Dicroismo Circolare e struttura secondaria di proteine

Dicroismo Circolare
e struttura secondaria
di proteine
A.A. 2010/2011
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Dicroismo Circolare
•  Il dicroismo circolare (CD) è un tipo di spettroscopia di
assorbimento che può fornire informazioni sulla struttura
di molte macromolecole e molecole biologiche
•  Si misura la differenza tra l’assorbimento di radiazione
polarizzata circolamente in senso left e right della
soluzione. Il CD è usato per;
•  Determinazione della struttura di proteine.
•  Variazioni strutturali indotte, cioè pH, calore e solvente.
•  Folding/unfolding di proteine.
•  Binding di leganti
•  Aspetti strutturali di acidi nucleici, polisaccaridi, peptidi,
ormoni e altre piccole molecole.
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Luce polarizzata piana
E
M
Direzione di
propagazione
E
Polarizzatore
Direzione di
propagazione
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Luce a polarizzazione piana e circolare
Una sorgente di luce solitamente consiste una serie di emettitori
orientati irregolarmente. La luce emessa è un insieme di onde aventi
tutte le possibili orientazioni del vettore E.
• La luce polarizzata nel piano è ottenuta facendo passare la luce attraverso un
polarizzatore, il quale trasmette una luce con solo un singolo piano di
polarizzazione, cioè passa solo quella componente del vettore E che è
parallela all’asse di polarizzazione.
• Luce polarizzata circolamente: i
vettori E di due onde a pol piana
sono fuori fase e perpendicolari. Il
vettore
risultante
delle
due
componenti ruota così che la sua
estremità
forma
un
percorso
elicoidale (linea tratteggiata).
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Luce Polarizzata Circolarmente
Vettore campo elettrico:
•  Luce polarizzata linearmente: direzione costante - diversa ampiezza
•  Luce polarizzata circolarmente: direzione diversa - ampiezza costante*
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Luce Polarizzata Circolarmente
•  Luce polarizzata circolarmente:
diverse direzioni del campo elettrico - ampiezza
costante*
•  Si presenta in due forme: destrorsa ( R ) e
sinistrorsa (L)
E
Righthanded
E
Lefthanded
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Dicroismo Circolare
•  CD misura la differenza di assorbimento tra luce polarizzata
circolarmente con verso sinistrorso e destrorso.
•  Luce polarizzata:
• 
Questa è misurata come una funzione della lunghezza d’onda: la differenza
è sempre molto piccola (<<1/10000 del totale). Dopo esser passata
attraverso il campione, la luce S e D ha diversa ampiezza e la
combinazione dei due raggi dà la luce polarizzata ellitticamente. Quindi, CD
misura l’ellitticità della luce trasmessa (la luce che non è stata assorbita).
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Dicroismo Circolare e chiralità
Due enantiomeri
assorbiranno in modo
opposto le componenti
poralizzate circolarmente
perché i momenti di dipolo
indotti dalla transizione
saranno spazialmente
orientati specularmente
CD: Lambert-Beer
•  CD misura la differenza tra la luce assorbita polatizzata
circolarmente a sinistra e a destra.
ΔA(λ) = AL(λ) - AR(λ)= [εL (λ) - εR (λ)]bc
o
ΔA(λ) = Δε (λ)bc
• 
Δε è la differenza nel coefficiente di estinzione, tipicamente <
10 M-1cm-1
•  Un valore indicativo di ε è circa 20 000 M-1cm-1
•  Così il segnale CD è una piccolissima differenza tra due
segnali originali grandi.
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[θ]
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Relazione fra ellitticita’ e Δε
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In particolare:
•  Si osserva CD solamente a lunghezze d’onda dove
l’assorbanza delle componenti D e S della luce polarizzata
circolarmente non è nulla, i.e. nelle bande di assorbimento.
