυπτογραφεί τον αριθµό και τον εκθέτει σε µια µικρή οθόνη παρόµοια µε αυτή του ηλεκτρονικού υπολογιστή. Οι εκποµποί είναι κυλινδρικοί, µετρούν 11 mm σε µήκος και 2.1 mm σε διάµετρο. Υπάρχουν µόνο τρία συστατικά µέσα τους: ένα υπολογιστικό µικροτσίπ (συνηθισµένου ολοκληρωµένου κυκλώµατος) που φαίνεται στη φωτογραφία σε ένα ανθρώπινο δάχτυλο. Εικόνα 40: Το υπολογιστικό µικροτσίπ που περιέχει ο εκποµπός. Αυτό το µικροτσίπ περιέχει το µοναδικό αριθµό ID παραχωρηµένο στον εκποµπό, και όλη την ηλεκτρονική διάταξη κυκλωµάτων που είναι απαραίτητη για την αποστολή του αριθµού στον σαρωτή, όταν λαµβάνει το ασύρµατο σήµα του σαρωτή. 103 Το δεύτερο συστατικό του εκποµπού είναι ένα πηνίο από χάλκινο σύρµα τυλιγµένο γύρω από ένα πυρήνα φερριτίου (σίδηρος). Αυτό λειτουργεί σαν µια µικροσκοπική ασύρµατη κεραία για τη συλλογή του σήµατος από τον σαρωτή, και την αποστολή του κρυπτογραφηµένου αριθµού ID από το µικροτσίπ πίσω στον σαρωτή. Το τρίτο συστατικό είναι ένας πυκνωτής που χρησιµοποιείται για συντονισµό. Κάθε µοναδικός αριθµός ID του εκποµπού είναι κρυπτογραφηµένος µέσα του κατά τη διάρκεια της κατασκευαστικής µεθόδου. Ένα laser εντυπώνει τον κώδικα στην επιφάνεια του µικροτσίπ πριν τη συναρµολόγηση του εκποµπού και πριν τη περιβολή του σε γυαλί. Εάν ο αριθµός κρυπτογραφηθεί είναι αδύνατο να αλλάξει µετά. Η κρυπτογράφηση του ίδιου αριθµού χρησιµοποιεί 38 bits πληροφορίας που επιτρέπουν 490 δισεκατοµµύρια πιθανούς αριθµούς ID. Το εξωτερικό του εκποµπού είναι από γυαλί ανθρακικού νατρίου και υδροξειδίου του ασβεστίου που είναι ειδικά επιλεγµένο για τη γνωστή βιοσυµβατότητα του. Κατά τη κατασκευή, αυτό το γυαλί σφραγίζεται στεγανά έτσι είναι απίθανο οποιαδήποτε υγρασία των ανθρώπινων σωµατικών υγρών να φτάσει τα ηλεκτρονικά στο εσωτερικό. Ενώ το γυαλί είναι βιοχηµικά αδρανές είναι επίσης και πολύ οµαλό, κάτι που σε σπάνιες περιπτώσεις θα µπορούσε να επιτρέψει τη µετακίνηση του εκποµπού στο σώµα άπαξ και εισαχθεί. Γι’ αυτό, έχει επινοηθεί ένα ειδικό, προστατευτικό περίβληµα από πορώδες πολυπροπυλένιο που καλύπτει τη µια άκρη του εκποµπού. Αυτό το Biobond στρώµα επίστρωσης προσφέρει επιφάνεια µε την οποία αρχίζει να συνενώνεται ινώδης συνδετικός ιστός µέσα σε 24 ώρες από την εισαγωγή. Η θέση της εισαγωγής µπορεί να είναι ο ώµος ή, για αναγνώριση µιας εµφυτευµένης ιατρικής συσκευής, κοντά στο εµφύτευµα. Σε αυτή την εφαρµογή θα µπορούσε να προσκολληθεί στο εξωτερικό της καρδιακής συσκευής ή να εµφυτευτεί πλησίον στο σώµα. Αυτό θα µπορούσε να επιτρέψει στο ιατρικό προσωπικό να προσδιορίσει και να παρακολουθεί τις εµφυτευµένες συσκευές ενός ασθενή αποκλειστικά και µόνο µε την κύλιση ενός χειροκίνητου σαρωτή πάνω στο στήθος του ασθενούς. Για παράδειγµα, εάν κάποιος είναι χρήστης βηµατοδότη και βρεθεί σε ένα ατύχηµα και σε κατάσταση σοκ, ένας συνοδός