Protocollo diagnosi Tilletia indica

Protocollo diagnostico
per
Tilletia indica Mitra
A cura di: Luca Riccioni, Mauro Bragaloni
Versione n. 1 del 15 febbraio 2013
1
2
Descrizione della malattia
Agente causale
Tilletia indica Mitra
Tassonomia
Fungo: Basidiomycota: Ustilaginomycetes:Tilletiales
Ceppi individuati
Avversità
‘Carie’ parziale del grano
Sinonimi
Neovossia indica (Mitra) Mundkur
Introduzione
Tilletia indica Mitra è agente della ‘Carie parziale’ del grano La ‘carie parziale’ (nota come ‘Karnal
bunt’ perché scoperta nel 1931 nella zona di Karnal, Haryàna, nell’India del Nord), è una malattia
della cariosside del grano, del triticale, e potenzialmente della segale e del farro.
T. indica non è presente in Europa ed è considerato patogeno di quarantena per l’Unione
Europea (Dir. 2000/29/CE) e quindi anche per l’Italia dal 1997, con Decreto del Ministero delle
Politiche Agricole e Forestali del 19 febbraio 1997 (Gazzetta Ufficiale, Serie Generale, n. 69 del
24 marzo 1997). Da la semente di grano, di triticale e di segale è soggetta a strette misure di
controllo se importate da paesi dove il fungo è presente.
Dall’India la malattia si è diffusa prima nelle zone limitrofe del Pakistan, Afghanistan, Iran, Iraq e
Nepal, per poi essere segnalata nel 1969 in Messico, nel 1996 in USA e nel 2001 in Sudafrica.
Benché la malattia non comporti una riduzione apprezzabile della produzione in quanto le perdite
sono stimate al massimo attorno all’1%, i danni economici maggiori sono dovuti alla riduzione
della qualità del grano. Il fungo, infatti, produce trimetilammina, un composto chimico volatile, che
conferisce al frumento infetto un odore ed un sapore di “pesce marcio”. È sufficiente un’infezione
del 3% delle cariossidi per rendere la granella non più adatta all’alimentazione umana e
un’infezione del 6-9% per renderla inutilizzabile anche per l’alimentazione del bestiame.
.
Sintomatologia
Il sintomo sulle cariossidi è rappresentato dal così detto ‘soro’, massa nera e compatta di micelio
del fungo che a maturità produce spore, dette ‘teliospore’, dando un aspetto polverulento al soro
stesso. E’ denominata “carie parziale” perché generalmente soltanto una porzione della cariosside
è attaccata (Foto 1). Se l’ospite è molto suscettibile e le condizioni ambientali favorevoli, l’intera
cariosside sarà trasformata in soro, ma ciò accade raramente. Più comunemente il danno della
cariosside è limitato ad un piccolo soro in prossimità dell’ilo.
3
Foto 1. Cariossidi di grano con sintomi a diversi gradi di
intensità di ‘carie’ parziale.
Morfologia
Le teliospore (Foto 2) sono globose e/o subglobose, nere o castano
scuro, a pareti spesse, del diametro di 20-60 µm, costituite
esternamente da un episporio echinulato, formato da numerose
“spine” (caratteristiche per ciascuna delle diverse specie di Tilletia).
Le teliospore costituiscono le strutture di sopravvivenza del fungo,
potendo rimanere vitali in uno stato dormiente per diversi anni nel
terreno, e rappresentano gli organi di diffusione e dispersione del
fungo. Le teliospore vengono disperse nell’ambiente soprattutto
durante la raccolta del grano e possono diffondersi per centinaia di
chilometri sia attraverso il vento sia attraverso i macchinari per la
raccolta e il trasporto del grano.
Bastano poche cariossidi infette per contaminare il raccolto ed il
Foto 2. Teliospora di
terreno. Le teliospore dormienti, una volta presenti nel terreno
Tilletia indica
all’interno del seme infetto o libere, possono essere riportate in
superficie con le normali lavorazioni agricole e, se si trovano ricoperte da non più di 1-2 mm di
terra e in presenza di umidità e di temperature favorevoli, possono germinare e dare avvio al
ciclo.
Rischi di introduzione del patogeno in Europa
Il rischio maggiore di introdurre T. indica è legato soprattutto all’importazione di partite di cereali
infette e/o contaminate provenienti da Paesi dove il patogeno è già presente. Per questa ragione i
Servizi Fitosanitari dei paesi dell’Unione Europea hanno messo in atto i possibili mezzi di difesa
per evitare questa eventualità (Dir. 2000/29/CE e D.M. del 19/02/1997 di recepimento). Tali mezzi
sono basati essenzialmente su attenti controlli, mediante specifiche analisi (Protocollo EPPO
PM7/29 (2) (Anonymous, 2007), di tutte le partite commerciali di grano, segale e triticale dirette in
Europa e provenienti dai Paesi in cui il patogeno è presente. Queste analisi servono a
verificare la presenza di teliospore di T. indica, quindi, proprio l’identificazione delle teliospore
rappresenta la difficoltà principale. Le teliospore di T. indica sono molto simili nelle dimensioni e
nel disegno dell’episporio a quelle di altre specie di Tilletia che infettano altre graminacee, come
T. horrida del riso e T. walkeri del loglio. Tale difficoltà aumenta se il campione di grano oggetto
d’analisi presenta un basso livello d’infezione e/o contaminazione (presenza di 1-5 teliospore).
Ricerche recentissime riguardanti la valutazione del rischio (Pest Risks Analisis, PRA) di un
eventuale ingresso della malattia in Europa, a cui hanno partecipano diversi istituti Europei fra cui
il Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale di Roma (CRA-PAV), concludono che il fungo ha la
capacità di stabilirsi in Europa e di causare enormi danni economici (Sansford et al., 2006).
Il rischio di introduzione è, inoltre, confermato da tre intercettazioni su partite di grano messicano
infetto da T. indica da parte di alcuni Servizi Fitosanitari Regionali.
Il CRA-PAV è stato indicato dal MiPAAF come laboratorio di riferimento per i Servizi Fitosanitari
Regionali (Circolare Ministeriale Prot. 33249 del 24.07.2006) per l’identificazione del fungo in
partite di importazione.
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Diagnosi
Il metodo utilizzato fino a pochi anni fa consisteva nell’analisi al microscopio ottico del
sedimento ottenuto dal lavaggio di 400 semi e relativa centrifugazione, per ricercare la
presenza delle teliospore del fungo. Poiché tale metodo, pur nella sua validità, presentava
alcuni limiti, è stato validato, recentemente, un nuovo protocollo diagnostico molto più articolato
(Protocollo EPPO PM7/29 (2)) che fornisce precise istruzioni per la diagnosi su basi
morfologiche di T. indica, e un successivo diagramma di lavoro per l’identificazione molecolare
da DNA estratto da micelio ottenuto da spore germinate.
Schematicamente i requisiti necessari per una diagnosi positiva sono:
a. presenza nel campione analizzato di cariossidi con sintomi di “carie parziale”. In questo
caso, dopo verifica che le spore contenute nel seme cariato abbiano i caratteri morfologici
caratteristici di T. indica, si può dare il campione positivo, senza necessariamente
raccomandare ulteriori analisi, poiché si ritiene sufficiente il requisito di cariosside con
sintomi di carie parziale (T. indica è l’unica delle tre specie di Tilletia con cui si può