•  Il CD nasce a causa delle interazioni tra i differenti dipoli di
transizione che causano l’assorbimento. Poichè questo
dipende dalle orientazioni relative dei diversi gruppi nello
spazio il segnale è molto sensibile alla conformazione.
•  In generale quindi Δε è molto più dipendente dalla
conformazione che ε.
•  Noi ci concentreremo sul “CD elettronico” di peptidi e proteine
sotto 240 nm. Questa regione è dominata dall’assorbimento
del legame peptidico ed è sensibile ai cambiamenti della
struttura secondaria.
•  Possiamo anche fare CD nella regione del vicino UV
(osservando le catene laterali trp), visibile (cofattori ecc.) e
IR.
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Chiralita’ Strutturale
• Gli amminoacidi sono inerentemente asimmetrici e sono sempre
otticamente attivi.
• Ogni attività ottica dai cromofori laterali è indotta (dalla connessione
con un centro chirale) e risulta dall’interazioni con gruppi asimmetrici
vicini.
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Segnali CD per strutture secondarie pure
Mean residue ellipicity in deg cm2 dmol-1
80000
60000
EL – ER > 0
α-helix
β-sheet
random coil
40000
20000
0
EL – ER < 0
-20000
-40000
190
200
210
220
230
240
250
wavelength in nm
•  Queste sono curve standard di Fasman per poly-lysine in
differenti ambienti.
(data from anonymous ftp: jgiqc.llnl.gov)
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Caratteristiche principali degli spettri CD
-ve band (nm)
+ve band (nm)
α-helix
222
208
192
β-sheet
216
195
β-turn (e’ molto
variabile)
220-230 (weak)
180-190 (strong)
205
L.H polypro II helix
190
210-230 weak
Random coil
200
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Ancora sulla Struttura Secondaria
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Sperimentalmente:
doi:10.1093/bioinformatics/btl327
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Applicazioni del CD in biologia strutturale
• Determinazione della struttura secondaria di proteine che non
possono essere cristallizzate
• Studio dell’effetto di farmaci legati sulla struttura secondaria di
proteine.
• Processi dinamici, e.g. folding delle proteine
• Studi gli effetti dell’ “intorno” sulla struttura delle proteine
• Struttura secondaria e super secondaria delle proteine di
membrana
• Studi sui cambiamenti conformazionali indotti dai leganti
• Conformazione dei carboidrati
• Analisi delle interazioni proteina-proteina e proteina-acido
nucleico
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Perchè utilizzare il CD?
• 
Facile e veloce
• 
Preparazione minima del campione
• 
Misure in soluzione
• 
Concentrazioni/quantità di campioni basse
• 
Tempi di risoluzione di microsecondi
• 
Qualsiasi dimensione macromolecolare
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Esempio: denaturazione termica
CD signals for GCN4-p1
O'Shea et al. Science (1989) 243:538
figure 3: 34µM GCN4-p1 in 0.15M NaCl,
10mM phosphate pH 7.0
80
70
60
-1
0 OC
50 OC
75 OC
50
40
2
dmol
30
20
10
0
in θ]
1000
deg cm
[
-10
-20
-30
-40
190
200
210
220
230
240
wavelength in nm
250
260
•  100% α-elica a 0oC
•  Si trasforma in un
“random coil” ad alta T
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Esempi: Proteine Globulari
—— chymotrypsin (~all β)
—— lysozyme (mixed α & β)
—— triosephosphate isomerase
(mostly α some β)
—— myoglobin (all α)
•  Notare il progressivo cambiamento in θ222 dato
dall’aumento del numero di eliche da chimotripsina
a mioglobina
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Esempi: Proteine Globulari
N.B.: Poli-L-Lisina
riferimento per strutture
tutta α-elica o tutta β
-foglietto
