INVIO DEL MATERIALE E TRATTAMENTO DEL TESSUTO

INVIO DEL MATERIALE E TRATTAMENTO DEL TESSUTO
EMOLINFOPOIETICO
PREMESSA
Le procedure riportate di seguito fanno segnatamente riferimento al
trattamento del tessuto emolinfopoietico (linfonodo, milza, midollo osseo,
etc.). La maggior parte di esse, tuttavia, non ha alcun carattere di specificità,
corrispondendo ai passi tecnici ottimali che ogni Struttura di Anatomia
Patologica applica o dovrebbe applicare nella gestione del materiale bioptico,
indipendentemente dal tipo di patologia in esame.
Il raggiungimento del pieno successo nell’utilizzazione di tali procedure non
può prescindere dalla stretta collaborazione fra Anatomo-Patologo e
Clinico o Chirurgo. In particolare, Quest’ultimo deve avere completa
conoscenza di una serie di problematiche di ordine generale, che saranno
trattate sinteticamente nel prosieguo.
SCELTA DELL’APPROCCIO BIOPTICO
LINFOGHIANDOLE SUPERFICIALI
In linea di principio, è opportuno effettuare l’asportazione completa, con
rispetto – là dove possibile – della capsula.
Non altrettanto efficace si rivela la biopsia incisionale: essa, infatti,
frequentemente si associa a degenerazione filamentosa dei nuclei per
danneggiamento delle cellule nel corso del prelievo: ciò può rendere difficile
o, perfino, impossibile l’interpretazione del dettaglio citologico, con le
conseguenti difficoltà diagnostiche, che non dipendono dal Patologo.
Nel caso in cui si sospetti un’emopatia, assolutamente da proscrivere è
l’ago-aspirato: questo, infatti, oltre a non dare alcuna informazione
topografica, importante nella diagnostica emolinfopatologica, può addirittura
ingenerare false impressioni, causate dalla prevalente aspirazione di una
delle componenti cellulari del tessuto esaminato. Così, si spiegano le
diagnosi errate di linfoma diffuso a grandi cellule B, talora riscontrate in corso
di iperplasia follicolare e dovute all’aspirazione di soli centroblasti nel
contesto di un centro germinativo in fase secondaria di sviluppo. E’ vero che il
rischio di misinterpretazione potrebbe essere ridotto dall’avvio di una parte
del materiale aspirato allo studio citofluorimetrico, approccio, tuttavia, che
comporta costi di gestione piuttosto elevati. Appare, pertanto, difficile
giustificare perché si debba basare la diagnosi e, quindi, la terapia su di un
cito-aspirato, quando l’esame istopatologico dell’intera linfoghiandola è in
grado di fornire in tempi brevi una quantità molto più sostanziosa di
informazioni, consentendo anche di acquisire materiale che –
opportunamente conservato – può rappresentare uno strumento insostituibile
per l’attività di ricerca. Da ultimo, non è possibile sottacere un rischio
connesso con l’aspirazione: in un certo numero di casi, essa è seguita
dall’infarto del linfonodo per lesione dei vasi ematici da parte dell’ago. Se ciò
si verifica in un Paziente con una singola adenopatia, nel quale l’ago-aspirato
non ha prodotto la diagnosi, la successiva asportazione del linfonodo
infartuato non è di alcuna utilità. Di fatto, il caso rimane non concluso – non
certo per colpa del Patologo – ed il Paziente deve essere strettamente
seguito nel tempo, al fine di cogliere tempestivamente la comparsa di
eventuali nuove adenopatie: nel caso di una forma sistemica, ciò
comporterebbe un ritardo nell’inizio della terapia e potrebbe avere
implicazioni giudiziarie.
Sempre nel sospetto di un’emopatia, inopportuna appare la richiesta di
un esame estemporaneo. Infatti, quest’ultimo comportando il congelamento
del materiale causa una significativa alterazione del dettaglio citologico, che
ha fondamentale importanza nella diagnostica ematopatologica.
