Fattori genetici di resistenza/suscettibilità alla scrapie nella capra

Fattori genetici di
resistenza/suscettibilità alla scrapie
nella capra
Simone Peletto
Resistenza genetica alle malattie negli animali da reddito: presente e futuro
Torino – 16 maggio 2013
La suscettibilità alla TSE è influenzata dai
polimorfismi del gene PRNP
Polimorfismo: presenza di diverse forme (alleli) di
uno stesso gene all’interno di una specie o razza
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Polimorfismi del gene PRNP
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
I142M
Associato con un allungamento del periodo di incubazione in
capre inoculate con scrapie e BSE e con aumento di
resistenza alla scrapie naturale in uno studio caso-controllo
francese
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
R154H
Associato con moderata protezione nei confronti della scrapie
classica in studi caso-controllo in Grecia, Italia, Cipro e
Francia.
Associato con elevata suscettibilità alla scrapie atipica in uno
studio caso-controllo italiano
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
R211Q
Associato con resistenza in studi caso-controllo francesi e in
Spagna
N146S/D
Associato con resistenza in studi caso-controllo a Cipro
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Q222K
Analizzati 177 capre di cui 25 positive, da 6 focolai: il
polimorfismo K222 è risultato statisticamente associato ai
controlli, assente in tutti i casi (P-value: 0.029)
La Lisina al codone 222 sembra quindi agire quale fattore di
resistenza verso la scrapie classica
Stessa associazione trovata
da:
• Vaccari in Italia
• Barillet e Corbiere in Francia
• Bouzalas in Grecia
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Scopo del lavoro
• Indagare l’effetto del polimorfismo al codone 222
sulla suscettibilità alla scrapie classica nella capra
tramite infezione sperimentale
• Studio della sintomatologia clinica e
distribuzione della PrPSc nell’organismo
scrapie classica
della
nella
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Materiali e Metodi
• Selezione dei soggetti con genotipo adeguato per
le prove di infezione sperimentale (10 caprini di
cui 5 di genotipo 222 Q/Q e 5 222 Q/K).
Scrapie classica i.c. (0.5 ml)
Q/Q
Q/K
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Materiali e Metodi
• Gli animali sono stati trasportati allo stabulario
dell’IZS di Brescia, in cui sono state condotte le
prove sperimentali, ed inoculati a 5 mesi di età.
• Registrazione dei segni clinici giornaliera, visita
clinica mensile
• Esame autoptico sugli animali deceduti e prelievo di
campioni di tessuto.
• Diagnosi di scrapie mediante test rapido (TeSeE
Sheep and goat; BIORAD) esame istologico,
immunoistochimico e Wb
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Risultati
Genotipo Animali
deceduti
Animali
positivi
Tempo medio di
sopravvivenza
Durata
sintomi
222Q/Q
5/5
5/5
569 giorni
3-20
giorni
222Q/K
1/5
0/5
1458 giorni
---
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Curve di sopravvivenza Kaplan-Meier
0
500
1000
giorni di sopravvivenza
Q/K
1500
Q/Q
L’analisi statistica ha dimostrato che la probabilità di sopravvivenza
delle capre Q/K 222 versus le capre Q/Q 222 è significativamente
maggiore (χ2= 9.34, p = 0.002).
