Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van

Identificazione degli Enterococchi e dei
geni di resistenza Van tramite il sistema
Phoenix e PCR
Lavoro di Diploma di:
Astrea Rossetti,
Formazione Tecnico in Analisi Biomediche
Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno
2008
Lavoro svolto presso l’Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona
Responsabili:
Antonella Demarta
AnnaPaola Caminada
Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Indice:
1. Nomenclatura
3
2. Riassunto / Abstract
4
3. Introduzione
5
3.1 Gli enterococchi
5
3.2 Aspetti clinici
5
3.3 Resistenza agli antibiotici
6
3.4 I geni di resistenza van
6
3.5 Obiettivi
7
9
4. Materiali e metodi
4.1 Campioni di Enterococchi
9
4.2 Phoenix
9
4.3 Estrazione
10
4.4 Amplificazione di un frammento del gene 16S rDNA tramite PCR
10
4.5 Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis
11
4.6 Multiplex PCR dei geni van
12
4.7 Controlli
13
4.8 Elettroforesi
13
4.9 Purificazione prodotti Multiplex PCR
13
4.10 Reazione di sequenza
14
4.11 Purificazione prodotti Reazione di sequenza
14
4.12 Sequenziamento
15
4.13 Banca dati
15
4.14 Organizzazione del lavoro
15
16
5. Risultati
5.1 Identificazione degli stipiti
16
5.2 Estrazione
17
5.3 PCR 16S rDNA
17
5.4 Multiplex PCR dei geni van
17
5.5 Sequenze
18
Astrea Rossetti
TAB 3 - SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
6. Discussioni e conclusioni
19
7. Ringraziamenti
21
8. Bibliografia
22
9. Allegati
23
9.1 Soluzioni
23
9.1.1 Campioni e culture
23
9.1.2 Estrazione
23
9.1.3 Elettroforesi
24
9.2 Risultati
Astrea Rossetti
25
TAB 3 - SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
1. Nomenclatura
ICM
Istituto Cantonale di Microbiologia
VRE
Vancomycin-Resistant Enterococcus
MRSA
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
PCR
Polimerase Chain Reaction
DNA
Deoxyribonucleic acid
RNA
Ribonucleic acid
MIC
Minimum Inhibitory concentration
PYR
Pirrolidonylarylamidase
ID
Identificazione
MEGA
Molecular Evolution Genetics Analysis
BLAST
Basic Local Alignement Search Tool
NCBI
National Center for Biotecnology Information
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
2. Riassunto
Abstract
Introduzione:
Gli Enterococchi sono batteri molto diffusi in
natura e presenti in forma commensale negli
essere umani. Da qualche anno a questa parte però
sono riconosciuti sempre più come agenti
patogeni
causanti
importanti
infezioni
nosocomiali. Il problema delle infezioni
nosocomiali è aggravato dal fatto che sempre più
ceppi diventano resistenti agli antibiotici
glicopeptidici (come la vancomicina) e quindi
difficili da curare. Pertanto un obiettivo del mio
lavoro di diploma era quello di stabilire la
ripartizione delle specie di Enterococchi e
l’incidenza dei geni di resistenza, in Ticino.
Inoltre si è voluto valutare la validità della
Multiplex PCR per l’identificazione simultanea
della specie e dei geni di resistenza alla
vancomicina.
Materiale e metodi:
Sono stati analizzati 121 ceppi di Enterococchi, la
routine ha ritenuto 31 ceppi significativi e 90 non
significativi per il caso. Per questi ultimi ceppi
sono stati eseguiti dei Phoenix. Per 118 ceppi si è
continuato con una PCR 16S, una Multiplex PCR
per i geni van ed una Multiplex PCR per i geni ddl
E. faecalis ed E. faecium. Dopo ogni PCR è stata
eseguita un’elettroforesi. Per i risultati dubbi si è
continuato con il sequenziamento del ceppo, poi
immesso in una banca dati e confrontato con le
sequenze conosciute. 3 ceppi si sono rivelati
appartenenti alla famiglia degli Streptococcus,
quindi non sono più stati presi in considerazione.
Risultati:
Entrambe le tecniche d’identificazione (Phoenix,
Multiplex ddl) hanno mostrato che la specie più
frequente è E. faecalis (90.7%), seguita a molta
distanza da E. faecium (6.8%). Dei 118 ceppi
analizzati solo 3 hanno mostrato dei geni di
resistenza, tutti della classe vanC.
Conclusioni:
In Ticino come nel resto del mondo le specie più
isolate sono E. faecalis ed E. faecium. Si è potuto
escludere un incremento di altre specie nei
materiali clinici. Inoltre si è constatato che il
problema dei VRE in Ticino non è
particolarmente diffuso. Con questo lavoro si è
notato che la Multiplex per l’identificazione
simultanea della specie e dei ceppi di resistenza
non è un metodo valido, in quanto non permette di
discriminare bene sia la specie che la resistenza
(se presente), per questo motivo il lavoro è stato
svolto con due Multiplex separate.
Introduction:
Enterococci are widespread bacteria in nature and
present in commensal form in human beings. For
some years now they have been increasingly
recognized as pathogenes causing important
nosocomial infections. The problem of
nosocomial infections is compounded because
more and more strains become resistant to
glycopeptide antibiotics (such as vancomycin) and
hence difficult to treat. Therefore one aim of my
diploma study was to establish the breakdown of
the species of Enterococci and the incidence of the
resistance genes, in Ticino. Furthermore we
wanted to assess the validity of the Multiplex PCR
for the simultaneous identification of the species
and the genes of vancomycin resistance.
Materials and Methods:
121 strains of Enterococci were analysed, the
routine considered 31 significant strains and 90
not significant for the case. For these 90 strains,
Phoenix identification was performed. For 118
strains the work continued with a PCR 16S, a
Multiplex PCR for the genes van and a Multiplex
PCR for the genes ddl E. faecalis and E. faecium.
After every PCR an electrophoresis was
performed. For the doubtful results we continued
with a sequencing of the strains, which were then
placed in a database and compared with known
sequences. 3 strains were revealed belonging to
the family of Streptococcus, hence they were not
longer considerated.
Results:
Both the techniques of identification (Phoenix and
Multiplex ddl) showed that the more frequent
species is E. faecalis (90.7%), followed at a
distance by E. faecium (6.8%). Of 118 strains
analysed, only 3 showed resistance genes, all of
the vanC class.
Conclusion:
In Ticino as in the rest of the world the species
most often isolated are E. faecalis and E. faecium;
we were able to exclude an increase of other
species in the clinical materials. Furthermore we
saw that the problem of VRE in Ticino is not
particularly widespread. With this work, we were
able to show that the Multiplex for the
simultaneous identification of the species and the
resistance is not a valid method, because it does
not allow discrimination of the species and the
resistance (if it is present), for this reason the
work was made with 2 separate Multiplex.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
3. Introduzione
3.1 Gli Enterococchi
Gli Enterococchi sono dei batteri, quindi organismi unicellulari procarioti che si presentano come
cocchi gram positivi, catalasi negativi, disposti singolarmente, a coppia o in corte catene. Sono
asporigeni e appartengono al gruppo D nella classificazione di Lancefield, poiché possiedono
l’antigene D sulla loro membrana [6]. Dopo un’incubazione di 24 ore a 37° C su una piastra agar
sangue, le colonie misurano da 1 a 2 mm di diametro. Generalmente non provocano emolisi su
piastre agar sangue, oppure si presentano con α-emolisi. Solo alcuni ceppi come Enterococcus
faecalis (tranne su piastre agar con sangue di pecora) ed Enterococcus durans sono in grado di fare
β-emolisi [5].
Sono batteri molto diffusi in natura (suolo, vegetali, animali, acque, prodotti alimentari) dove grazie
a loro particolari caratteristiche riescono a sopravvivere anche in condizioni difficili. Negli uomini
possono presentarsi come forme commensali che colonizzano l’apparato intestinale. Questa flora
normale è rappresentata principalmente da Enterococcus faecalis [6].