morfologicamente confondere che può causare sintomi su grano).
b. presenza di numerose spore (>10). In questo caso si ritiene possibile identificare la specie
con la sola DIAGNOSI MORFOLOGICA nel caso in cui TUTTI i caratteri morfologici chiave
Tab. 4 del PM7/29 (misure, colore, aspetto dell’ornamento dell’episporio (strato
superficiale) sono conformi ad una specie. Una eventuale analisi molecolare viene
raccomandata in caso di dubbi nell’identificazione.
c. presenza nel campione analizzato di poche spore (< 10). In questo caso si ritiene che non
sia possibile discriminare fra le specie Tilletia indica, T. walkeri e T. horrida facendo solo
uso dei caratteri morfologici, quindi si raccomanda l’uso della diagnosi molecolare da DNA
estratto da micelio fungino.
Il protocollo EPPO da la possibilità di utilizzare l’analisi molecolare su DNA ottenuto da micelio,
e fa riferimento a tre tecniche possibili disponibili in letteratura:
1) amplificazione diretta del DNA mitocondriale con l’uso di primer specifici (Frederick et al.,
2000);
2) amplificazione del DNA ribosomale e successivo taglio con enzimi di restrizione (Pimentel et
al., 1998);
3) uso di sonde specifiche in Real Time PCR (Frederick et al., 2000).
Le tecniche molecolari, dovendo essere applicate al micelio, richiedono la germinazione,
evento non facile per le spore di T. indica che sono di tipo durevole e caratterizzate da un
periodo di lunga dormienza.
Poiché la germinazione delle spore è una fase critica del protocollo, come sopra
spiegato, si è voluto mettere a punto un metodo capace di identificare il fungo da singole
spore non germinate. E’ stato quindi testato e validato il metodo multiplex pubblicato da
(Tan e Murray, 2006), e si è messo a punto un secondo metodo non in multiplex con
primers specifici, e confrontato con il precedente.
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Normativa fitosanitaria
Decreto Ministeriale 31 gennaio 1996 dal titolo “Misure di protezione contro l’introduzione e la
diffusione nel territorio della Repubblica italiana di organismi nocivi ai vegetali o ai prodotti
vegetali” e successive modifiche (D. M. 19 febbraio 1997)
Circolare Ministero per le politiche agricole alimentari e forestali Prot. 33249 del 24.07.2006
Bibliografia
Agarwal, V.K., Verma, H.S. e Khetarpal, R.K. (1977) – “Occurrence of partial bunt on triticale”,
Plant Protection Bulletin 12: 210–211.
Mitra M., (1931) – “A new bunt on wheat in India”, Annals of Applied Biology, 18: 178–179.
Sekhon K. S., Saxena A. K., Randhawa S. K. e Gill K.S., (1980) – “Effect of Karnal bunt
disease on quality characteristics of wheat”, Bulletin Grain Technology, 18: 208–212.
Joshi L.M., Singh D.V., Srivastava K.D., e Wilcoxson R.D., (1983) – “Karnal bunt: A minor
disease that is now a threat to wheat”, Botanical Review, 49: 309–330.
Nagarajan S., (1991) – “Epidemiology on Karnal bunt of wheat incited by Neovossia indica and
an attempt to develop a disease prediction system”. In: Technical Report Wheat-Program
CIMMYT, Mexico, March, 1-62.
Anonymous, 2004 EPPO Standards PM 7/29 Diagnostic Protocol for Tilletia indica. Bulletin
OEPP/EPPO 34: 155 –157.
C. Sansford, R. Baker, J. Brennan, F. Ewert, B. Gioli, A. Inman, P. Kelly, A. Kinsella, V. Leth,
H. Magnus, F. Miglietta, G. Murray, G. Peterson, A. Porta-Puglia, J. Porter, T. Rafoss, L.
Riccioni, F. Thorne, M. Valvassori (2006). Risks associated with Tilletia indica, the newlylisted EU quarantine pathogen, the cause of Karnal bunt of wheat. EC Fifth Framework
Project QLK5-1999-01554. http://karnalpublic.pestrisk.net. 164 pp
Pimentel G, Carris LM, Levy L & Meyer R (1998) Genetic variability among isolates of Tilletia
barclayana, T. indica and allied species. Mycologia 90, 1017–1027.
Frederick RD, Snyder KE, Tooley PW, Berthier-Schaad Y, Peterson GL, Bonde MR, Schaad
NW & Knorr DA (2000) Identification and differentiation of Tilletia indica and T. walkeri
using the polymerase chain reaction. Phytopathology 90, 951–960.
Tan Mk, Murray GM, 2006. A molecular protocol using quenched FRET probes for the
quarantine surveillance of Tilletia indica, the causal agent of Karnal bunt of wheat. Mycol
Res. 2006 Feb;110(Pt 2):203-10
6
Metodologie
diagnostiche
7
Premessa
Il protocollo diagnostico descritto è il prodotto dell’attività effettuata nell’ambito del Progetto
Finalizzato ‘ARON-ARNADIA’, finanziato dal Ministero per le Politiche Agricole, Alimentari e
Forestali.
Il protocollo diagnostico fornisce le linee guida per la diagnosi e l’identificazione del fungo
Tilletia indica Mitra nei laboratori presenti sul territorio italiano preposti alla diagnosi degli organismi
da quarantena. L’uso di protocolli diagnostici armonizzati è alla base di un’efficiente applicazione
delle misure fitosanitarie e consente il confronto di risultati ottenuti da diversi laboratori in diverse
circostanze.
Le metodologie di laboratorio riportate nel protocollo riprendono il Protocollo EPPO PM7/29
(2) implementato in base all’esperienza e alle nuove tecnologie e metodologie pubblicate
recentemente, dopo una analisi della loro sensibilità, specificità, accuratezza, sensibilità analitica,
ripetibilità e riproducibilità (ISO 16140:2003) .
Per la definizione di tali parametri le diverse metodologie di diagnosi sono state effettuate
con reagenti, strumentazione dettagliatamente riportati. Ciò non comporta l’esclusione dell’uso di
reagenti e strumentazioni alternative e la modifica di alcune procedure per meglio avvicinarsi agli
standard di ogni singolo laboratorio, purché ciò venga adeguatamente validato.
La definitiva validazione attraverso un ring test (riproducibilità) fra diversi laboratori è stata
eseguita in collaborazione con:
1. CRA-PAV - Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale, Via C.G. Bertero 22, Roma (Luca
Riccioni Coordinatore del Gruppo, Mauro Bragaloni)
2. Laboratorio di Micologia del Servizio Fitosanitario della Regione Emilia Romagna, via
Corticella, 133, 40129 Bologna. (Carla Montuschi, Baschieri Tiziana)
3. Laboratorio di Patologia Vegetale, Università degli Studi di Catania, Facoltà di Agraria.,
Dipartimento di Scienze delle Produzioni Agrarie e Alimentari (DISPA), Sezione Patologia
Vegetale, Via S. Sofia, 100, 95123 Catania (Vittoria CATARA, Patrizia Bella)
4. Centro di Ricerca e Sperimentazione in Agricoltura “Basile Caramia” Via Cisternino 281,
70010 Locorotondo (BA) (Nicola TRISCIUZZI, Enza Dongiovanni).
Le prove di validazioni sono riportate nell’Allegato1.
8
FLUSSO DI LAVORO
L’identificazione di teliospore di T. indica all’interno di un campione di grano di importazione viene
effettuata secondo il seguente diagramma di lavoro:
CAMPIONE DI SEME DI GRANO DI 50g
“WASHING TEST”
ESAME VISIVO
A SECCO
“WASHING TEST” POSITIVO
NESSUN SEME CARIATO
E/O “WASHING TEST”
NEGATIVO
SEME CARIATO
OSSERVAZIONE E CONTA DELLE SPORE
NEGATIVO
Con almeno 10 spore
