procedura diagnostica delle infezioni su protesi articolari

AZIENDA OSPEDALIERA DI COSENZA
UOC MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA
Direttore dr. Cristina Giraldi
PROCEDURA DIAGNOSTICA DELLE INFEZIONI SU PROTESI ARTICOLARI
Elaborazione
Gruppo di lavoro
Dott. P. Cavalcanti
Dott. M.A.Filia
Dott. D.Perugini
Dott. S.Dodaro
Sig. B.Casazzone
Sig. C.Gaccione
Sig. P.A.Pingitore
Sig. L.Nudo
Dott. F.Togo
Dott. G.Cipparrone
Sig. M.Coschignano
Dott. F.Cesario
Dott. F.Luciani
Verifica
Verifica clinica:
Dott. F. Cesario
Dott. C. Giraldi
Dott. F. Togo
Dott. MD Vantaggiato
Direttore FF M.Infettive
Direttore UOC Microbiologia e Virologia
Direttore UOC Ortopedia
SSD Risk Management
Verifica Metodologica:
Dott.ssa M. Loizzo
S.S. Qualità ed Accreditamento
Approvazione
Giorno 04.03.2013
Prot.059 AO CS
Direttore Sanitario PU Cosenza
Direttore CIO
Dott. O. Perfetti
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PROCEDURA DIAGNOSTICA DELLE INFEZIONI SU PROTESI ARTICOLARI
Razionale
L’infezione su protesi articolare rappresenta una grave complicanza in chirurgia protesica ortopedica e richiede una accurata diagnosi microbiologica per assicurare la
corretta gestione clinica dell’evento infettivo che differisce sensibilmente rispetto alla gestione del fallimento asettico. Il tasso di infezione per le protesi del ginocchio è
dello 0.8-1,9%, mentre per le protesi totali d’anca è dello 0.3-1.7% [Del Pozo 2009].
Solo recentemente la definizione di infezione protesica ha trovato un consenso grazie alla definizione di criteri specifici, tra i quali uno è strettamente microbiologico:
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“isolamento del medesimo microrganismo da due o più colture di aspirato articolare o tessuti periprotesici e/o isolamento del microrganismo in carica significativa dal
sonicato della protesi”.
Per soddisfare questo requisito il microbiologo deve disporre di campioni multipli da sottoporre ad indagine microbiologica, prelevati da zone definite con tecniche
idonee a prevenire la contaminazione crociata ed in assenza di terapia/profilassi antibiotica per un adeguato periodo di tempo.
L’applicazione dei nuovi criteri diagnostici, insieme all’attiva collaborazione di un gruppo multidisciplinare composto da ortopedico, infettivologo e microbiologo sono i
requisiti essenziali per ottenere un aumento significativo delle probabilità di eradicazione dell’infezione.
DEFINIZIONE DI INFEZIONE DELLA PROTESI ARTICOLARE
La definizione di infezione periprotesica prevede il riscontro di almeno uno dei seguenti criteri:
presenza di un tragitto fistoloso comunicante con la protesi e/o la cavità articolare,
elevato numero di leucociti nel liquido articolare (≥ 1.7 x 109/L con ≥ 65% neutrofili) [Trampuz 2004,.
raccolta purulenta nello spazio periprotesico,
isolamento dello stesso microrganismo da due o più colture di liquido articolare o biopsie di tessuto periprotesico,
isolamento di microrganismi in carica significativa dal sonicato della componente protesica.
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infiammazione acuta dei tessuti periprotesici all’esame istologico (≥1 - ≥10 polimorfonucleati neutrofili per campo ad alto ingrandimento (600-400X)
(esclusi i 3 mesi postoperatori e le malattie infiammatorie articolari),
CLASSIFICAZIONE DELLE INFEZIONI PROTESICHE
Le infezioni protesiche possono essere classificate in base al tempo di insorgenza dei sintomi dopo l’impianto in:
Infezioni precoci (early infections) con tempo di insorgenza < 3 mesi. Vengono acquisite durante l’intervento o nei 2-4 giorni successivi; possono
essere anche di origine ematogena. Sono causate da microrganismi ad alta virulenza (S. aureus, bacilli gram negativi).
