Project proposal: Study of the vibrational spectra of floppy molecules... stimulated Raman spectroscopy
by user
Comments
Transcript
Project proposal: Study of the vibrational spectra of floppy molecules... stimulated Raman spectroscopy
Project proposal: Study of the vibrational spectra of floppy molecules using ionization-loss stimulated Raman spectroscopy Student: Amir Bernat Advisor: Prof. Ilana Bar Abstract: The structure of flexible biomolecules plays an important role in determining their selectivity and functionality. Therefore, revealing their shapes is of much importance. As was very recently shown, this can be achieved by the ionization-loss stimulated Raman spectroscopy (ILSRS) method. This method allows measurement of vibrational spectra in the gaseous phase and consequently the structures of these molecules in their differing shapes. The goal of this project is to learn the method and to try measuring the vibrational or electronic spectra of a model molecule אוניברסיטת בן-גוריון בנגב הפקולטה למדעי הטבע המחלקה לפיסיקה מדידת חתימות ספקטרליות של מולקולות גמישות בשיטת Ionization-loss stimulated Raman spectroscopy חיבור מסכם בפרויקט תואר ראשון במחלקה לפיסיקה מאת :אמיר ברנט מנחה :פרופ' אילנה בר חשוון התשע"א אוקטובר 2010 תודות ברצוני להודות לאיתמר מלכא שהנחה אותי בעבודה המעשית במהלך החודשים בהם לקחתי חלק בעבודת המעבדה. לניצן מיורקס על שהעלה בפני את האפשרות להצטרף לקבוצת המחקר .על הנחייתו ,מקרוב ומרחוק ,ועל האתגרים שהציב בפני .תודתי לפרופסור אילנה בר שאפשרה לי לקחת חלק בעבודת הקבוצה ועל שפתחה בפני תחומי ידע חדשים אליהם נחשפתי במהלך כתיבת העבודה. תוכן עניינים תודות 3................................................................................................................................................. תוכן עניינים 4......................................................................................................................................... רשימת איורים 5...................................................................................................................................... .1מבוא6............................................................................................................................................... 1.1סקירה 6 ...................................................................................................................................... 8 ................................................... Ionization-loss stimulated Raman spectroscopy (ILSRS) 1.2 ינון דו פוטוני מוגבר תהודה חד-צבע )8 ..................................................................................... (R2PI עירור רמאן מאולץ 9 ....................................................................................................................... מציאת תדרי ויברציה מולקולריים 11 .................................................................................................. 1.3מולקולת -2פנילאתנול 12 .................................................................................... 2-Phenylethanol .2מערכת ומהלך הניסוי 14....................................................................................................................... 2.1מבנה המערכת הניסויית 14 ............................................................................................................. .1המערכת האלקטרואופטית14 ....................................................................................................... : .2מערכת 16 ................................................................................................................... TOFMS .3מערכת מדידת הנתונים17 ........................................................................................................... . .4תוכנת 17 ............................................................................................................... Gaussian03 2.2מהלך הניסוי 18 ............................................................................................................................ 2.3תוצאות ועיבודן 19 ........................................................................................................................ .3דיון בתוצאות ומסקנות 23.................................................................................................................... 