ασθενοφόρου θα µπορούσε να σαρώσει το σώµα και να παραλάβει πληροφορίες για τη συσκευή. Το τσιπ θα µπορούσε να παρέχει πληροφορίες για τις ρυθµίσεις του βηµατοδότη, ποιος είναι ο κατασκευαστής του και κατά πόσο ο ασθενής έχει ιατρικές αλλεργίες. Για αυτές τις εισαγωγές, λοιπόν, κάθε εκποµπός έρχεται προεισαγόµενος σε µια σωληνοειδή βελόνα, και αυτή η συναρµολόγηση πακετάρεται σε αποστειρωµένους πλαστικούς φακέλους. Κάθε τέτοιο σετ απορρίπτεται µετά από µια χρήση. 104 Έχουν εκτελεστεί πολυάριθµες µελέτες για να αποδείξουν την ασφάλεια του εκποµπού. Αυτές οι µελέτες έχουν ασχοληθεί µε θηλαστικά, πουλιά, ψάρια και ερπετά που δεν έχουν δείξει επιβλαβή αντιδράσεις στον εκποµπό, είτε βιολογικές είτε συµπεριφορικές. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Έχοντας αναλύσει πλέον τι και ποιες είναι οι συσκευές MEMS µπορούµε να καταλήξουµε στα εξής πλεονεκτήµατα που έχουν έναντι άλλων τρεχόντων συσκευών που εκτελούν τις ίδιες λειτουργίες. Αυτά είναι τα παρακάτω: Οι συσκευές MEMS µπορούν να είναι τόσο µικρές που εκατοντάδες αυτών µπορούν να χωρέσουν στον ίδιο χώρο όσο µια µόνο µακρο-συσκευή που εκτελεί την ίδια λειτουργία. Τα ογκώδη ηλεκτρικά εξαρτήµατα δεν χρειάζονται πλέον, αφού τα ηλεκτρονικά µπορούν να τοποθετηθούν κατ’ ευθείαν πάνω στη συσκευή MEM. Αυτή η ενσωµάτωση έχει επίσης το πλεονέκτηµα να παίρνουµε λιγότερο ηλεκτρικό θόρυβο, βελτιώνοντας έτσι την ακρίβεια και την ευαισθησία των αισθητήρων. Χρησιµοποιώντας µεθόδους IC, εκατοντάδες χιλιάδων αυτών των συσκευών µπορούν να κατασκευαστούν σε ένα µόνο wafer. Αυτή η µαζική παραγωγή µειώνει σηµαντικά την τιµή των ατοµικών συσκευών. Έτσι, οι συσκευές MEMS θα είναι πολύ λιγότερο ακριβές απ’ ότι οι οµόλογες τους στον µακρόκοσµο. Στα σηµερινά χρόνια ο µέσος άνθρωπος επισκέπτεται το φαρµακείο µια φορά τη βδοµάδα για να ξαναπάρει µια παλιά συνταγή ή για να αγοράσει καινούργια φάρµακα. Οι άνθρωποι έχουν συνηθίσει να παίρνουν και ένα χάπι µαζί µε το γεύµα τους ή να χορηγούν µια ένεση ινσουλίνης κάθε πρωί. Τα µικρορευστοµηχανικά συστήµατα παροχής φαρµάκων ίσως παρέχουν εναλλακτικές σε αυτούς τους τρόπους χορήγησης. Όπως ακριβώς οι τεχνολογίες του στιλ ‘Lab-on-a-Chip’ περιορίζουν κλιµακωτά ολόκληρα εργαστήρια σε µια µόνο συσκευή µε την ικανότητα της εκτέλεσης πολύπλοκων βιοχηµικών θεµάτων, είναι τώρα προβλεπόµενο ότι µια εύχρηστη, µικροκατασκευαστική συσκευή θα είναι σύντοµα ικανή να εκτελεί την ίδια λειτουργία µε ένα γιατρό ή φαρµακοποιό. Μια ολοκληρωµένη, ‘έξυπνη’ συσκευή που είναι ικανή να ανταποκρίνεται συνεχώς σε φυσιολογικές άλλες και να παρέχει ακριβή ποσά θεραπευτικών συστατικών θα έχει σηµαντική επίπτωση στον τρόπο που οι άνθρωποι ζούνε τις ζωές τους. στο κοντινό µέλλον, ο µέσος άνθρωπος ίσως να µην έχει να ανησυχεί για την αγορά φαρµάκων από τα φαρµακεία. Το ‘Pharmacy-on-a-Chip’ θα χορηγεί φάρµακα όπου χρειάζονται, όταν χρειάζονται. 