Meno di 10 spore
1
3
2
ANALISI MORFOLOGICA
DA SPORE NON GERMINATE
DIAGNOSI MOLECOLARE
- Real Time PCR con sonde speciespecifiche in multiplex.
Opp.
- Real Time PCR con primer speciespecifici.
GERMINAZIONE DELLE
SPORE IN VITRO
SE TUTTE LE CARATTERISTICHE
MORFOLOGICHE COINCIDONO
POSITIVO
2A
2B
DIAGNOSI MOLECOLARE
DIAGNOSI MOLECOLARE
(“End Point PCR” oppure “Dual Labeled Probe
Real Time PCR con primers specie-specifici)
(“RFLP via PCR” della regione ITS”)
9
In questo protocollo si riportano le procedure per l’identificazione di T. indica attraverso il
riconoscimento morfologico delle teliospore, ed eventuale verifica con metodo molecolare
direttamente da spora (non germinata), punto 3 del flusso di lavoro.
Per l’applicazione delle metodiche molecolari su DNA estratto da micelio del fungo, ottenuto per
germinazione delle spore, si rimanda direttamente al protocollo EPPO PM PM7/29 (2).
Metodo diagnostico
Componente riconosciuta
Metodo morfologico (“washing test”)
Teliospora
Metodo Molecolare 1: RT-PCR con sonde
specie-specifiche in multiplex
Metodo Molecolare 2: RT- PCR con primer
specie-specifici
Porzione di DNA ribosomale
Porzione di DNA mitocondriale
10
METODO di
CAMPIONAMENTO
11
Campionamento
In fase di preparazione
12
SAGGIO MORFOLOGICO
 ‘WASHING TEST’
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PROTOCOLLO PER L’ESTRAZIONE DI SPORE DI TILLETIA SPP. DA UN
CAMPIONE DI SEMI DI GRANO (WASHING TEST)
Il protocollo qui esposto è tratto dal protocollo EPPO PM29/7, ed è stato precedentemente validato
attraverso un Ring test internazionale nell’ambito del progetto EU DIAGPRO Project.
Il saggio morfologico si basa sul reperimento delle teliospore mediante un filtraggio selettivo
dell’acqua di lavaggio di una parte del campione di grano in esame (50 g), e successiva
osservazione al microscopio ottico del materiale che si ottiene per l’eventuale identificazione
attraverso i caratteri morfologici delle spore di Tilletia spp. presenti.
Prima del “washing test” l’intero campione in esame deve essere osservato a secco, possibilmente
aiutandosi con una lente di ingrandimento, per la ricerca di cariossidi con “carie” parziale (EPPO
PM29/7). In caso di esito negativo si deve seguire il successivo protocollo.
Se invece vengono rinvenute cariossidi cariate si deve seguire il capitolo successivo
“Identificazione morfologica” per il riconoscimento delle teliospore presenti per confermare
l’esito positivo.
Materiale occorrente
1. Ipoclorito commerciale
2. Soluzione acquosa allo 0,01% di TWEEN 20, come detergente (10 µl di Tween 20 in 100
ml di acqua distillata sterile)
3. Navicelle (8x8 cm) per pesata
4. Bilancia
5. Una beuta da 250 ml
6. Due beute da 500ml
7. Un cilindro da 100 ml
8. Parafilm “M”
9. Agitatore
10. Filtro in nylon con pori di 53 µ di diametro, con un diametro esterno di 11 cm
11. Filtro in nylon con pori di 20 µ di diametro, con un diametro esterno di 4 cm
12. Imbuto da 13 cm di diametro
13. Una spruzzetta con acqua distillata e pipette pasteur da 3 ml
14. Pipettatrice da 100 µl e puntali sterili
15. Pipettatrice da 1000 µl e puntali sterili
16. Tubi falcon da 15 ml sterili
17. Centrifuga per falcon da 15 ml
18. Sacchetti per autoclave
19. Un contenitore da 500 ml sterilizzabile in autoclave (es. becker)
20. Vetrini portaoggetto (76x21 mm). Vetrini copri oggetto (18x18 mm)
21. Stereomicroscopio (x 100-400 ingrandimenti)
22. Microscopio composto
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PROCEDURA
1. Sterilizzare per 15-20 minuti tutto l’equipaggiamento necessario per eseguire il test,
immergendo in una soluzione di ipoclorito di sodio all’1,5 % v/v (diluire 3 parti di candeggina
commerciale al 6% circa di cloro attivo aggiungendo 7 parti di acqua di rubinetto) e sciacquare
il tutto in acqua di rubinetto ed infine in acqua distillata.
1. Pesare 50 g di semi dal campione di 1–2 kg, rappresentativo della spedizione, per avere il
campione da analizzare (sotto viene riportata la tabella che indica il numero di repliche da
effettuare, a seconda del livello di contaminazione e del livello di confidenza richiesto).
Tabella 1 – Numero di repliche di sub-campioni da 50 g
necessarie per individuare diversi livelli di contaminazione in
funzione dei diversi livelli di confidenza, assumendo che le
teliospore si distribuiscono in modo uniforme (Protocollo EPPO
29/7).
Livello di
contaminazione
(n. di spore per 50 g)
N. di repliche richieste in funzione
del livello di confidenza (%)
99%
99.9%
99.99%
1
3
5
6
2
2
3
4
5
1
1
1
3
Mettere il campione in una beuta da 250 ml, aggiungere 100 ml della soluzione contenente
Tween 20 allo 0,01% e sigillare la beuta con parafilm.
4
Agitare per un tempo complessivo di 3 minuti la beuta da 250 ml con 350 oscillazioni al minuto
o 200 rotazioni al minuto o a mano.
5
Versare il contenuto della beuta (semi e soluzione Tween 20) su un filtro di nylon con pori da
53 µ e 11 cm di diametro posto su di un imbuto sovrastante una beuta da 500 ml.
6
Risciacquare la beuta di 250 ml con acqua distillata mediante una spruzzetta e versare il
contenuto sul filtro.
7
Ripetere per due volte il punto 6.
8
Usando una spruzzetta, risciacquare con cura tutta la semente posta sul filtro da 53 µ con
acqua distillata fino ad ottenere un volume di circa 300-400 ml. Rimuovere il filtro da 53 µ e
risciacquare l’imbuto con 2 aliquote di 10-20 ml di acqua distillata che raggiungeranno il resto
del contenuto della beuta da 500 ml.
9. Versare la sospensione così ottenuta su un filtro da 20 µ di nylon (diametro filtro 4 cm) posto
su un imbuto sovrastante una seconda beuta da 500ml. Risciacquare la prima beuta da 500 ml
due volte con acqua distillata, e versando anche questo sul filtro da 20 µ.
15
10 Inclinare il filtro di 30-45° e risciacquare delicatamente la membrana e le pareti del filtro con
acqua distillata, con una spruzzetta o una pipetta Pasteur. Rimuovere con acqua distillata il
deposito sul filtro mediante una pipetta e porlo in un tubo da centrifuga da 15 ml.
11 Ripetere 10 finché il filtro non appare pulito. Se necessario esaminarlo sotto lo
stereomicroscopio per verificare la presenza di spore residue.
12 Centrifugare la sospensione a 200g per 3 minuti.
13 Rimuovere il supernatante con la pipettatrice da 1000 µl, senza alterare il pellet (il
supernatante dovrà essere successivamente sterilizzato).
14 Risospendere il pellet con 100 µl di acqua sterile.
15 Dispensare 20 µl dei 100 µl ottenuti (con pipette da 100 µl) sui vetrini portaoggetti e chiudere
con coprioggetto da 18x18 mm, per permettere l’osservazione al microscopio da 100 a 400
ingrandimenti. La preparazione dei vetrini deve avvenire uno alla volta, e l’osservazione va
fatta velocemente, poichè il vetrino tende a seccarsi (in tal caso è possibile aggiungere acqua
per capillarità con la pipettatrice. Le caratteristiche di eventuali spore rilevate vanno osservate
ad un ingrandimento di 400.