All’Istituto Cantonale di Microbiologia (ICM) gli Enterococchi sono identificati grazie ad esami
fenotipici come: l’aspetto delle colonie, il test della catalasi negativo, la crescita sul terreno selettivo
“bile esculina” dove idrolizzano l’esculina formando un complesso bruno-nero ed il test rapido
della “pirrolidonylarylamidase” (PYR) sempre positivo per gli Enterococchi. Se i ceppi sono
ritenuti significativi per la diagnosi microbiologica, il laboratorio esegue l’identificazione con il
Phoenix o con l’Api ed un’antibiogramma. Se da quest’ultimo risulta una resistenza alla
vancomicina, vengono ricercati i geni di resistenza vanA, vanB e vanC. Nei campioni in cui la
presenza di Enterococchi è giudicata non significativa per la diagnosi, il referto di laboratorio
segnalerà la loro presenza, ma non verranno eseguite ulteriori indagini.
Le specie più isolate dai campioni biologici sono Enteococcus faecalis ed Enterococcus faecium
(riportati anche in letteratura [1]come i più importanti nelle patologie), ma segnalazioni di altri
laboratori indicano che anche altre specie (E. durans, E. hirae, E. gallinarum, E. casseliflavus) sono
isolate con una frequenza rilevante e in aumento.
3.2 Aspetti clinici
Essendo dei batteri commensali, gli Enterococchi infettano in particolare persone deboli, come gli
anziani o pazienti immunocompromessi che sono stati ricoverati in ospedale per un lungo periodo
sottomettendosi a terapie invasive e quant’altro. Per questo motivo sono considerati dei
microrganismi patogeni opportunisti [5].
Da qualche anno a questa parte, gli Enterococchi sono riconosciuti sempre più come agenti patogeni
causanti infezioni nosocomiali importanti. Infezioni urinarie, setticemie, infezioni di ferita ed
endocarditi sono le malattie più frequenti causate da questi batteri [2,3,5]. Negli Stati Uniti
d’America sono la terza causa di batteriemie nosocomiali. [3]
Il problema delle infezioni nosocomiali causate da Enterococchi è aggravato dal fatto che sempre
più ceppi diventano resistenti agli antibiotici glicopeptidici e quindi difficili da curare. La
vancomicina è un antibiotico appartenente a questa classe, ottenuta da Streptomyces orientalis ed è
utilizzata per combattere infezioni causate da batteri gram positivi, in caso di resistenza o allergia ad
altri antibiotici, è inattiva contro batteri gram negativi e micobatteri [1,2,3,4,8]
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
È usata in ambiente ospedaliero e si somministra tramite infusioni endovenose. La sua azione è
rivolta contro il peptidoglicano, inibendone la sintesi ed impedendo così la normale formazione
della cellula [7].
La resistenza alla vancomicina è spesso associata ad una multiresistenza, che rende inefficace
qualsiasi terapia antibiotica. Per questo motivo è considerata come un’ultima speranza, perché se
questo antibiotico non ha nessun effetto, molto probabilmente anche gli altri sono inefficaci.
Inoltre la resistenza a quest’antibiotico potrebbe avere gravi ripercussioni nel campo della sanità
pubblica perché è noto che i geni di resistenza alla vancomicina possono essere trasferiti anche ad
altri batteri, magari più patogeni, come lo Staphilococcus aureus.
Il trasferimento della resistenza è un problema molto importante perché è noto che già dopo pochi
anni dall’introduzione della penicillina molti ceppi di Staphilococcus aureus diventarono resistenti
a quest’antibiotico. S’iniziò ad usare la meticillina, ma questa specie risultò resistente anche a
quest’antibiotico (MRSA)
Per questo motivo dagli anni ’80 s’iniziò ad utilizzare la vancomicina che risulta ancora oggi, uno
dei pochi farmaci ancora efficaci nella terapia delle infezioni a MRSA. Ecco spiegate le gravi
ripercussioni sanitarie se lo Staphilococcus aureus risultasse resistente anche a quest’antibiotico.
[7,8]
Sebbene il problema dell’antibiotico resistenza sia principalmente ospedaliero, l’origine della
diffusione di questo problema sta nell’uso di antibiotici negli animali d’allevamento, per
promuoverne la crescita. Purtroppo si sono manifestati meccanismi di resistenza, ottenendo così dei
cibi contaminati da batteri resistenti che hanno infettato delle persone. Ne è l’esempio il focolaio
europeo di VRE, causato quasi sicuramente da un aumentato uso di avoparcin (antibiotico
glicopeptidico) in cibi d’origine animale [7].
3.3 Resistenza agli antibiotici
La resistenza agli antibiotici può essere dovuta da una resistenza naturale grazie alla costituzione
stessa del batterio e/o da una resistenza acquisita. Quest’ultima è la conseguenza di modifiche del
genoma batterico, quali:
• Mutazioni:
Le mutazioni spontanee avvengono quando il batterio è sottoposto ad una pressione selettiva
da parte dell’antibiotico. I batteri sensibili muoiono lasciando spazio al battere con la
mutazione e cioè resistente all’antibiotico che può riprodursi facilmente trasmettendo la
resistenza verticalmente ai suoi cloni.
• Scambio di geni di resistenza tra specie o ceppi:
I plasmidi, (DNA extracromosomale circolare), sono il vettore dei geni di resistenza. Non
sono presenti in tutti i batteri perché non sono d’importanza vitale, ma i batteri che li
possiedono possono avere caratteristiche vantaggiose di selettività. Lo scambio
d’informazioni genetiche della resistenza agli antibiotici avviene principalmente grazie a
meccanismi di coniugazione, ossia la trasmissione di DNA tramite processi
d’accoppiamento e quindi grazie al contatto diretto fra due cellule.
La resistenza ad un antibiotico si manifesta grazie a dei meccanismi biochimici come la
modificazione della permeabilità della membrana, l’inattivazione dell’antibiotico grazie ad
enzimi inattivanti come ad esempio le β-lattamasi, o la produzione di un bersaglio alternativo
[3,7,9].
3.4 I geni di resistenza van
La resistenza alla vancomicina si basa sull’ultimo meccanismo citato. Infatti, il suo bersaglio è la
parte terminale del precursore del peptidoglicano (N-acetilmuramico-pentapeptide) D-ALA-DALA. Dimero legato da un enzima (D-ALA-D-ALA ligase) prodotto dal gene ddl.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Le cellule resistenti non hanno il terminale sopra citato, bensì D-ALA-D-LATTATO che riduce di
molto la sensibilità della cellula, agli antibiotici glicopeptidici [7].
Le specie che presentano una resistenza alla vancomicina hanno un complesso (operone) di 5 geni
van:
vanR e vanS sono geni di regolazione, controllano l’espressione degli altri geni van; il gene vanH
codifica per un’enzima che trasforma il piruvato in D-LATTATO; il gene vanA codifica per
un’enzima che lega D-ALA e D-LATTATO invece di D-ALA e D-ALA e il gene vanX codifica per
un’enzima che è in grado di rompere il legame fra D-ALA-D-ALA e non di D-ALA-D-LATTATO.
Esistono altri geni van, come vanY e vanZ in grado di amplificare la resistenza ma non implicati
nell’espressione di essa.
Figura 1: meccanismo di resistenza alla vancomicina
Sono stati decritti sei tipi di resistenze agli antibiotici glicopeptidici:
La resistenza di tipo vanA ha un alto livello di resistenza sia alla vancomicina che alla teicoplanina,
nuovo complesso chimico glicopeptidico simile alla vancomicina, usato in molte nazioni, tranne in
USA. [8]
La resistenza di tipo vanB ha un livello variabile di resistenza alla vancomicina, ma è sensibile alla
teicoplanina.