MASSE PROFONDE
Vale anche per queste la necessità di disporre di un’adeguata quantità di
materiale da esaminare, elemento che dovrebbe influenzare la scelta
dell’approccio strumentale più idoneo (laparotomia, laparoscopia, agobiopsia
eco/TAC-guidata, etc.). E’ chiaro, comunque, come in relazione alle
condizioni del Paziente, si debba di volta in volta ricercare il giusto
compromesso fra l’invasività e l’accuratezza dell’esame. Importante è
ricordare che per l’ago-aspirato valgono in prima istanza le considerazioni di
cui sopra. Per ciò che riguarda l’esame estemporaneo, questo
rappresenta soltanto il mezzo per stabilire la rappresentatività dell’area
nella quale si sta operando. Il tessuto prelevato per l’estemporanea da
una massa profonda non potrà, quindi, costituire l’unico campione
disponibile per la diagnosi: una volta definita in intraoperatoria l’idoneità del
campo, dovranno essere effettuate nuove prese da avviare alle procedure
routinarie.
INVIO DEL MATERIALE
Il materiale bioptico deve essere sempre accompagnato da esaurienti
notizie cliniche, le quali fanno parte integrante degli elementi richiesti per la
diagnosi, come previsto dalla Classificazione dell’Organizzazione Mondiale
della Sanità.
L’invio del campione va effettuato in maniera tempestiva, rispettando i
tempi concordati con l’Anatomo-Patologo in base alla modalità prescelta (a
fresco od in fissativo). In caso di invio in fissativo, se il campione tissutale non
corrisponde ad un’ago-biopsia ed il tempo che intercorre fra l’exeresi e la
consegna alla Struttura di Anatomia Patologica è di alcune ore, è necessario
che il Chirurgo esegua un primo sommario sezionamento, seguendo i
protocolli che sono riportati su alcuni Trattati (ad esempio il Rosai and
Ackerman’s Surgical Pathology, 9a Edizione, Mosby Editore) che possono
esserGli facilmente trasmessi dal Patologo.
Assolutamente da proscrivere, in quanto scorretta sotto il profilo
deontologico e possibile motivo di controversie giuridiche, è la
suddivisione del materiale bioptico fra due diverse Strutture di
Anatomia-Patologica.
LINEE GUIDA PER LA MANIPOLAZIONE DEI PRELIEVI CHIRURGICI
(con specifico riferimento al linfonodo)
Il tessuto può giungere alla Struttura di Anatomia Patologica a fresco/senza
fissativo od in fissativo. Essendo le procedure da seguire in queste
eventualità differenti, tali vie verranno descritte separatamente.
INVIO A FRESCO
Questa procedura è preferibile per l’ottimale conservazione degli antigeni e
degli acidi nucleici.
CONSEGNA
La consegna del prelievo all’Anatomia Patologica di riferimento deve essere
effettuata entro 30 minuti dall’asportazione chirurgica; laddove il rispetto dei
tempi di consegna non possa essere garantito, si sconsiglia di intraprendere
tale via.
La modalità consigliata per l’invio del materiale bioptico consiste
nell’avvolgere lo stesso in una garza imbevuta di soluzione fisiologica,
ponendo il tutto in un contenitore a tenuta; se il pezzo ha grandi dimensioni,
può essere ricoperto da molteplici garze imbevute dello stesso liquido.
CAMPIONAMENTO/FISSAZIONE
Il campione bioptico va sezionato subito dopo la consegna. Si raccomanda
di eseguire sezioni dello spessore massimo di 3-5 mm.
A questo punto, possono essere allestite 2 o più apposizioni; di queste, una
va asciugata all’aria e colorata con May-Grünwald-Giemsa, un’altra fissata
con cytofix e colorata con Papanicolau.
Se le dimensioni del pezzo lo consentono, si consiglia di procedere
effettuando prelievi (di dimensioni tali da non occupare l’intera superficie del
supporto impiegato per la criopreservazione o l’inclusione) da avviare a:
• criopreservazione
La procedura ottimale consiste nel porre sul fondo di un contenitore
CRYOMOLD STANDARD (modelli 25mm x 20mm x 5mm) un sottile strato di
O.C.T. Compound, sul quale va appoggiato il prelievo; quest’ultimo deve
essere poi completamente ricoperto con altro O.C.T. Compound, avendo
cura che il gel non fuoriesca dal contenitore. L’intero cryomold è posto a
congelare in azoto liquido per circa 1 minuto e, quindi, conservato in ultrafreezer a -80 °C. Tale approccio garantisce l’ottimale conservazione degli
acidi nucleici;
• fissazione ordinaria
Il fissativo di elezione è la formalina. Si raccomanda l’uso di formalina
tamponata al 10%. Quest’ultima viene realizzata, diluendo l’aldeide formica al
40%, commercialmente disponibile, in acqua distillata, in un rapporto di 1/10;
alla soluzione così prodotta viene aggiunto il tampone, seguendo
possibilmente la metodica di Lillie (allegato 1).
l tempo di fissazione ottimale è di 24 ore, superate le quali il prelievo può
essere conservato in alcool 70% fino al momento dell’inserimento nel
processatore automatico.