Se nessuna spora viene rinvenuta allora il test è concluso poiché il “washing test” è da
considerarsi negativo.
Se invece vengono rinvenute teliospore si deve seguire il capitolo successivo per il riconoscimento
morfologico.
NB. Alla fine, tutto il materiale utilizzato deve essere trattato con varecchina e risciacquato con
acqua, come descritto nel punto 1, per poter essere riutilizzato nuovamente.
16
IDENTIFICAZIONE MORFOLOGICA
Se vengono rinvenute teliospore applicare lo schema diagnostico riportato qui di seguito
registrando i caratteri morfologici (dimensioni, colore, ornamentazione) e, se possibile, effettuando
e registrando foto al microscopio al fine di raggiungere l’identificazione tassonomica.
Table 2 Caratteristiche morfologiche di Tilletia indica, Tilletia walkeri and Tilletia horrida
Caratteri Teliospore
Tilletia indica1
Tilletia walkeri2
Tilletia horrida3
Dimensione (range) m
22–47–(61)(26–55(64))
(23–45)
17–36(20–38(41))
Dimensione (media) m
35–41
(40–44)†
30–31*
(34–36)†
24–28‡
(28)†
Colore
Da arancione pallido a
prevalentemente scuro, da
bruno rossastro fino a nero
opaco.
Da debolmente giallo a
prevalentemente
scuro
bruno
rossastro
(mai
opaco).
Da debolmente giallo a
prevalentemente marrone
castano chiaro o scuro
(semi-opaco).
Ornamentazione
dell’episporio vista con
messa a fuoco mediana
(Hawksworth et al., 1995)
Episporio
sollevato
a
formare punte diritte ed
aguzze (occasionalmente
ricurve) e, in alcuni casi,
troncate ed in genere
ricoperte di una guaina
ialina
con
dimensioni
variabili da 1.5–5.0 m.
Episporio
sollevato
a
formare punte coniche
(occasionalmente ricurve)
in molti casi tronche, delle
dimensioni di 3–6 m,
ricoperte da una guaina che
va da trasparente-ialina a
giallo-bruna.
Episporio
sollevato
a
formare punte diritte ed
aguzze oppure ricurve,
grandi 1.5–4.0 m, che
possono trasformarsi in
scaglie tronche quando
raggiungono la maturità,
ricoperte da una guaina che
può variare da ialina a
colorata.
Ornamentazione
dell’episporio vista con
messa a fuco sulla
superficie
Punte dell’episporio molto
ravvicinate a formare aree
molto
dense
dove
permangono
isolate
lasciando
spazi
liberi
(densamente
echinulate)
oppure molto strette tra di
loro da formare creste
sollevate
molto
fini
(finemente cerebriforme).
Episporio arrangiato in
punte disposte in maniera
lassa e quindi formanti
creste con spazi molto
larghi,
incompletamente
cerebriformi
(fino
a
formazioni
di
tipo
coralloide)
oppure
in
aggregati molto spessi.
Episporio a formare punte
che appaiono come scaglie
con
forma
poligonale
(occasionalmente episporio
con punte che formano
creste cerebriformi oppure
piccoli aggregati).
1
Dati degli Autori (A. J. Inman, K. J. D.Hughes and R. J. Bowyer, Central Science Laboratory, York (GB) - 2004
OEPP/EPPO,
Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, 219 –227)
2
3
†
*
‡
Based on: Castlebury & Carris (1999); Cunfer & Castlebury (1999); Milbrath et al. (1998); Castlebury (1998).
Riportata da alcuni autori come T. barclayana: Castlebury & Carris (1999); CMI Description no. 75 (1965); Durán (1987);
Durán & Fischer (1961). Altri Autori l’hanno indicata come T. horrida: Agarwal et al. (1990); Khanna & Payak (1968);
Castlebury (1998).
Castlebury & Carris (1999) hanno riportato una dimensioni delle spore più grandi (misura riportata tra parentesi) per teliospore
che venivano riscaldate in “overnight” a 45°C immerse nella soluzione di Shear; Anche in Castlebury (1998) sono state riportate
dimensioni delle spore molto più grandi..
Dati ottenuti dagli Autori Milbrath et al. (1998) ottenuti da teliospore osservate in sospensione acquosa e rinvenute su Lolium
(due isolati dall’Oregon, USA).
Dati degli Autori (A. J. Inman, K. J. D.Hughes and R. J. Bowyer, Central Science Laboratory, York (GB) - 2004 OEPP/EPPO,
Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, 219 –227) ottenuti dall’osservazione in acqua di teliospore originate da semi del genere Oryza
(California, USA; Arkansas, USA); sebbene non sia riportato in letteratura, alcune teliospore potrebbero avere porzioni
dell’episporio sollevato a formare creste ma anche, contemporaneamente, formazioni appuntite individualmente separate.
Letteratura citata:
Agarwal R, Joshi LM & Singh DV (1990) Morphological differences between teliospores of Neovossia indica and N.
horrida. Indian Phytopathology 43, 439–442.
17
Castlebury LA (1998) Morphological characterisation of Tilletia indica and similar fungi. In: Bunts and Smuts of
Wheat: an InternationalSymposium (Ed. Malik VS & Mathur DE), pp. 97–105. NAPPO, Ottawa (CA).
Castlebury LA & Carris LM (1999) Tilletia walkeri, a new species on Lolium multiflorum and L. perenne. Mycologia
91, 121–131.
CMI (1965) Description of Pathogenic Fungi and Bacteria, no. 75. Tilletia barclayana. CAB International, Wallingford
(GB).
Cunfer BM & Castlebury LA (1999) Tilletia walkeri on annual ryegrass in wheat fields in the southeastern United
States. Plant Disease 83, 685–689.
Durán R (1987) Ustilaginales of Mexico: Taxonomy, Symptomatology, Spore Germination and Basidial Cytology.
Washington. State University, Seattle (US).
Durán R & Fischer GW (1961) The Genus Tilletia. Washington. State University, Seattle (US).
Khanna A & Payak MM (1968) Teliospore morphology of some smut fungi. II. Light microscopy. Mycologia 60, 655–
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Milbrath GM, Pakdel R & Hilburn D (1998) Karnal bunt spores in ryegrass (Lolium spp.). In: Bunts and Smuts of
Wheat: an International Symposium (Ed. Malik, VS & Mathur, DE), pp. 113–116. NAPPO, Ottawa (CA).
18
FOTO TELIOSPORE
Immagini di spore di T. indica individuate in un campione di grano importato dal Messico.
19
Teliospore di T. walkerii
20
Teliospore di T.barclayana
21
Teliospore di T. indica
22
SAGGI MOLECOLARI
su singola spora
 REAL-TIME PCR CON SONDE SPECIESPECIFICHE in reazione multiplex
 REAL TIME PCR CON PRIMER SPECIESPECIFICI in reazioni separate
23
METODO 1
Target rDna
Sonde di Tan et al. 2010
Cap. 1
METODO 2
Target mtDna
Sonda di Frederick et al.. 2000
Cap. 2
ALLESTIMENTO DI STRUTTURE A “SANDWICH”
CON VETRINI COPRIOGGETTI TAGLIATI
Cap. 1.1
ALLESTIMENTO PROVETTA DA 0,2 l PER PCR
Cap. 1.2
PCR DI ARRICCHIMENTO
“TARGET” - rDNA
Cap. 1.2
PCR DI ARRICCHIMENTO
“TARGET” mtDNA
Cap.2.1
DIAGNOSI MOLECOLARE
DIAGNOSI MOLECOLARE
(“Dual labelled Probe Real Time PCR” con
sonde specie-specifiche)
Cap. 1.3
“Dual Labeled Probe Real Time PCR con
primers specie-specifici)
Cap. 2.2
Diagramma di flusso delle fasi da seguire per ciascun metodo per l’identificazione specifica di
Tilletia indica e T. walkeri con 2 diverse metodiche di diagnosi molecolare in RealTime PCR
(TaqMan), dove i campioni da analizzare sono rappresentati da singole teliosporespore.
24
METODO 1
1. - IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE MEDIANTE REAL-TIME PCR CON SONDE
SPECIE-SPECIFICHE (Tan et al., 2010 con alcune modifiche)