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Denaturazione Chimica Cyt-C
a= stato nativo
b= stato A simile al molten-globule
c= stato denaturato
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Concanavalin A: effetto TFE
a = in presenza di TFE
b = Nativa
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Effetto del Solvente
•  Effetto di trifluoroethanol (TFE) •  Ma su un coiled-coil rompe le
su un coiled-coil simile a
eliche dimere portando a
GCN4-p1
eliche singole
•  TFE induce ellitticità in tutti i
peptidi
Effect of 50% TFE on a coiled-coil
0
TM-36 aqueous
TM-36 + TFE
-5
-10
Effect of 50% TFE on a monomeric peptide
-15
0
MRE
peptide in water
peptide in 50% TFE
-5
-20
-25
-10
-30
-15
MRE
TFE
-20
TFE
-35
200
210
220
230
240
wavelength in nm
-25
-30
-35
200
210
220
230
wavelength in nm
240
Lau, Taneja and Hodges (1984)
J.Biol.Chem. 259:13253-13261
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Esempio: Peptide fotoresponsivo
•  iodioacetammide bifunzionale
derivato da azobenzene
•  Il gruppo azobenzene adotta una
conformazione trans al buio ma può
essere forzata ad adottarne una cis
per l’esposizione alla luce visibile di
appropriata lunghezza d’onda:
hv
N
buio
trans
instabile
N
luce
cis
stabile
hv' or
time
N
N
•  Peptide elicoidale in cis (luce) ma
elica designata ad essere instabile al
buio (trans).
2
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Esempio: Peptide fotoresponsivo
— Dark adapted peptide
— After light exposure
Buio
trans
instabile
luce
cis
stabile
(380nm 7mW 5 mins)
•  è possibile stimare l’ellitticità:
elitticità = [θ]222/32000
•  buio11% elica, luce 48%
Kumita, Smart & Woolley
PNAS (2000) 97:3803-3808
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Esempio: DNA
•  CD of E.Coli DNA
Nativo
------ Denaturato
•  Per esempio a 260 nm
Δε = ~3 M-1cm-1
ε = ~6000 M-1cm-1
•  i.e. Segnale CD 0.05%
dell’originale
•  bisogna misurare segnali
~1/100
di questo!
Combinazione Lineare di segnali CD puri
•  Fittare la curva incognita con una combinazione di
curve standard.
•  Nel caso più semplice usare gli standard di Fasman
θtotale = xαθα + xβθβ + xcθc+(xtθt)
80000
-1
60000
2
dmol
•  Variare xα, xβ , xt e xc
per miglior fitting di θtotale a θexp
mentre xα+ xβ + xt + xc = 1.0
•  Fare questo con
minimizzazione ai minimi quadrati
α-helix
β-sheet
random coil
40000
20000
0
-20000
-40000
Mean residue ellipicity in deg cm
190
200
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
210
220
230
wavelength in nm
240
250
Esempio di fitting: Mioglobina
•  In questo caso:
θtotale = xαθα + xβθβ +
xcθc
•  Best Fit con:
xα = 80%, xβ= 0%
xc = 20%
•  la struttura e’:
78% helix, 22% coil
Per ulteriori dettagli:
80000
-1
60000
2
dmol
α-helix
β-sheet
random coil
40000
20000
0
-20000
-40000
Mean residue ellipicity in deg cm
190
200
210
220
230
wavelength in nm
240
250
www-structure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Esempio di fit(2): GCN4-p1
CD signals for GCN4-p1
O'Shea et al. Science (1989) 243:538
figure 3: 34µM GCN4-p1 in 0.15M NaCl,
10mM phosphate pH 7.0
•  A
80
70
60
-1
40
2
dmol
75oC 0% helix
•  Q: A 50oC cosa succede?
0 OC
50 OC
75 OC
50
30
20
10
0
in θ]
1000
[
deg cm
-10
•  θtotale = xoθo + x75θ75
-20
-30
-40
190
200
210
220
230
240
250
260
wavelength in nm
O
fit to GCN4-p1 50 C data
10
original data
best fit with mix of 0OC and 75OC spectra
5
0oC 100% helix
-1
0
2
mol
•  Fitting migliore con
xo = 50%, x75= 50%
-5
-10
-15
MRE in 1000 degs cm
-20
-25
200
210
220
230
wavelength in nm
240
250
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Set di base: molte proteine
•  Ci sono diversi algoritmi.