E’ vivamente consigliata la fissazione a temperatura ambiente (non in
inclusore).
Laddove la disponibilità di materiale lo consenta, una parte del tessuto può
essere fissata in B5 (allegato 2). In tale caso, ci si deve attenere ai seguenti
accorgimenti: a) il prelievo deve avere spessore massimo di 2 mm, b) il
tempo di fissazione ottimale è di 2.30-3.00 ore: tale tempistica va osservata
scrupolosamente, pena l’indurimento eccessivo del campione, con difficoltà di
taglio, c) dopo la fissazione, il pezzo va conservato in alcool 70% fino al
momento dell’inserimento nel processatore automatico, d) il B5 e la miscela
fissativa vanno preparate attenendosi alle istruzioni (allegato 2). Tale
approccio, che consente di avere il materiale bioptico in visione in tempi
molto rapidi e preserva ottimalmente diversi antigeni, non viene tuttavia
consigliato quale unica modalità di fissazione a causa della degradazione
degli acidi nucleici, che esso produce.
Un’alternativa al B5 è rappresentata dalla fissazione in liquido di Bouin
(allegato 3). Anche in questo caso, vanno eseguiti prelievi sottili, dato lo
scarso potere di penetrazione del fissativo, ed il tempo di esposizione deve
essere limitato a poche ore (18 al massimo), a causa dell’indurimento del
pezzo prodotto dal Bouin. Dopo la fissazione, il campione tissutale va lavato
in alcool 70%, fino alla quasi completa rimozione del colore giallo da questo
assunto durante la fissazione;
• ulteriori procedure applicabili alla biopsia a fresco per:
1) esami culturali/microbiologici
Appare indispensabile che l’invio del materiale alla Struttura di Anatomia
Patologica avvenga in maniera sterile e che le condizioni di sterilità siano
garantite durante la successiva manipolazione/sezionamento del tessuto da
parte del Patologo;
2) analisi citogenetiche di cariotipo
Come per tutte le procedure che coinvolgono il linfonodo a fresco è
necessario che trascorra un brevissimo lasso di tempo tra l’asportazione del
pezzo e la sua manipolazione che deve seguire le fasi seguenti:
a) preparazione della coltura (fase da eseguirsi in sterilità):
- mettere circa 2 ml di terreno di coltura (RPMI 1640) in una capsula di Petri
(grande) o in un mortaio e provvedere a mettervi una fettina od un pezzetto di
tessuto;
- sminuzzare il tessuto usando un bisturi monouso (se si usa la capsula di
Petri) od il pestello (se si usa il mortaio);
- procedere ad una conta automatizzata delle cellule;
- prendere una quantità di tessuto che contenga circa 60 milioni di cellule ed
aggiungere terreno di coltura fino a 10 ml. (laddove si riesca ad ottenere solo
una minore quantità di tessuto utilizzare solo 5 ml. di terreno di coltura);
- se possibile, allestire almeno 6 colture ed incubare a 37°C al 5% di CO2 per
tempi diversi (due per 24 ore, 2 per 48 ore, 2 per 72 ore);
b) arresto in metafase (fase da eseguirsi in sterilità):
- terminata la fase (a) aggiungere 40 microlitri di colcemid lasciando incubare
a 37°C al 5% di CO2 per tempi di 20 e 40 minuti per ogni coppia di colture;
c) fase di raccolta (“harvest”):
- centrifugare i campioni per 10 minuti a 1200 rpm;
- rimuovere il sopranatante;
- aggiungere 8 ml si soluzione ipotonica e “mixare”;
- lasciare riposare per 20 minuti a 37°C;
- “vortexare” aggiungendo 5 ml di fissativo;
- centrifugare per 10 minuti a 1200 rpm;
- rimuovere il sopranatante;
- aggiungere 5 ml di fissativo: i primi 2 ml goccia a goccia;
- centrifugare per 10 minuti a 1200 rpm;
- fare tre lavaggi con il fissativo;
d) allestimento vetrini:
- eliminare il sovranatante e risospendere il fondello con il fissativo;
- allestire tre vetrini per ogni campione;
