MICROSCOPIO OTTICO COMPOSTO

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MICROSCOPIA
IL MICROSCOPIO OTTICO
Il microscopio ottico composto, comunemente chiamato microscopio, è uno strumento che
permette di osservare oggetti non percettibili ad occhio nudo consentendone l’ingrandimento.
E’ costituito dalla combinazione di due sistemi di lenti convergenti: l’oculare (vicino all’occhio
dell’osservatore) e l’obiettivo (prossimo all’oggetto). Il campione da osservare viene posto davanti
all’obiettivo, che ne fornisce un’immagine reale, capovolta ed ingrandita. L’immagine viene poi
fatta cadere, a distanza opportuna, davanti all’oculare, che a sua volta dà un’altra immagine virtuale
ingrandita e capovolta rispetto all’originale. In pratica non vi sono solo due lenti, ma una
combinazione di più lenti che, oltre ad ingrandire l’immagine, corregge e riduce le aberrazioni.
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oculari
obiettivo
tavolino porta oggetti
vite micrometrica
vite macrometrica
condensatore con diaframma
vite regolatrice del tavolino
oggetto da osservare
lente obiettivo
immagine reale ingrandita e capovolta
lente oculare
immagine virtuale ingrandita e
capovolta rispetto all’originale
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Come si nota dalla fotografia obiettivo ed oculare sono inseriti all’estremità di un tubo metallico,
chiamato tubo ottico, appoggiato su un sostegno detto stativo, che regge anche il tavolino porta
oggetti dove viene posto il campione da osservare. La distanza tra obiettivo e campione si può
variare con un movimento a cremagliera del tubo, regolato da due viti , quella macrometrica per
spostamenti rapidi e quella micrometrica per la messa a fuoco. Una vite posta al di sotto del
tavolino consente lo spostamento del preparato da osservare. Sempre inferiormente al tavolino si
trova anche il condensatore, che fa convergere sull’oggetto la luce prodotta da una lampadina
incorporata nel microscopio. Il condensatore è munito di un diaframma regolabile, che varia
l’intensità luminosa . Vicino all’interruttore della lampadina c’è un variatore di tensione che
regola la quantità di luce emessa dalla lampadina.
Gli obiettivi, di cui è dotato un microscopio, sono di solito più di uno, per dare la possibilità
all’operatore di lavorare con ingrandimenti diversi. Per conoscere l’ingrandimento degli oculari e
degli obiettivi è sufficiente leggere il numero associato ad una x (unità di misura in diametri)
riportato su ciascuna lente.
L’ingrandimento totale del microscopio è il prodotto dell’ ingrandimento dell’oculare moltiplicato
per quello dell’obiettivo.
L’ingrandimento è solo una delle principali caratteristiche di un microscopio. Un’altra caratteristica
fondamentale è il potere di risoluzione ossia la capacità che possiede uno strumento di distinguere
due oggetti vicini. Il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di 0,2 µm, cioè non può
distinguere dettagli posti ad una distanza inferiore a 0,2 µm. Tale limite è determinato dal mezzo
che si usa per ingrandire l’immagine, che in questo caso è la luce (bianca), come indica la parola
“ottico”. Il potere di risoluzione è proporzionale alla lunghezza d’onda della luce.
Il microscopio ottico ha una risoluzione 1.000 volte più grande di quello dell’occhio umano che è di
circa 0,2 mm.
COME SI USA IL MICROSCOPIO
1. Mettere il vetrino sul tavolino porta oggetti e fissarlo con le apposite graffette; accendere la
luce.
2. Regolare la distanza interpupillare dei due oculari avvicinandoli o allontanandoli in modo da
osservare un unico campo luminoso.
3. Osservare con l’obiettivo più piccolo(4x). L’ utilizzo di questo obiettivo permette un campo
visivo più vasto e consente la selezione rapida delle zone meglio riuscite. La prima messa a
fuoco del campione viene fatta con la vite macrometrica, che avvicina il tavolino porta oggetti
all’obiettivo fino a che non si intravede l’immagine, quindi si completa la messa a fuoco
utilizzando la vite micrometrica.
4. Effettuare la regolazione della differenza tra l’acutezza visiva degli occhi. Chiudere l’occhio
sinistro e mettere il preparato a fuoco osservando con l’occhio destro utilizzando la vite
micrometrica. Chiudere poi l’occhio destro e, osservando con l’occhio sinistro, mettere a fuoco
utilizzando l’anello di rettifica del fuoco presente sull’oculare.
5. Aggiustare l’intensità della luminosità del campo usando il variatore di tensione, non usare il
diaframma
6. Regolare il diaframma, chiudendolo o aprendolo lentamente, fintanto che l’immagine non ha
raggiunto il contrasto ottimale. Questa operazione va fatta ogni volta che si cambia obiettivo.
7. Inserire gradualmente gli obiettivi ad ingrandimento
superiore
secondo l’esigenza
dell’osservazione. Quando dall’obiettivo 4x si passa agli obiettivi 10x e 40x il fuoco
sostanzialmente non cambia, perciò, per ottimizzare l’immagine , basterà usare la vite
micrometrica. Quando si mette a fuoco si possono osservare bene tutte le strutture presenti su un
piano; tutto ciò che si trova sotto o sopra questo piano è invisibile. Per vedere l’oggetto nella sua
tridimensionalità si deve muovere con piccoli spostamenti la vite micrometrica (fochettatura),
in modo da osservare i piani posti superiormente o inferiormente a quello di riferimento.
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8. Al termine del lavoro, riposizionare l’obiettivo 4x , spegnere la lampada e pulire il tavolino
porta oggetti.
