lezione 4 strategie incremento di resistenza 5 12

Strategie biotec per l’incremento di
resistenza alle malattie
Come si difendono le piante dai patogeni?
Difese costitutive:
-barriere strutturali: es., cuticola, periderma, parete
cellulare
-metaboliti secondari tossici
Difese indotte:
- risposta locale: induzione di una serie di reazioni
metaboliche al sito di infezione mirate a bloccare
l’ingresso del patogeno
-risposta sistemica (Resistenza sistemica acquisita, SAR)
Strategie usate per produrre piante transgeniche
Strategia 1: interferenza diretta con la patogenicità o inibizione della
fisiologia del patogeno
Strategia 1a – difesa costitutiva (inserire geni codificanti proteine
antimicrobiche)
Strategia 1b –difesa indotta (è una variante della strategia 1a dove
le proteine antimicrobiche sono controllate da un promotore
inducibile)
Strategia 2: regolazione della naturale risposta di difesa indotta
Strategia 2a: Modifica del sistema di riconoscimento del patogeno
(es. geni R)
Strategia 2b: Modifica delle vie di regolazione a valle (es. SAR)
e fattori di trascrizione
Strategia 3: “Pathogen mimicry” o vaccinazione genetica o resistenza
indotta. Consiste nella manipolazione della pianta per indurre il
riconoscimento di uno specifico patogeno attraverso sequenze
derivate dal patogeno.
Collinge et al. Eur J Plant Pathol (2008) 121:217–231
I geni più comuni inseriti in piante coltivate e di cui si
stanno effettuando prove di campo negli USA
Collinge et al. Annu. Rev. Phytopathol. 2010. 48:269–91
Strategia 1a – constitutive defence
Resistenza agli insetti
Mais
resistente
alla piralide
tramite la
proteina Bt
Esempio di:
•Unica pianta transgenica coltivata in Europa
•Implementazione dell’espressione
Strategia 1a – constitutive defence
Strategia 1a – constitutive defence
Proteine PR
Families
PR-1
Type member
Tobacco PR-1a
Properties
antifungal
PR-2
Tobacco PR-2
b-1,3-glucanase
PR-3
Tobacco P, Q
chitinase type I,II, IV,V,VI,VII
PR-4
Tobacco 'R'
chitinase type I,II
PR-5
Tobacco S
thaumatin-like
PR-6
Tomato Inhibitor I
proteinase-inhibitor
PR-7
Tomato P69
endoproteinase
PR-8
Cucumber chitinase
chitinase type III
Tobacco 'lignin-forming
PR-9
peroxidase'
peroxidase
PR-10
Parsley 'PR1'
'ribonuclease-like'
PR-11
Tobacco 'class V' chitinase
chitinase, type I
PR-12
Radish Rs-AFP3
defensin
PR-13
Arabidopsis THI2.1
thionin
PR-14
Barley LTP4
lipid-transfer protein
PR-15
Barley OxOa (germin)
oxalate oxidase
PR-16
PR-17
Barley OxOLP
Tobacco PRp27
'oxalate oxidase-like'
unknown
Fusariosi della spiga: Fusarium head
Blight (FHB)
Malattia causata da Fusarium
graminearum e altre specie del genere
Fusarium spp.
Metodo biolistico – co-bombardamento pAHCBarChit +
pAHC25 in embrioni immaturi
pAHCBarChit: plasmide contenente un gene di chitinasi classe II (PR-3) di orzo
T nos: terminatore della nopalina sintasi di A. tumefaciens
uidA: gene per la β-glucuronidasi (GUS) di Escherichia coli
Bar: gene per la phosphinothricin acetyltransferase (PAT) di Streptomyces hygroscopicus
Selezione, rigenerazione e trasferimento in terreno delle piante T 0
Esperimenti di infezione
Frumento-Fusarium
graminearum
Esperimenti di infezione Frumento-Fusarium
graminearum
% infected spikelets
NS
T
Days post-infection
Strategia 1a– (Detossificazione delle tossine)
Phytotoxicity of eight mycotoxins associated with the fusariosis of wheat
spikelets.
Eudes, F.; Comeau, A.; Rioux, S.; Collin, J.
Canadian Journal of Plant Pathology 2000 Vol. 22 No. 3 pp. 286-292
The study of eight mycotoxins from Fusarium spp. at concentrations ranging
from 0 to 4.3 mg/L for deoxynivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol, nivalenol, and a
culture filtrate, and from 0 to 14.3 mg/L for T2 toxin, HT2 toxin,
diacetoxyscirpenol, and zearalenone, demonstrate that trichothecenes are
phytotoxic. The inhibition of coleoptile elongation by each trichothecene is well
described by a linear equation and these compounds show differences in
phytotoxicity. Deoxynivalenol and 3-acetyldeoxynivalenol are 2.5 times more
toxic than T2 toxin, 8 times more toxic than HT2 toxin, and 13 times more toxic
than diacetoxyscirpenol. The culture filtrate, which contains deoxynivalenol and
3-acetyldeoxynivalenol, is the most toxic to the coleoptile. A mixture of four
purified trichothecenes, deoxynivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol, T2 toxin, and
nivalenol, revealed differences in trichothecene susceptibility among 11 wheat
cultivars. Moreover, reduction of coleoptile elongation of these cultivars was
correlated with scab susceptibility (r=0.74; P=0.0068).
