STUDIO DELL` ATTIVITA` ANTIOSSIDANTE IN MOLECOLE

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI
TRIESTE
FACOLTÀ DI FARMACIA
Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia
Farmaceutiche
TESI DI LAUREA SPERIMENTALE
IN
LEGISLAZIONE FARMACEUTICA
STUDIO DELL’ ATTIVITA’ ANTIOSSIDANTE
IN MOLECOLE BIOATTIVE SOTTOPOSTE
A DIFFERENTI TRATTAMENTI CHIMICO-FISICI
Laureanda :
Elena SPESSOT
Relatrice:
Dott.ssa Antonella CALABRETTI
Correlatore:
Prof. Dario VOINOVICH
Anno Accademico: 2010-2011
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l’attività antiossidante
di molecole bioattive, derivanti da matrici alimentari naturali. La scelta di
queste matrici vegetali è stata determinata dall’ampio consumo di
alimenti di questo tipo, nella Dieta Mediterranea. Quest’ultima un
modello educativo alimentare per eccellenza, in quanto ha come
obbiettivo la prevenzione di patologie croniche- degenerative (ictus,
malattie cardiovascolari, ipercolestorelemie, obesità, diabete e tumori)
attraverso una corretta e bilanciata alimentazione. Tant’è vero che
l’Unesco, nel 2010, ha consacrato patrimonio culturale dell’umanità il
regime alimentare mediterraneo per i suoi sicuri benefici. Numerosi studi
hanno dimostrato effetti protettivi nei confronti del tumore al seno. Infatti
se tutte le donne adottassero una dieta più vicina a quella mediterranea, la
possibilità di insorgenza del cancro al seno si ridurrebbe del 10% .La
dieta mediterranea si basa sul consumo giornaliero di verdure, frutta e
cereali, ossia prodotti ad elevata qualità sia dal punto di vista
organolettico sia nutrizionale. In Italia, per sviluppare una “coscienza
alimentare” sana, corretta e bilanciata al consumatore, si è deciso di
promuovere ma anche facilitare lo schema alimentare mediterraneo
grazie al principio dei 5 colori del benessere sostenuto da UNAPROA
(Unione Nazionale tra le Organizzazioni di Produttori Ortofrutticoli
Agrumari e di Frutta in Guscio). Il progetto consiste nel consumare
giornalmente cinque porzioni di frutta e verdura di diverso colore: rosso,
giallo-arancio, blu-viola e bianco; ad ogni gruppo di colore è
caratterizzato dalla presenza di specifiche molecole bioattive.
Rosso
Molecole bioattive
Anguria,
Arancia
rossa,
Barbabietola rossa, Ciliegia,
Fragola,
Funzione
Pomodoro,
Antiossidante,
antiproliferativa,
Carotenoidi,
antitumorale,
Ravanello, Rapa rossa
antinfiammatoria
Giallo- arancio
Albicocca, Arancia, Carota,
Clementina, Kaki, Limone,
Mandarino,
Nespola,
Antiossidante,
Melone,
Carotenoidi,
Nettarina,
Acidi fenolici
Peperone,
flavonoidi.
antiproliferativa,
antitumorale,
Pesca,
antinfiammatoria
Pompelmo, Zucca
Verde
Agretti, Asparagi, Basilico,
Bieta, Broccoletti, Broccoli,
Carciofo,
Cavolo
broccolo,
Cavolo cappuccio, Cetriolo,
Lignani,
Cicoria,
querecetina
Cime
Indivia,
di
Kiwi,
rapa,
polifenoli,
antinfiammatoria,
antiossidante, antitumorale
Lattuga,
Prezzemolo
Estrogenica,
Rughetta,
Spinaci Uva, Zucchina
Blu- viola
Fichi,
Frutti
di
Melanzane,
bosco,
Prugne,
Radicchio, Uva nera
Antocianine
Procianidine
e
Antiossidante, antitumorale,
cardioprotettiva
Bianco
Antiossidante,
antiproliferativa,
Aglio,
Cavolfiore,
Finocchio,
Funghi,
Cipolla,
Mela,
antipertensiva,antitumorale,
Flavonoidi
Pera, Porri, Sedano
antitrombotica, arresto ciclo
cellulare,
ossidazione
inibizione
LDL,
miglioramento vascolare.
Per mantenere le specifiche proprietà e per non andare incontro ad
alterazioni chimiche, fisiche o biologiche gli alimenti devono essere
conservati e cotti attraverso tecniche tradizionali.
Negli ultimi anni la cottura di alimenti mediante il microonde è ormai
diffusa sia livello industriale che domestico, soprattutto per i prodotti ad
elevato contenuto di umidità per le proprietà dielettriche dell’acqua che
assorbe velocemente l’energia a microonde. Alcuni vantaggi da
considerare in questa tecnica sono:il minor tempo di starting ovvero
dell’inizio del trattamento, riscaldamento più veloce, ottimizzazione del
solvente, cioè riduzione del consumo durante i processi industriali e gli
alimenti conservano le loro qualità nutrizionali. Gli effetti negativi
sull’utilizzo dei forni a microonde possono essere l’eventuale perdita di
colore e sapore e nelle matrici alimentari di grande pezzatura, e il
riscaldamento potrebbe essere non omogeneo.
ANTIOSSIDANTI
Antiossidanti esogeni
•
Vitamina E
 Vitamina C
 Vitamina A
• Non vitaminici
 Carotenoidi (beta-carotene,
licopene, luteina)
 Polifenoli (resveratrolo,
idrossitirosolo, acidi fenolici,
stilbeni, lignani, flavonoidi ).
 Catechine.
• Origine minerale
 Zinco
 Rame
 Selenio.