PULIZIA DELLE LENTI
Per pulire gli oculari e gli obiettivi è necessario prima di tutto rimuovere la polvere con un
soffietto, quindi con un cotton fioc imbevuto di alcol al 70% si detergono le lenti con un movimento
a spirale.
TECNICA DI PREPARAZIONE DI UN VETRINO A FRESCO
Questa semplice tecnica consente la preparazione di vetrini senza l’utilizzo di coloranti. Nel caso
si voglia seguire questa metodica è necessario che il campione offra un contrasto sufficiente per
evidenziare le diverse parti. Ad esempio, cellule vegetali già naturalmente colorate, come quelle
che contengono i cloroplasti o i cromoplasti, non richiedono alcuna colorazione, anzi, se colorate,
l’immagine risulta poco chiara e di difficile interpretazione.
Materiali:
• Vetrino portaoggetti e coprioggetto
• Acqua distillata
• Strumenti per maneggiare e prelevare il campione da osservare: pinzette, forbici ecc..
• Campione da osservare
Procedimento:
• Preparare il campione da osservare facendo attenzione che sia di piccole dimensioni ( deve
essere più piccolo del coprioggetto) e sottile ( deve essere trasparente per fare passare la luce
del microscopio).
• Appoggiare sul vetrino il preparato cercando di distenderlo il più possibile ( il campione è
sottile e si piega facilmente)
• Lasciare cadere sul preparato 1 o 2 gocce di acqua distillata.
• Coprire il preparato con il coprioggetto: appoggiare un lato del coprioggetto sul vetrino,
quindi lasciarlo cadere lentamente. Questo accorgimento limita la formazione di bolle
d’aria, nel caso queste si formino ugualmente con le pinzette picchiettare leggermente sul
coprioggetto ed asciugare con la carta da filtro l’acqua che potrebbe fuoriuscire dal
coprioggetto
• Mettere il vetrino sul tavolino portaoggetti ed osservare.
TECNICA DI PREPARAZIONE DI UN VETRINO COLORATO
Questa tecnica, a differenza di quella precedente, fa uso del colorante ed è indicata in tutti quei casi
in cui il campione non possiede contrasto.
Il tipo di colorante va scelto in base alle diverse esigenze dell’osservazione.
Materiali:
• Vetrino portaoggetti e coprioggetto
• Acqua distillata
• Strumenti per maneggiare e prelevare il campione da osservare: pinzette, forbici ecc..
• Campione da osservare
• Colorante
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Procedimento:
• Preparare il campione da osservare facendo attenzione che sia di piccole dimensioni ( deve
essere più piccolo del coprioggetto) e sottile ( deve essere trasparente per fare passare la luce
del microscopio).
• Mettere il campione in un recipiente tipo lente a orologio o piastra ed aggiungere 1 o 2
gocce di colorante.
• Attendere il tempo di fissaggio che dipende dal tipo di colorante utilizzato. Il fissaggio è il
tempo che occorre al colorante per essere assorbito dal preparato.
• Lavare il campione in acqua di fonte per eliminare l’eccesso di colorante.
• Appoggiare sul vetrino il campione cercando di distenderlo il più possibile ( il campione è
sottile e si piega facilmente)
• Lasciare cadere sul campione 1 o 2 gocce di acqua distillata.
• Coprire il campione con il coprioggetto: appoggiare un lato del coprioggetto sul vetrino,
quindi lasciarlo cadere lentamente. Questo accorgimento limita la formazione di bolle
d’aria, nel caso queste si formino ugualmente, con le pinzette picchiettare leggermente sul
coprioggetto ed asciugare con la carta da filtro l’acqua che potrebbe fuoriuscire dal
coprioggetto.
• Mettere il vetrino sul tavolino portaoggetti ed osservare.
N.B. I vetrini preparati con questa tecnica non si possono conservare, nel caso si voglia mantenerli
per qualche ora si possono chiuderei bordi del coprioggetto con smalto trasparente per unghie.
COLORANTI
Per osservare semplici preparati vegetali si usano coloranti che per le loro caratteristiche chimiche
evidenziano selettivamente alcune parti cellulari.
Coloranti più utilizzati
Parti colorate
Eosina
Rosso neutro
Ematossilina
Blu di metilene
Blu di toluidina
Lugol
Carminio acetico
citoplasma
citoplasma
nucleo
nucleo e parete cellulare
nucleo
granuli di amido
cromosomi
IMMAGINI
Striscio ematico con granulocita neutrofilo.
Sezione trasversale di tessuto in cui sono
evidenti il canale di Havers, le lacune ossee ed i
canalicoli ossei.
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IL MICROSCOPIO ELETTRONICO
Nel microscopio elettronico la radiazione utilizzata per "illuminare" il campione da osservare è
costituita da un fascio di elettroni, fatto convergere per mezzo di lenti elettromagnetiche.
L'immagine ottenuta può essere visualizzata direttamente su un monitor o essere fissata
fotograficamente.
Il potere risolutivo è più di mille volte superiore a quello dei microscopi ottici. Con il microscopio
elettronico è possibile distinguere strutture che hanno dimensioni inferiori al nanometro (1
milionesimo di millimetro).
A seconda che l'immagine sia prodotta dagli elettroni trasmessi da un preparato ultrasottile, oppure
da quelli riflessi dalla superficie scabrosa di un campione, si distinguono il microscopio elettronico
in trasmissione (TEM) e quello a scansione (SEM).
IMMAGINI
Linfocita B infettato dal virus dell\rquote epatite
C (indicato dalle frecce) visto al TEM.
Cellula di colon umano infettata da un batterio
vista al SEM.