Strategia 2a – Detection of pathogen
Strategia 2a
Strategia 2b – Induced defence regulation
Infezione su
spiga con F.
graminearum
Trattmento
sulla foglia
Trattmento
sulla foglia
NH1 (NPR1 di riso) sotto il controllo del promotore Ubi1 di mais induce
una espressione costitutiva dei geni PR
Nuove Strategie
Nuove Strategie
PGIP
Strategia 3
Resistenza indotta
Resistenza ai virus
Virus del
mosaico del
tabacco
Resistance to tomato spotted
wilt virus in transgenic
tomatoes (left) due to the
insertion of a viral gene.
Control plants are on the
right. (Courtesy T. German)
T
C
Il controllo delle malattie virali è
difficile, in genere
si controllano gli organismi che ne
consentono la diffusione (es. afidi, ma
l’uso degli insetticidi ha un impatto
limitato nel controllo della diffusione
della malattia) o più efficacemente si
attuano controlli colturali (rimozione
delle piante malate o uso di varietà
resistenti/tolleranti)
Osservazione chiave: Protezione crociata
- 1972: l’inoculo di una pianta con un ceppo virale
non molto virulento di TMV si otteneva la
protezione contro una successiva infezione con un
ceppo virale molto virulento.
Quasi tutti i virus esprimono proteine dei seguenti tre tipi:
• Proteine di rivestimento (Coat proteins, CPs);
• Proteine di movimento (Movement proteins, MPs);
• Proteine per la replicazione
I meccanismi di difesa naturali delle piante sono
diretti verso questi target e verso il genoma virale.
La resistenza delle piante ai virus può essere divisa in:
• Resistenza mediata da proteine virali
• Resistenza mediata a livello di DNA/RNA
L’approccio transgenico da intraprendere dipende dal tipo di
virus da combattere:
• RNA virus
• DNA virus
• RT virus.
Virus ad RNA: Le prime piante transgeniche
Es. Virus del mosaico del tabacco (Tobacco mosaic virus,
TMV).
- 1972: prima osservazione: l’inoculo di una pianta con un
ceppo virale non molto virulento si otteneva la
protezione contro una successiva infezione con un
ceppo virale molto virulento. Protezione crociata
• Varietà di zucchine e papaya resistenti
a virus in commercio
Virus a DNA: Non ci sono piante coltivate in
commercio ma solo dati sperimentali contro i
geminivirus in pomodoro, cassava e mais.
Possibili meccanismi per la resistenza mediata da RNA
contro i virus a DNA:
1) Silenziamento dei trascritti di mRNA (PTGS)
2) Metilazione del DNA virale (inattivazione
trascrizionale, TGS)
RT virus (Reverse transcribing viruses): solo
resistenza incompleta (es. Rice tungro bacilliform
virus.
Solo riduzione del titolo virale esprimendo la CP e RNA
ripetuto invertito
Come funziona la resistenza indotta
nelle piante GM?
Sovraesprimendo nella pianta una proteina del virus
(in genere la proteina del capside) si induce un
processo noto come cosoppressione genica
In caso di infezione la cellula vegetale transgenica
“percepisce” che un gene è sovraespresso e risponde
bloccando l’espressione del transgene e virale
Strategia nota anche come Resistenza virale mediata
dalla proteina del capside
Silenziamento genico nelle piante
“Cosoppressione” (RNAi di un gene endogeno indotta da una insezione di
un transgene) originalmente descritta in una petunia transgenica in cui
desiderava sovraesprimere la calcone sintasi (CHS), un enzima per la
biosintesi delle antocianine (Jorgensen et al, Plant Cell 1990 2:279).
35S CHS cDNA
promotore
Processo che determina la downregulation di un gene
•a livello della trascrizione (TGS)(es.
trasposoni, geni retrovirali,
eterocromatica)
•o post-trascrizionale (PTGS)(dopo la
trascrizione di un gene)
Esistono due meccanismi correlati basati sull’RNA
che determinano il silenziamento genico nelle
piante :
1) RNA interference (RNAi): degradazione
dell’mRNA
2) Metilazione del DNA controllata dall’RNA (RNAdirected DNA Methylation, RdDM): soppressione
della trascrizione
Meccanismo generale dell’ RNAi
RNA a doppia elica
dicer ribonucleasi
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
Meccanismo generale dell’ RNAi
RNA a doppia elica
dicer ribonucleasi
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
Fattori scatenanti l’RNAi nelle piante
1) Infezione con un virus a RNA che contiene un segmento della
sequenza genica target
replication
dicer
2) Integrazione di un transgene ripetuto invertito fortemente trascritto
transcription
dicer
3) Trascrizione elevata di transgeni ripetuti non-invertiti
transcription
?
dicer
RNAi fornisce una difesa contro virus e sequenze trasponibili, ma si è
anche evoluto come meccanismo per produrre micro-RNAs (miRNAs) da
sequenze endogene che regolano l’espressione genica durante lo
sviluppo disturbando la stabilità o la traduzione dell’ mRNA target.
From: Lodish et al. “Molecular Cell Biology”
RNA a doppia elica o siRNAs scatenano la metilazione del DNA (RdDM)
RNA aberrante
priming
RdRP, etc.
ds RNA
dicer ribonuclease
siRNAs
RISC
Degradazione del trascritto
animazione