Antiossidanti endogeni
Vitaminici
•
Vitaminici

Acido lipoico : induce l’attività di
alcuni antiossidanti enzimatici.
•
Enzimatici

Superossidodismutasi -SOD

Catalasi – CAT

Glutatione perossidasi.
Perché sono importati gli antiossidanti?
Perché hanno un potenziale effetto protettivo
nei confronti dello stress ossidativo indotto dai
radicali liberi
È ormai noto che alla base delle patologie cronico degenerative,
l’invecchiamento cellulare la causa principale è dato dallo stress
ossidativo e le difese degli antiossidanti .Gli antiossidanti sono molecole
che si suddividono in due gruppi endogeni ed esogeni presenti negli
alimenti soprattutto della dieta mediterranea. Essi hanno un potenziale
effetto protettivo nei confronti dello stress ossidativo, inibendo cosi i
radicali liberi. Viste le proprietà fondamentali degli antiossidanti
l’obbiettivo finale è quello di creare alimenti nutraceutici, quindi
produrre alimenti funzionali arricchiti di sostanze benefiche (come i
carotenoidi, i polifenoli, resveratrolo). La progettazione di un alimento
funzionale, può essere ottenuta secondo metodiche di trattamento diverse
per
preservarne
le
molecole
funzionali
naturalmente
presenti
nell’alimento.
LO SCOPO DELLA TESI
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l’attività antiossidante
di molecole bioattive, provenienti da matrici alimentari naturali trattate
termicamente
e/o
tecnologicamente,
mediante
l’utilizzo
dell’incapsulazione, al fine di migliorarne la stabilità, biodisponibilità e
la solubilità senza che venga compromesso il valore nutrizionale.
La ricerca si è suddivisa in varie fasi:
1. Determinazione dell’ attività antiossidante e attività polifenolica
nelle matrici vegetali mediante metodi colorimetrici ABTS e
DPPH e l’attività polifenolica mediante il Folin- Ciocalteau.
2. Determinazione delle attività antiossidante nelle matrici vegetali
sottoposte a trattamenti termici.
3. Pianificazione dello screening dei fattori del processo “attivazione
dello stato solido” per la determinazione delle condizioni di
processo ottimali e realizzazione delle prove sperimentali sulla
base del Disegno sperimentale prescelto.
4. Analisi quali- quantitativa delle sostanze prescelte mediante UV.
Per quanto riguarda la scelta delle matrici è stata effettuata tra gli
alimenti più diffusi nella Dieta Mediterranea come il pomodoro, la zucca,
gli infusi di tè verde, foglie d’olivo, karkadè, rosa canina, e frutti rossi
(lamponi, mirtilli) e i loro derivati.
MATERIALI E METODI
I campioni alimentari scelti, per le loro ricche caratteristiche compositive,
sono stati analizzati tal quali o come materie prime nella preparazione di
alimenti più complessi, quindi salse, infusi, puree, liofilizzati.
Ogni matrice alimentare è stata trattata secondo processi chimico-fisici
conservando le proprietà iniziali.
I campioni derivati del pomodoro (passate, doppio e triplo concentrato) e
della zucca (Cucurbita maxima) sono stati sottoposti a due processi di
trasformazione: la liofilizzazione e la cottura a microonde (potenze
utilizzate sono state 300W, 500W e 750W).
Gli infusi di tè verde, le foglie d’olive, karkadè e rosa canina sono stati
analizzati sia a temperatura ambiente sia a temperatura di 80°C.
Infine, i campioni di frutti rossi (mirtillo, lamponi, e purea di frutti di
bosco) non hanno subito trattamenti termici, ma fisici come la
disidratazione e la micronizzazione.
Successivamente, tutte le matrici alimentari sono state sottoposte a
diverse procedure di estrazione e preparazione al fine di valutare quale
permettesse di aumentare la resa in termini di:
Contenuto di polifenoli (metodo di FOLIN-Ciocalteau)
Attività antiossidante (mediante ABTS e DPPH)
Determinazione della TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant
Capacity).