3.1יצירת הקישור בין המאפיינים הספקטרליים Aו C-לקונפורמרים 2ו23 ............................................. .5- 3.2הצעות לשיפור וניסויים נוספים 25 ................................................................................................... .4ביבליוגרפיה 26................................................................................................................................... רשימת איורים איור 1הצגה סכמטית של שיטת ה :ILSRS-עירור רמאן מאולץ בו הפרש האנרגיה בין שתי קרני הלייזר תואם להפרש האנרגיה בין רמות ויברציה במולקולה .ערור זה מוריד מהאוכלוסיה של רמת היסוד הויברציונית שיכולה לעבור יינון .R2PIמימין מוצגת הירידה בעוצמת המדידה כאשר הפרש האנרגיות תואם למעבר ויברציוני12 ........... . איור 2המערכת האופטית כוללת שלוש קרני לייזר ,לייזר ה UV-המתכוונן המאפשר את יינון המולקולות ,הקרן השואבת באורך גל קבוע של 532nmוקרן הסטוקס סורקת תחום תדרים .נתוני המדידה מועברים דרך שני מגברים לאוסילוסקופ ,LeCroy 9374לממצע אנלוגי ואחר כך מומר על ידי מתאם Analog to Digitalומועבר לשמירה במחשב .PCקרן ה UV-וקרן השאיבה מורחבות על ידי טלסקופ קפלרי וטלסקופ גליליי )בהתאמה( .הכוונת הקרניים נעשית על ידי פריזמות ומראות דיכרואיות15 .............................................................................................. . איור 3סכמה של מערכת TOFMSמסוג Wiley-McLarenבה נעשה שימוש בניסוי .סילון הגז עובר יינון ע"י קרן ה UV-והיונים מואצים על ידי הפרשי מתח בכיוון גלאי ה .MSP-המערכת כולה נשאבת ,כך שסילון הגז יהיה בטמפרטורה רוטציונית נמוכה16 ............................................................................................................. 4. איור 4הצגה זו מתבססת על תוצאת האופטימיזציה הגיאומטרית .באפור כהה מוצגים אטומי הפחמן ,באפור בהיר אטומי המימן ובאדום אטום החמצן .המולקולה מורכבת מטבעת בנזן וזנב פונקציונלי בו קבוצת ה OHמופיעה בכיוונים שונים במרחב .ישנה חלוקה בין קבוצת ) Gaucheבחלק העליון של האיור( לקבוצת ה Antiבחלק התחתון .המיספור לפי הסימון של ניוסר 10וסימון אותיות לפי סימונס 11.מוצגות תוצאות חישובי האנרגיה שביצענו בשיטת 19 .... .MP2 איור 5ספקטרום R2PIשל PEALלאחר מיצוע של חמש מדידות והחלקה על 20נקודות מדידה .המאפיינים הספקטרליים A-Eמסומנים בסמוך לעליה בכמות היונים .מאפיינים אלו נוצרים כאשר פוטון ה UVהראשון בעל אורך גל התואם למעבר אל רמה ויברונית מעוררת20 ........................................................................................... . איור 6השוואת קטע של ספקטרום ה ILSRS-לספקטרום רמאן מחושב מחישובים קוונטיים עבור המאפיין הספקטרלי ) Aקונפורמר .(2בחלק העליון של הגרף מוצגות התוצאות הניסיוניות ובחלק התחתון דיאגרמת מקלות של הסימולציה בתוכנת .Gaussian03מוצגות ויברציות יסוד )אדום( ואוברטונים )ירוק(21 ..................................... . איור 7השוואת קטע של ספקטרום ה ILSRS-לספקטרום רמאן מחושב מחישובים קוונטיים עבור המאפיין הספקטרלי ) Cקונפורמר . (5בחלק העליון של הגרף מוצגות התוצאות הניסיוניות ובחלק התחתון דיאגרמת מקלות של הסימולציה בתוכנת .Gaussian03מוצגות ויברציות יסוד )אדום( ואוברטונים )ירוק(21 ................................ . איור 8ספקטרא ILSRSשל PEALהמתאימים למאפיינים הספקטרליים E-Aבספקטרום ה .R2PI-מבט על תחום רחב של ויברציות מולקולריות מאפשר לנו לראות את הבדלי המיקום והעוצמה שבין המאפיינים הספקטרליים השונים. השוואה זו תומכת בכך שהמאפיינים Aו B-וכן המאפיינים Cו D-נוצרים מאותם קונפורמרים22 ......................... . .1מבוא 1.1סקירה ספקטרוסקופיה ויברציונית הינו תחום מחקר המאפשר מדידת חתימה ספקטרלית של מולקולות על ידי ערור ויברציות שונות שלהן .על ידי שימוש בספקטרוסקופיה ויברציונית ניתן ללמוד רבות על מאפייני מבנה המולקולה ועל הכוחות והאינטראקציות התוך -והבין-מולקולריות .למידע הנלמד בצורה זו חשיבות ויישומים בתחומים שונים ,החל בחקר פיזיקלי בסיסי וכלה ביישומים עתידיים בתעשיית התרופות .מולקולת -2פנילאתנול 2-Phenylethanol ) C6H5–CH2–CH2–OH ,(PEALבה עסקנו ,מעוררת עניין בגלל דמיונה לנוירוטרנסמיטר 2-Phenylethylamine )קבוצת OHב PEAL-במקום NH2במולקולה האחרונה( .מולקולות אלו יכולות להופיע כקונפורמרים שונים ,עקב אפשרותן להמצא בכמה מבנים ,תוך סבוב של קבוצה מסויימת סביב קשר בודד .לכן ,חשוב לקבל מידע על מבני מולקולות אלו בפאזה הגזית ,כשהן בסביבה מבודדת ,או כשהן באינטראקציה עם מולקולות מים משום שהמבנים משפיעים על הפונקציונליות שלהם בסביבה הביולוגית. 1 ישנן דרכים רבות ליצירת ספקטרום ויברציוני של אופני תנודה יסודיים ,המשותף לכולן הינו שהתחום האנרגטי הנבחן הינו ב ,mid-IR -מכוון שזהו סדר הגודל של האנרגיה הנדרשת לעירור רוויברציות במולקולות. 