105 Τα βιοτσιπς τώρα, είδαµε ότι είναι ακριβή, µικροσκοπικά, και προσδοκούνται να γίνουν οικονοµικά επωφελή- προσόν που τα κάνει ανάλογα µε τα υπολογιστικά τσιπς. Κάποιος περιµένει να δει επιταχυνόµενη τάση υπερ-µικροσκοπικοποίησης, που ίσως να περιλαµβάνει πρωτότυπα µέσα µαζικής ενηµέρωσης, και µια αυξηµένη ικανότητα ανάλυσης όχι µόνο γενετικού υλικού αλλά επίσης και άλλων τύπων βιολογικών µορίων. Κάποιος περιµένει, επίσης, µια επακόλουθη εναρµόνιση των τεχνολογιών, έτσι ώστε να προκύψουν επικρατέστερες κατασκευαστικές στρατηγικές, τουλάχιστον για ορισµένους τύπους εφαρµογών, περιλαµβάνοντας µια ευνοϊκότερη διάταξη για γενετική ανάλυση και µια άλλη για αντισώµατα και άλλες πρωτεΐνες. Από τη στιγµή που οι ενδεχόµενες εφαρµογές είναι απέραντες, και για έρευνα και για κλινική χρήση, οι εκµεταλλεύσιµοι τοµείς της αγοράς για τα βιοτσιπς θα είναι τεράστιοι, µια πανίσχυρη κινητήρια δύναµη για την συνεχόµενη ανάπτυξη τους. 106 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ 1. http://ems.wvu.edu/mems/memsr.htm 2. http://www.hosppract.com/genetics/9911mmc.htm 3. http://www.manufacturingcenter.com/dfx/archives/0899/899MEM.A SP 4. http://www.its.caltech.edu/~sciwrite/journal03/A-L2/lammers.html 5. http://www.manufacturingcenter.com/tooling/archives/0902/0902me dical.asp 6. http://www.Spie.org/web/oer/march/mar00/biochips.html 7. http://www.tms.org/pubs/journals/JOM/0010/Kumar/Kumar- 0010.html 8. http://computertimes.asia1.com.sg/news/story/0,514,1208,00.html 9. http://www.erc- assoc.org/showcase/accomplishments/microelectronic/caltech1electro…http://books.nap.edu/books/0309084989/html/99.html 10. http://www.nsf.gov/home/crssprgm/nano/mole.htm 11. file://A:\FAQ’s%20Verichip.htm 12. file://A:\verichip3.htm 13. file://A:\verichip2.htm 14. http://www.adsx.com/investorrelations/pdfs/VeriBro.pdf 15. http://www.techweb.com/wire/story/TWB20030718S0003 16. file://A:\page1.htm 17. file://A:\Lab-on-a-Chip%20Microfluidics.htm 18. file://A:\DNAchip2.htm 19. http://yekuo.edu/Biochips.htm 20. http://www/txtwriter.com/Backgrounders/Genetech/Gepage15.htm 21. http://www/coe.berkeley.edu/labnotes/1003/boser.html 22. http://www.accessexcellence.org/AB/BA/biochip.html 23. http://www.ornl.gov/info/ornlreview/rev293/text/biosens.htm 107 24. www.medicaldevicesonline.com 25. www.landesbioscience.com/iu/output.php?id=415 26. ncbi.nlm.nih.gov/enterz 27.mic.ki.se/others ΕΝΤΥΠΗ 1. <<Implantable Microsystems for Monitoring and Neural rehabilitation>>, του Thomas Stieglitz 2. << Integrated microsystems for controlled drug delivery>>, των S. Zafar Razzacki, Prasanna K. Thwar, Ming Yang, Victor M. Ugaz, Mark A. Burns 3. <<Nanopumps for programmable Biochips>>, των Achim Wixforth, Jurgen Scriba 108