Il metodo Folin-Ciocalteau
Questa tecnica colorimetrica permette la determinazione del contenuto
dei polifenoli totali.
Il reattivo di Folin- Ciocalteau è costituito da miscela di sodio tungstato e
sodio molibdato che aggiunto al campione è in grado di assumere una
colorazione blu proporzionale al numero di residui fenolici presenti.
Nella procedura utilizzata, 1ml degli estratti precedentemente preparati è
stato addizionato con 500µl di reattivo di Folin- Ciocalteau, e dopo 3
minuti è stato aggiunto 1ml di soluzione di carbonato di sodio al 7,5%
(infuso di foglie d’olivo), 10% (Karkadè) e 20% per le altre analisi.
Ogni campione è stato portato a volume (10ml) con acqua distillata e
lasciato a riposo a temperatura ambiente per un’ora. La misurazione è
stata effettuata mediante lettura allo spettrofotometro alla lunghezza
d’onda di 765 nm, utilizzando come riferimento la curva di calibrazione
dell’acido Gallico.
ABTS e DPPH
Entrambi i metodi colorimetrici si basano sulla capacità pro-ossidante
che hanno i radicali liberi nei confronti di substrati facilmente ossidabili.
Sono due tecniche dirette, stabili, facilmente riproducibili e ampiamente
applicate per l’individuazione dell’attività antiossidante totale sulle
matrici vegetali.
Per questa procedura l’ABTS (Acido 2,2-azinobis( 3- etibenzotiazolin -6solfonico) deve essere attivato mescolando 5ml di ABTS (7mM) con 88
ųl di persolfato di potassio (140mM). Così la soluzione assume
un’intensa colorazione blu- verde. La miscela così ottenuta ha attivato
l’ossidazione dell’ABTS, ma richiede un periodo di stabilizzazione di
circa 16 ore, al buio e a temperatura ambiente. Successivamente, la
soluzione è stata diluita in etanolo fino ad ottenere un’assorbanza di
0,70± 0,02 ad una lunghezza d’ onda di 734 nm dello spettrofotometro.
La soluzione cosi formata è utilizzata per le prove. Inoltre, l’ABTS è
stato utilizzato per valutare la TEAC espressa, come TROLOXequivalenti ovvero le mmoli di Trolox aventi attività antiossidanti pari
1mg di estratto
Invece, per la preparazione della soluzione madre del DPPH ( 2,2diphenil -1-picryl- hydrazyl) 0,6 Mm sono stati pesati esattamente
23,660mg di DPPH e diluiti in 100ml di metanolo. La soluzione ottenuta
è di colore viola scuro. Proseguendo un’aliquota della soluzione madre è
stata diluita con metanolo per raggiungere un’assorbanza di 1,1 ± 0,02,
misurata a 545nm.
Infine, aggiungendo un‘aliquota di ABTS (o DPPH), ai campioni si
ottiene una decolorazione in base alla quantità di antiossidanti presenti
nelle matrici.
RISULTATI
Contenuto dei polifenoli totali
In questo progetto, la determinazione dei polifenoli totali presenti nelle
matrici vegetali, è stata compiuta su alcune matrici vegetali, ossia foglie
d’olivo (Bianchera e Leccino, due varietà tipica della zona locale
triestina), tè verde (Thamu long special), karkadè, rosa canina, mirtillo,
purea di frutti rossi, lamponi.
Infuso delle foglie d’olivo
Il contenuto di polifenoli totali negli infusi di foglie d’olive a caldo (C) e
freddo (F) delle due varietà scelte, ha dato risultati migliori nei campioni
estratti a caldo, rispettivamente con concentrazioni di 26,73 e 48,10
mg//ml. Per di più l’infuso a caldo della varietà Leccino presenta il
contenuto polifenolico superiore del 79,95% rispetto a quella Bianchera.
Negli infusi a freddo(F) il contenuto.
Tè verde
Durante questa ricerca sono state confrontate le concentrazioni del tè
verde ottenute nelle varie forme, sia come infuso di foglie essiccate, sia
come infuso di foglie micronizzate, sia liofilizzato ottenuto dall’infuso di
foglie micronizzate. Quest’ultimo campione ha aumentato notevolmente
l’estrazione, fino ad essere maggiore del 74,2% rispetto agli infusi
tradizionali.
Contenuto in polifenoli: Foglie d’olivo e tè
verde