- conservare il materiale rimasto a –20°C;
e) colorazione dei vetrini:
- colorare per ogni campione un vetrino con soluzione di Giemsa al 10% in
tampone per 3 minuti;
- mettere i restanti due vetrini in termostato a -60°C da 1 a 3 giorni e poi
colorali mediante bandeggio G;
3) conservazione di cellule vitali selezionate
Come per tutte le procedure che coinvolgono il linfonodo a fresco è
necessario che trascorra un brevissimo lasso di tempo tra l’asportazione del
pezzo e la sua manipolazione che deve seguire le fasi seguenti:
a) trattamento del campione:
- mettere circa 2 ml di terreno di coltura (RPMI 1640) in una capsula di Petri
(grande) o in un mortaio e provvedere a mettervi una fettina od un pezzetto di
tessuto;
- sminuzzare il tessuto usando un bisturi monouso (se si usa la capsula di
Petri) od il pestello (se si usa il mortaio);
b) separazione delle cellule:
- mediante citocentrifugazione per densità, con isolamento dello strato
desiderato (procedura opzionale, che può precedere la separazione con
biglie);
- mediante l’uso di biglie magnetiche (con conferma mediante FACS analisi
della purezza delle cellule isolate);
- conteggio delle cellule isolate;
- criopreservazione in aliquote definite delle cellule isolate (4-8 milioni), poste
in 60% di siero bovino fetale, 30% di terreno coltura (RPMI 1640) e 10% di
DMSO; la criopreservazione avviene a -80°C; a distanza di 24-48 ore, le
aliquote sono trasferite in Azoto liquido, ove vengono conservate fino al
momento dell’uso.
INVIO IN FISSATIVO
Quale fissativo si intende generalmente la formalina (con le specifiche di cui
sopra).
CONSEGNA
La consegna del campione bioptico all’Anatomia Patologica di riferimento in
un contenitore a tenuta deve essere effettuata entro la stessa giornata
lavorativa rispetto all’asportazione chirurgica. Laddove, per motivi
organizzativi delle sale operatorie e/o dei servizi di anatomia patologica, tale
modalità non possa essere rispettata, si raccomandano accordi preventivi
con i Colleghi Chirurghi, affinché procedano al parziale sezionamento del
campione, secondo le indicazioni fornite dal Patologo (vedi sopra), in modo
da evitare che le aree più profonde non raggiunte dalla formalina (che ha una
capacità di penetrazione di 4 mm in 16 ore) vadano incontro a fenomeni
autolitici.
Il rapporto volumetrico tra il campione bioptico ed il fissativo deve essere di
circa 1/20.
CAMPIONAMENTO
Il campionamento del prelievo va eseguito preferibilmente entro la giornata di
consegna: laddove ciò contrasti con l’organizzazione del Servizio, si
raccomanda comunque la valutazione macroscopica del materiale da
campionare e l’esecuzione degli atti necessari a garantire l’omogenea
fissazione (tagli di ampie masse, aperture di organi cavi giunti chiusi etc).
Si raccomandano prelievi dello spessore di 3-5 mm e di non eccessiva
ampiezza (nello specifico evitare che il prelievo occupi l’intera superficie
dell’unicassetta, pena il rischio che, nel corso delle operazioni di inclusione, il
campione si imbarchi, rendendo poi difficile la completa scopertura della sua
superficie di taglio, al momento del sezionamento al microtomo).
FISSAZIONE:
Dopo la campionatura, in relazione allo stato macroscopico di fissazione del
pezzo, il campione può essere ancora conservato in formalina o posto in
alcool 70%.
In ogni caso, vanno rispettate le indicazioni sopra riportate: a) uso di
formalina tamponata al 10%, partendo dall’aldeide formica con
concentrazione al 40%, commercialmente disponibile, ed utilizzando
possibilmente il tampone previsto dalla metodica di Lillie (allegato 1), b)
tempo di fissazione medio di 24 ore a temperatura ambiente (non in
inclusore).