Infezioni ritardate (late infections) con tempo di insorgenza tra 3 e 24 mesi. Vengono acquisite durante l’intervento e sono causate da microrganismi
a bassa virulenza (stafilococchi coagulasi negativi o Propionibacterium acnes).
Infezioni tardive (very late) (>24 mesi) causate prevalentemente da disseminazione ematogena da siti di infezione remoti.
Una diagnostica microbiologica corretta e tempestiva nelle infezioni precoci (< 4 settimane) e nelle infezioni tardive precocemente diagnosticate, può rendere
possibile un approccio conservativo della protesi poiché i microrganismi non sono ancora organizzati in biofilm. Diversamente le infezioni ritardate e le diagnosi non
tempestive (> 4 settimane) di infezioni precoci e tardive implicano la strutturazione e maturazione del biofilm microbico con necessità di rimozione della protesi.
MICRORGANISMI ASSOCIATI A INFEZIONE DELLA PROTESI ARTICOLARE
I microrganismi comunemente associati a infezione della protesi articolare sono riportati in Tabella 1. Gli stafilococchi sono i microrganismi isolati più
frequentemente sia nelle infezioni precoci, sia nelle ritardate che nelle tardive; sul totale prevalgono gli Stafilococchi coagulasi negativi (30-41%) seguiti da S. aureus
(12-39%) [Moran 2010, Trampuz 2005]. Streptococchi, enterococchi e difteroidi vengono isolati circa nel 10% dei casi ciascuno; i batteri Gram-negativi in circa 8% dei casi
[Moran 2010].
Tra i batteri anaerobi Propionibacterium acnes è il microrganismo con maggior frequenza di isolamento. Il 10-12% delle infezioni sono sostenute da più
di un microrganismo [Trampuz 2005]. Nelle infezioni di origine ematogena S. aureus ha un ruolo dominante, seguito da streptococcacee e batteri gram negativi
[Stefansdottir 2009]; Stafilococchi coagulasi negativi vengono comunque isolati in un terzo di esse.
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Microrganismi
Frequenza%
Stafilococchi coagulasi negativi
30-41
Staphylococcus aureus
12-39
Streptococchi
9-10
Enterococchi
3-10
Bacilli gram negativi
3-8
Anaerobi
2-4
Polimicrobiche
10-12
Sconosciuto
10-11
Tabella 1: microrganismi isolati nelle infezioni della protesi articolare [Trampuz, 2005, Stefansdottir 2009, Moran 2010]
I microrganismi che si organizzano in biofilm sulle superfici protesiche presentano caratteristiche particolari con implicazioni rilevanti nella diagnosi e nella terapia:
diversità genetica: si può esprimere in sottopopolazioni con colonie piccole a lenta crescita, di difficile identificazione da parte del laboratorio. Sul versante
clinico la crescita lenta aumenta il rischio di fallimento terapeutico e giustifica la somministrazione prolungata di antibiotici.
produzione di matrice polisaccaridica extracellulare: crea un microambiente dove la comunicazione tra cellule è facilitata, la persistenza dei microrganismi
favorita, la fagocitosi inibita. La terapia antibiotica va prolungata e deve includere rifampicina.
aderenza dei microrganismi alle superfici protesiche: riduce la possibilità di isolamento dei microrganismi dal liquido articolare. Ai fini diagnostici sono
necessari campioni protesici e tissutali.
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DIAGNOSI MICROBIOLOGICA
La coltura e l’isolamento del microrganismo infettante da campioni di tessuto periprotesico è tuttora il gold standard per la diagnosi di infezione della protesi
articolare.
Fase pre-analitica
Modalità di raccolta dell’aspirato articolare
L’aspirazione richiede asepsi e preferibilmente dovrebbe essere eseguita in sala operatoria mediante aspirazione articolare percutanea o comunque a capsula
articolare chiusa se eseguita durante l’intervento di revisione. Inoculare aliquote >0,5ml in fiasche da emocoltura per microrganismi aerobi e anaerobi e trasferire
l’eventuale rimanente in contenitore sterile. L’utilizzo di brodi di arricchimento è importante perché:
nelle forme croniche il numero dei microrganismi liberi (planctonici) può essere ridotto e la sensibilità colturale dell’aspirato articolare può quindi risultare
scarsa.
favorisce lo sviluppo di microrganismi a vitalità ridotta a seguito di pregressi trattamenti antibiotici e/o per le caratteristiche metaboliche dei microrganismi
sessili.