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Conclusioni
La prova sperimentale conferma
l’associazione di K222 con resistenza
alla scrapie
K222 candidato a costituire il fattore
genetico da utilizzare per il controllo
della scrapie caprina
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Elementi necessari per stabilire
l’applicabilità della selezione genetica
• Identificazione di polimorfismi associati a resistenza
e valutazione del loro grado di protezione
• Correlazione polimorfismi-ceppi di EST
• Frequenza dei polimorfismi nelle diverse popolazioni
e razze
• Possibili effetti sui caratteri produttivi
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Frequenza dei polimorfismi nelle
diverse popolazioni e razze
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
SNP
Breed
CA
(n=84)
I142M
8.9
(4.6(4.6-13.2)
SA
(n=69)
7.2
(2.9(2.9-11.5)
RO
(n=70)
VA
(n=77)
GA
(n=58)
MA
(n=25)
IO
(n=27)
RM
(n=28)
5.7
(1.9(1.9-9.5)
28.2
(20.9(20.9-35.1)
2.6
(0.0(0.0-5.5)
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
R154H
11.3
(6.3(6.3-15.7)
0.0
3.6
(0.5(0.5-6.7)
0.0
11.2
(5.3(5.3-16.7)
6.0
(0.0(0.0-12.6)
7.4
(0.0(0.0-14.4)
5.3
(0.0(0.0-11.2)
R211Q
13.7
(8.7(8.7-19.2)
10.2
(5.0(5.0-15.0)
13.6
(8.2(8.2-19.8)
9.6
(4.9(4.9-14.2)
0.0
0.0
0.0
0.0
Q222K
2.4
(0.1(0.1-4.7)
3.0
(0.1(0.1-5.8)
4.3
(0.9(0.9-7.7)
1.3
(0.0(0.0-3.1)
17.2
(10.2(10.2-23.8)
12.0
(3.0(3.0-21.0)
7.3
(0.4(0.4-14.2)
5.4
(0.0(0.0-11.3)
N146S/D
*CA= Camosciata delle Alpi; SA= Saanen; RO= Roccaverano; VA= Valdostana;
GA= Garganica; MA= Maltese; IO= Ionica; RM= Red Mediterranean
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Effetti sui caratteri produttivi?
Un notevole numero di studi e dataset è oggi disponibile per
valutare effetti della selezione sui caratteri produttivi nelle
pecore, ma non vi sono dati relativi alle capre.
La probabilità che vi siano effetti collaterali associati alla
selezione di alcune varianti alleliche nelle capre è
considerata in generale bassa.
Rimane comunque il rischio di un “effetto fondatore”.
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
AIMS:
Provide scientific support for genetic selection to control goat
TSEs & mobilize goat sector to implement genetics-based
resistance breeding programs, focusing on three issues:
1) Strengthening scientific data on link between TSE resistance &
candidate PrP alleles.
2) Involving goat sector in participating countries to generate a
reservoir of resistance allele carriers & recording production
trait information.
3) Providing information towards policy makers & goat sector
about strategies to control TSEs in goat herds at European,
national or regional scale.
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Progetto GOAT-TSE-FREE EMIDA
National Working Document – Italia
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Livello Nazionale
• Obiettivo: identificare becchi resistenti alla scrapie classica nel
gruppo di becchi controllato da ASSONAPA e valutarne il possibile
impiego come diffusori dell’allele di resistenza.
• Azioni: ASSONAPA produrrà un elenco di becchi da genotipizzare.
I campioni verranno inviati a IZSTO che effettuerà l’analisi al
codone 222, al fine della ricerca di becchi portatori dell’allele di
resistenza K222.
• I risultati ottenuti verranno valutati collegialmente ai fini di
indagare la fattibilità di un piano di selezione genetica in Italia.
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Regione Sardegna
Sono stati presi contatti con l’associazione provinciale allevatori
(APA) della provincia di Nuoro ed Ogliastra. Nella razza Sarda la
frequenza dell’allele K222 è stata stimata intorno al 4%.
• Obiettivo: Esistendo una banca dati delle produzioni, il lavoro
sarà principalmente orientato a stabilire correlazioni tra K222 e
produzioni.
Regione Sicilia
Sono stati presi contatti con allevatori interessati e con i
responsabili regionali Agricoltura. E’ stato fatto un piano di
campionamento su razze autoctone, anche se non iscritte ai
libri: Maltese, Girgentana, Rossa Mediterranea, Argentata
dell’Etna e Messinese.
• Obiettivo: stimare la frequenza dell’allele di resistenza e la
variabilità genetica nelle razze siciliane.