2 לספקטרוסקופיית IRהמבוססת על מקורות לייזר יש חסרון עיקרי הנובע ממחסור במקורות לייזר שניתנים לסריקה בתחום תדרים רחב .אחד הפתרונות לחסרון זה הינו השימוש בתהליך רמאן מאולץ 3.בספקטרוסקופייה זו הערור הויברציוני נעשה על ידי שתי קרני לייזר בעלות הפרש תדרים המתאים לתדר הויברציה .קרני לייזר אלו יכולות להיות בתחום הנראה ולכן יחסית קל לקבלן ע"י לייזרים קונבנציונליים .בעוד שלתהליך רמאן ספונטני יעילות נמוכה מאד ניתן להגביר יעילות זו על ידי העברת קרן סטוקס המאלצת את התרחשות התהליך ,זהו תהליך רמאן מאולץ. בעבודה זו השתמשנו בשיטת ) ,ionization-loss stimulated Raman spectroscopy (ILSRSייתרונה של השיטה ביכולת לאפשר סריקה של תחום רחב של אורכי גל ,השיטה פותחה בקבוצתנו ונעשה בה שימוש בעבר בחקר מולקולות אורגניות אחרות. 6,4 מטרת השיטה הינה להשיג אפשרות סריקה של תחום תדרים רחב ורגישות גבוהה .בעזרת שילוב של לייזרים וסלקטיביות מסות ע"י שימוש בספקטרומטר מסות מסוג זמן מעוף ) Time of flight mass spectrometer (TOFMSמדדנו את ספקטרום ה ILSRS-של קונפרמרי הPEAL- המשקפים את המבנים השונים ,ותוצאות אלו הושוו לתוצאות חישוביות. השוואת הספקטרא המדודים ,בתחום תדרים רחב של אופני תנודה יסודיים ,לתוצאות חישובים קוונטים מאפשרת לנו לזהות ביתר ודאות את קונפורמרי ה .PEAL -תוצאות אלו מצביעות על חשיבות ספקטרוסופיית ה ILSRS-ככלי ייחודי וחשוב לחקר המבנה של מולקולות גמישות בפאזה הגזית. Ionization-loss stimulated Raman spectroscopy (ILSRS) 1.2 בשיטת ה ILSRS-נעשה שימוש בשלוש קרני לייזר ,קרן אחת ב UV-המשמשת ליינון דו פוטוני מוגבר תהודה של המולקולה ונוסף אליה שתי קרניים נוספות המשמשות לעירור רמאן מאולץ .ייחודה של שיטה זו הינו ביכולת לסרוק תחומים רחבים של אורכי גל ,מ 400 cm-1-ועד 4000 cm-1ברמת רזולוציה גבוהה ,המאפשרת בחינת קווי ויברציה בודדים. 6,5,4 שיטת ה ILSRS-מבוססת על שילוב שתי שיטות ספקטרוסקופיות: יינון דו פוטוני מוגבר תהודה חד צבע –)resonantly-enhanced two-photon ionization (R2PI פיזור רמאן מאולץ stimulated Raman scattering (SRS) - ינון דו פוטוני מוגבר תהודה חד-צבע )(R2PI תהליך יינון רב פוטוני מוגבר תהודה ) Resonantly enhanced multiphoton ionization (REMPIהינו ערור בעזרת בליעה של מספר פוטונים בו זמנית ,המתרחש תוך עירור רזוננטי לרמה ויברונית ולאחר מכן יינון המולקולה .מקרה פרטי של REMPIהינו תהליך ה .R2PI-יינון דו פוטוני מוגבר תהודה מתקיים כאשר האנרגיה של פוטון בודד מתאימה לעירור ויברוני ופוטון שני מיינן את המולקולה ..מציאת הסתברות המעבר מרמת היסוד ) (iלרמה המעוררת ) (kניתן על ידי לורנציאן ויגנר ,המעבר למצב מיונן ) (fמתואר אף הוא בצורה זו ,אך עם מומנט דיפול שונה:. 7 k 1 i E ki h S ei f 2 k 1 כאשר מדובר על מעבר מרמה iלרמה kשהפרש האנרגיה בניהן שווה ל , Ekiעל ידי פוטון בעלי תדירות , 1 , 2הנם מומנטי הדיפול למעבר .כאשר אורך הגל של הפוטון המעורר מתלכד עם רמה ויברונית מידת ההסתברות של המעבר גדלה מאד .בזכות הסלקטיביות שבמעבר לרמה המעוררת ניתן לעורר כל מאפיין ספקטרלי בנפרד מהאחרים. עירור רמאן מאולץ עירור רמאן מאולץ הינו חיבור של תהליך רמאן עם פליטה מאולצת ,בתהליך רמאן מתבצע מעבר לרמה ויברונית על ידי מעבר ביניים ברמה וירטואלית .המעבר בין הרמות מתבצע על ידי מעבר לרמה וירטואלית לו גורם הפוטון האנרגטי יותר )שאיבה( והירידה מאולצת על ידי פוטון נוסף בעל אנרגיה נמוכה יותר )סטוקס( .התנאי לקיומו של התהליך הינו שהפרש אורך הגל בין הקרן השואבת לקרן הסטוקס יתאים להפרש האנרגיה בין רמות בדגימת החומר. ניתן לקבל ביטוי הקושר את כמות המולקולות שעוברות תהליך רמאן לפרמטרי המערכת על ידי פיתוח של חוק בר-למברט והסוספטביליות הלא ליניארית מסדר שלישי באורך הגל של קרן הסטוקס .חוק בר-למברט מתאר את היחלשות קרן הסטוקס I S 0 -בעוברה דרך החומר מרחק Zעם מקדם ההגברה :g I s ( Z ) I S 0 e g s Z 2 ההפרש בין עוצמת הקרן הנכנסת ליוצאת ניתן לביטוי . I S I S ( Z ) I S 0 I S 0 e g s Z 1כאשר הקרניים אינן ברוויה ניתן להניח g S Z 1וכך ניתן לבצע את הקירוב . I S I S 0 g S Zמספר הפוטונים שהתווספו בתהליך n -שווה לעל יה ביחס שבין עוצמת קרן הסטוקס והאנרגיה של פוטונים אלו ולכן I S AS T S , n כאשר ASהינו שטח החתך של הקרניים ,ו T-משך הזמן שהקרניים באינטרקציה .מכוון שכל פוטון שנותר בתהליך מעיד על עירור שהתבצע מתקיים השוויון , n N eכאשר N eהינו כמות המולקולות שעברו את התהליך מקדם ההגברה של סטוקס ניתן על ידי המשוואה: *16k s '' I p cns2 n p 3 gs s ns כאשר ns , n pמקדמי השבירה של קרני השאיבה והסטוקס בהתאמה ,גודל וקטור הגל של קרן הסטוקס: c עוצמת קרן השאיבה , I pמספר קבועים פיזיקלי ים והחלק המדומה של הסוספטביליות הלא ליניארית מסדר שלישי , k s* באורך הגל של קרן הסטוקס ,אותו ניתן לבטא: d Nc 4 6 NR d 4 s4 res p s i 2 ' ' ( s ) 4 כאשר d dהינו חתך הפעולה הדיפרנציאלי לפיזור רמאן- ,רוחב מלא בחצי הגובה ) (FWHMשל קו רמאן ספונטני ,הינו הפרש האכלוס בין הרמה העליונה והתחתונה N ,הינו מספר הצפיפות המולקולרי ,הפרש האנרגיות שבין הקרניים ומרחקן מתדר הרזוננס הינו NR , res P S :הינו מקדם הסוספטביליות שלא ברזוננס .