La resistenza di tipo vanD ha una resistenza moderata sia alla vancomicina che alla teicoplanina.
Le resistenze di tipo vanC, vanE, vanG hanno un basso livello di resistenza alla vancomicina.
Di questi, vanA e vanB sono i tipi maggiormente isolati dai materiali clinici ed in letteratura è
riportato che la stragrande maggioranza dei ceppi VRE appartengono alla specie E. faecium [1,7]
3.4 Obiettivi
La resistenza agli antibiotici è uno dei problemi sanitari di maggiore importanza, sempre più diffuso
a causa di un cattivo ed eccessivo uso di antibiotici che ha causato una selezione di ceppi resistenti.
La PCR è usata per fare diagnosi mediche, per identificare specie e per determinare resistenze agli
antibiotici. Questa tecnica di biologia molecolare ha tre vantaggi molto importanti: il tempo ridotto
nell’avere un risultato, i costi diminuiti ed una maggiore accuratezza rispetto i metodi classici di
identificazione (colture, test biochimici, …).
Il tempo è un aspetto molto importante quando c’è un infezione in corso causata da batteri multiresistenti, perché una rapida identificazione può prevenire il propagarsi della malattia,
somministrando una terapia adeguata, evitando quindi un contagio tra i pazienti ospedalizzati.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Gli obiettivi del mio lavoro di diploma possono essere riassunti in:
ƒ Stabilire la ripartizione delle specie di Enterococchi, nei materiali clinici che l’ICM riceve,
suddividendo gli stipiti tra commensali e potenzialmente patogeni.
ƒ Valutare l’incidenza dei geni di resistenza alla vancomicina nelle differenti specie
analizzate.
ƒ Valutare la validità di un metodo molecolare che permette l’identificazione simultanea della
specie e dei geni di resistenza alla vancomicina tramite PCR.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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4. Materiali e metodi
4.1 Campioni di Enterococchi
I 121 ceppi di Enterococchi usati in questo lavoro sono stati isolati in routine all’ICM nel 2007 da
diversi materiali biologici e provenienti da diversi ospedali ticinesi. Di questi 121 ceppi 31 sono
stati ritenuti significativi, cioè responsabili dell’infezione, e 90 sono non significativi per il caso.
Sono stati poi congelati a -80 °C nel terreno di coltura Skin Milk, Becton Dickinson (allegato
9.1.1). La coltivazione dei ceppi di Enterococchi è stata effettuata su piastre Agar Sangue (prodotte
dall’ICM, allegato 9.1.1) ed incubati a 37 °C per circa 24 ore. Il giorno seguente sono state
ripiastrate da una colonia per avere una crescita pura.
4.2 Phoenix
È un sistema automatizzato (BD, Becton Dickinson) usato in routine per l’identificazione rapida dei
batteri tramite reazioni biochimiche, e per la determinazione della loro sensibilità agli antibiotici,
determinandone la concentrazione minima inibitrice (MIC). In questo lavoro è stato usato il
Phoenix per determinare la specie dei campioni che in routine sono stati identificati solo come
“Enterococchi” in quanto considerati commensali o contaminanti.
Figura 2: Phoenix (BD, Becton Dickinson) [10]
Metodica per l’uso del sistema automatizzato Phoenix:
Inoculare alcune colonie nel brodo ID, fino a raggiungere una torbidità, misurata con un
nefelometro, di 0.5 McF. Mettere una goccia di indicatore (sostanza fluorescente), nel brodo AST e
aggiungere 25 μl della soluzione ID. Versare le due soluzioni nelle apposite sezioni del pannello,
aspettare che scenda tutto il liquido, chiudere e inserirlo nell’apparecchio per la lettura.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
4.3 Estrazione
L’estrazione del DNA è stata eseguita con un’estrazione classica al fenolo/cloroformio. Le
soluzioni utilizzate sono preparate all’ICM (allegato 9.1.2).
Il DNA ottenuto è stato utilizzato nelle varie PCR.
Metodica usata all’ICM:
Prelevare una piccola quantità di batteri (un’ansa da 10 μl riempita bene dai due lati) e risospendere
in 508 μl di TE in un Eppendorf.
Aggiungere 50 μl di Lisozima (10 mg/mL) ed incubare a 37°C per due ore.
Aggiungere 30 μl di SDS 10% e 12 μl di proteinasi K (8,3 mg/mL), miscelare con il vortex ed
incubare a 37°C per 1 ora, la soluzione deve essere limpida.
Aggiungere 100 μl di NaCl 5 M e miscelare, aggiungere 80 μl di CTAB 10% preriscaldato a 65°C
in bagno-Maria, mescolare molto bene ed incubare 10 minuti a 65°C nel termoblock o a bagnoMaria.
Aggiungere 700 μl di cloroformio/alcol isoamilico (24:1), mescolare a mano fino a quando non si
vedono più le due fasi e centrifugare 10 minuti a 13000 rpm.
Trasferire in una nuova Eppendorf 500 μl del sopranatante prestando attenzione a non aspirare lo
strato bianco (proteine), pipettando piano.
Aggiungere 500 μl (stesso volume di sopranatante) di fenolo/cloroformio/alcol isoamilico
(25:24:1), mescolare a mano (come sopra) e centrifugare 10 minuti a 13000 rpm.
Trasferire 200 μl di sopranatante in Eppendorf safe-look, con gli stessi accorgimenti di prima.
Aggiungere 120 μl (corrispondenti a: μl di soluzione presente nell’Eppendorf, moltiplicato per 0.6)
di isopropanolo freddo -20°C, far precipitare il DNA oscillando la provetta e centrifugare 13 minuti
a 4°C a 13000 rpm.
Decantare, facendo attenzione a non perdere il precipitato di DNA.
Lavare il pellet aggiungendo 300 μl di alcool 70% tenuto a -20°C, far precipitare il DNA come
prima fino all’apparizione del precipitato di DNA e centrifugare 5 minuti a 13000 rpm.
Decantare come prima e far asciugare il pellet nello speed vac, o lasciando l’Eppendorf aperta e
capovolta su un portaprovette per circa 1 ora.
Una volta asciutto risospendere il materiale in 80 μl di TE e tenere in frigo.
4.4 Amplificazione di un frammento del gene 16S rDNA tramite PCR
La PCR utilizzata serve ad amplificare una regione del gene 16S, grazie ai primer rrs (16SrRNA)
forward e rrs (16SrRNA) revers (Microsynth, CH), (tabella 1).
Questa PCR è stata utilizzata come controllo, per assicurarsi che la quantità di DNA estratto
permettesse una buona amplificazione, nelle due Multiplex.
Il mix per un campione contiene 50 µl:
• 25 μl Taq PCR Master Mix (QIAGEN, CH)
• 1.5 μl primer rrs (16SrRNA) F (concentrazione iniziale di 10 μM)
• 1.5 μl primer rrs (16SrRNA) R (concentrazione iniziale di 10 μM)
• 20 μl H2O sterile RNase-free
• 2 μl DNA
Le reazioni sono state fatte con un thermal cycler 2720 (Applied Biosystem):
15 minuti a 94°C (prima denaturazione)
30 cicli di amplificazione:
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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• 1 minuto a 94°C (denaturazione)
• 1 minuto a 54°C (ibridazione)
• 1 minuto a 72°C (estensione)
7 minuti a 72°C (estensione finale)
Tabella 1: Primer utilizzati nella PCR 16S rDNA
Primer
rrs (16SrRNA)F
rrs (16SrRNA)R
Sequenza
Taglia prodotti
PCR
Gene
320 pb
16S
5'-GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC C-3'
5'-TCG TTG CGG GAC TTA ACC CAA C-3'
4.5 Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis
Questa Multiplex serve ad amplificare contemporaneamente i geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis.
Primer mix: 10 μl di ogni primer (10 μM), quantità variabile di H2O a dipendenza da quanti primer
si utilizzano. Volume totale 500 μl.