Modalità di raccolta del materiale da fistola o raccolta non secernente
Utilizzare n.2 tamponi sottili con asta metallica
Dopo disinfezione accurata della cute introdurre il primo tampone nel tragitto fistoloso e prelevare il materiale sospetto.
Ripetere il prelievo con il secondo tampone
Modalità di raccolta del materiale da fistola o raccolta secernente
Dopo disinfezione accurata della cute prelevare il materiale siringa sterile.
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Il contenuto della siringa può essere inoculato direttamente nei terreni per emocoltura (batteri aerobi, anaerobi e miceti) lasciando una aliquota nella stessa siringa
utilizzata per il prelievo.
Modalità di raccolta dei tessuti periprotesici
Il prelievo di campioni bioptici multipli è indispensabile al fine di aumentare la sensibilità dei metodi colturali e distinguere i microrganismi contaminanti dai
patogeni. Ogni singola biopsia di tessuto periprotesico va prelevata con strumentazione separata ed inserita in un contenitore dedicato, per prevenire la
contaminazione crociata di tutti i campioni da sottoporre all’esame colturale. Prelevare un numero ≥3 di biopsie periprotesiche, includendo un campione
rappresentativo della interfaccia protesi osso e due della capsula articolare. Qualora venga evidenziata una zona con infezione manifesta prelevare i tessuti
interessati. Aggiungere nel contenitore soluzione fisiologica sterile fino al ricoprimento della biopsia. Inviare rapidamente al laboratorio per colture in aerobiosi e
anaerobiosi. Nei medesimi punti prelevare un numero equivalente di biopsie per la valutazione dello stato infiammatorio mediante esame istologico.
Modalità di raccolta delle componenti protesiche
Porre ogni singola componente protesica in un contenitore rigido, sterile, a tenuta, di idonee dimensioni e adatto alla procedura di sonicazione. Ricoprire la
componente per almeno il 90 % del suo volume con soluzione di Ringer o soluzione fisiologica sterile.
Trasporto e conservazione
I campioni devono essere inviati al laboratorio nel minor tempo possibile e, possibilmente, entro lo stesso giorno di prelievo. Per tempi superiori conservare i
materiali a 4°C per un massimo di 24-48h e le fiasche inoculate con liquido articolare a temperatura ambiente fino a 48-72h.
Fase analitica
Coltura del liquido articolare
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Incubare le fiasche per emocoltura inoculate in sala operatoria in strumentazione dedicata per 14 giorni. Centrifugare l’aliquota inviata in contenitore sterile e
allestire un preparato microscopico dal sedimento. Nelle infezioni acute è utile una colorazione di Gram dell’aspirato articolare, sebbene un risultato negativo non
esclude la possibilità d’infezione. In generale la colorazione di Gram ha elevata specificità ma bassa sensibilità (SE 26%, SP 97% [Zimmerli 2004]).
Coltura del materiale da fistola o raccolta non secernente
Il primo tampone è utilizzato per la semina nei seguenti terreni:
agar sangue e agar cioccolato. Incubare in atmosfera con 5% CO2 per 5 giorni a 35°C
agar Schäedler. Incubare in atmosfera anaerobia per 5 giorni a 35°C
brodo per anaerobi esigenti (tioglicollato in atmosfera con 5% CO2). Subcoltivare in agar sangue, agar cioccolato e agar Schäedler quando il brodo diventa
torbido o a fine incubazione.
Il secondo tampone è utilizzato per preparare un vetrino da sottoporre a colorazione di Gram.
Coltura del materiale da fistola o raccolta secernente
I flaconi di emocoltura sono incubati nel sistema automatico presente in laboratorio.
L’aliquota inviata nella siringa utilizzata per il prelievo è in parte sottoposta a colorazione di Gram e in parte congelata per ulteriori eventuali approfondimenti.
Coltura dei tessuti periprotesici
a. omogeneizzare i frammenti bioptici in 3-10 ml di brodo (es. Brain Hearth Infusion broth)
b. per raggiungere una sufficiente sensibilità colturale inoculare 0,5 ml di omogenato in:
agar sangue e agar cioccolato. Incubare in atmosfera con 5% CO2 per 5 giorni a 35°C
agar Schäedler. Incubare in atmosfera anaerobia per 10 giorni a 35°C
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brodo per anaerobi esigenti (tioglicollato in atmosfera con 5% CO2 o cooked meat in aria a 35°C per 14 giorni a 35°C). Subcoltivare in agar sangue, agar
cioccolato e agar Schäedler quando il brodo diventa torbido o a fine incubazione.