Laddove vi sia la necessità di avere in visione dei preparati in tempi rapidi,
incompatibili con le convenzionali 24 ore di fissazione in formalina, si può
procedere ad una post-fissazione in B5 per 2.30 – 3.00, in modo da avviare
la processazione del pezzo in giornata. Per le modalità di preparazione del
B5 e della miscela fissativa si veda l’allegato 2. Il liquido di Bouin può
rappresentare un’alternativa al B5 (allegato 3).
LINEE GUIDA PER LA MANIPOLAZIONE DELLE AGOBIOPSIE (non
osteomidollari) E DELLE BIOPSIE ENDOSCOPICHE
Tali prelievi giungono usualmente all’Anatomia Patologica già in fissativo.
Il fissativo di elezione è la formalina (da usare tamponata al 10%, partendo
dall’aldeide formica a concentrazione 40%, commercialmente disponibile; per
il tamponamento secondo Lillie, si veda l’allegato 1).
Il tempo di fissazione raccomandato va dalle 12 alle 24 ore.
Dopo la fissazione, la biopsia va posta in alcool 70% fino al momento
dell’inserimento nel processatore automatico.
LINEE GUIDA PER LA MANIPOLAZIONE DELLE AGOBIOPSIE
OSTEOMIDOLLARI
FISSAZIONE
Usualmente le biopsie osteo-midollari giungono al Servizio di Anatomia
Patologica in fissativo. Per quest’ultimo, si prospettano le seguenti
alternative:
fissazione in B5
Impone molta attenzione nel rispetto dei tempi di fissazione, pena
l’indurimento eccessivo del campione con importanti difficoltà di taglio.
Tali tempi corrispondono a 2.00-2.30 ore per soluzioni preparate presso
l’Ospedale (vedi anche allegato 2 per la preparazione del B5 e della miscela
fissativa) ed a 1.30 ore per soluzioni commercialmente disponibili (tipo
BIOPTICA-Mielodec reagente A).
GIUDIZIO: ottimale per rapidità e conservazione sia citologica che antigenica;
non consente studi molecolari. Presuppone collaboratività con il Personale
tecnico-infermieristico, che assiste all’esecuzione della biopsia;
fissazione in formalina
Usare formalina tamponata al 10% (vedi sopra + allegato 1); tempo di
fissazione 12-24 ore; dopo la fissazione porre la biopsia in alcool 70% fino al
momento dell’inserimento nel processatore automatico.
GIUDIZIO: non ottimale per la conservazione del dettaglio citologico; analoga
al B5 per la conservazione antigenica; consente studi molecolari;
CONSERVAZIONE
Dopo la fissazione, la biopsia va posta in alcool 70% per almeno 20 minuti. Si
segnala come l’alcool 70% costituisca il mezzo nel quale la biopsia
osteomidollare fissata può essere conservata anche per tempi lunghi, prima
di essere sottoposta alla successiva fase di decalcificazione. Ciò permette
anche la spedizione del campione fissato in sedi distanti: il dettaglio citologico
ed il profilo antigenico rimangono sostanzialmente immodificati, specie nel
caso in cui sia stato usato il B5 quale fissativo.
DECALCIFICAZIONE
Immergere la biopsia in liquido decalcificante, verificando che questa non
tenda a galleggiare (fenomeno possibile nei casi a ricca componente
adiposa).
Rispettare il rapporto ottimale tra il volume del campione e quello del
decalcificante (almeno 1:20).
Il tempo di decalcificazione varia in base al tipo di liquido decalcificante
utilizzato:
a) per soluzioni preparate presso il Laboratorio secondo le
indicazioni dell’allegato 4: 180 minuti;
b) per la soluzione BIOPTICA-Mielodec Reagente B: 90-120 minuti.
Terminata la decalcificazione, la biopsia viene nuovamente posta in alcool
70% fino all’inizio della processazione.
ALLEGATI
Allegato 1: FORMALINA TAMPONATA SECONDO LILLIE
Componenti:
Aldeide formica 40% 100ml
Acqua distillata
900ml
Na2H2PO4H2O
4g
Na2HPO4
6.5g
La confezione di aldeide formica va conservata al buio, a temperatura
ambiente
Allegato 2: B5
PREPARAZIONE DEL B5 (SOLUZIONE MADRE)
Componenti:
Mercurio cloruro ico
Sodio acetato anidro
Acqua distillata
6g
1.25g
90 ml
Preparazione:
- far bollire per 45’ una quantità di acqua distillata sufficiente per la
soluzione (90 ml) e per il lavaggio della vetreria di lavoro;
- dopo 45’ di ebollizione, misurare 90 ml di acqua distillata e sciogliervi, con
agitazione, prima il mercurio cloruro ico e poi il sodio acetato anidro;
- filtrare la soluzione su carta.