In questa Multiplex si usano 4 primer (tabella 2) quindi:
• 40 μl Primer
• 460 μl H2O
Il mix per un campione contiene 50µl:
• 25 μl 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN, CH)
• 5 μl Primer Mix (concentrazione iniziale di ogni primer 10 μM)
• 18 μl H2O sterile RNase-free
• 2 μl DNA
Le reazioni sono state fatte con il thermal cycler 2720 (Applied Biosystem)
15 minuti a 94°C (prima denaturazione)
30 cicli di amplificazione:
• 1 minuto a 94°C (denaturazione)
• 1 minuto a 54°C (ibridazione)
• 1 minuto a 72°C (estensione)
7 minuti a 72°C (estensione finale)
Tabella 2: Primer utilizzati nella Multiplex PCR per i geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis
Primer
DD13 (+)
Sequenza
5'-ATG GCT ACT TCA ATT TCA CG-3'
FAC1-1 (+)
5'-GAG TAA ATC ACT GAA CGA-3'
Astrea Rossetti
Gene
475 pb
ddl (E. faecalis)
1091pb
ddl (E. faecium)
5'-CAC CTG AAG AAA CAG GC-3'
DD3-2 (-)
FAC2-1 (-)
Taglia prodotti
PCR
5'-CGC TGA TGG TAT CGA TTC AT-3'
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
4.6 Multiplex PCR dei geni van
Questa Multiplex serve ad amplificare contemporaneamente i geni vanA, vanB, vanC1/2, vanD,
vanE, vanG.
Primer mix: 10 μl di ogni primer (10 μM), quantità variabile di H2O a dipendenza di quanti primer
si utilizzano. Volume totale 500 μl
In questa Multiplex si usano 14 primer (tabella 3) quindi:
• 140 μl Primer
• 360 μl H2O
Il mix per un campione contiene 50 µl:
• 25 μl 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN, CH)
• 5 μl Primer Mix (concentrazione iniziale di ogni primer 10 μM)
• 18 μl H2O sterile RNase-free
• 2 μl DNA
Le reazioni sono state fatte con il thermal cycler 2720 (Applied Biosystem)
15 minuti a 94°C (prima denaturazione)
30 cicli di amplificazione
• 1 minuto a 94°C (denaturazione)
• 1 minuto a 54°C (ibridazione)
• 1 minuto a 72°C (estensione)
7 minuti a 72°C (estensione finale)
Tabella 3: Primer utilizzati nella Multiplex PCR van
Primer
EA1 (+)
Sequenza
Taglia prodotti
PCR
Gene
732 pb
VanA
647 pb
VanB
815/827 pb
VanC1/2
732 pb
VanD
5'-GGG AAA ACG ACA ATT GC-3'
EA2 (-)
5'-GTA CAA TGC GGC CGT TA-3'
EB3 (+)
5'-ACG GAA TGG GAA GCC GA-3'
EB4 (-)
5'-TGC ACC CGA TTT CGT TC-3'
EC5 (+)
5'-ATG GAT TGG TAY TKG TAT-3' *
EC8 (-)
5'-TAG CGG GAG TGM CYM GTA A-3' *
ED1 (+)
5'-TGT GGG ATG CGA TAT TCA A-3'
ED2 (-)
5'-TGC AGC CAA GTA TCC GGT AA-3'
* Y = C/T, K = G/T, M = A/C
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TAB 3 – SSMT
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Primer
EE1 (+)
Sequenza
Gene
430 pb
VanE
941 pb
VanG
5'-TGT GGT ATC GGA GCT GCA G-3'
EE2 (-)
5'-ATA GTT TAG CTG GTA AC-3'
EG1 (+)
5'-CGG CAT CCG CTG TTT TTG A-3'
EG2 (-)
Misura prodotti
PCR
5'-GAA CGA TAG ACC AAT GCC TT-3'
4.7 Controlli
Nella Multiplex PCR dei geni van ho utilizzato 7 controlli:
E. faecium VanA (3.40, ICM, Bellinzona)
E. faecium VanB (3.104, ICM, Bellinzona)
E. gallinarum VanC1 (2.130, ICM, Bellinzona)
E. casseliflavus VanC2 (3.80, ICM, Bellinzona)
E. faecalis VanE (BM 4405, Istituto Pasteur, Paris, France)
E. faecium VanD (BM 4339, Istituto Pasteur, Paris, France)
E. faecalis VanG (BM 4518, Istituto Pasteur, Paris, France )
Nella Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis) ho usato 2 controlli:
E. faecalis (1.8, ICM, Bellinzona)
E. faecium (2.52, ICM, Bellinzona)
4.8 Elettroforesi
Tutti i prodotti di amplificazione della PCR 16S rDNA e delle Multiplex PCR sono stati fatti
migrare, in gel d’agarosio (agarose LE, Roche) al 1.5% in tampone TBE. Inoltre sono state eseguite
elettroforesi di controllo dell’estrazione al 0.8% in tampone TBE (allegato 9.1.3).
Per ogni campione della PCR 16S rDNA sono stati caricati 3 µl di Loading Buffer 6x nelle placche
di titolazione, sono stati aggiunti 5 µl di DNA amplificato ed è stato caricato sul gel. Per i campioni
delle Multiplex PCR si è usato 2 µl di DNA amplificato e per il controllo dell’estrazione sono stati
usati 4 µl di DNA estratto.
Il marcatore di taglia è stato caricato con 3 µl di Loading Buffer e 3 µl di Marker XIII 50 pb
(Roche) per la PCR 16S rDNA, rispettivamente 3 µl di Marker XIV 100 pb (Roche) per le
Multiplex.
La migrazione è stata eseguita a 120 Volt/cm2 per circa 1 ora per la PCR 16S e per l’elettroforesi
dei controlli dell’estrazione; circa 1 ora e 30 minuti per la Multiplex PCR dei geni van e per la
Multiplex dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis. Dopo ogni migrazione sono state realizzate le
foto con un transilluminatore UV per evidenziare i frammenti di DNA.
4.9 Purificazione prodotti Multiplex PCR
I ceppi che hanno mostrato bande dubbie sono stati purificati mediante colonnine del kit
NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel, Germania) per togliere primer, dNTP e Taq Polimerasi
liberi ed in eccesso.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Metodica:
Aggiungere all’amplificato il volume mancante per arrivare a 100 µl di buffer NT e poi due volumi
del campione (100 µl per 2 = 200 µl) di buffer NT, depositare il tutto nella colonnina e centrifugare
un minuto a 11000g. Dopo la centrifugazione togliere la soluzione di scarto presente nell’Eppendorf
ed aggiungere 600 µl buffer NT3 facendo di nuovo centrifugare il tutto per un minuto a 11000g.
Togliere lo scarto e centrifugare due minuti a 11000g. A questo punto aggiungere 15-50 µl di
Elution buffer NE, incubare a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare ulteriormente un
minuto a 11000g.
4.10 Reazione di sequenza
Con i ceppi purificati è stata eseguita una reazione di sequenza. Reazione che permette di
polimerizzare un solo braccio del DNA batterico.
Il mix per un campione contiene 15 µl:
• 3 µl Big Dye Terminator v1.1 (Applied Biosystem)
• 1.5 µl Loading Buffer, BigDye Terminator v1.1 sequencing Buffer 5x (Applied
Biosystem)
• 2.4 µl primer (concentrazione iniziale 1 μM)
• 6.1 µl H2O sterile RNase-free
• 2 µl DNA
La quantità di DNA da utilizzare si decide in base alla grandezza del frammento da amplificare ed
in base alla concentrazione di DNA amplificato. Per esperienza è stato usato questo volume in tutte
le reazioni. In alcuni casi però la prima reazione di sequenza non è riuscita, si è quindi quantificato
il DNA ed in base alla concentrazione si è deciso di usare quantità diverse per ogni campione.