La metodica consiste nel rilascio del DNA di una sola teliospora attraverso lo schiacciamento tra
due pezzettini di vetro (“sandwich”), quindi da un arricchimento del DNA mediante una PCR con
primer Tilletia specifici, e una multiplex Real-Time PCR per l’identificazione della specie. Il
metodo originariamente è stato messo a punto per il riconoscimento di 5 specie di Tilletia in una
sola analisi, ma nel nostro caso il metodo verrà applicato per il riconoscimento di due specie: la
specie target T. indica, e la specie no target T. walkerii, specie che più facilmente può essere
confusa con T. indica nel riconoscimento morfologico. Pertanto in un unico tubo di reazione
saranno presenti le due sonde Taqman, specie-specifiche, disegnate sul DNA ribosomale, e una
coppia di primer non specie-specifiche.
1.1 Preparazione del “sandwich”
1) Prendere un vetrino coprioggetto da microscopia per preparare i pezzettini di vetro con i quali
verranno schiacciate le teliospore a “sandwich”. Romperlo con una punta e selezionare i frammenti
con dimensioni adeguate (1-3 x 1-3 mm). Può essere utile eseguire la scelta allo stereo microscopio
utilizzando come sfondo carta millimetrata che farà da riferimento per il vaglio.
2) Preparare le soluzioni riportate nell’Allegato al Metodo 1.
3) Prelevare le spore e deporle singolarmente su un frammento di vetrino di 1-3 mm. Questa fase
può avvenire in qualsiasi modo si voglia operare, tenendo conto che è una fase molto delicata
poichè si può perdere o distruggere la spora con facilità. Qui viene descritto un metodo: si consiglia
di far scorrere il coprioggetto del vetrino lateralmente, osservando il tutto sotto uno stereoscopio,
fino a liberare la spora dal coprioggetto. Assicurarsi che ci sia sufficente liquido tra vetrino e
coprioggetto, altrimenti aggiungere acqua sterile con una pipetta. Prelevare la spora con un
talloncino di carta da filtro tenuta con una pinzetta, previamente imbevuta in etanolo 95% e
flambata al bunsen, e trasferirla sul frammento di vetrino di 1÷3 mm scelto. Una piccola goccia di
acqua sterile posta sul frammento può aiutare il trasferimento della spora dalla carta al vetrino
(questa è la fase più delicata dove si rischia di perdere il campione pertanto bisogna porre molta
attenzione nell’esecuzione). Lasciare asciugare il frammento di vetro con la spora, coprire quindi
con un altro frammento di vetro di dimensioni paragonabili al primo (fig. 1) e schiacciare facendo
25
pressione con l’ago, controllando nel contempo la rottura del materiale in piccoli pezzi (fig. 2). A
questo punto, facendo attenzione a non far slittare i due vetri sovrapposti, trasferire il “sandwich”
nel fondo di una provetta 0,2 ml da PCR.
In alternativa al talloncino si può utilizzate un pezzettino di agar-acqua (tenuto da una ansetta
precedentemente sterilizzata) che, una volta catturata la spora, può essere direttamente poggiato nel
frammento di vetrino.
Fig. 1 - “Sandwich” già assemblato con la
spora al centro (sullo sfondo è visibile della
carta millimetrata).
Fig.2 - Rottura della spora dopo aver fatto pressione
sul vetrino con un ago da dissezione
Fig. 3 - Rottura del “sandwich” prima dell’incubazione in
termociclatore
26
1.2 - Amplificazione di arricchimento
Aggiungere 19 μl della miscela di reazione per l’arricchimento via PCR (allegato al Metodo 1) con
un puntale senza filtro in cui viene rimossa la parte terminale (circa 3 millimetri). Rompere
completamente il vetro all’interno della provetta con il puntale utilizzato per dispensare la miscela
sopradescritta mediante rotazioni e schiacciamento (fig. 3), verificando che non rimanga materiale e
liquido alla fine dell’operazione all’interno del puntale. Sigillare le provette e incubarle in un
termociclatore per eseguire la seguente attivazione/amplificazione:
95°C
3 min
63°C
1 min
72°C
1 min
94°C
20 sec
TD 63-59°C 30 sec
72°C
30 sec
72°C
10 min
4°C
1min
20 cicli (iniziare il “touch down” (“TD”) dal 2° ciclo diminuendo 1°C per ciclo)
Per controllare l’amplificazione del DNA e verificare l’inesistenza di contaminazioni, inserire nella
prova anche i) due campioni positivi, uno con DNA di T. indica e uno con DNA di T. walkerii,
aggiungendo a 19 μl della miscela di reazione 1 μl del DNA standard inviato (STI e STW),
preventivamente diluito 10 volte, e ii) un controllo negativo rappresentato da 20 μl di miscela di
reazione senza DNA. Alla fine, se si ritiene utile, si possono correre i prodotti ottenuti da PCR (5
μl) su gel di agarosio-TBE al 2 %, insieme al DNA standard diluito e non arricchito. La fig. 4
rappresenta un esempio di corsa elettroforetica degli amplificati di arricchimento. I controlli positivi
arricchiti saranno ben visibili, mentre il controllo negativo e i nostri campioni (spore) non saranno
visibili.
27
Figure 4 - Gel elettroforetico per la verifica di avvenuto arricchimento del Dna di T.
indica e T. walkeri: 1, 7, e 14 = 1 KB Dna Ladder (Invitrogen); 6, 8, 9, 10, 11 e 12 =
prodotti di amplificazione dei campioni positivi (270 bps) di T. indica (6, 8 e 12) e T.
walkeri (9, 10 e 13), ciascuno replicato tre volte; 2, 3, 4, e 5 campioni arricchiti ottenuti
da spore, non visibili nel gel di agarosio (che potranno risultare positivi nell’analisi in
Real-Time PCR).
1
2 3 4 5
6
7
28
8 9 10 11 12
13 14
1.3 – Real-Time PCR con sonde a doppia marcatura (“dual labelled probes”)
Iniziare l’analisi in Real Time avendo cura di fissare i seguenti parametri:
-
Detector per 6-FAM, (canale verde 518 nm);
Detector per JOE, (canale giallo 554 nm);
Quencher per BHQ-1 (Black Hole Quencher-1; 534 nm)
Volume del campione a 20 l
Nessun riferimento passivo
Curva standard fra 10 e 0,31 ng entrambe le specie
Definire i/il campione/i NTC (“No Template Control”)
-
Definire i termocicli secondo la seguente procedura:
attivazione
amplificazione
95°C, 10’ per 1 ciclo
94°C, 15 sec;
65°C, 1’per 35 cicli, con “touch down” a 60°C (iniziando dal 2° ciclo diminuendo
1°C per ciclo)
raffreddamento
50°C, 1’ per 1 ciclo
Utilizzare 1 l del DNA arricchito, ottenuto come descritto nel capitolo 1.2, per inizializzare la
miscela di reazione di 19 l per la Real Time, preparata come nella tabella seguente.
MISCELA DI REAZIONE per RT- PCR (19 l di miscela di reazione + 1 l di
campione arricchito) - metodo 1
COMPONENTI
STOCK
l
Tampone di amplificazione (bioline)
MgCl2 (bioline)
dNTPs
Immolase Dna Polymerase (bioline)
Acqua priva di Rnase
TOTALE
10X
50mM
10mM
5U/microlitro
MISCELA PRIMER E SONDA 10X
COMPONENTI*
KB-DL-For1
KB-DL-Rev1
Sonda per T. indica, FAM-BHQ1
Sonda per T. walkeri, Joe-BHQ1
Acqua priva di Rnase
TOTALE
STOCK
100microM
100microM
100microM
100microM
2
2
0,4
0,2
0,4
5
l
0,08
0,18
0,04
0,04
1,66
2
ACQUA GRADO PCR
12
VOLUME TOTALE DI REAZIONE
19
* Primers e sonde sono state prodotte secondo quanto descritto in Mui-Keng Tan
et al. 2009.
29
Predisporre almeno 4 diluzioni per ottenere una curva standard di Dna delle due specie di Tilletia:
per esempio, per avere n. 6 diluizioni da 10 a 0,31 ng/l, dopo avere determinato quantitativamente
per via spettrofotometrica o fluorimetrica il contenuto dei campioni di riferimento inviati,
predisporre prima la soluzione con concentrazione 10 ng/l, quindi diluire la soluzione di volta in
volta in rapporto 1 a 1 (v/v).
A fine ciclo, salvare i risultati (grafico e tabelle dei valori ct) ed analizzare i dati comparando i
campioni con i ct delle curve standard. Porre la linea “threshold” al di sopra delle curve della specie
non “target”. Il campione è positivo quando la pendenza è paragonabile a quella degli standard di
riferimento e cade all’interno dei valori di ct degli standard.
Comunque, dal momento che è stato effettuato un “pre-step” di arricchimento del Dna, non sarà
possibile individuare una relazione tra concetrazione di Dna e numero di spore.
Si acclude qui di seguito un grafico di esempio ottenuto con Dna standard di T. indica (1) e di T.
walkeri (2) tra 10 e 0,31 ng/l.
Fig. 5 – Variazione di fluorescenza in funzione dei cicli di amplificazione ottenuti con il metodo 1
(Tan et al., 2010) con contenuti di Dna tra 10 e 0,31ng.
Referenza
Tan MK, Ghalayini A, Sharma I, Yi JP, Shivas R, Priest M, Wright D (2009) A one-tube
fluorescent assay for the quarantine detection and identification of Tilletia indica and other grass
bunts in wheat. Australasian Plant Pathology. 38(2):101-109.
30
Allegato al Metodo 1 – Soluzioni per l’amplificazione di arricchimento metodo 1 (cap. 1.2)
Soluzione Madre per PCR 5X( per 50 reazioni)
Componenti
Stock
μl
Tampone di Amplificazione (Tampone
10X
100
L)*
MgCl2 (Invitrogen)
50mM
30
dNTPs
10mM
20
BioTaq DNA Polymerase (Invitrogen)
5U/μl
10
Acqua Grado PCR
40
200
TOTALE
* Tampone L: [50mM Tris (pH 9), 20mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% gelatine]
Miscela di Primer 10X (per 50 reazioni)
Componenti
MK56 primer
Tilletia-R primer
Acqua Grado PCR
TOTALE
Stock
100 mM
100 mM
μl
5
5
90
100
Preparazione della miscela di reazione (per 1 reazione)
Componenti
Miscela di reazione
Soluzione Madre 5X PCR
Miscela dei primer 10X
Acqua Grado PCR
TOTALE
μl
4
2
13
19
31
METODO 2
2. IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE MEDIANTE “REAL TIME” PCR CON PRIMER
SPECIE-SPECIFICI (Frederick et al. 2000, con alcune modifiche)
Differenze con il metodo precedente:
- non c’è schiacciamento della spora;
- non è una analisi multiplex (più specie in un tubo);
- l’analisi è specifica per individuare la sola specie “target”, T. indica, o la sola specie no-target T.
walkeri;
- la specificità è data dai primers: (Tin3/Tin4) in PCR e (Tin3/Tin10) i RT-PCR per T. indica;
(Tin11/Tin4) in PCR e (Tin11/Tin10) in RT-PCR per T. walkerii.
La metodica consiste nell’arricchire il DNA di una teliospora con i primers specifici disegnati sul
DNA mitocondriale, e successivamente nell’identificare in Real-Time PCR la specie target o no
target (con reazioni separate), facendo uso di primer specifici che amplificano in entrambi i casi un
amplicone di 212 bp, più piccolo e interno al prodotto di amplificazione della PCR di
arricchimento. In questo caso la sonda (5’-FAM-labeled)
che viene utilizzata è di tipo non
specifico.
2.1 Amplificazione di arricchimento
1) Preparare la miscela di reazione (di seguito riportata nella tabella) per la PCR di arricchimento
per T. indica o per T. walkerii a secondo del campione da analizzare;
“miscela di reazione” per l’amplificazione di arricchimento metodo 2 (per 1 reazione)
COMPONENT
Tampone di amplificazione (bioline)
STOCK
10X
MgCl2 (bioline)
50mM
dNTPs
10mM
Immolase Dna Polymerase (bioline)
5U/microlitro
*
Primers Tin3 per T. indica
100microM
Primers Tin4 per T. indica
100microM
Acqua Grado PCR
TOTALE VOLUME l
*
per T. walkerii (Tin11/Tin4)
32
l
2
2
0,4
0,2
0,52
0,52
13,36
19
2) Prelevare la spora come descritto nel metodo precedente (cap.1.1 punto 3), e depositarla
direttamnete nel tubo da 0,2 ml da PCR (non si effettua lo schiacciamento della spora tra due
frammenti di vetrino).
3) Aggiungere 19 l di miscela di reazione per l’arricchimento del Dna mitocondriale. Sigillare le
provette e incubarle in un termociclatore per eseguire la seguente attivazione/amplificazione:
95°C
63°C
72°C
10 min
1 min
1 min
94°C
20 sec
TD 63-59°C 30 sec
72°C
30 sec
72°C
4°C
20 cicli (iniziare il “touch down” (“TD”) al 2° ciclo diminuendo 1°C per ciclo)
10 min
1min
2.2 “Real Time” PCR con sonda aspecifica e primers specifici
L’analisi qui descritta è un adattamento dell’analisi in Real-Time PCR su DNA estratto da micelio
descritta da Frederick et al. (2000), applicata in questo test al DNA arricchito di una spora singola.
Come per l’arricchimento, anche l’analisi in Real-Time si effettua preparando due miscele diverse a
secondo del fungo da identificare, una con i primers per T. indica (Tin3/Tin10) e l’altra con i primer
per T. walkeri (Tin11/Tin10).
Preparare la seguente miscela di reazione:
MISCELA MADRE: per 19 l di reazione
COMPONENTI
Tampone di amplificazioner (bioline)
MgCl2 (bioline)
dNTPs
Immolase Dna Polymerase (bioline)
STOCK
10X
50mM
10mM
5U/microlitro
Acqua Grado PCR
TOTAL
vol.
microlitri
2
2
0,4
0,2
0,4
5
Soluzione Primer e Sonda 10X
COMPONENTI
Primer Tin 3 per T. indica*
Primer Tin10 per T. indica
Sonda aspecifica FAM 5’,TAMRA 3’
STOCK
100microM
100microM
100microM
33
vol.
microlitri
0,13
0,13
0,08
Acqua Grado PCR
1,66
2
TOTALE
Acqua Grado PCR
12
VOLUME TOTALE DI REAZIONE
19
* T. walkeri (Tin11/Tin10).
Aggiunge 1
l di Dna arricchito per ottenere una miscela di reazione con volume finale pari a 20
l. Utilizzare differenti quantità di Dna standard di entrambe le specie al fine di ottenere una curva
-Time PCR ad un canale, fissare i seguenti
parametri:
-
Detector per 6-FAM (6-carboxy-fluorescein), channel green 518 nm
Quencher per TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)
Volume del campione a 20 l
Referenza passiva, nessuna
Curva standard fra 10 and 0,31 ng per entrambe le specie
Fissare almeno un campione NTC (“No Template Control”)
-
Fissare il termociclatore con i seguenti cicli termici
“pre-step”
50°C, 2’ per 1 ciclo
attivazione
95°C, 10’ per 1 ciclo
amplification 95°C, 15 sec; 60°C 1’ per 34 cicli
raffredamento 50°C, 1’ per 1 ciclo
A fine reazione, salvare i risultati (grafico e tabelle dei valori ct) ed analizzare i dati comparando i
campioni con i dati della curva standard. Porre la linea “threshold” al disopra delle curve della
specie non “target”. Il campione è positivo quando la pendenza è paragonabile a quella degli
standard di riferimento e cade all’interno dei valori di ct degli standard.
Referenza
Frederick, R. D., Snyder, K. E., Tooley, P. W., Berthier-Schaad, Y., Peterson, G. L., Bonde, M. R.,
Schaad. N. W., and Knorr, D. A. 2000. Identification and differentiation of Tilletia indica and T.
walkeri using the polymerase chain reaction. Phytopathology 90:951-960.
Raccomandazioni generali