על ידי הצבה של משוואה 5במשוואה 4ואת תוצאתן בפיתוח של חוק בר-למברט ניתן לקבל את משוואה 5 שמראה את הקשרים בין הגדלים הפיזיקליים ,קבועי המערכת וכמות במולקולות שעוברות תהליך רמאן מאולץ. ביטוי הקושר את כמות המולקולות שעוברות תהליך רמאן לפרמטרי המערכת הינו: 9,8 8 2 Nc 2 d N e 2 I I ZA t 0 P S S h n n 4 d 2 2 4 S P S res Change V I PS L Scatter cons tan ts 5 משוואה זו מושגת על ידי פיתוח של חוק בר-למברט עם מקדם ההגברה של סטוקס ,היא מוצגת כאן בחלקיה העיקריים-L :הרחבת קו הומוגנית-V ,הנפח בו הפעולה מתבצעת-I ,עוצמות הקרינה במערכת-Scatter ,חתך הפעולה הדיפרנציאלי לפיזור ו-Constantsשהנם קבועים פיזיקליים או קבועים הקשורים במערכת כל אלו מובילים לגודל השינוי בכמות המולקולות שיעברו את התהליך ומסומן כ. N e - פעילות רמאן הינה המידה בה כל אחת מהויברציות במולקולה תבוא לידי ביטוי ,הגודל אותו אנו נמדוד הינו עוצמת רמאן התלויה בעיקר בטמפרטורה בה נמצאת המולקולה אך גם באורך הגל השואב Pוכן בתדר הויברציה שהינו ההפרש בין אורך הגל של הקרן השואבת לקרן הסטוקס . Sיחסים אלו משמשים כמקדמים הקושרים בין 6 עוצמת רמאן המחושבת לפעילות רמאן הנמדדת ,ונתונים על ידי הנוסחה: 4 p 1 exp hc k T B I i fS i )( 6 כאשר I iהינה עוצמת רמאן שנמצאה לויברציה ה S i ,iפעילות רמאן שחושבה לויברציה ,iהינו ההפרש באורכי הגל בין הקרן השואבת לקרן הסטוקס f .הינו גורם נרמול בו נעשה שימוש בהצגה. מציאת תדרי ויברציה מולקולריים שיטת ה ILSRS-מאפשרת מדידת ספקטרומי רמאן )עצמת קווים כנגד תדרי ויברציה( של מולקולות בפאזה הגזית .השיטה מנצלת יינון דו פוטוני מוגבר תהודה ב UV-באורך גל המתאים למעבר מרמת היסוד האלקטרונית לרמה מעוררת ויינון של קונפורמר נבחר של המולקולה ,סכמה של שיטת ה ILSRS-מוצגת באיור .1סריקה רציפה של ההפרש באורכי הגל בין שתי קרני לייזר ב :VIS-קרן שואבת באורך גל קבוע ,מסומנת ב , P -וקרן הסטוקס סורקת באורך גל גבוה יותר ,מסומנת ב . S -הפרש אורכי הגל מתאים לעיתים לאנרגיה של מעבר בין רמות ויברציה )באותה רמת אנרגיה אלקטרונית( דבר שיוריד את האוכלוסיה ברמה הויברציונית היסודית ולכן אורך הגל של קרן ה UVלא יתאים לביצוע ,R2PIדבר זה יוריד את כמות האוכלוסייה שניתן ליינן ולכן יוביל להחסרת יונים. איור 1הצגה סכמטית של שיטת ה :ILSRS-עירור רמאן מאולץ בו הפרש האנרגיה בין שתי קרני ה לייזר תואם להפרש האנרגיה בין רמות ויברציה במולקולה .ערור זה מוריד מהאוכלוסיה של רמת היסוד הויברציונית שיכולה לעבור יינון .R2PIמימין מוצגת הירידה בעוצמת המדידה כאשר הפרש האנרגיות תואם למעבר ויברציוני. 1.3מולקולת -2פנילאתנול 2-Phenylethanol מולקולת PEALהינה מולקולת דוגמה ביולוגית שמשמשת לבחינת שיטות ספקטרוסקופיות וחישוביות שונות כאבן דרך ליישומן על מולקולות גדולות ומורכבות יותר .1המולקולה כוללת טבעת בנזן עם "זנב" שבקצהו קבוצת OHשיכולה להימצא במגוון כיוונים במרחב .למולקולה 51ויברציות יסודיות ,מכוון שהקונפורמרים שונים מעט זה מזה תדרי הויברציה וקווי הבליעה המייצגים אותן תנועות של המולקולה עוברים הסחה במידה שונה בגלל הבדלים בפוטנציאל בסביבתן ,דבר שמאפשר לנו להבחין בין הקונפורמרים השונים. על ידי חישובים קוונטיים ניתן למצוא את הכיוונים המרחביים והאנרגיה של מבנים אלו ,כאשר ברור שהמבנים היציבים יותר הם המסתברים ביותר להמצא בקרן המולקולרית .החישובים הקוונטיים מאפשרים גם לחשב את התדירויות האנהרמוניות של הויברציות המולקולריות במבנים השונים ואת פעילויות הרמאן שלהם .חישובים תיאורטיים נעשו ברמות שונות של תיאוריה ,בבסיסית ופונקציונלים שונים ,בעוד שהמבנים שנבחנו דומים ויזואלית זה לזה האנרגיות שחושבו לכל קונפורמר שונות .עבודה משמעותי נעשתה על ידי ניוסר )(Neusser 10 אשר חישב בבסיס , cc - pVDZניוסר מציין כי בחישובים בסט בסיסים רחב ביותר מצא שקונפורמר 5נמוך מקונפורמר 4ב– 0.6 kJ/molבניגוד לתוצאות המפורטות אותן הציג במאמרו ומוצגות בטבלה .1סימונס )(Simons 11 השתמש בחישוב ברמת ) ,B3LYP/6-311G(d,pמאמר מאת בראון ) 12(Brownמדווח על חישוב בבסיס )B3LYP/6311++G(d,p בבסיס רחב זה גם בראון מצא כי קונפורמר 5בעל אנרגיה נמוכה משל קונפורמר .4 מיקאמי ) 13(Mikamiובעקבותיו סימונס 14טענו כי לא נצפים כל חמשת המבנים אלא רק שניים מהם ,לצורך כך השתמשו בשיטת ) laser-induced fluorescence (LIFובשיטת UV Holeburning spectroscopy )בהתאמה( .מבנים אלו הנם בעלי האנרגיה הנמוכה ביותר שחושבה בכל קבוצת מבנים .