Il B5 va conservato in bottiglie di vetro scuro con l’indicazione della data
di preparazione. Sostituire la soluzione madre almeno una volta alla
settimana.
PREPARAZIONE DEL B5 (SOLUZIONE DI LAVORO)
Al momento della biopsia miscelare 9 ml del B5 (soluzione madre) e 1 ml
di aldeide formica al 40% (la confezione di aldeide formica va conservata al
buio, a temperatura ambiente); il frustolo agobioptico va immerso in tale
miscela e da questo momento va calcolato il tempo di fissazione.
Allegato 3: PREPARAZIONE DEL LIQUIDO DI BOUIN
- Mescolare 75 ml di soluzione satura di acido picrico con 25 ml di formalina
madre (soluzione satura di aldeide formica al 40%);
- Aggiungere 5 ml di acido acetico glaciale.
Allegato 4: PREPARAZIONE DEL DECALCIFICANTE
- Portare 1 litro di acqua distillata ad ebollizione;
- sciogliere a caldo 37,22g di sale bisodico dell’acido etilen-diamino-tetraacetico (EDTA);
- raffreddare a 40°C ed aggiungere 70 ml di HCL concentrato;
- lasciar riposare una notte e filtrare.
PROCESSAZIONE DEL TESSUTO
Una volta terminata la fase di fissazione, i prelievi vanno posti nel
processatore automatico od inclusore.
Relativamente a questa fase, si raccomandano i seguenti accorgimenti:
a) evitare la fissazione a temperatura;
b) garantire tempi di disidratazione, chiarificazione ed impregnazione in
paraffina sufficienti (almeno 45 minuti per stazione);
c) applicare un’ottimale sequenza di reagenti [ad esempio: alcool 70, alcool
80, alcool 90, alcool 95, alcool 100 (x3), diafanizzante (x3), paraffina con
punto di fusione a 56°C, addittivata con polimeri (x4)];
d) garantire la frequente pulizia della macchina ed il ricambio dei vari reagenti
(in particolare, scalando possibilmente ogni giorno l’ultimo degli alcool, dei
diafanizzanti e delle paraffine).
INCLUSIONE
Le unicassette, prelevate dal processatore automatico, vengono poste nella
camera calda della centralina d’inclusione ed aperte una alla volta. Il
procedimento di inclusione segue modalità standard.
Si raccomanda che temperatura della paraffina rimanga compresa tra 56° e
57°C, in ogni fase del processo di inclusione (ivi compresa quella di
dispensazione).
SEZIONAMENTO
Il procedimento di sezionamento segue modalità standard. Si raccomandano
sezioni di spessore non superiore a 3 micron (monostrato di cellule)
rappresentative dell’intera superficie di sezione del campione.
RACCOLTA DELLE SEZIONI
Il procedimento di raccolta delle sezioni segue modalità standard.
Si raccomanda che la temperatura del bagno termostatico non superi i 3740°C (necessari controlli sistematici), allo scopo di fare distendere le sezioni
in maniera ottimale, eliminando così eventuali ripiegature.
I vetrini con le sezioni raccolte vanno posizionati in apposite griglie portavetrini e lasciate asciugare in stufette a 37°C per un tempo massimo di 60
minuti.
Se per l’indagine immunoistochimica si utilizza un coloratore automatico, si
raccomanda di utilizzare vetrini a carica elettrica per la raccolta delle
sezioni; se l’immunocoloratore lavora per “capillarità di risalita del reagente” è
opportuno che nella fase di raccolta, la sezione venga posizionata nella metà
inferiore del vetrino, in modo che possa essere raggiunta agilmente dai
reagenti.
Le sezioni destinate alla Biologia Molecolare vanno tagliate con uno spessore
di 10 micron, raccolte in contenitori “eppendorf” o su vetrini (opzione definita
dal Personale addetto all’esecuzione dell’indagine molecolare).
COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE
Le colorazioni da eseguire routinariamente per la diagnostica
ematopatologica sono la Ematossilina–Eosina, il Giemsa l’impregnazione
argentica secondo Gomori (quest’ultima almeno per le biopsie osteomidollari) .