Le reazioni sono state fatte con il thermal cycler 2720 (Applied Biosystem)
25 cicli di amplificazione:
• 10 secondi a 96°C (denaturazione)
• 5 secondi a 50°C (ibridazione)
• 4 minuti a 60°C (estensione)
4.11 Purificazione prodotti reazione di sequenza
I ceppi amplificati con la reazione di sequenza sono stati purificati con due metodi, a dipendenza
del tempo a disposizione e dalla quantità di campioni da purificare.
Metodica 1: Kit Sephadex
Pipettare 900 µl di Sephadex in una colonnina vuota (messa in un’Eppendorf) e centrifugare 3
minuti a 770 g. Gettare la soluzione presente nell’Eppendorf e pipettare sulla colonnina 15 µl di
reazione di sequenza. Centrifugare 3 minuti a 770 g, gettare il Sephadex presente nella colonnina e
tenere la soluzione presente nell’Eppendorf. Pipettare 8 µl del campione e metterli nelle provettine
apposite per il sequenziatore, dove in precedenza sono stati pipettati 12 µl di HI-DI Formamide
(Applied Biosystem).
Metodica 2: Purificazione con filtro di nitrocellulosa (0.025 µm, Millipore)
Mettere in una camera di Petri del TE pH 8. Identificare i campioni sul filtro, poi appoggiarlo nel
TE. Pipettare 15 µl del campione ed incubare 2 ore a temperatura ambiente. Aspirare 8 µl del
campione e metterli nelle provettine apposite per il sequenziatore, dove in precedenza sono stati
pipettati 12 µl di HI-DI Formamide (Applied Biosystem).
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
4.12 Sequenziamento
I ceppi della reazione di sequenza purificati sono stati sequenziati con l’apparecchio ABI Prism 310
Genetic Analyzer (Applied Biosystem).
4.13 Banca dati
Le sequenze ottenute sono state corrette manualmente leggendo l’elettroferogramma e analizzate
mediante il programma MEGA 3.0 (Molecular Evolution Genetics Analysis) che permette
l’allineamento del frammento con i primer. Le sequenze corrette sono state poi introdotte nella
banca dati BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) della NCBI (National Center for
Biotecnology Information, USA) per confrontarle con le sequenze conosciute. Questo è servito ad
identificare il frammento.
4.14 Organizzazione del lavoro
Il lavoro è stato svolto in questo ordine:
• Coltivazione dei 121 ceppi
• Estrazione di DNA batterico
• Identificazione con il Phoenix dei 90 ceppi ritenuti non significativi dalla routine
• PCR 16S di 118 ceppi
• Multiplex PCR dei geni van di 118 ceppi
• Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis di 118 ceppi
• Purificazione, reazione di sequenza e sequenziamento dei 6 ceppi dubbi
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TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
5. Risultati
5.1 Identificazione degli stipiti
In totale sono stati analizzati 121 ceppi batterici. Tramite il sistema automatico d’identificazione
Phoenix i ceppi E34, E37 ed E44, le cui crescite su piastra erano già risultate anomale, sono stati
identificati come Streptococcus spp e non sono più stati presi in considerazione nelle analisi
successive.
Dei 118 ceppi rimasti il 93% è stato identificato in ugual modo sia dal Phoenix che dalla Multiplex
PCR per i geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis. Il 7% invece ha mostrato delle incongruenze
(tabella 4):
ƒ 7 ceppi (E22, E23, E175, E192, E218, E219 ed E242) identificati dal Phoenix come E.
casseliflavus/gallinarum, nella Multiplex hanno mostrato una banda a 475 bp, relativa a E.
faecalis.
ƒ Il ceppo E100, identificato dal Phoenix come E. raffinosus, ha mostrato una banda a 1091
bp, relativa a E. faecium.
(figura 3)
Tabella 4: Confronto ID Phoenix e Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis
ID Phoenix
ID Multiplex
100
7
10
1
0
118
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus raffinosus
Negativi
107
8
0
0
3
118
Figura 3: Migrazione elettroforetica
Multiplex PCR geni ddl (E.faecium e
faecalis) gel 1.5%
1) DNA Molecular Weight Marker XIV,
100 bp, Roche
2) K+ E. faecalis (1.8, ICM, Bellinzona)
475 bp
3) Campione E1
4) Campione E3
5) Campione E22
6) K+ E. faecium (2.52, ICM,
Bellinzona) 1091 bp
7) Campione E4
8) Campione E24
9) Campione E100
10) EN 24/07
11) DNA Molecular Weight Marker
XIV, 100 bp, Roche
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TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
I ceppi ritenuti significativi dalla routine sono stati suddivisi in 3 gruppi di specie batteriche, mentre
quelli ritenuti non significativi appartenevano unicamente alle specie E. faecalis ed E. faecium
(tabella 5).
Tabella 5: Suddivisione dei ceppi batterici
Ceppi ritenuti significativi
E. casseliflavus/E.gallinarum
E. faecalis
E. faecium
3
22
6
31
Ceppi ritenuti non significativi
E. faecalis
E. faecium
85
2
87
In conclusione i ceppi analizzati appartenevano alle specie indicate nella tabella 6.
Tabella 6: Identificazione conclusiva
107
8
2
1
3
121
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus casseliflavus
Enterococcus gallinarum
Streptococcus spp
5.2 Estrazione
Sono state eseguite 121 estrazioni, le quali sono state controllate con un gel d’agarosio allo 0.8%.
Tutte le estrazioni eseguite hanno avuto esito positivo.
5.3 PCR 16 S rDNA
Tutti 118 i campioni sono stati amplificati con successo. Controllati con un gel d’agarosio al 1.5%.
5.4 Multiplex PCR dei geni van
I 118 ceppi sono stati amplificati con successo.
Per 115 ceppi non si sono riscontrati geni di resistenza.
Il ceppo EN33/07 ha mostrato un’amplificazione positiva per il gene di resistenza vanC1 e i ceppi
EN24/07 ed EN28/07 per il gene vanC2.
Per i ceppi E24 ed E29, si è presentata una banda ad un’altezza simile al gene di resistenza vanA
(732 bp).
Per i ceppi E95 ed E100, si è presentata una banda ad un’altezza simile al gene di resistenza vanG
(941 bp).
Per i ceppi E158 ed E160 si è presentata una banda ad un’altezza simile al gene di resistenza vanD
(500 bp); (figura 4).
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Figura 4: Migrazione elettroforetica Multiplex PCR dei geni van gel 1.5%. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV,
100 bp, Roche, 2) K+ E. faecium vanA (3.40, ICM, Bellinzona) 732 bp, 3) Campione E24, 4) K+ E. faecium vanB
(3.104, ICM, Bellinzona) 647 bp, 5) K+ E. gallinarum vanC1 (2.130, ICM, Bellinzona) 815 bp, 6) Campione EN 33/07,
7) K+ E. casseliflavus vanC2 (3.80, ICM, Bellinzona) 827 bp, 8) Campione EN 28/07, 9) K+ E. faecalis vanE (BM
4405, Istituto Pasteur, Paris, France) 430 bp, 10) K+ E. faecium vanD (BM 4339, Istituto Pasteur, Paris, France) 500 bp,
11) Campione E158, 12) K+ E. faecalis vanG (BM 4518, Istituto Pasteur, Paris, France ) 941 bp, 13) Campione E100,
14) Campione E1, 15) Campione E4, 16) Molecular Weight Marker XIV, 100 bp, Roche
5.5 Sequenze
I 6 ceppi che hanno dato delle bande dubbie, sono stati sequenziati per identificare il frammento.
Tutte le sequenze sono state inserite nella banca dati, ma non hanno mostrato nessuna
corrispondenza con i geni di resistenza van.
Il sequenziamento dei ceppi E95, E100, E158 ed E160 non ha dato nessun risultato.
In conclusione nella tabella 7 è mostrata la suddivisione dei geni di resistenza trovati nei 118 ceppi
analizzati.