הסיבה לכך שלא ניתן להבחין בין הקונפורמרים השונים בכל קבוצה היא שמחסום רמות האנרגיה בין הקונפורמרים בכל אחת מהקבוצות קטן מהאנרגיה התרמית במערכת ולכן סטטיסטיקת בולצמן תאפשר מעבר בין הקונפורמרים בקבוצה ותגרום לכך שמרבית המולקולות תהינה במצב האנרגטי הנמוך ביותר בקבוצתה. .2מערכת ומהלך הניסוי 2.1מבנה המערכת הניסויית .1המערכת האלקטרואופטית: המערכת האלקטרואופטית מתוארת באיור ,2מטרתה להביא את שלושת קרני הלייזר כך שתתמקדנה בסילון הגז .הקרניים בהן נעשה שימוש בתהליך ה SRS-התקבלו מלייזר Nd:YAGמוכפל ששאב לייזר צבע ND6000של חברת .Continuumההרמוניה השנייה של לייזר ה Nd:YAGפוצלה על ידי מפצל קרניים ,Beam Splitterכך ש 20 %של עצמת הקרן שימשו כקרן השואבת בעלת אורך הגל הקבוע ,שאר 80 %שאבו לייזר צבע ,אשר סיפק את קרן הסטוקס ,נעשה שימוש בתמהיל של רודמין ) (Rhodamine 6Gבריכוז התחלתי של 120מ"ג לליטר מתנול. הקרן ששימשה ל R2PI-נוצרה על ידי לייזר צבע FL3002של Lambda-Physikשנשאב ע"י לייזר Nd:YAG נוסף .במקרה זה ההרמוניה השלישית של לייזר ה Nd:YAG-שואבת תמהיל של קומרין )(Coumarine 540A בריכוז של 1000מ"ג לליטר מתנול .ע"י הכפלת תדר של קרן לייזר הצבע מתאפשרת קבלת קרן לייזר באורך גל נסרק ב UV-באזור של .265 nmנתוני המדידה הועברו דרך שני מגברים אל אוסצילוסקופ דיגיטליLeCroy 9374 , .האות הועבר לממצע אנלוגי לדגימה ואח"כ למתאם Analog to Digitalלדגימת המידע והעברתו למחשב .PC קרן ה UV-וקרן השאיבה מועברות בנפרד דרך טלסקופ קפלרי וטלסקופ גליליי )בהתאמה( שמשמש להרחבתן כך שלא יגרמו לרוויה במדידה .עדשות מרכזות מוצבות בכניסה לספקטרומטר מסות זמן תעופה Time Of ) Flight Mass Spectrometer (TOFMSוממקדות את קרני הלייזר בסילון הגז .הכוונת קרני הלייזר נעשית על ידי פריזמות )מסומנות באיור כמשולשים( ומראות דיכרואיות )מסומנות באיור כ ,(DM-החלשת עוצמת קרן הסטוקס וקרן ה UV-בוצעה באמצעות מקטבים )מסומנים כ.(PZ- איור 2המערכת האופטית כוללת שלוש קרני לייזר ,לייזר ה UV-המתכוונן המאפשר את יינון המולקולות ,הקרן השואבת באורך גל קבוע של 532nmוקרן הסטוקס סורקת תחום תדרים .נתוני המדידה מועברים דרך שני מגברים לאוסילוסקופ ,LeCroy 9374לממצע אנלוגי ואחר כך מומר על ידי מתאם Analog to Digitalומועבר לשמירה במחשב .PCקרן ה UV-וקרן השאיבה מורחבות על ידי טלסקופ קפלרי וטלסקופ גליליי )בהתאמה( .הכוונת הקרניים נעשית על ידי פריזמות ומראות דיכרואיות. כדי לבצע את המדידות על שלוש הקרניים להגיע לאותו מיקום בסילון הגז ,כאשר הקרן השואבת וקרן הסטוקס מגיעות בו זמנית וקרן ה UV-מגיעה זמן קצר מאד לאחר מכן .תזמון המכשירים )לייזריםTOFMS , ואוסצילוסקופ( בוצע על ידי פולסים שהתקבלו ממחוללי השהיות .כיוון המערכת האופטית כולל כיוון של קרן הUV- ושל קרני ה SRS-ביחס לספסל האופטי ול .TOFMS-לאחר כיוון זה נקבע לחץ העבודה במערכת כך שספקטרום R2PIלא יהיה ברוויה ויתקבל יחס אות לרעש גבוה .עוצמת הקרן הסטוקס וקרן ה UV-הונחתו באמצעות מקטבים כדי שלא ליצור רוויה ,אשר לא תאפשר להבחין בין עוצמות יחסיות שבין קווי רמאן השונים. .2מערכת TOFMS בניסוי השתמשנו בספקטרומטר מסוג זמן מעוף TOFMSמדגם Wiley-McLarenשנבנה בקבוצתנו ומוצג באיור .3על ידי כיוון המתחים על האופטיקה האלקטרוסטטית שכוללת Deflectors ,Einzel lens :וכן Acceleration platesגרמנו לכך שפרופיל ההגעה של היונים המולקולריים אל גלאי יונים Microsphere Plate ) (MSPייצור ערך מדידה מקסימלי באוסילוסקופ .במהלך המדידות הלחץ האפקטיבי באזור המדידה נקבע סביב ל 6 x 10-6 Torr-לחץ העבודה נבחר כך שמאפייני הספקטרום יראו בצורה החדה ביותר. איור 3סכמה של מערכת TOFMSמסוג Wiley-McLarenבה נעשה שימוש בניסוי .סילון הגז עובר יינון ע"י קרן ה UV-והיונים 4 מואצים על ידי הפרשי מתח בכיוון גלאי ה .MSP-המערכת כולה נשאבת ,כך שסילון הגז יהיה בטמפרטורה רוטציונית נמוכה. עקרון פעולת ה TOFMSהוא כך שהסילון המולקולרי מוזרק לתא היינון במהירות ,קרני הלייזר דוגמות אותו וכאשר לא מתרחש עירור ויברציוני לייזר ה UV-מבצע תהליך R2PIשגורם ליינון המולקולה .המתח על פלטת ההאצה גורם ליונים אלו לנוע בכיוון גלאי ה ,MSP-הקרן היונית "מפוקסת" על ידי ה Deflectors-וה.Einzel lens- מכיו ון שההאצה נוצרת בגלל השדה החשמלי שבספקטרומטר ,האנרגיה הקינטית של היונים המולקולריים תלויה רק במטענם ובשדות החשמליים של האקסטרטור ) (exופלטת ההאצה) . U qd ex Eex qd ac Eac :(acמקינמטיקה 2U 1 פשוטה ניתן לראות שזמן המעוף למרחק קבוע ~ tוהפרופורציה בין המהירות לאנרגיה הינו m V זו נקבל שתלות זמן המעוף במסה הינו V מהצבה m q m ~ 2U ~t 6 מולקולת PEALנמצאת במצב צבירה נוזלי בטמפרטורת החדר ,על ידי חימום לטמפרטורה של 35 oC העלינו את לחץ האדים של הדגימה .גז ארגון בלחץ של כ 4.5) 3400 Torr-אטמוספרות( הוזרם מצינור חיצוני כך שסחף את האדים לתוך ה ,TOFMS-הפרש הלחצים הגדול בין החוץ לפנים מערכת ה TOFMS-והשימוש בברז פולסי עם חריר מאוד קטן ) (0.08 cmגרם להתפשטות ולקירור אדיאבטי של הגז הנדגם. .3מערכת מדידת הנתונים. נתוני המדידה הועברו מה TOFMS-אל אוסילוסקופ דיגיטלי .