Per assicurare la manipolazione delle piastre in sicurezza ed evitare inquinamenti è consigliabile inoculare aliquote di omogenato da 0,1 mL in cinque piastre per ogni
tipologia di terreno.
Coltura delle componenti protesiche
Le componenti protesiche vengono sottoposte a sonicazione (procedura necessaria per rimuovere i microrganismi organizzati in biofilm dalle superfici dei dispositivi
protesici espiantati) negli stessi contenitori di trasporto al fine di minimizzare le possibili contaminazioni nelle seguenti modalità:
preparare il bagno di sonicazione riempiendo la vasca con acqua sterile e procedere alla degasazione
vortexare il contenitore con la protesi per 30 secondi
sonicare a 40 khz 0,22±0,04 w/cm2 per 5 minuti
vortexare il contenitore con la protesi per ulteriori 30 secondi
Le colture sul sonicato delle componenti protesiche possono essere effettuate direttamente sul sonicato o su sonicato concentrato.
Inoculo diretto del sonicato:
0,5ml in Agar sangue. Incubare in atmosfera con 5% CO2 per 5 giorni a 35°C
0,5ml in Agar Schäedler. Incubare in anaerobiosi per 10 gg a 35°C
Per assicurare la manipolazione delle piastre in sicurezza ed evitare inquinamenti è consigliabile inoculare aliquote di omogenato da 0,1 mL in cinque piastre per ogni
tipologia di terreno.
Oppure concentrare il sonicato 100 volte mediante centrifugazione a 3000 rpm per 10 min. Eliminare il surnatante e inoculare:
1 aliquota da 0,1ml del sedimento in Agar sangue. Incubare in atmosfera con 5% CO2 per 5 giorni a 35°C
1 aliquota da 0,1ml del sedimento in Agar Schäedler. Incubare in anaerobiosi per 10 gg a 35°C
Allestire un vetrino dal sedimento, colorare al Gram e osservare al microscopio.
Identificazione dei microrganismi:
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Le metodiche routinarie di laboratorio per l’identificazione dei microrganismi (test biochimici e pattern di sensibilità agli antibiotici) sono adeguate nella maggior
parte dei casi.
Porre attenzione:
alla crescita di colonie varianti piccole cresciute su terreno solido. I microrganismi rimossi dal biofilm, in particolare i batteri gram negativi, possono
presentare caratteristiche biochimiche anomale per inattivazione di processi enzimatici nelle forme sessili. La subcultura ripetuta in terreni arricchiti fa
riacquisire i caratteri fenotipici normali e permette la corretta identificazione a livello di genere e specie.
al pattern antibiotico degli stafilococchi coagulasi negativi, che non è un metodo sempre affidabile per distinguere ceppi diversi. I metodi molecolari hanno
dimostrato che lo stesso antibiogramma può essere mostrato da due diversi ceppi e contrariamente, microrganismi con antibiogrammi diversi possono
apparire indistinguibili alla genotipizzazione. Inoltre, ceppi multipli possono essere presenti contemporaneamente nella stessa protesi infetta.
Colture negative
Le colture possono risultare negative in caso di precedente esposizione ad antibiotico, presenza di un basso numero di microrganismi, terreni di coltura
inappropriati, microrganismi fastidious o tempo prolungato di trasporto dei materiali alla microbiologia. Alcuni microrganismi, come Abiotrophia defectiva o
Granulicatella adiacens (precedentemente classificata come variante nutrizionale di streptococchi) sono difficili da evidenziare in coltura.
Microrganismi inusuali o fastidious associati ad infezioni protesiche
Nelle infezioni protesiche ricorrenti a coltura negativa per germi aerobi ed anaerobi e/o quando la storia clinica suggerisce uno specifico rischio da esposizione
infettiva, allestire terreni specifici per germi inusuali (funghi, micobatteri, Brucella, ecc.). E’ utile congelare a -80°C una aliquota di liquido articolare (se disponibile),
di omogenato di tessuto e di sonicato della protesi per allestire tali colture in caso di necessità.
