screening neonatale esteso in sardegna: prevenire le

SCREENING NEONATALE ESTESO IN SARDEGNA:
PREVENIRE LE MALATTIE METABOLICHE
Massimo Mura
Laboratorio Malattie Metaboliche
Ospedale Microcitemico- ASL 8 Cagliari
Cosa si intende per screening:
esami medici poco costosi, eseguiti a tappeto su tutta la popolazione in oggetto
che, per definizione, non ha alcun sintomo, né segno clinico di malattia.
Obiettivo dello screening:
Lo scopo dello screening è quello di identificare le malattie presenti in una
comunità in una fase precoce, permettendo così di giungere ad interventi
terapeutici tempestivi in modo di ridurre la mortalità e/o i disturbi legati alla
malattia o gli effetti dannosi dei trattamenti somministrati in una fase di
malattia avanzata.
Un programma di screening perché sia accettabile
deve sottostare ad una serie di criteri di ammissibilità:
Criteri di Wilson e Jungner
1. La malattia costituisce un problema importante di salute pubblica
(prevalenza, gravità, costi)
2. È disponibile un trattamento efficace.
3. Sono disponibili strutture per diagnosi e trattamento.
4. La condizione è riconoscibile in uno stadio pre-sintomatico o
precoce.
5. Esiste un test di appropriato (semplice, riproducibile, affidabile,
non dannoso, di basso costo ).
6. Il test di screening è accettabile per la popolazione.
7. La storia naturale della malattia è conosciuta.
8. Il protocollo di trattamento è chiaro.
9. Il costo dello screening (conferma diagnostica e trattamento) è
bilanciato dai costi complessivi della patologia.
10. Lo screening è un processo sistematico e non una tantum.
Wilson. JMG, Jungner G.
Principles and practice of screening for disease.
Geneva: WHO; 1968
Perchè esteso.....
Perchè esteso.....
SCREENING NEONATALE ALLARGATO CON L’USO DELLA LC-MS/MS
(1990-3)
POMPA
SISTEMA
INIEZIONE
COMPUTER
SORGENTE
IONICA
STAMPANTE
SPETTROMETRO
DI MASSA
LA SPETTROMETRIA DI MASSA TANDEM
CHE COSA E’ ?
È una tecnica di analisi e di rivelazione quali-quantitativa
delle molecole (ioni)
PRINCIPALI CAMPI DI APPLICAZIONE
•BIOCHIMICA CLINICA: determinazione quali-quantitativa
di sostanze endogene ed esogene
•CHIMICA AMBIENTALE/AGROALIMENTARE
•CHIMICA FARMACEUTICA E FARMACOLOGIA
•CHIMICA FORENSE E BIOTECNOLOGIE
SVANTAGGI
VANTAGGI
•Versatilità
•Velocità
•Sensibilità
•selettività
•Non facile utilizzo
•Costi elevati
CHE COSA E’ UNA MALATTIA METABOLICA?
GENE MUTATO
ALTERAZIONE ENZIMATICA
ACCUMULO
CARENZA
METABOLITI ANOMALI
METABOLISMI INTERESSATI
PROTIDICO •Aminoacidopatie, acidurie organiche, difetti del ciclo dell’urea
•Glicogenosi, galattosemia, gluconeogenesi
GLICIDICO
LIPIDICO
•Ipercolesterolemia familiare, beta ossidazione, difetti di carnitina
METALLI
•Wilson, Menkes, emocromatosi
MITOCONDRI •Difetti catena respiratoria
LISOSOMI
•Malattie da accumulo lisosomiali
PURINE&PIRIMIDINE •Lesch-Nyhan
PEROSSISOMI
•Sindrome di Zellweger
FREQUENZA ERRORI CONGENITI DEL METABOLISMO
 aminoacidopatie
1:2800
 acidurie organiche
1:8000
 difetti beta-ossidazione
1:10000
 malattie del metabolismo dei carboidrati
1:8500
 mucopolisaccaridosi e altre malattie da accumulo
1:10000
Malattie metaboliche ereditarie sottoposte a screening
neonatale esteso in Sardegna
Acidemie Organiche (9 malattie)
Propionico acidemia
Metilmalonica acidemia
Isovalerico acidemia
Deficit multiplo della carbossilasi
Deficit di biotinidasi
Deficit di β-chetotiolasi
Glutarico acidemia tipo I
3-idrossi-3-metilglutarico aciduria
Piroglutammico aciduria
Malattie metaboliche ereditarie sottoposte a screening
neonatale esteso in Sardegna
Difetti della β-ossidazione acidi grassi (10 malattie)
Difetto delle acil-deidrogenasi a corta catena
Difetto delle acil-deidrogenasi a media catena
Difetto delle acil-deidrogenasi a catena molto lunga
Difetto multiplo della acil-deidrogenasi (glutarico aciduria II)
Difetto della carnitinapalmitoil transferrasi I
Difetto della carnitinapalmitoil transferrasi II
Difetto della idrossi-aciltranferrasi a catena lunga
Difetto proteina trifunzionale
Difetto della carnitina acilcarnitina translocasi
Difetto uptake della carnitina
Malattie metaboliche ereditarie sottoposte a screening
neonatale esteso in Sardegna
Aminoacidopatie (10 malattie)
Fenilchetonuria e iperfenilaninemie
Leucinosi
Tirosinemia I e II
Iperglicinemia non chetotica
Citrullinemia
Argininosuccinico aciduria
Deficit di ornitinatranscarbamilasi
Argininemia
Omocistinuria
Ipermetioninemie
Lo screening neonatale esteso in Sardegna
Programma regionale
Screening neonatale esteso
Lo screening neonatale esteso in sardegna
ATTUAZIONE DEL PROGRAMMA...