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
• Nuovo gene riportato da Premzl et al. (2003) in zebrafish
• Comprende due esoni, con l’intera open reading frame (ORF)
contenuta nell’esone 2
• Codifica per una proteina di 130-150 aminoacidi (Shadoo)
• Il gene è stato chiamato SPRN (Shadow of Prion Protein)
• Il gene SPRN è stato identificato in pesci (zebrafish, fugu) e
mammiferi
PRND
PRNP
SPRN
La glicoproteina Shadoo ha proprietà
protettive PrPC-like e mostra livelli ridotti
nelle infezioni prioniche
Watts et al., EMBO J (2007) 26, 4038–4050
Scopo del lavoro
Approfondire la variabilità del gene SPRN nella capra e di
effettuare uno studio caso-controllo per individuare
un’eventuale associazione tra mutazioni e
suscettibilità/resistenza alla malattia
IZSTO
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Materiali e Metodi
• 21 capre scrapie POSITIVE
• 403 controlli NEGATIVI da focolaio
• PCR dell’intera ORF e frammento della 3’UTR
gene SPRN
Analisi statistica:
• Test del chi-quadro
• Analisi multivariata
• Modello di simulazione (Monte Carlo)
Nella ORF, la maggior parte dei polimorfismi identificati risultano
essere mutazioni sinonime
Analisi multivariata ha escluso confondenti (età, focolaio).
Possibile bias
effetto prevalente del gene PRNP
(esclusi 49 controlli 222K, modello di simulazione per allele 154H)
L’analisi in silico per la ricerca di siti target di microRNA effettuata con il
programma Patrocles (http://www.patrocles.org) ha predetto multipli siti di
legame putativi per miR-149* in questa regione specifica del gene SPRN
Human precursor miR-149
stem-loop is processed into
two miRNAs, miR-149 and
miR-149*
(adapted from the miRBase;
http://microrna.sanger.ac.uk/sequence
s/index.shtml)
miR-149 expression levels at various tissues
(www.microrna.org)
Frontal cortex
Midbrain
miR-149* has been demonstrated to be involved in apoptosis induction
in neuroblastoma, Be2C and HeLa cells (Lin et al., 2010)
----------AGCCCCGA-TCGCCC-TCCCCTCCCCTCCCCTCCCC-----ACAGCCAGGAGCCTAGAACAACG
-----------AGCCCCGA-TCGCCC-TCCCCTCCCCTCCCTTCCCCTCCCCGCAGCCAGGAGCCTAGAGCAACG
-----------AGCCCTGA-TCGCCCCTCCCCGCCCCTCCCC----------ACAGCCAGGAGCCTGGAGCAACG
-----------AGCCCTGA-TCGCCCCTCCCCGCCCCTCCCC----------ACAGCCAGGAGCCTGGAGCAACG
-----------GGCCCCGA-TCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGAGCCTAGAGCAGTG
-----------GGCCCCGA-TCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGA
-----------GGCCC-GATT-GCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCACGGGCCTAGAGCAGCG
-----------GGCCC-GACT-GCCCCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC-----ACAGCCACGGGCCTAGAGCAGTG
AGAGGCTACCCAGCCCTGA-TCGCCCCTTCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGAGCCTAGA
-----------GGCCCCGA-TCGCCCCTCCCCTCCCCTGCCC----------ACAGCCAGGAGCCTAGAGCAGTG
|--1--||-2-||-3-||-4-||-5-||-6-|
Conservazione evolutiva del sito target putativo nei
ruminanti
sheep
goat
oryx
gems
cattle
lechwe
kudu
nyala
deer
Associazione confermata
anche in uno studio in UK
Genetic approaches in
TSE control for goats
from the United Kingdom
Stewart et al.
POSTER – 175
Prion 2012
Amsterdam
Conclusioni
1. Lo studio fornisce nuovi dati sulla variabilità genetica del gene SPRN
caprino mettendo in evidenza che Shadoo è altamente conservata
nella capra.
2. I risultati ottenuti suggeriscono un ruolo del polimorfismo indel 602
nella modulazione della suscettibilità alla scrapie classica nella
capra, ipoteticamente attraverso un meccanismo post-trascrizionale
di regolazione dell’espressione genica mediato da microRNA.
3. Un meccanismo d’azione alternativo potrebbe essere il legame
differenziale delle sequenza 3’UTR a proteine regolatorie.
4. L’identificazione di un target genetico al di fuori del gene PRNP
potrebbe essere utile per migliorare futuri piano di selezione
genetica nella capra
GRAZIE !