•Tè VERDE
FOGLIE OLIVE
Varietà
Polifenoli
totali mg/ml
Bianchera C.
26,73 ± 1,32
Campioni
2,73 ± 0,28
Inf. conc.f oglie essiccate
Bianchera F.
Leccino C
48,10 ±3,56
.
Leccino F.
2,69 ± 0.44
Leccino C. >79,95%.
Tè verde Thamu long Special
Polifenoli totali
(mg/100 ml)
775 ± 4,36
Inf. conc. foglie
micronizzate
1350 ± 12,45
Liofilizzato
2691 ± 16,61
(mg/g estratto secco)
Liofilizzato > attività polifenolica.
Karkadè, Rosa canina
La micronizzazione dei campioni di karkadè e della rosa canina, ha
aumentato sicuramente l’estrazione dei polifenoli, tant’è vero che il
campione micronizzato di karkadè ha evidenziato l’incremento maggiore
pari al 281,6%, che si è rivelato maggiore rispetto al campione essiccato;
invece per la rosa canina micronizzata l’aumento è stato del 221,1%
paragonato al campione essiccato.
Estratto di Mirtillo, Lamponi e Purea di Frutti rossi
Considerando la quantità polifenolica degli estratti di base di frutti rossi
si nota che la quantità di molecole bioattive trovata non è significativa
rispetto al campione tale quale .
Attività polifenolica di mirtillo,lamponi,
purea di frutti di bosco
Campioni