Tabella 7: Frequenza geni di resistenza
Neg
VanA
VanB
VanC1
VanC2
VanD
VanE
VanG
Astrea Rossetti
115
0
0
1
2
0
0
0
118
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
6. Discussioni e conclusioni
I risultati ottenuti mostrano chiaramente che il ceppo isolato con maggior frequenza, da diversi
materiali clinici, è Enterococcus faecalis (90.7%), seguito a molta distanza da Enterococcus
faecium (6.8%), Enterococcus casseliflavus (1.7%) ed Enterococcus gallinarum (0.8%).
Dei 121 ceppi analizzati, 3 non sono più stati considerati dopo identificazione con il Phoenix,
perché appartenenti ad un’altra specie (Streptococcus spp.).
Esaminando i 118 ceppi si nota che il problema degli Enterococchi resistenti alla vancomicina, in
Ticino, non è ancora particolarmente diffuso. Infatti, dei 17/118 ceppi dove il Phoenix ha mostrato
una resistenza alla vancomicina, solo 3 ceppi hanno presentato effettivamente un gene di resistenza,
tutti della classe vanC.
A differenza dell’articolo di F. Depardieu and all [1], in questo lavoro non è stata eseguita una
singola Multiplex PCR per identificare contemporaneamente i geni van ed i geni ddl. Questo perchè
all’inizio del lavoro i gel ottenuti da questa Multiplex mostravano bande troppo vicine (E. faecalis
475 bp, vanD 500 bp, vanE 430 bp) difficili da separare, con il rischio di ottenere risultati falsati.
Si è così deciso di separare l’identificazione del ceppo, dalla determinazione dei geni di resistenza
van, perchè il nostro interesse principale era quello di individuare, se presenti, i geni di resistenza;
visto che l’identificazione si otteneva già con il Phoenix e la Multiplex ci forniva solo l’ID di E.
faecium ed E. faecalis.
A questo punto la Multiplex ddl non sarebbe più stata necessaria, ma è stata eseguita per avere un
confronto con l’ID del Phoenix. Infatti è stato utile, perché si è osservato che 7 ceppi identificati dal
Phoenix come E. casseliflavus/gallinarum, con la Multiplex ddl si sono rivelati E. faecalis; ed un
ceppo identificato come E. raffinosus si è rivelato E. faecium.
Questa contraddizione si spiega col fatto che alcune reazioni biochimiche per l’ID nel sistema
Phoenix, sono simili sia per la specie E. faecalis che E. casseliflavus/gallinarum ed altre sia per E.
faecium che E. raffinosus. Può darsi quindi che alcuni tipi di E. faecalis ed E. faecium hanno
caratteristiche fenotipiche simili ad altre specie o comunque diverse dai ceppi tipici della stessa; ed
il Phoenix ha difficoltà nel riconoscerli. Con la Multiplex queste difficoltà non ci sono perché si
lavora specificatamente sui geni ddl presenti su E. faecalis ed E. faecium è quindi difficile che possa
dare dei risultati falsi. Essendo la Multiplex più specifica, si può dire con certezza che se si ottiene
una banda all’altezza corrispondente ad E. faecalis o E. faecium, si tratta sicuramente di queste 2
specie, perché se fosse un E. casseliflavus/gallinarum, come mostra la figura 3, campione 10, ceppo
EN 24/07, non si otterrebbero bande oppure si conseguirebbero bande aspecifiche ad un’altezza che
non corrisponde ne ad una ne all’altra specie. Lo stesso discorso vale per E. raffinosus (figura 3,
campione 9, ceppo E100).
In routine, la microbiologa, non si basa solo sull’ID del Phoenix, ma guarda anche altri aspetti,
come la morfologia delle colonie, il tipo di materiale, la casistica, l’antibiogramma, … Quando il
sistema Phoenix identifica un E. casseliflavus/gallinarum, esprime automaticamente la resistenza
alla vancomicina sul referto cartaceo, senza dare un valore della MIC perché entrambi presentano
sempre una resistenza a quest’antibiotico. La microbiologa consulta il referto al computer e se
osserva un valore della MIC ≤ 4 µg/ml, quindi sensibile, procede con un altro metodo
d’identificazione, se invece il valore della MIC è veramente intermedia o resistente procede con un
VancoScreen. Probabilmente anche i 7 ceppi identificati erroneamente dal Phoenix come E.
casseliflavus/gallinarum, al computer presentavano una MIC sensibile.
Quindi raramente o mai un risultato viene validato in modo incorretto. Infatti con questo lavoro si è
anche notato che tutti i ceppi ritenuti “non significativi” dalla routine, quindi senza ID specifiche,
non hanno mostrato nessun gene di resistenza, questo consolida quanto affermato sopra, perché
dimostra che non esiste un serbatoio di geni di resistenza alla vancomicina in Enterococchi ritenuti
commensali/contaminanti.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Se avessimo ottenuto geni di resistenza in questi ceppi, il problema in sanità pubblica sarebbe
aumentato, perché se il ceppo non viene identificato come patogeno principale della malattia, non
viene neanche eseguito un antibiogramma e se casualmente viene somministrata della vancomicina,
il batterio resistente si riprodurebbe facilmente e la possibilità di infettare altri organi od individui
aumenterebbe.
Personalmente trovo che la Multiplex PCR ddl per determinare la specie sia un buon metodo perché
molto specifico, però non proporrei necessariamente la sua introduzione in routine, perché
determina solo due specie, ha dei costi elevati ed il Phoenix resta comunque un sistema
d’identificazione valido, tant’è vero che dei 121 ceppi esaminati, solo per 8 ha dato un risultato
falso, di cui solo 3 erano ceppi ritenuti significativi nella patologia, che sono stati poi identificati
con un altro metodo (Api).
A differenza della Multiplex ddl, trovo che la Multiplex van è una tecnica che potrebbe migliorare il
lavoro in routine in routine, perché oltre ad essere un metodo molto valido e specifico, comprende
tutti i geni di resistenza. Questo è molto utile perché è già capitato di ottenere una resistenza alla
vancomicina con il Phoenix, ma che la PCR risultasse negativa. Invece ricercando anche i geni
vanD, vanE, vanG si avrebbe subito una visione completa del ceppo resistente.
Inoltre consiglio l’introduzione della Multiplex rispetto alla PCR utilizzata ora per migliorare
aspetti pratici, temporali ed economici.
A questo punto si potrebbe provare ad inserire tutti i controlli in una sola provetta di reazione. Se il
risultato ottenuto sarà buono come quello con provette separate, l’analisi acquisterebbe ancora più
vantaggi pratici e temporali perché basterebbe preparare una sola volta un mix di controlli ed usarne
la quantità voluta per ogni PCR che si esegue.
Curioso sarebbe testare una Multiplex PCR ddl anche sui 3 ceppi identificati come Streptococcus
spp, per vedere se anche queste identificazioni mostrano delle incongruenze o se effettivamente
appartengono a questa specie, visto che morfologicamente questi ceppi erano stati identificati dalla
routine come Enterococchi.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
7. Ringraziamenti
In primo luogo ringrazio il direttore dell’Istituto Cantonale di Microbilogia, Dr. Orlando Petrini, per
avermi permesso di svolgere il mio lavoro di diploma presso l’Istituto.
Ringrazio la dottoressa Antonella Demarta ed AnnaPaola Caminada per la scelta dell’argomento del
lavoro di diploma, per avermi seguito durante il suo svolgimento, per il loro supporto tecnico ed i
loro consigli.
Ringrazio anche tutto il laboratorio di routine dell’ICM, per la raccolta dei campioni e l’aiuto
pratico.
Inoltre ringrazio il direttore della SSMT Andrea Boffini ed il docente di chimica clinica Giovanni
Togni per gli insegnamenti metodologici ricevuti durante tutto il periodo scolastico.
Ringrazio le docenti Daniela Marcacci e Sonja Marci per il loro sostegno, il docente Francesco
Bezzola per gli insegnamenti informatici e metodologici.