ATTUAZIONE DEL PROGRAMMA...
 Acquisto strumentazione
 Formazione del personale
 Creazione software gestionale
 Organizzazione spedizioni
Accreditamento presso il Centers for Disease Control and Prevention
ATTUAZIONE DEL PROGRAMMA...
Strumentazione acquistata
 2 spettrometri di massa/massa accoppiati ad HPLC
 Evaporatore ad azoto riscaldato
 Cappa chimica
 Solventi e standard chimici (preparati da noi)
 Colonne per HPLC
 Pipette e vetreria varia
ATTUAZIONE DEL PROGRAMMA...
Formazione del personale
• attività di tutoraggio e formazione di due chimici per un periodo di 12 mesi
presso il Laboratorio di Spettrometria di massa, chimica clinica e
farmacologia della Clinica di Neurologia Pediatrica dell'A.O.U. Meyer
• formazione del personale amministrativo
• percorsi di formazione/informazione per il personale sanitario e per i
pediatri di famiglia al fine di rendere uniformi in tutta la regione le procedure
operative e fornire adeguate informazioni per il rilascio del consenso
informato da parte degli esercenti la potestà genitoriale.
ATTUAZIONE DEL PROGRAMMA...
Creazione del sofware gestionale
ATTUAZIONE DEL PROGRAMMA...
SPEDIZIONI
Fondamentali le spedizioni giornaliere!!
Ritiro dai 12 centri
nascita ogni giorno
• Cagliari - 7 centri nascita
• Carbonia - 1 centro nascita
• Iglesias - 1 centro nascita
• Sassari - 3 centri nascita
• Alghero - 1 centro nascita
• Olbia - 1 centro nascita
• La Maddalena - 1 centro nascita
• Tempio Pausania - 1 centro nascita
• Ozieri - 1 centro nascita
• Nuoro - 1 centro nascita
• Lanusei - 1 centro nascita
• Oristano - 1 centro nascita
Arrivo entro le ore 10.00 dal
lunedì al venerdì
ATTUAZIONE DEL PROGRAMMA...
Accreditamento presso la CDC of Atlanta
ORGANIZZAZIONE CENTRO SCREENING NEONATALE
Personale centro screening e laboratorio di spettrometria di massa
1 Medico
2 Chimici
3 Tecnici Sanitari
1 Amministrativo
ORGANIZZAZIONE CENTRO SCREENING NEONATALE
Personale centro screening e laboratorio di spettrometria di massa
1 Medico
2 Chimici
3 Tecnici Sanitari
1 Amministrativo
STRUMENTAZIONE IN DOTAZIONE
SCREENING NEONATALE
2 Spettrometri LC-MS/MS
1 Evaporatore ad azoto riscaldato
CONFERMA DIAGNOSTICA
1 Spettrometro GC-MS
1 Analizzatore di aminoacidi
LA FASE ANALITICA:
DAL PRELIEVO AL RISULTATO
CRITICITA’ DEL PRELIEVO
IL PRELIEVO PER LO SCREENING DEVE PER LEGGE ESSERE
EFFETTUATO TRA LA 48a E LA 72a ORA DI VITA
CRITICITA’ DEL PRELIEVO
DIFFICOLTA’ DEL PRELIEVO
CRITICITA’ DEL PRELIEVO
Il personale tecnico controlla
la congruità dei prelievi e la corretta
compilazione del cartoncino
PROTOCOLLI SPECIALI
Elevata % di positività in neonati di basso peso
SCREENING
14 GIORNI
Neonati dopo exsanguino
o trasfusioni
SCREENING
7 giorni dopo
exsanguino/
trasfusione
Neonati in parenterale totale
o parziale
SCREENING
48h FINE NPT
Neonati basso peso <1800g
Obiettivi del protocollo
- Ridurre % falsi positivi
- Ridurre rischio di falsi negativi