האוסילוסקופ מבצע מיצוע של 30המדידות האחרונות ואינטגרציה על עוצמת האות הנמדדת בנקודת הזמן שתואמת להגעת היון המולקולרי לגלאי ה .MSP-מידע זה נאסף ונשמר .לאחר מכן מתבצע מיצוע של מספר סריקות ,והחלקה של 50נקודות מדידה במדידות הספקטרא הויברציוניות והחלקה של 20נקודות בספקטרום ה .R2PI-ערכים מספריים אלו מייצגים סכימה של המתח בסקופ בפרק זמן מסוים הנקבע על פי רוחב הgate- בממצע האנלוגי .boxcar-המתח פרופורציוני לכמות היונים המולקולריים שפוגעים ב.MSP- .4תוכנת Gaussian03 תוכנת Gaussian0315משמשת לחישוב האנרגיה של הקונפורמרים היציבים ביותר כמו גם של התדירויות האנהרמוניות ושל פעילות הרמאן של אופני התנודה .יצרנו בתוכנת Avogadroייצוג למבנה המולקולה כפי שזה מוצג במאמר של סימונס, 14 שם בוצעה אופטימיזציה של שדה הכח המולקולרי .תוצאת חישוב זה הועברה לתוכנת Gaussian03ועליו בוצעו חישובי DFTעם הפונקציונל B3LYPובסיס ) 6-311+G(d,pשלבי העיבוד שבוצעו הם כדלהלן: .1אופטימיזציה גיאומטרית בה התוכנה מבצעת אופטימיזציה גיאומטרית ומינימיזציה של האנרגיה עבור מבנים שונים של המולקולה. .2חישוב של תדרי ויברציה בקירוב הרמוני ,פעילות ברמאן וב ,IR-חישוב תיקון אנרגית נקודת אפס Zero Point - ).correction (ZPC .3חישוב אנהרמוני ממנו הוצאו תיקונים נדרשים לקירוב התנודות כאוסצילטור הרמוני שנעשה בחישובי הויברציות מידת הדיוק בתדירות הויברציה בשיטת B3LYPבבסיס בו השתמשנו עם קירוב אנהרמוני הינו כ– 7 cm-1מבחינת מיקום הקווים. 16 נוסף על כך בוצע חישוב Second order Møller–Plesset (MP2)-למציאת אנרגית רמת היסוד הויברונית ותיקון .ZPEבעוד שבמאמרים שנסקרו בעבודה היו התייחסויות לבסיסים ולפונקצונלים איתם עבדו החוקרים ,לא הייתה התייחסות לגודל מטריצת החישוב ,ה ,grid-עימו עבדו .אנו הגדרנו את המאפיינים int=ultrafineוכן ,opt=tight הפקודה ultrafineמגדירה הגדלה של כ 30 %-בכמות נקודות ה grid-בחישוב ,הפקודה tightמגדירה כי הערכים המקסימליים של פרמטרי ההתכנסות קטנים בסדר גודל מאלו של ברירת המחדל .דרישות אלה משמעותיות במיוחד בעת חישוב תדרי ויברציה נמוכים ,כאשר לא נ עשה באפשרויות אלה שימוש חלק מהחישובים האנהרמוניים התכנסו כאשר התדר המחושב הנמוך ביותר התקבל שלילי .מכוון שדרישת ההתכנסות נמוכה יותר וכן המרווח בין צעדי האינטגרציה נעשה עדין יותר נוכל להתקרב יותר לנקודה בה תתקבל אנרגית המינימום של כל קונפורמר בה אנו מעוניינים. 2.2מהלך הניסוי לאחר כיוון הקרניים דרך הרכיבים האופטיים בוצעה מדידת ספקטרום R2PIבשלב זה נעשה שימוש בלייזר ה UV-בלבד למציאת אורכי הגל בהם ניתן להגיע ליינון מוגבר בצבע יחיד .כאשר אורך הגל תאם ליינון R2PIנוצרה עליה בכמות היונים המולקולריים של קונפורמר מסוים שהגיעו אל ה ,MSP -עליות אלו סומנו כמאפיינים הספקטרליים A-Eממספר הגל הנמוך לגבוה. לאחר מציאת אורכי הגל שתואמים לעליה בכמות היונים ,ננעל לייזר ה UV-על אחד המאפיינים הספקטרליים ובוצעה סריקה בלייזר ה SRS-של קרן הסטוקס ,כך שאורך הגל שלה נע בתחום 560 – 564 nmבעוד שהקרן השואבת נותרה באורך גל קבוע של ,532 nmהפרש מספר הגל שבין קרן סטוקס לקרן השואבת נע בתחום של ,940-1060 cm-1בתחום זה צפינו במספר אורכי גל התואמים לעירור רמאן של אופני תנודה שונים. 2.3תוצאות ועיבודן באיור 4מוצגים המבנים של קבוצות הקונפורמרים Gaucheו Anti-לאחר שעברו אופטימיזציה גיאומטרית בתוכנת ,Gaussian03מבנים אלו מייצגים את חמשת הקונפורמרים שחושבו כבעלי אנרגיות הבסיס הנמוכות ביותר ,מתחת לכל מבנה מוצגים הסימון המספרי על פי ניוסר, 10 11 סימון באותיות על פי סימונס האות הראשונה מציינת את זווית ) CCCOאטום הפחמן אליו מחובר ה"זנב" ,שני אטומי הפחמן ב"זנב" ואטום החמצן( והאות השנייה את זווית ) CCOHשני אטומי הפחמן ב"זנב" וקבוצת החמצן והמימן( ,וכן ההפרש באנרגיה ביחס לקונפורמר בעל האנרגיה הנמוכה ביותר כפי שחושבה על ידינו. איור 4הצגה זו מתבססת על תוצאת האופטימיזציה הגיאומטרית .באפור כהה מוצגים אטומי הפחמן ,באפור בהיר אטומי המימן ובאדום אטום החמצן .המולקולה מורכבת מטבעת בנזן וזנב פונקציונלי בו קבוצת ה OHמופיעה בכיוונים שונים במרחב .ישנה חלוקה בין קבוצת ) Gaucheבחלק העליון של האיור( לקבוצת ה Antiבחלק התחתון .המיספור לפי הסימון של ניוסר סימונס 11.מוצגות תוצאות חישובי האנרגיה שביצענו בשיטת .MP2 10 וסימון אותיות לפי איור 5מראה את ספקטרום ה R2PI-של ,PEALומתאים לכמות היונים שנוצרה כפונקציה של אורך הגל של לייזר ה UV -הנסרק .ניתן לראות את המאפיינים הספקטרליים השונים ,קל לראות שהעלייה הגדולה ביותר בכמות היונים שנמדדה הינה במאפיין הספקטרלי .Aהריווח בין המאפיינים השונים מאפשר לנו סלקטיביות בבחירת המאפיין אותו אנו רוצים לבחון. איור 5ספקטרום R2PIשל PEALלאחר מיצוע של חמש מדידות והחלקה על 20נקודות מדידה .