Colorazioni aggiuntive utili ai fini diagnostici sono: l’acido Periodico di Schiff
(PAS), il Pearls, lo Ziehl-Neelsen ed il Rosso Congo.
Tutte le sezioni devono venire sottoposte al processo di sparaffinatura e reidratazione del tessuto. Nell’esecuzione manuale, tale processo prevede:
Diafanizzante/Histoclear
alcool etilico 100%:
alcool etilico 95°
alcool etilico 80°
alcool etilico 70°
alcool etilico 50°
acqua distillata
2 passaggi di 20 minuti ciascuno;
3 passaggi;
1 passaggio (alcuni risciacqui);
1 passaggio (alcuni risciacqui);
1 passaggio (alcuni risciacqui);
1 passaggio (alcuni risciacqui);
1 passaggio (alcuni risciacqui).
Qualora le colorazioni vengano effettuate in maniera automatizzata, i tempi di
sparaffinatura e di re-idratazione sono indicati nella specifica procedura (vedi
sotto).
Le colorazioni possono venire eseguite, sia manualmente (evenienza
necessaria per il Giemsa) che in coloratore automatico, con possibili
modifiche dei tempi previsti per le singole fasi, per cui si daranno prima
indicazioni sulle modalità di colorazione manuale e poi di quelle in
automatico.
COLORAZIONI MANUALI
Colorazione Giemsa (secondo Lennert)
1° soluzione di Giemsa (preferibilmente Merck) diluita al 50% con acqua
distillata: 5 minuti
2° Soluzione acida (10 gocce di acido acetico puro in 200 ml di acqua
distillata): 2-3 passaggi (questo passaggio non si esegue per le sezioni
ottenute da biopsie osteomidollari)
3° Alcool etilico 95% : alcuni passaggi
4° Fase di “differenziazione” : controllo al microscopio ottico dell’intensità di
colorazione per valutare l’eventuale necessità di ulteriori passaggi in alcool
95%
5° Alcool isopropilico
6° Diafanizzante/Histoclear: in tale liquido i vetrini possono permanere a
lungo. Di regola vi permangono sino alla fase successiva di montaggio
In caso di estemporanea: i passaggi osservano la stessa sequenza, ma
vengono accorciati i tempi (Giemsa 1 minuto circa, rapido passaggio in acqua
acida, rapido passaggio in alcool 95%, rapido passaggio in alcool isopropilico
e lavaggio breve in Histoclear).
Nel caso in cui il tessuto sia stato fissato in liquido di Bouin, oltre ai prolungati
lavaggi del pezzo in alcool 70% prima della processazione, è necessario
effettuare lavaggi prolungati delle sezioni, sia in alcool 70% (durante la fase
di reidratazione) che in acqua (a reidratazione terminata), prima di procedere
alla colorazione in Giemsa.
Ematossilina Eosina
Ematossilina:
Acqua di fonte:
Eosina G:
Acqua distillata:
Alcool 70% :
Alcool 80% :
Alcool 95% :
Alcool 100% :
Diafanizzante/Histoclear:
immersione per 5 minuti
lavaggio rapido (10 secondi)
immersione per 5 minuti
lavaggio rapido (10 secondi)
lavaggio rapido (5 secondi)
lavaggio rapido (5 secondi)
lavaggio rapido (5 secondi)
lavaggio con 3 cambi (5-10 secondi ciascuno)
lavaggio con 3 cambi (5-10 secondi ciascuno)
In caso di estemporanea: i passaggi osservano la stessa sequenza, ma
vengono accorciati i tempi [Ematossilina 1 minuto, rapido passaggio in acqua
di fonte, Eosina 1 minuto, rapidi lavaggi in acqua distillata, rapidi lavaggi nella
scala crescente degli alcooli (100%, 95%, 80%, 70%), lavaggio breve in
Histoclear]
Impregnazione argentica secondo Gomori:
1.
Permanganato di potassio allo 0,5%. acidificato con acido solforico al
3%
2.
Lavaggio in acqua distillata
3.
Acido ossalico al 5% (lasciare le sezioni in soluzione fino a
schiarimento)
4.
Lavaggio in acqua distillata
5.
Soluzione di ferro ammonio solfato-ico al 2%
6.
Lavaggio in acqua distillata
7.
Nitrato d’argento filtrato
8.
Soluzione di formalina al 10% (togliere le sezioni non appena le stesse
si scuriscono)
9.