Un grazie anche a Sheila Tomasini per la sua disponibilità, i consigli e l’aiuto nella stesura del
lavoro.
Infine ringrazio Athos e la mia famiglia per il loro supporto morale ed i loro aiuti ricevuti durante
tutto il periodo scolastico.
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
8. Bibliografia
1. Depardieu F., Perichon B. and Courvalin P., Detection of the Van Alphabet and
Identification of Enterococci and Staphylococci at the Species Level by Multiplex PCR, J. Clin.
Microbiol.,Vol. 42 No.12, p. 5857-5860
2. Eigner U., Fahr A., Weizenegger M. and Witte W., Evaluation of a New Molecular System
for Simultaneous Identification of Four Enterococcus Species an Their Glycopeptide Resistance
Genotypes, J. Clin. Microbiol., Vol. 43 No. 6, p. 2920-2922
3. Dutka-Malen S., Evers S. and Courvalin P., Detection of Glycopeptide Resistance Genotypes
and Identification to the Species Level of Clinically Relevant Enterococci by PCR, J. Clin.
Microbiol., Vol. 33 No. 1, p. 24-27
4. Kariyama R., Mitsuhata R., Chow J. W., Clewell D. B. and Kumon H., Simple and Reliable
Multiplex PCR Assay for Surveillance Isolates of Vancomycin-Resistant Enterococci, J. Clin.
Microbiol., Vol 38 No. 8, p. 3092-3095
5. Martins Teixeira L., Da Gloria Siqueira Carvalho M. and Facklam R. R., Enterococcus, in
Manual of Clin. Microbiol. 9th edition, di Murray P. R., Jo Baron E., Jorgensen J. H.,
Landry M. L., Pfaller M. A., Vol. 1 No. 30, p. 430-439
6. Pelli C., corso di Microbiologia SSMT , Dispense 2005-2006, p. 6-11
7. Rice L. B. and Bonomo R.A., Mechanisms of Resistance to Antibacterial Agents, in Manual of
Clin. Microbiol. 9th edition, di Murray P. R., Jo Baron E., Jorgensen J. H., Landry M. L.,
Pfaller M. A., Vol. 1 No 71, p.1114-1145
8. Yao J. D. C. and Moellering R. C., Antibacterial Agents, in Manual of Clin. Microbiol. 9th
edition, di Murray P. R., Jo Baron E., Jorgensen J. H., Landry M. L., Pfaller M. A., Vol. 1,
No 70, p. 1077-1113
9. EARSS Annual Report 2006:
http://www.rivm.nl/earss/Images/EARSS%202006%20Def_tcm61-44176.pdf
10. http://www.bd.com/ds/productCenter/spotlights/SP6.asp
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
9. Allegati
9.1 Soluzioni
9.1.1 Campioni e colture:
•
•
Skim Milk:
Skim Milk, BBL
10 g
70 ml
H2Odem
Sterilizzare 15 min a 120°C lasciar raffreddare ed aggiungere
Calf serum, Sigma
10 ml
Glicerolo, Fluka
20 ml
Mescolare bene e conservare in frigo
Agar Sangue:
Columbia Agar Base, Oxoid
312 g
H2Odem
7600 ml
Sterilizzare 15 min a 120 °C raffreddare ed aggiungere
Sangue montone, Mischler
400 ml
Versare 20-25 ml nelle Petri con diametro di 90mm, conservare in frigo
9.1.2 Estrazione:
•
•
•
•
•
•
Lisozima 10mg/ml:
Lisozima (Roche)
10 mg
H2Odem
1 ml
Fare fresco ogni volta
Tampone Te pH 8 (Tris-HCl 10 mM – EDTA 1mM):
Tris base (Fluka)
1.211 g
0.372 g
Na2EDTA.2H2O (Fluka)
Aggiustare il pH a 8
H2Odem, aggiustare il volume a
1l
Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservare a TA (temperatura ambiente)
SDS 10%:
SDS (Fluka, Sigma)
10 g
H2O
90 ml
Scaldare a 68 °C per far sciogliere
Aggiustare a pH 7.2 con HCl concentrato
Portare a volume
100 ml
Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservare a TA
Proteinasi K (8,3 mg/mL):
Proteinasi K (Sigma)
25 mg
H2O sterile
3 ml
Aliquotare 200 µl e conservare a -20 °C
NaCl 5M:
NaCl (Fluka)
29.22 g
H2O
80 ml
Portare a volume
100 ml
Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservare a TA
CTAB 10%:
CTAB (Merck)
10 g
NaCl 0.7 M (4.09 g in 100 ml H2O)
100 ml
Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservara a TA
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
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Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
•
•
•
•
Cloroformio/alcool isoamilico (24:1):
Cloroformio (Merck)
Alcool isoamilico (Fluka)
Conservare a TA
Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico (25:24:1):
Fenolo saturato in una soluzione TRIS pH 7.9
Cloroformio (Merck)
Alcool isoamilico (Fluka)
Conservare in frigo
Isopropanolo freddo (Fluka) conservare a –20 °C
Alcool 70%:
Etanolo assoluto (Fluka-Merck)
H2Odem
Conservare a -20 °C
96 ml
4 ml
50 ml
48 ml
2 ml
70 ml
30 ml
9.1.3 Elettroforesi:
•
Tampone TBE 10x:
Tris base (Fluka)
Boric acid (Fluka)
EDTA 0.5 M, pH 8
Portare a volume
• EDTA 0.5 M, pH 8:
Na2EDTA.2H2O (Fluka)
H2Odem
Aggiustare il pH a 8
Portare a volume
• Tampone TBE 1x:
Tampone TBE 10x
H2Odem
• Gel d’agarosio 1.5% (200 ml):
Agarose LE (Roche)
Tampone TBE 1x
Sciogliere con microonde
Aggiungere Bromuro d’etidio (1 µl/100 ml)
• Bromuro d’etidio (10 mg/ml):
Bromuro d’etidio
H2O
Far sciogliere sull’agitatore a lungo
Tenere al buio
• Loading Buffer 6x:
Blu di bromotimolo (Merck)
Xylene Cyanol
Glycerol in H2O
• PM 50 bp:
Proporzione 2+2
Marker 50 bp(Roche)
H2Odem
• PM 100 bp:
Proporzione 2+3
Marker 100 bp (Roche)
H2Odem
Astrea Rossetti
TAB 3 – SSMT
108 g
55 g
40 ml
1l
18.61 g
~ 40 ml
100 ml
100 ml
900 ml
3g
200 ml
0.2 g
200 ml
0.25%
0.25%
30%
2 µl
2 µl
2 µl
3 µl
24/28
Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
9.2 Risultati
Nr.
Ceppi
E 175
E 192
E 218
E 219
E 22
E 23
E 242
EN 24/07
EN 28/07
EN 33/07
E1
E 10
E 11
E 12
E 126
E 13
E 138
E 139
E 143
E 144
E 145
E 146
E 147
E 148
E 149
E 15
E 150
E 151
E 156
E 157
E 158
Nr.