Si raccomanda di lavorare con ESTREMA attenzione e di avvalersi SEMPRE di controlli
negativi sicuri per verificare la validità di ogni evento di amplificazione,al fine di evitare
34
eventuali falsi positivi dovuti a contaminazioni nel laboratorio (reagenti contaminati, estratti
contaminati, blocco del termociclatore contaminato, micropipette contaminate, etc.).

Al fine di evitare contaminazioni si raccomanda di:
-
organizzare il laboratorio di diagnosi molecolare, se possibile, con ambienti separati
(laboratorio per estrazione, laboratorio per amplificazione e laboratorio per
elettroforesi). Se ciò non è possibile utilizzare assolutamente bancali separati per le
tre fasi e set di micropipette dedicate a ciascuna fase. Fare molta attenzione al
bancale di elettroforesi, dove si maneggiano amplificati;
-
è consigliabile aliquotare tutti i reagenti ed al primo sospetto di contaminazione,
eliminarli tutti e ripartire da aliquote nuove (in caso di contaminazione è molto difficile
risalire al reagente o campione contaminato);
-
usare solo acqua sterile RNAsi-free (se preparata in laboratorio è meglio utilizzare
acqua DEPC);
-
cambiare i guanti frequentemente durante le operazioni di preparazione della
miscela di reazione e di caricamento dei target (estratti TRNA);
-
aprire tutte le provette con gli appositi ‘apri-provette’ e non farlo con le mani;
-
usare solo puntali sterili con filtro;
-
al momento di caricamento del blocco del termociclatore accertarsi che le provette
siano ben chiuse; se al termine di una PCR si ritrovano provette aperte all’interno del
termociclatore (dovute ad una chiusura non ermetica del coperchio o a provette
fallate) trattare il blocco con soluzioni di DNasi reperibili in commercio.