•  Tutti contano sull’uso di fino a 20 spettri CD di proteine
di struttura nota.
•  Miscelando questi è possibile ottenere uno spettro che
fitta uno incognito
•  Per tutti i dettagli vedi:
Dichroweb: il sistema di analisi CD online
www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/
•  è possibile ottenere un’accuratezza:
0.97 per eliche,
0.75 per foglietti beta,
0.50 per turns, e
0.89 per altri titpi di strutture
(Manavalan & Johnson, 1987, Anal. Biochem. 167, 76-85).
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Limitazioni del CD
• La deconvoluzione semplice di uno spettro CD in 4 o 5
componenti che non variano da una proteina all’altra è una
semplificazione grossolana.
• Gli spettri di riferimento corrispondenti a 100% di eliche, fogliettti,
turn non sono direttamente applicabili a proteine che contengono
piccole sezioni di varia struttura. Il CD di un α-elica è noto
aumentare con l’aumento della lunghezza dell’elica, i CD di βfoglietti sono molto sensibili all’ambiente e alla geometria.
• Curve nel lontano UV (>275nm) possono contenere contributi da
amminoacidi aromatici, in pratica il CD è misurato a lunghezze
d’onda sotto questo.
• Le forme delle curve CD nel lontano UV dipendono sia dalla
struttura terziaria che dalla secondaria.
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Aspetti pratici
•  Il CD si basa sul misurare una differenza veramente piccola
tra due segnali grandi: deve essere fatta attentamente
•  L’ Abs deve essere ragionevole, max tra ~0.5 and ~1.5.
•  Celle di quarzo di lunghezza tra 0.0001 cm e 10 cm. 1cm e
0.1 cm sono comuni
•  Deve essere fatta attenzione con tamponi, TRIS: cattivi UV abs alta
•  Misurare la linea di base della cella con il solvente
•  Così un campione con la stessa cella è introdotto circa allo
stesso modo
•  La torbidità uccide la misura- filtrare le soluzioni
•  Ogni cosa deve essere pulita
•  Per accurata misura della struttura secondaria deve
essere nota la concentrazione
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Tipiche condizioni per il CD
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Concentrazione delle proteine: 0.25 mg/ml
Lunghezza della cella: 1 mm
Volume 400 µl
Necessità di poco campione 0.1 mg
Concentrazioni ragionevoli
Stabilizzatori (ioni metellici, etc.): minima quantità
Concentrazione di campione: 5 mM più bassa
possibile per mantenere la stabilità delle proteine
•  Un metodo di biologia strutturale che può dare
risposte reali in un giorno.
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Un esperimento CD reale
raw CD spectra
12
buffer baseline
7.5uM GramPM in buffer (1)
7.5uM GramPM in buffer(2)
TFE baseline
7.5uM GramPM in TFE(1)
7.5uM GramPM in TFE(2)
7.5uM GramPM in TFE(3)
10
8
6
4
2
cd signal in millidegrees
0
-2
205
210
215
220
225
230
235
240
245
250
wavelength in nm
Average of 5 runs - converted to MRE
-1
8
2
dmol
GramPM in buffer
GramPM in TFE
6
4
2
0
-2
mean residue ellipticity in 10
205
210
215
220
225
230
235
wavelength in nm
240
245
250
•  CD di una sospensione di gramicidina
in acqua
•  Raw spectra - dati ogni 0.2nm da
205nm a 250nm, ciascun punto
misurato 5 volte al 1sec in media.
•  Notare che la linea di base varia da
cella a cella e se lo strumento viene
mosso, cambiata la lampada,
ricalibrato …
•  Notare il rumore – è il motivo per cui
misuriamo gli stessi punti molte volte
•  Spettro finale la media la media di 5
cicli (con circa 3 linee di base).