Mirtilli freschi

Mirtilli integratore

Purea di frutti rossi

Lamponi
Polifenoli totali
mg/100ml
15,14 ±1,05
4,38 ± 0,87
5,65 ± 1,12
4,55 ± 1,19
Attvità Antiossidante
La determinazione dell’attività antiossidante è stata eseguita su tutti
campioni considerati sia tal quali, sia sulle matrici sottoposti a diversi
trattamenti termici, allo scopo di evidenziare il metodo più efficiente per
ottenere una maggiore quantità di molecole bioattive. Dopo di che di
ogni aliquota è stata calcolata l’IC50, ossia la concentrazione di estratto
(espressa in mg/L) che riduce del 50% la concentrazione iniziale di
DPPH e/o dell’ABTS.
Pomodoro e derivati
Le analisi per l’attività antiossidante sui derivati del pomodoro sono state
effettuate su aliquote di doppio e triplo concentrato, passata di pomodoro
e passata arricchita di licopene tali quali o trattati alle microonde. Come
si nota dal grafico, i derivati del pomodoro sottoposti a cottura con
microonde risultano avere una capacità antiossidante maggiore tra il
2,99% al 32,8%.
Differenze della TEAC tra campioni tal quali e trattati con MW a
500W
+14,09%
+23,43%
mmol
Campioni non trattati vs campioni trattati
Zucca
Come si può notare dal grafico, i trattamenti applicati sulla zucca non
hanno evidenziato notevoli riduzioni della capacità antiossidante rispetto
ai valori individuati dal campione fresco.
L’applicazione delle microonde a 750W denota il più significativo
aumento della TEAC (13,23%), mentre solo la cottura per vapore ha dato
un aumento del 25,78%.
Attività antiossidante: Zucca
140
-14,05%
+13,23%
120
100
80
60
40
20
0
teac
dpph
mmol
Infuso di foglie d’olivo e tè verde
Sia calcolando l’attività antiossidante delle due varietà locali di piante
d’olivo scelte sia quella del tè verde hanno dimostrato di essere matrici
vegetali ricche di molecole bioattive .
Durante la ricerca della TEAC del tè verde sono stati paragonati i risultati
dei campioni dell’infuso della Bianchera e del Leccino del tè verde. Il
DPPH ha manifestato una particolare attività rispetto a questi campioni
perché i risultati sono stati maggiori.
Attività antiossidante:
foglie d’olivo e tè verde
450
400
350
300
250
TEAC
200
DPPH
150
100
50
0
BIANC.F
LECC.F
teaverde
Karkadè e Rosa canina
La TEAC degli infusi di Karkadè e Rosa canina ha evidenziato che
entrambi questi vegetali sono caratterizzati da una notevole attività
antiossidante legata non solo alla componente fenolica ma anche alla
componente carotenica. Anche in questo caso emerge la differenza tra gli
infusi fatti con i fiori integri e quelli fatti con i fiori micronizzati, in cui è
osservabile un aumento pari al 72,4% per il Karkadè e al 67,3% per la
Rosa Canina.
Resveratrolo, purea di frutti rossi, mirtillo e lamponi
I campioni di frutta rossa scelti sono stati paragonati con la molecola del
resveratrolo per valutare l’azione antiossidante; il resveratrolo è una
molecola caratteristica dei prodotti vegetali ricchi principalmente in
antocianidine e procainidine.
I lamponi liofilizzati denotano un’importante capacità antiossidante totale
elevata, rispetto al DPPH, mentre le TEAC complessive sono risultate
decisamente meno significative.
Attività antiossidante: frutti rossi