controllare sempre la etichetta dei reagenti, in particolare quella degli enzimi, prima di
effettuare le opportune diluizioni (le Unità di enzima possono variare in funzione del lotto
utilizzato).

mantenere in ghiaccio le provette contenenti la miscela di reazione, durante la preparazione
della RT-PCR.

fare attenzione a caricare in modo uniforme le provette nel blocco del termociclatore, la
chiusura non ermetica del coperchio può produrre temperature disomogenee con
conseguenti reazioni di amplificazione parziali o non confrontabili tra i campioni.

rispettare scrupolosamente le condizioni di conservazione di tutti i reagenti. In particolare
mantenere sempre in ghiaccio gli enzimi quando vengono utilizzati nella preparazione della
miscela di reazione.
35
Allegato 1
Prove di validazione
Per la validazione dei protocolli diagnostici sono stati calcolati i seguenti parametri (ISO
16140:2003(E) ) utilizzando campioni di riferimento.
 Sensibilità analitica: la più piccola quantità di “target” che può essere rilevata.
 Sensibilità diagnostica: capacità del protocollo di rilevare la presenza del patogeno nei
campioni sicuramente infetti;
 Specificità analitica/diagnostica: capacità del protocollo di NON rilevare la presenza del
patogeno nei campioni non infetti dal patogeno in esame/rispetto ad un metodo standard.
 Accuratezza relativa: il valore risultante dal calcolo della Sensibilità diagnostica e
Specificità diagnostica;
della
 Accordanza (Ripetibilità): corrispondenza dei risultati ottenuti utilizzando lo stesso
protocollo con gli stessi campioni di riferimento e nelle stesse condizioni di lavoro
(strumentazioni, operatore, laboratorio), ripetendo la metodica a brevi intervalli di tempo;
 Concordanza (Riproducibilità): corrispondenza dei risultati ottenuti utilizzando lo stesso
protocollo con gli stessi campioni di riferimento in diversi laboratori.
Tutte le prove di validazione sono state effettuate utilizzando teliospore da isolati fungini di
riferimento ‘target’ e ‘non target’.
Campioni di riferimento ‘target’: un isolato di T. indica ottenuto da grano messicano importato.
Campioni di riferimento ‘non target’: un isolato di T. walkerii inviato dal Fera, York. T. walkerii
rappresenta la specie con cui più facilmente si può confondere, pur essendo ospite del loietto, e
non del grano, ma che si può comunque ritrovare nel grano di importazione perché presente come
infestante.
Validazione delle metodologie diagnostiche
Per la validazione mediante Ring test dei due metodi diagnostici molecolari, sono stati forniti
ai laboratori partecipanti campioni in modalità blind (cieca) come riportato in tabella 2.
Criteri per il calcolo dei dati di validazione
Positivi ottenuti/positivi attesi
(falsi positivi)
PD
PA
Positivi ottenuti/positivi attesi
(veri positivi)
Negativi ottenuti/positivi attesi
(falsi negativi)
ND
NA
Negativi ottenuti/negativi attesi
(veri negativi)
Sensibilità diagnostica (%):
Specificità diagnostica (% ):
Accuratezza relativa (%)
PA/(PA+ND)
NA/(NA+PD)
PA+NA/(PA+NA+PD+ND)
36
Tabella 2 – Campioni inviati per il ring test: 46 campioni per il Metodo 1 in multiplex; 31+20
campioni per il Metodo 2, rispettivamente con il primer specifico per T. indica e con il primer
specifico per T. walkerii. I=spora di T. indica; W=spora di T. walkerii; c-= controllo negativo.
N.
Metodo 1
Metodo 2
T.indica T.walkerii
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
cccccI
I
I
I
I
W
W
W
W
W
W
W
W
W
W
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1W
1W
1W
1W
1W
(1W)
(1W)
(1W)
(1W)
(1W)
1I+1W
1I+1W
1I+1W
1I+1W
1I+1W
ccccc-
37
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1I
1W
1W
1W
1W
1W
1W
1W
1W
1W
cc-
Metodo 1: REAL-TIME PCR CON SONDE SPECIE-SPECIFICHE
1. Valori di validazione
I valori per la validazione sono stati ottenuti utilizzando il seguente materiale:








MK56 primer
Tilletia-R primer
Immolase Dna Polymerase (bioline)
1 KB Dna Ladder (Invitrogen)
gel di agarosio-TBE al 2 %
Acqua Grado PCR
BIOTAQ buffer
KB-DL-For1

KB-DL-Rev1

Sonda per T. indica, FAM-BHQ1


Sonda per T. walkeri, Joe-BHQ1
Sonda aspecifica FAM 5’,TAMRA 3’
Parametri
Valori
59
100
66
1 spora*
Sensibilità diagnostica
Specificità diagnostica
Accuratezza relativa
Sensibilità analitica(1)
Accordanza (Ripetibilità) (3)
Concordanza (Riproducibilità) (4)
*E’ una sensibilità potenziale. La pubblicazione originale, per valutare la sensibilità
analitica, riporta il segueste test: 4 esperimenti con 10 ripetizioni ciascuna con una singola
spora: positivi rispettivamente 5, 6, 4, 7 con un Ct compreso tra 27 e 36. I risultati ottenuti
nel laboratorio del CRA-PAV confermano tale sensibilità. In termini di DNA, la sensibilità
del metodo è di 0,001 ng.
Punti critici del protocollo e valutazione dei risultati
La manipolazione delle spore è stato il punto critico nell’esecuzione del ring test. Anche in una
situazione reale il reperimento della spora e la successiva manipolazione fino alla provetta di
amplificazione può costituire la parte più elaboriosa, abbassando la percentuale di successo del
protocollo, pur avendo un accettabile grado di sensibilità e specificità analitica.
É stato suggerito dai laboratori partecipanti l’applicazione del metodo direttamente al pellet
derivante dal “washing test”.
38
Metodo 2: “REAL TIME” PCR CON PRIMER SPECIE-SPECIFICI
2. Valori di validazione

Tampone di amplificazione (bioline)

MgCl2 (bioline)

dNTPs


Immolase Dna Polymerase (bioline)
Primers Tin3/Tin4/ Tin10/Tin11

Sonda aspecifica FAM 5’,TAMRA 3’
 TPersonal Thermocycler BIOMETRA
 CFX 96 Real-Time PCR Detection System (Biorad, Hercules, USA)
Parametri
Valori %
75
100
Sensibilità diagnostica
Specificità diagnostica
Accuratezza relativa
Sensibilità analitica(1)
Accordanza (Ripetibilità)
1 spora*
(3)
Concordanza (Riproducibilità) (4)
*E’ una sensibilità potenziale. Dalle prove effettuate nei laboratori del CRA-PAV, il
risultato positivo da una singola spora è stato ottenuto due volte su tre con Ct compreso tra
20-e 30. In termini di DNA, la sensibilità del metodo è risultato di 156-78pg (per entrambe
le specie di Tilletia testate.
Punti critici del protocollo e valutazione dei risultati
Per quanto riguarda i punti critici vale quanto detto per il Metodo 1 riguardo alla manipolazione
delle spore. Rispetto al metodo 1, il metodo 2 è risultato meno sensibile in termini di quantità di
DNA rilevabile, ma meno variabile producendo meno falsi negativi.
39
INDICE
Descrizione della malattia
pag.
3
Diagnosi
5
Normativa fitosanitaria
6
Metodologie diagnostiche
7
Premessa
8
Diagramma di flusso
9
Metodo di campionamento
11
Saggio morfologico
13
Saggi molecolari su singola spora
23
Metodo 1 - REAL-TIME PCR CON SONDE SPECIE-SPECIFICHE
25
Metodo 2 - REAL-TIME PCR CON PRIMER SPECIE-SPECIFICI
31
Prove di validazione
36