•  Risultato - sospensione di gramicidina
in tampone ha un insolito spettro CD
•  Ma qual’è la struttura??
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Sommario
•  Il CD è un utile metodo per osservare la struttura
secondaria di peptidi e proteine.
•  è un adattamento della spettroscopia standard di
assorbimento in cui è misurata la differenza in abs
tra la luce polarizzata circolarmente a sinistra e
destra.
•  Il CD può essere utilizzato per misurare
cambiamenti strutturali.
•  Il CD è un complemento di tecniche più dettagliate
come la cristallografia.
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Ulteriori Informazioni in rete
• 
Lawrence Livermore National Laboratory CD tutorial
www-structure.llnl.gov/cd/cdtutorial.htm
• 
Birkbeck College CD Tutorial
www.cryst.bbk.ac.uk/BBS/whatis/cd_website.html
• 
Karolinska Institutet PPS material on CD
broccoli.mfn.ki.se/pps_course_96/ss_960723_21.html
• 
CD links page at Daresbury
www.srs.dl.ac.uk/VUV/CD/links.html
• 
Dichroweb: online CD analysis tool
www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/
Di seguito trovate delle diapositive (opzionali) che spiegano in
dettaglio come viene in realta generato il segnale e misurata la
dicroicita del campione.
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Extra: Come funziona in realtà?
(tratto da http://www.photophysics.com/cdoperation.php)
•  Most modern circular dichroism instruments operate on the same
principles, which is demonstrated in the slide show at the bottom of the
page. There is a source of monochromatic linearly polarised light which
can be turned into either left- or right-circularly polarised light by passing
it through a quarter-wave plate whose unique axis is at 45 degrees to the
linear polarisation plane as described in the section about polarised light.
•  Instead of a static quarter-wave plate, a circular dichroism
spectrophotometer has a specialised optical element called a photoelastic modulator (PEM). This is a piezoelectric element cemented to a
block of fused silica. At rest, when the piezoelectric element is not
oscillating, the silica block is not birefringent; when driven, the
piezoelectric element oscillates at its resonance frequency (typically
around 50 kHz), and induces stress in the silica in such a way that it
becomes birefringent.
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Extra: Come funziona in realtà?
•  The alternating stress turns the fused silica element into a dynamic
quarter-wave plate, retarding first vertical with respect to horizontal
components of the incident linearly polarised light by a quarter-wave and
then vice versa, producing left- and then right- circularly polarised light at
the drive frequency. The amplitude of the oscillation is tuned so that the
retardation is appropriate for the wavelength of light passing through the
silica block.On the other side of the sample position there is a light
detector. When there is no circularly dichroic sample in the light path, the
light hitting the detector is constant. If there is a circularly dichroic sample
in the light path, the recorded light intensity will be different for right- and
left-CPL. Using a lock-in amplifier tuned to the frequency of the PEM, it is
possible to measure the difference in intensity between the two circular
polarisations (vAC). The average total light intensity across many PEM
oscillations (vDC) can be used to scale the size of the lock-in amplifier
signal to take into account variations in total light level. Both signals can
be recorded and from them the circular dichroism signal can be
calculated easily by dividing the vAC component by the vDC signal.
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Extra: Come funziona in realtà?
G is a calibration-scaling factor to provide either
ellipticity or differential absorbance.
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Extra: Come funziona in realtà?
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Extra: Come funziona in realtà?
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Extra: Come funziona in realtà?
Lab. di Proprietà Chimico Fisiche delle Molecole
Extra: Come funziona in realtà?
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Extra: Come funziona in realtà?
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Extra: Come funziona in realtà?
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Extra: Come funziona in realtà?
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Extra: Come funziona in realtà?
A.A. 2009/2010
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Extra: Come funziona in realtà?
A.A. 2009/2010
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