Saggi per la determinazione della concentrazione delle proteine

Saggi per la determinazione della
concentrazione delle proteine
Nicola Franceschini
Facoltà di Biotecnologie
aa 2009-2010
Determinazione Quantitativa delle Proteine
• Nessun metodo soddisfa pienamente la
necessità di determinare la concentrazione delle
proteine in soluzione di uno specifico campione
• La scelta di un metodo dipende dalla natura
della proteina, la natura degli altri componenti
presenti nel campione, la velocità, l’accuratezza
e la sensibilità del metodo
Metodi più comuni per la
Determinazione delle Proteine
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Analisi gravimetrica
Test Biureto
Saggio Folin-Ciocalteau (Lowry)
Saggio dell’acido Bicinconinico (BCA)
Saggio del Dye-Binding (Bradford)
Assorbimento nell’Ultravioletto
Saggio Kieldhal
Metodo gravimetrico
• Si basa sulla pesata di una determinata
quantità di proteina allo stato liofilizzato in
un opportuno volume di acqua o tampone
• Tra le più precise delle tecniche richiede
grandi quantità di proteina
Test Biureto
Catena peptidica
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Complesso Biureto (color porpora)
Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.
Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.
Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940.
Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269.
Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.
Test Biureto
• Riproducibile
• Poche sostanze interferenti
(ammonio solfato è uno di questi)
• Minori deviazioni che con il Lowry o i metodi
ultravioletti
• Richiede grandi quantità di proteine (1-20mg)
• Bassa sensibilità
Test Biureto
1.
Accendere lo spettrofotometro 15 min. prima delle misure.
2.
Diluire il campione con tampone a una concentrazione di 1-20
mg/ml . Aggiungere 1 ml a ogni provetta. Preparare I campioni in
duplicato.
3.
Preparare una provetta per il bianco con 1 ml di tampone.
4.
Preparare degli standard partendo da una soluzione 10 mg/ml di
albumina sierica bovina. Gli standards devono coprire l’intervallo
da 1 a 10 mg di proteine.
5.
Aggiungere 9 ml di reagente Biureto a ogni provetta, agitare e
lasciare 20 min.
6.
Leggere a 550 nm.
Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)
•Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951.
•Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978.
•Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
•Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).
Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)
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Ampio intervallo di sensibilità
Può essere effettuato a temperatura ambiente
10-20 volte più sensibile che le misure UV
Può essere realizzato su piastre multiwell
• Molte sostanze interferiscono con il saggio
(acidi forti, solfato di ammonio)
• Necessita di molto tempo per la realizzazione
• Il saggio è sensibile alla luce
• L’intensità del cromoforo varia con il tipo di
proteina
Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)
1. Aggiungere in provetta campioni contenenti fino a 100 µg di
proteina.
2. Portare le provette a un volume di 1 mL totale con acqua.
3. Preparare la miscela di saggio e diluire il reagente Folin-Ciocalteu .
4. A ogni provetta aggiungere 5 mL di miscela di saggio e agitare
con vortex.
5. Incubare le provette a temperatura ambiente per 10 min.
6. Aggiungere 0.5 mL di Folin-Ciocalteu, agitare immediatamente.
7. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
8. Agitare le provette, azzerare lo spettrofotometro con il bianco e
misurare l’assorbanza a 500-750 nm.
Saggio acido Bicinconinico (BCA )
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P.K. Smith et al. (1985) Anal. Biochem. 150: 76.
K. J. Wiechelman et al. (1988) Anal. Biochem. 175: 231
Saggio acido Bicinconinico (BCA)
• Molto sensibile e rapido se si usano alte
temperature
• Compatibile con molti detergenti
• Il reagente è stabile
• Piccole variazioni tra proteine diverse
• Ampio e lineare intervallo di lavoro
• La reazione non va a completamento se
condotta a temperatura ambiente
Saggio acido Bicinconinico (BCA)
1. Preparare la quantità necessaria di 1 volume di solfato di rame a 50
volumi di una soluzione di acido bicinconinico.
2. Prepare un set di provette contenenti il campione e albumina sierica
bovina nel range da 0 a 100 microgrammi. Ogni provetta deve
contenere un volume totale di 0.1 mL.
3. Aggiungere 2.0 mL del reagente in ogni provetta e agitare.
4. Incubare le provette a 60oC per 15 min.
5. Raffreddare le provette a temperatura ambiente e misurare
l’assorbanza a 562 nm.
Saggio Dye-Binding (Bradford)
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CBBG risponde soprattutto alle arginine
(otto volte che gli altri residui)
Per proteine ricche di arginina è opportuno usare
Uno specifico standard
CBBG si lega a questi residui nella forma anionica
Assorbimento a 595 nm (blue)
Il colorante libero in soluzione è nella forma
cationica (blu)
Assorbimento massimo a 470 nm (rosso).
Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram
quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.
Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
Saggio Dye-Binding (Bradford)
• Veloce ed economico
• Altamente specifico per le proteine
• Molto sensibile [1-20 µg (micro saggio)
20-200 µg (macro saggio)]
• Compatibile con diverse sostanze
• Il colorante complessato si forma in
circa 15 min ed è stabile per circa 1
ora
• Curva standard non-lineare su un
ampio intervallo di concentrazioni
• Risposta variabile per proteine
diverse, quindi la scelta di uno
standard è molto importante
Saggio proteine BioRad
• Dopo 10 minuti, l’assorbanza può essere letta a 595 nm.
L’assorbanza è stabile per un’ora.
Saggio Dye-Binding (Bradford)
• Gli spettri di assorbimento anionico e cationico del colorante si
sovrappongono.
• Questo determina una curva standard non lineare, in realtà è lineare
su piccoli intervalli di concentrazione.
• Se il campione contiene più di 20 microgrammi, viene fuori una
curva di secondo ordine che fitta meglio che la curva lineare.
Saggio Dye-Binding (Bradford)
1. Accendere lo spettrofotometro 15 min. prima dell’uso
2. Diluire i campioni con tampone a una concentrazione di 1-20
microgrammi/ul
3. Preparare gli standards contenenti 1-20 microgrammi proteina
(albumina o gamma globuline) in un volume di 1000 µl
4. Preparare I campioni sconosciuti da misurare da 1 a 20
microgrammi di proteina per provetta .
5. Aggiungere 200 ul di reagente Bradford e complementare a 1000 ul
con acqua. Mescolare con forza e incubare 10 minuti a
temperatura ambiente .
6. Misurare l’assorbimento a 595.
Assorbimento ultravioletto 280 nm
• Può rappresentare un’ottima tecnica quando non si ha
alcuna idea della concentrazione di un campione che
deve essere assolutamente recuperato.
• Si usa in genere prima di passare a metodi più precisi e
sensibili
• La detrminazione si basa sull’assorbimento specifico
degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano
• La misura è soggetta a interferenza da altri componenti
cellulari e in particolare acidi nucleici
• Il metodo non è molto sensibile e presuppone l’uso di
cuvette di quarzo
• Il vantaggio reale è che il campione non viene distrutto e
la misura è molto rapida.
Ultraviolet Absorbance (pro e contro)
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Vantaggi
Veloce
Recupero campione
Utile per fare screening di concentrazione
• Svantaggio
• Sensibile alla presenza contaminati come Sali e altre
molecole biologiche
• Essendo varia la composizione in aminoacidi elle
proteine è difficile la scelta di uno standard
• L’assorbanza è fortemente influenzata da pH e forza
ionica della soluzione.
Assorbimento Ultravioletto
Procedura
1.
Azzerare lo spettrofotometro con acqua o tampone
2.
Misurare l’assorbimento a 280 nm in cuvette di quarzo
3.
Cambiare lunghezza d’onda a 260 nm, far lo zero con acqua o
tampone
4.
Misurare l’assorbimento a 260 nm in cuvette di quarzo
5.
Usare la seguente equazione per calcolare la concentrazione
proteica
[Proteina] (mg/mL) = 1.55*A280 – 0.76*A260
Metodo Kieldhal
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(1) Digestione
+ H2SO4 concentrato
+ catalizzatore
azoto convertito in ione ammonio.
(2) Neutralizzare con NaOH per ottenere NH3
(3) distillare NH3 e intrappolare in acido borico.
(4) Titolare con acido cloridrico.
Calcolo:
Grammi azoto/ grammo di campione =
*(ml di campione - ml di bianco) × N acido × 0.014g/meq
peso del campione
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* ml di acido cloridrico richiesti per titolare il campione.
Metodo Kjeldhal
• svantaggi: non tutto l’azoto viene dalle proteine.
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Purine
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Pirimidine DNA, RNA, ecc.
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Urea
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Molti tessuti vegetali contengono > 50% N
non proteico
• % N × 6.25 = % Proteina
Note
• Usare vetreria pulita
• Usare cuvette pulite (in questo caso si usano provette in
policarbonato usa e getta)
• I saggi proteici sono influenzati fortemente dalla
composizione del campione (es. Detergenti, Sali ecc.)
• Accertarsi del funzionamento dello spettrofotometro e
accenderlo 20 minuti prima di iniziare le misure
Note
• Le curve standard vanno eseguite con le proteine
adeguate
• I valori calcolati per il campione devono stare sempre
all’interno di quelli ella curva standard
• Controllare la linearita’ della risposta delle proteine
facendo delle curve di diluizione
• Eseguire sempre un bianco con acqua o tampone usato
per la misura
• Mettere la concentrazione proteica sull’asse y per avere
una stima diretta della concentrazione proteica