Mirtillo, lamponi, purea di frutti rossi
o
L’ attività antiossidante è stata paragonata con il Resveratrolo.
3,5
3
2,5
2
TEAC
1,5
dpph
1
0,5
0
resveratrolo
purea
mirtillo
lamponi
mmol
INCAPSULAZIONE DI MOLECOLE BIOATTIVE MEDIANTE
ATTIVAZIONE ALLO STATO SOLIDO (SSA)
È una tecnica brevettata che permette di ottenere nuovi materiali
compositi definiti co-macinati. La SSA impiega alta energia di tipo
vibrazionale e implica il trattamento di sostanze funzionali con polimeri,
matrici e carriers appropriati, in assenza di solventi. Tutto ciò per poter
modificare la solubilità, la biodisponibilità, i parametri chimico fisici e il
rilascio del principio attivo.
Solo alcune molecole oggetto di questo studio sono state sottoposte ad
incapsulazione, mediante la tecnica dell’attivazione allo stato solido,
ossia Karkadè, Mirtillo e Rosa Canina.
Preparazione dei comacinati
Per la preparazione dei campioni di “co- macinato” sono state individuate
le migliori condizioni sperimentali. Prima della costruzione del disegno
sperimentale è stato necessario determinare i fattori di prodotto e di
processo di tipo quantitativo (rapporto aroma è co-macinante, tempo,
rapporto polveri e mezzi co-macinanti, rapporto disassamento e
movimento) e qualitativo, ossia il materiale adsorbente (due tipi di
Maltodestrine ,Silice, Fecola e Ciclodestrine) e il materiale co-macinante
(i co-macinati scelti in base alla differente natura dei campioni ,ossia
lipidica, silicea, polisaccaridica e appartenenti alla famiglia delle gomme
naturali).
Valutazione del rilascio delle sostanze attive
Dopo la determinazione del contenuto di antiossidanti, i comacinati sono
stati sottoposti al “Saggio di Dissoluzione per le forme farmaceutiche
solide”, secondo il metodo ufficiale della FU XI. 10 grammi di comacinato sono stati posti alla base del contenitore di vetro contenente una
soluzione tampone al ph fisiologico di 7.4, sotto agitazione e ad una
temperatura di 37°C. Al tempo definito di 1, 5, 20, 40, 60, 120, 180 e 240
minuti sono state prelevate aliquote di 5ml di liquido delle quali è stata
letta l’assorbanza per la determinazione della TEAC e gli altri per la
determinazione dei polifenoli, della vitamina C e dei carotenoidi.
I risultati della TEAC nei comacinati ottenuti in questo studio hanno
dimostrato che tutti campioni hanno dimostrato una perdita più o meno
significativa dell’attività antiossidante, tale perdita è strettamente
correlata al polimero utilizzato. Tutti i campioni supportati su silice
hanno ridotto drasticamente il valore della TEAC, mentre i campioni
supportati su maldodestrine e ciclo destrine hanno conservato l’attività
antiossidante.
Appare evidente che la procedura di incapsulazione di molecole bioattive
oggetto di questo studio permette di mantenere l’attività antiossidante e
determinare un rilascio modulato nel tempo delle molecole bioattive.
Tale metodica può rappresentare una valida soluzione sia per la
formulazione di integratori dietetici, che per la produzione di alimenti
arricchiti con considerevoli proprietà nutraceutiche.
CONCLUSIONI
Le applicazioni pratiche del trattamento con le microonde possono
rivelarsi utili per la preparazione di “alimenti nutraceutici”. Rispetto alle
matrici esaminate, si è potuto infatti constatare che le microonde non
hanno pregiudicato il profilo qualitativo e quantitativo degli analiti
ricercati. Si è dimostrato che in alcuni processi ad alta potenza
migliorano la disponibilità quantitativa delle molecole bioattive ad azione
antiossidante. Bisogna sottolineare che la scelta del trattamento migliore
è stata definita non solo sulla base dei risultati quali-quantitativi migliori
ma anche sul mantenimento delle proprietà organolettiche tipiche
dell’alimento (sapore, aroma, colore, texture). Ad esempio, nella zucca
questo aumento può essere dato da una migliore distruzione delle cellule
vegetali e dei cloroplasti contenti nelle molecole carotenoiche.
Un ulteriore scopo di questo studio è stato quello di aumentare le
caratteristiche salutistiche dei polifenoli vegetali, mediante processi che
offrano una protezione nei confronti dei principi attivi, migliorando sia la
stabilità che la biodisponibilità.
Pur rivelandosi un buon metodo di preservazione delle molecole attive,
tecnologicamente le microonde non trovano applicazione industriale
causa la mancanza di sistemi su larga scala che utilizzano questo
trattamento.