Routine
U 48472
U 49335
R 50762
U 51065
VA 41824
VA 41826
VA 52654
EMO 26758
EMO 31673
VA 37995
G 40539
VA 41477
G 41405
G 41515
G 46590
G 41519
VA 46971
VA 46971
VA 47840
VA 47705
VA 47897
VA 46480
VA 47526
VA 47339
U 47964
G 41673
U 47976
G 48104
U 48110
U 48116
U 48135
Astrea Rossetti
Provenienza
OSG
OSG
OCL
OCL
FAI
FAI
OSG
ODL
OCL
OCL
OSG
HILDEBRAND
OCL
Medico privato
ODL
Medico privato
OSG
OSG
ODL
ITA
OCL
ITA
ITA
ITA
OCL
OCL
ODL
OCL
OCL
OCL
ODL
Materiale
uricult
uricult
lavaggio bronchiale
uricult (catetere a dimora)
st. ulcera sacrale
st. ulcera caviglia
st. ferita superiore
emocolture
emocolture
catetere
st. vaginale
st. ferita
st. vaginale
st. cervicale
sperma
st. vaginale
puntato periepatico
puntato periepatico
sperma
st. ferita
st. ferita
st. ferita
st. ferita profonda
st. ferita profonda
uricult (catetere)
st. vaginale
uricult
sperma
urina
uricult
uricult
TAB 3 – SSMT
ID
Routine
Enterococchi
E. faecalis
E. faecalis
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
E. faecalis
E. casseliflavus
E. casseliflavus
E. gallinarum
E. faecalis
Enterococchi
Flora normale
Flora normale
Enterococchi
Flora normale
E. faecalis
E. faecalis
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
E. faecalis
E. faecalis
Enterococchi
Enterococchi
Flora normale
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
vancoscreen
routine
Van C2
Van C
Van C1
ID
Phoenix
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus casseliflavus/gallinarum
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Antibiogram
ma
Phoenix
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
MULTIPL
EX
PCR geni
Van
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
VanC2
VanC2
VanC1
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
Multiplex
PCR
faecium/
faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
Neg
Neg
Neg
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
25/28
Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Nr.
Ceppi
E 159
E 16
E 160
E 164
E 166
E 167
E 168
E 169
E 17
E 170
E 174
E 176
E 177
E 178
E 179
E 18
E 180
E 181
E 182
E 183
E 184
E 185
E 189
E 19
E 190
E 193
E 195
E 196
E2
E 20
E 202
E 208
E 21
Nr.
Routine
VA 48152
VA 41513
VA 48358
VA 48408
G 48403
G 48508
G 48568
G 48733
VA 41554
G 48741
U 49000
U 49130
G 48974
G 48989
G 48997
VA 41610
U 49136
U 49147
U 49158
U 49179
U 49184
U 49197
U 49194
VA 41617
U 49260
U 49571
VA 49451
VA 49623
G 40556
G 41704
VA 50119
G 50373
G 41769
Astrea Rossetti
Provenienza
OBV
OCL
ODL
OSG
Medico privato
ODL
Medico privato
OSG
Medico privato
OCL
OBV
OCL
OBV
OCL
ODL
OBV
OCL
HILDEBRAND
OCL
ODL
ODL
OSG
OSG
OBV
OSG
OCL
ACQ
ITA
OCL
OSG
OSG
ODL
HILDEBRAND
Materiale
st. ulcera
biopsia ossea
uricult
st. ascesso dorsale
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. ulcera
st. vaginale
uricult
uricult
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
biopsia
uricult
uricult (catetere a dimora)
uricult
uricult
uricult
uricult
uricult
st. ferita
uricult
uricult
st. ferita
puntato ascesso epatico
sperma
st. vaginale
puntato addominale
sperma
st. vaginale
TAB 3 – SSMT
ID
Routine
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
E. faecalis
Flora normale
Enterococchi
E. faecalis
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
E. faecalis
Enterococchi
E. faecalis
Enterococchi
Flora normale
Enterococchi
Enterococchi
Flora normale
vancoscreen
routine
ID
Phoenix
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Van neg Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Antibiogram
ma
Phoenix
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
MULTIPL
EX
PCR geni
Van
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
Multiplex
PCR
faecium/
faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
26/28
Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Nr.
Ceppi
E 212
E 213
E 216
E 217
E 220
E 234
E 236
E 238
E 243
E 25
E 26
E 27
E 28
E 286
E3
E 30
E 31
E 32
E 33
E 35
E 36
E 38
E 41
E 42
E 43
E 45
E5
E 51
E 52
E 53
E 54
E 55
E6
Nr.
Routine
VA 50713
VA 50714
G 50441
G 50709
U 51093
VA 51581
VA 51761
VA 52266
VA 52655
VA 41900
U 41811
U 42060
G 41960
U 982
VA 40435
G 42145
G 42150
G 42156
G 42159
G 42237
G 42243
G 42255
G 42385
G 42557
G 42558
G 42550
Va 41058
U 43297
U 43023
U 43098
U 43180
U 43095
U 41002
Astrea Rossetti
Provenienza
OSG
OSG
Medico privato
ODL
ODL
OCL
OSG
OCL
OSG
OCL
FAI
OCL
OCL
ODL
ODL
OSG
OSG
OSG
OCL
OCL
OCL
OCL
OSG
Medico privato
OSG
Medico privato
ITA
ODL
Medico privato
ODL
OSG
ODL
OCL
Materiale
puntato drenaggio AXION (sup)
puntato drenaggio AXION (sup)
st. vaginale
sperma
uricult
st. ferita ulcera (arto inf dx)
puntato addominale
st. ferita profonda
st. ferita superiore
st. ferita profonda
uricult
uricult (catetere monouso)
st. vaginale
uricult (da sacchettino)
biopsia ossea
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
st. cervicale
st. vaginale
st. vaginale
st. ferita profonda
uricult
uricult
uricult
uricult
uricult
uricult (catetere monouso)
TAB 3 – SSMT
ID
Routine
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
E. faecalis
E. faecalis
Enterococchi
Enterococchi
Enterococchi
Flora normale
E. faecalis
E. faecalis
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Flora normale
Enterococchi
E. faecalis
E. faecalis
Enterococchi
Enterococchi
Flora normale
Enterococchi
vancoscreen
routine
ID
Phoenix
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Van neg Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Van neg Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Antibiogram
ma
Phoenix
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
I
S
S
S
S
MULTIPL
EX
PCR geni
Van
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
Multiplex
PCR
faecium/
faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
27/28
Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR
Nr.
Ceppi
E 61
E 62
E 64
E 65
E 67
E7
E 77
E8
E9
E 94
E 96
E 97
EN 34/07
E 162
E 197
E 24
E 29
E4
E 66
E 95
E 100
E 37
E 44
E 34
Nr.
Routine
U 43462
U 43469
G 43476
G 43485
VA 43448-2
G 41148
G 43621
G 41194
G 41354
VA 45013-1
U 45114
U 45128
VA 40435
VA 48289
VA 49624
VA 41740
VA 41648
Va 40996
VA 43448-1
VA 45013-2
VA 45558
G 42247
G 42604
G 42234
Astrea Rossetti
Provenienza
OBV
OCL
ODL
ODL
OBV
OSG
ODL
OBV
OSG
OBV
OSG
OCL
ODL
OBV
ITA
OSG
OCL
OSG
OBV
OBV
OBV
OCL
OCL
ODL
Materiale
uricult
uricult
sperma
sperma
biopsia
st. vaginale
sperma
st. vaginale
st. vaginale
puntato pleurico
uricult
uricult
biopsia ossea
st. ferita profonda
puntato ascesso epatico
puntato ascesso duglas
st. ferita
st. bile
biopsia
puntato pleurico
puntato ascesso pelvico
st. vaginale
st. vaginale
st. vaginale
TAB 3 – SSMT
ID
Routine
Enterococchi
E. faecalis
Flora normale
Enterococchi
E. faecalis
Flora normale
Enterococchi
Flora normale
Flora normale
E. faecalis
Enterococchi
Enterococchi
E. faecalis
E. faecium
E. faecium
Enterococchi
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
Enterococchi
Flora normale
Flora normale
Flora normale
vancoscreen
routine
ID
Phoenix
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis
Van neg Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Van neg Enterococcus faecium
Enterococcus raffinosus
Streptococcus agalactiae (gruppo B)
Streptococcus bovis II (gruppo D)
Streptococcus mitis
Antibiogram
ma
Phoenix
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
S
S
S
R
non determ
non determ
non determ
non determ
MULTIPL
EX
PCR geni
Van
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
neg
ann
ann
ann
Multiplex
PCR
faecium/
faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecalis
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
E. faecium
ann
ann
ann
28/28