המאפיינים הספקטרליים A-E מסומנים בסמוך לעליה בכמות היונים .מאפיינים אלו נוצרים כאשר פוטון ה UVהראשון בעל אורך גל התואם למעבר אל רמה ויברונית מעוררת. באיור 6ואיור 7מוצגות השוואות של קטעי ספקטרא ILSRSמדודים לספקטרא המחושבים בחישובים הקוונטיים ,עבור שני הקונפורמרים בעלי האנרגיה הנמוכה ביותר 2 :ו .5-מהחישוב ההרמוני בתוכנת הGaussian03- קיבלנו את פעילות רמאן ,באמצעות משוואה 6חישבנו את עוצמת רמאן של הויברציות שמתבטאות בתחום אותו סרקנו .מיקום קווים אלו שונה בהתאם לתוצאות החישוב האנהרמוני. איור 6השוואת קטע של ספקטרום ה ILSRS-לספקטרום רמאן מחושב מחישובים קוונטיים עבור המאפיין הספקטרלי ) Aקונפורמר .(2בחלק העליון של הגרף מוצגות התוצאות הניסיוניות ובחלק התחתון דיאגרמת מקלות של הסימולציה בתוכנת .Gaussian03 מוצגות ויברציות יסוד )אדום( ואוברטונים )ירוק(. איור 7השוואת קטע של ספקטרום ה ILSRS-לספקטרום רמאן מחושב מחישובים קוונטיים עבור המאפיין הספקטרלי ) Cקונפורמר . (5בחלק העליון של הגרף מוצגות התוצאות הניסיוניות ובחלק התחתון דיאגרמת מקלות של הסימולציה בתוכנת .Gaussian03 מוצגות ויברציות יסוד )אדום( ואוברטונים )ירוק(. באיור 8מוצגים הספקטרא שנמדדו למאפיינים הספקטרליים .A-Dמאפיינים Bו C-נלקחו מתוצאות מדידה קודמות שנעשו על ידי איתמר מלכא ,מדידת המאפיין הספקטרלי Bהורכבה ממיצוע של חמש מדידות לעומת שתיים או שלוש מדידות למאפיינים האחרים דבר שגורם לתוצאות המדידה של מאפיין זה להיות חלקות יותר .כפי שניתן לראות בספקטרום ) R2PIאיור (6המאפיינים הספקטרליים Dו E-הנם בעלי אכלוס נמוך ביחס למאפיינים A,BוC- דבר שחייב שימוש בהגברה אלקטרונית חזקה יותר וגרם להוספת רעשי רקע למערכת המדידה ,לא נמדדו קווי ראמן למאפיין הספקטרלי Eלכן אינו מוצג .מיקומי הקווים המוצגים הוזזו בכמה מספרי גל כך שתהיה התאמה בהצגת קטעי הספקטרא השונים .מידת ההזזה שנעשה הייתה מסדר הגודל של הדיוק במיקום באורך הגל של הלייזר. איור 8ספקטרא ILSRSשל PEALהמתאימים למאפיינים הספקטרליים E-Aבספקטרום ה .R2PI-מבט על תחום רחב של ויברציות מולקולריות מאפשר לנו לראות את הבדלי המיקום והעוצמה שבין המאפיינים הספקטרליים השונים .השוואה זו תומכת בכך שהמאפיינים Aו B-וכן המאפיינים Cו D-נוצרים מאותם קונפורמרים. .3דיון בתוצאות ומסקנות מתוך ספקטרום ה) R2PI-איור (4ניתן להבחין בברור בהבדל בין המאפיינים הספקטרליים ,A-Dכיוון שניתן להתמקד במאפיין בודד באמצעות לייזר ה UV-ישנה סלקטיביות באמצעותה אנו יכולים לבחון כל קונפורמר בנפרד. באיור 6ובאיור 7ניתן להבחין בהתאמה מסוימת של החישובים הקוונטיים שבוצעו בתוכנת Gaussian03 לספקטרום הנמדד .באיור 8ניתן לראות התאמה טובה בין הספקטרא שנמדדו למאפיינים הספקטרליים Aו B-ובנפרד מהם ,הספקטרא שנמדדו למאפיינים הספקטרליים Cו .D-ההבדלים ברורים במיוחד בקווי רמאן שב 945 cm-1-אשר מופיע רק במאפיינים Aו B-וקו רמאן שב 1000 cm-1-אשר מופיע רק במאפיינים Cו.D- 3.1יצירת הקישור בין המאפיינים הספקטרליים Aו C-לקונפורמרים 2ו.5- מאיור 8ניתן להבחין בברור בקיומם של שני קונפורמרים שונים אשר מתבטאים בשני קטעי ספקטרא ILSRSנפרדים .על פי החישובים הקוונטיים שביצענו בתוכנת Gaussian03מצאנו כי לקונפורמר 2האנרגיה הנמוכה ביותר ולכן נצפה שזה יהיה בעל האכלוס הגדול ביותר – התואם למאפיין .Aניתן להבחין בדמיון רב בין הספקטרא של המאפיינים Aו ,B-דבר המוביל אותנו למסקנה כי שני המאפיינים נוצרים מאותו קונפורמר .תוצאה זו מתאימה לתוצאות שהתקבלו בספקטרוספיה ברזולוציה גבוהה שנעשתה ביינון בשני צבעים. 13,14 על סמך חלוקת הקונפורמרים ל Anti-ול Gauche-וכן בהתאם למיפוי האנרגיות לזוויות סיבוב שונות שנעשה על ידי ניוסר 13נצפה כי במאפיין הספקטרלי Aיתבטאו הקונפורמרים מקבוצת Gaucheבו הקונפורמר שנצפה שיהיה המאוכלס ביותר הינו קונפורמר .2 ניתן להבחין גם שהספקטרא של המאפיינים הספקטרליים Cו D-בעלי מאפיינים דומים ,דבר המוביל אותנו למסקנה כי שני מאפיינים אלה נוצרים על ידי אותו קונפורמר .זיהוי מאפיינים אלו מסתמך על התאמות של קבועי 14,13 הרוטציה ומומנטי המעבר, תחומים אלו נמצאו מתאימים לקונפורמרים מקבוצת Antiבו הקונפורמר שנצפה שיהיה המאוכלס ביותרהינו קונפורמר .5בטבלה 1ניתן להבחין בהבדל משמעותי בין תוצאות רמת האנרגיה המולקולרית שמצאנו ואלו שנמצאו על ידי סימונס ואחרים .לדעתנו הבדלים אלו נוצרים בעיקר מכוון שכאשר ביצענו את החישובים הוגדרו לתוכנת Gaussian03מילות המפתח tightוכן ultrafineאשר מאפשרות לתוכנה לבצע שינויים עדינים יותר מהמוגדר בברירת המחדל של התוכנה בין איטרציה אחת לבאה וכן לדרוש התכנסות של שדה הכוח לערך גבולי נמוך יותר .ניתן להבחין שבהשוואה לאנרגיות המחושבות שנסקרו במחקרים נוספים אנו קיבלנו את האנרגיות הנמוכות ביותר דבר התומך בכך שבגלל ההגדרות המיוחדות התקרבנו יותר למבנה האופטימלי .