Prova di sensibilità agli antimicrobici
Eseguire un antibiogramma esteso con farmaci:
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anche di seconda scelta
che raggiungano alte concentrazioni tissutali
che siano attivi verso microrganismi a lenta crescita e organizzati in biofilm
determinare la MIC
Antimicrobici da saggiare verso batteri Gram positivi:
Rifampicina, Chinoloni, Daptomicina, Glicopeptidi, Linezolid, Minociclina, Clindamicina, Acido fusidico, Cotrimossazolo
Antimicrobici da saggiare verso batteri Gram negativi:
Cefalosporine di 3° generazione, Aminoglicosidi, Chinoloni, Piperacillina/Piperacillina-tazobactam, Carbapenemi
Biologia molecolare
La coltura rimane il gold standard nella diagnosi delle infezioni protesiche, ma le tecniche molecolari mostrano risultati promettenti. Le tecniche di biologia
molecolare possono assumere un ruolo nelle colture negative, ma, in generale, i metodi molecolari non sono ancora idonei per la gestione della routine clinica.
Fase post-analitica
Tessuti periprotesici e/o Liquido articolare
Se la coltura è positiva in almeno 2 campioni (tessuto e/o liquido articolare) per lo stesso microrganismo allora l’isolato è ritenuto probabile agente eziologico
dell’infezione e va refertato con antibiogramma. Se la coltura non è positiva in almeno 2 campioni (tessuto e/o liquido articolare) per lo stesso microrganismo allora
l’isolato è considerato probabile agente contaminante e la protesi non infetta. In questo caso refertare: “Assenza di crescita significativa per infezione”.
Sonicato della protesi
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Inoculo diretto del sonicato: se crescita ≥5CFU dello stesso microrganismo in 0,5 ml in aerobiosi e/o anaerobiosi, l’isolato è ritenuto probabile agente
eziologico dell’infezione e va refertato con antibiogramma [Trampuz 2007].
Inoculo del sonicato concentrato: se presenti un numero ≥20CFU dello stesso microrganismo in 0,1ml in aerobiosi e/o anaerobiosi: l’isolato è ritenuto
probabile agente eziologico dell’infezione e va refertato con antibiogramma [Piper 2009].
Se le colture del sonicato non rispondono ai criteri di positività sopra esposti la protesi è da ritenere non infetta e l’eventuale microrganismo isolato probabile agente
contaminante. Refertare: “Assenza di crescita significativa per infezione”.
Criticità
Diversi punti critici si ritrovano nel percorso diagnostico:
a. nella fase pre-analitica
raccolta di un numero significativo di campioni
modalità di prelievo dei campioni
inizio della profilassi antibiotica dopo il prelievo dei campioni intraoperatori
gestione e timing della terapia antibiotica
b. nella fase analitica:
disponibilità di strumentazione per trattamento dei campioni (omogenizzatore, sonicatore)
applicazione di criteri colturali di positività definiti in aderenza alle evidenze di letteratura
considerazione del ruolo dei microrganismi commensali cutanei
conoscenza delle difficoltà colturali di microrganismi organizzati in biofilm.
c. Infezioni precoci ed infezioni tardive diagnosticate precocemente:
la terapia antibiotica, se il paziente è clinicamente stabile, non va somministrata prima della pulizia chirurgica e del prelievo dei campioni intraoperatori
per esame colturale
d. Infezioni ritardate e tardive:
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la terapia antibiotica deve essere sospesa almeno 2 settimane prima dell’espianto delle componenti protesiche, compatibilmente con il quadro clinico
del paziente.
Bibliografia
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INDICATORI PER MONITORARE L’ADESIONE AL PERCORSO DIAGNOSTICO DELLE
INFEZIONI SU PROTESI ARTICOLARI
criterio
Indicatore
standard
1. Invio del liquido articolare nelle fiasche da
emocoltura
n. set fiasche pervenute/n. richieste di liquido articolare
>90%
2. Invio del materiale da fistola o raccolta secernente
n. emocolture contenenti materiale da fistola o raccolta
secernente/n. richieste totali
>90%
direttamente nei terreni di emocoltura
I report di verifica dell’aderenza allo standard saranno valutati a 6-12 mesi.
Responsabile della verifica dott.ssa P. Cavalcanti
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