Lavaggio in acqua distillata
10. Tiosolfato di sodio al 5%
11. Lavaggio in acqua distillata
12. Alcool 70%
13. Alcool 80%
14. Alcool 95%
15. Alcool 100%:
3 passaggi
16. Diafanizzante/Histoclear:
3 passaggi
Modalità di preparazione della soluzione di argento ammoniacale:
In 10 cc di soluzione acquosa di nitrato di argento al 10% aggiungere goccia
a goccia ammoniaca concentrata, fino a scomparsa del precipitato.
Aggiungere quindi 10 cc di idrossido di sodio al 3%: tale aggiunta induce la
formazione di un precipitato nero. Aggiungere lentamente, goccia a goccia
dell’ammoniaca, fino a che la soluzione non diventa limpida ed incolore. A
questo punto si aggiungono 100 cc di acqua distillata. La soluzione così
ottenuta va conservata in un contenitore di vetro scuro a +4°C.
ACIDO PERIODICO DI SCHIFF (PAS):
1. Acido periodico all’1%:
10 minuti
2. Lavaggio in acqua distillata
3. Reattivo di Schiff:
20 minuti
4. Lavaggio in acqua di fonte
5. Contrasto con emallume
6. Lavaggio in acqua di fonte
7. Alcool 70%
8. Alcool 80%
9. Alcool 95%
10. Alcool 100%:
3 passaggi
11. Diafanizzante/Histoclear:
2 passaggi
PAS DOPO DIASTASI:
1. Ricoprire la sezione con una soluzione di alfa-amilasi allo 0,1% per 15
minuti.
2. Lavaggio in acqua distillata
3. procedere come per il PAS (vedi sopra)
ZIEHL NEELSEN
1. Fucsina pura filtrata: 5 minuti, fiammeggiando e facendo attenzione a non
fare asciugare le sezioni
2. Lavaggio in acqua distillata
3. Acido solforico 20%
4. Lavaggio in acqua distillata
5. Acido solforico 20%
6. Lavaggio in acqua distillata
7. Acido solforico 20%
8. Lavaggio in acqua distillata
9. Alcool 95%
10. Lavaggio in acqua distillata
11. Contrasto con blu di metilene
12. Alcool 70%
13. Alcool 80%
14. Alcool 95%
15. Alcool 100%: 3 passaggi
16. Diafanizzante/Histoclear: 3 passaggi
COLORAZIONI AUTOMATIZZATE
Ematossilina Eosina:
Diafanizzante/Histoclear
Diafanizzante/Histoclear
Alcool 100%
Alcool 95%
Alcool 80%
Alcool 70%
Alcool 50%
Acqua corrente
Ematossilina di Gill
Acqua corrente
Eosina
10 minuti
10 minuti
25 minuti
25 minuti
25 minuti
25 minuti
25 minuti
30 minuti
5 minuti
10 minuti
3 minuti
Acqua corrente
Alcool 70%
Alcool 80%
Alcool 95%
Alcool 100%
Diafanizzante/Histoclear
Diafanizzante/Histoclear
Impregnazione Argentica:
Diafanizzante/Histoclear
Diafanizzante/Histoclear
Alcool 100%
Alcool 95%
Alcool 80%
Alcool 70%
Alcool 50%
Acqua corrente
Permanganato
Acqua corrente
Acido Ossalico
Acqua corrente
Argento Nitrato
Acqua
Formalina
Acqua
Sodio Tiosolfato
Acqua
Alcool 70%
Alcool 80
Alcool 95%
Alcool 100%
Diafanizzante/Histoclear
Diafanizzante/Histoclear
15 minuti
10 minuti
10 minuti
10 minuti
10 minuti
1 minuto
tempo indefinito; in base alla
contingenza d’uso
15 minuti
15 minuti
15 minuti
15 minuti
15 minuti
15 minuti
15 minuti
20 minuti
1 minuto
20 minuti
1 minuto
20 minuto
1 minuto
20 minuti
40 minuti
20 minuti
1 minuto
20 minuti
15 minuti
15 minuti
15 minuti
15 minuti
1 minuto
tempo indefinito; in base alla
contingenza d’uso
MONTAGGIO
Il montaggio dei vetrini può essere eseguito a mano o tramite un montavetrini
automatico. Il montante è rappresentato dalla gelatina Eukitt.