בראון מציג את אותו סידור אנרגטי בדומה לזה שחישבנו אנו וחישוביו הנם בבסיס הרחב ביותר שבוצעו ,סימונס וניוסר מציגים ערכים אנרגטיים גבוהים יותר והסדר היחסי באנרגיות שונה מאשר אצלנו ,אבל ניוסר מציין כי בחישובים שביצע בבסיס גדול מזה שמוצג במאמרו נתקבל סידור אנרגטי הדומה לשלנו )קונפורמר 5יציב יותר מ (4השוואת האנרגיות המחושבות מוצגות בטבלה .1האנרגיות אותן חישבנו מוצגות לאחר הוספת ה.ZPC- טבלה 1השוואת האנרגיות היחסיות שחשבו במספר בסיסים ופונקציונלים במאמרים של סימונס ,ניוסר ובראון .החישובים שלנו ,של בראון ושל סימונס בוצעו בגירסאות שונות של חבילת ה Gaussianנחישוביו של ניוסר בוצעו בתוכנה שונה 11 1 2 3 4 5 סימונס )MP2/6311(d,p 8.4 0 8.58 7.61 8.4 10 ניוסר MP2/cc-pVDZ 7.808980363 0 8.416802742 7.772015767 9.199279848 12 בראון )6-311++(d,p 7.24 0 9.91 6.91 6.46 תוצאת חישוב שלנו )B3LYP/6311+G(d,p) MP2/6311+G(d,p 4.794160595 5.940715869 0 0 7.333017821 8.748161611 7.25425286 6.409892484 2.208044392 4.792060196 פעולה חישובית נוספת שביצענו לאחר חישוב האופטימיזציה ותדירויות הויברציה הינה חישוב התדירויות האנהרמוניות ,בחלק מהתצורות שאותן חישבנו חישובים אלו התכנסו לתדירויות שליליות ,דבר המצביע על כך שבשלבים מוקדמים דרישת ההתכנסות לא הייתה מספיק קטנה .במידה שאותם חוקרים לא המשיכו לשלב זה בעיה זו לא הייתה מתגלה .במאמרים שנסקרו לא נמצאה התייחסות לביצוע חישובים אלה. 11 המסקנות אליהן הגענו עולות בקנה אחד עם מאמרו המאוחר של סימונס ,14זאת בניגוד למאמר מוקדם שלו שם זוהו קונטורות שונות לכל חמשת המאפיינים בספקטרום ה ,R2PI-דבר שהוביל אותם למסקנה כי נצפו חמישה קונפורמרים שונים ,בכך ניתן לראות את היתרון הגדול שבשיטת ה ILSRS-אשר מאפשרת מבט רוחב על "התמונה הגדולה" ,זאת בעוד ששיטות ספקטרוסקופיות שנסמכות רק על התאמת מקדמי רוטציה ומומנטי דיפול מעבר )בדומה 13 למאמר המוקדם של סימונס( מתמקדות בתחום תדרים צר מאד וניתן להתאימן באופן מטעה .המאמר של מיקאמי מציין כי בעת שימוש בשיטת LIFנצפתה כפילות בין התחומים Aו B-בדומה לתוצאות אותן קיבלנו ,עם זאת ,מיקאמי מתאר מאפיין ספקטרלי נוסף אותו הוא מסמן באות Cשלא נצפה על ידנו או צוין באף אחד מהמאמרים הנוספים שנסקרו בעבודה זו. 3.2הצעות לשיפור וניסויים נוספים בגלל קוצר הזמן בו ביצעתי את מרבית הניסויים המתוארים כאן לא יכולתי לבצע מיצוע על מספר מדידות רב ככל שהייתי רוצה ,באיור 8ניתן לראות את ההבדל שיותר מיצוע של 5מדידות לעומת 2-3מדידות בלבד .התקנת כבלים בעלי רגישות נמוכה לרעשים אלקטרוניים תסייע למניעת רעשי רקע ממכשירים סמוכים במעבדה .התקנה של מגבר איכותי במהלך העבודה יצרה שינוי משמעותי באיכות המדידה. בעבודה זו נסרק תחום קצר של 100 cm-1בלבד ,בעת מדידה של תחומים ארוכים יותר נוצר מצב בו קצב ההתקדמות של הלייזר ומערכת המדידה אינם תואמים ,מעבר לשליטה ממוחשבת על הלייזרים ומערכת המדידה יספק פתרון לכך. הסימולציה הממוחשבת בוצעה בהנחה שהמולקולה עצמה נמצאת לבדה בפאזה גזית ,אולם היא ישנה חשיבות גדולה לביצוע חישובים וניסויים אלו בצבירי מים עם המולקולה שכן בגופים ביולוגיים המולקולות ממוסות בעיקר במים. 17,1,10 ביבליוגרפיה.4 1 J. P. Simons, C. R. Chimie 6, 2003, 17-31. 2 W. Demtroder, Atoms, Molecules and Photons, Springer-Verlag, Germany, 2006. 3 E. Smith and G. Dent, Modern Raman Spectroscopy, John Wiley & Sons, England, 2005. 4 N. Mayorkas, M.Sc. Thesis, Ben Gurion University of the Negev, 2008. 5 G. V Hartland, B. F. Henson, V. A. Venturo, R. A. Hertz, and P. M. Felker, J. Opt. Soc. Am. B 7, 1990, 19501959 6 A. Golan, N. Mayorkas, S. Rosenwaks, I. Bar, J Chem. Phys. 131, 2009, 024305 1-6. 7 S. Rosenwaks, Vibrationally Mediated Photodissociation, RCS, England, 2009, 37-38. 8 J.J. Barrett, D.F. Heller, J. Opt. Soc. Am. 71, 1981, 1299-1308. 9 G.A. West, J.J. Barrett, D.R. Siebert and K.V. Reddy, Rev. Sci. Instrum. 54, 1983, 797-817. 10 R. Karaminkov, S. Chervenkov, and H. J. Neusser, J. Phys. Chem. A 112, 2008, 839-848. 11 J. A. Dickinson, M. R. Hockridge, R. T. Kroemer, E. G. Robertson ,J. P. Simons, J. McCombie, and M. Walker, J. Am. Chem. Soc. 120, 1998, 2622-2632. 12 R. D. Brown and P.D Godfrey, J. Phys. Chem. A 104, 2000, 5742-5746. 13 N. Guchait, T. Ebata, N. Mikami, J. Am. Chem. Soc. 121, 1999, 5705-5711. 14 M. Mons, E. G. Robertson, L. C. Snoek, and J. P. Simons, Chem. Phys. Lett. 310, 1999. 423–432. 15 M. J. Frisch et-al Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2004. 16 P. Carbonniere, T. Lucca, C. Pouchan, N. Rega, and V. Barone, J. Comp. Chem. 26, 2005, 384–388. 17 S. Chervenkov, R. Karaminkov, J. E. Braun, H. J. Neusser, S. S. Panja, and T. Chakraborty, J. Chem. Phys. 124, 2006, 234302 1-11