- Ridurre stress alle famiglie
30 GIORNI
METODO:
DBS (Dried blood spot)
Spot di diametro 3.2mm
Allo spot si aggiunge 200µL di MeOH
contenente gli standard e 100µL di
idrazina
Estrazione per 25’ a 37°C, ed evaporazione
sotto flusso di azoto a 45°C
Risospensione in H2O/CH3CN 30/70 + 0.1%HCOOH
Iniezione diretta in LC MS/MS
C16-D3
C2
C2 -D3
C14-D9
C0-D9
C0
C3
C5-D9
C4-D3
C3 -D3
C8-D3
C16
C5
C4
C14
Val
Phe
Xle
Phe-D6
Val-D8
Ala
Tyr
Xle-D3
Met Met-D3
Ala-D4
C0-D9
DeoxyAdo
Ado IS
Gly
C0
Orn
Gly-D2
Ado
Tyr-C6
DeoxyAdo IS
Cit
Cit-D2
Arg-D5
Met
Orn-D2
Met-D3
Arg
ArgSuc
SUAC
SUAC IS
ALGORITMO DI RICHIAMO
TEST DI CONFERMA DIAGNOSTICA
• Test C3 = Acido metilmalonico, acido propionico libero
• Test omocisteina
• Test Acido orotico
• Test Succinilacetone
• Test acido vanilmandelico e idrossi-vanilmandelico
RISULTATI
Inizio progressivo screening esteso: maggio 2012
Da luglio 2012 screening neonatale su tutti i nuovi nati
Analizzati circa 11000 neonati in 1 anno di attività
Recall rate: 0.95 %!!!!
PATOLOGIE IDENTIFICATE
Settembre 2012, aciduria organica - Isovalerico acidemia
Dicembre 2012 difetto Vit B12 Omocistinemia
Febbraio 2013 difetto beta-ossidazione - MCAD
RISULTATI
ISOVALERICO ACIDURIA
RISULTATI
ISOVALERICO ACIDURIA
sano
ALGORITMO DI RICHIAMO
Giorno 0
Nascita
Giorno 2
prelievo
Giorno 3
esecuzione esame – POSITIVO
Giorno 4
ripetizione esame stesso campione -
48+9h
CONFERMA POSITIVITA’
RICHIAMO URGENTE PAZIENTE
Giorno 5
valutazione clinica paziente,
-> BUONE CONDIZIONI CLINICHE
esecuzione esami 2° Livello
CONFERMA DIAGNOSI ISOVALERICO ACIDEMIA
5°-6° Giorno di vita inizio terapia
attualmente ottime condizioni cliniche
NON E’ STATO NECESSARIO RICOVERO OSPEDALIERO ORDINARIO
MA SOLO RICOVERO IN DAY-HOSPITAL
RISULTATI
DIFETTO VIT. B12 & OMOCISTINEMIA
RISULTATI
DIFETTO VITAMINA B12 & OMOCISTEINEMIA
TEST DI CONFERMA
DIAGNOSTICA IN
LC-MS/MS
Vit. B12 figlio
26 pg/ml (200-900pg/ml)
HCY totale
85µm
Vit. B12 madre
21 pg/ml (200-900pg/ml)
ACIDO METILMALONICO
MMA
4.05µm
RISULTATI
DEFICIT DI MCAD
RISULTATI
Deficit di MCAD
•Dopo digiuno prolungato
•Dopo infezione
DIAGNOSI POSTSINTOMATICA
Coma 84%
Patologia neurologica 40%
Mortalità 20%
DIAGNOSI PRESINTOMATICA
(screening neonatale)
Coma 0%
Ritardo mentale 0.02%
Mortalità 0.02%
Mortau 1999-03
•Episodi di ipoglicemia ipochetotica
•Epatomegalia
•Episodi Reye like
OBIETTIVI
OBIETTIVI
SFRUTTAMENTO DEI POTENZIALI USI DELLA SPETTROMETRIA
DI MASSA/MASSA IN AMBITO CLINICO
• MESSA APPUNTO DI ALTRI TEST DI SECONDO LIVELLO
• SCREENING MALATTIE LISOSOMIALI
• SCREENING SCID
• ANALISI TOSSICOLOGICHE
RINGRAZIAMENTI
LABORATORIO DI SPETTROMETRIA DI MASSA
OSPEDALE MEYER-FIRENZE
• Giancarlo la Marca
• Sabrina Malvagia
• Silvia Funghini
• Elisa Giocaliere
• Daniela Ombrone
• Maria Luisa dalla Bona
• Fabio Villanelli
• Alessio De Luca
LABORATORIO DI MALATTIE METABOLICHE
• Franco Lilliu
• Giulio Ferino
• Giuseppina Sanna
• Sara Pillai
• Fabrizio Gaviano
• Simona Cotza