Lavoro di diploma di Giada Gambetta SSMT, 2011.

Lavoro di diploma 2011
Scuola Superiore Medico Tecnica Locarno
DOSAGGIO DELL’ATTIVITÀ ANTI-XA
PER IL MONITORAGGIO DI PAZIENTI
ANTICOAGULATI CON EPARINA
Autore: Giada Gambetta
Responsabili: Dr. C. Castelli, Dr. M. Imperiali
Svolto presso: Laboratorio Ospedale regionale di Lugano, sede Civico
Giada Gambetta
2010-2011
RIASSUNTO
ABSTRACT
INTRODUZIONE
INTRODUCTION
Attualmente, presso gli ospedali dell’Ente
Ospedaliero
Cantonale
(EOC),
il
monitoraggio
dell‘anticoagulazione
con
eparina non frazionata (UFH) avviene tramite
il dosaggio del tempo di tromboplastina
parziale attivata (aPTT). Negli ultimi anni un
nuovo dosaggio è stato reso disponibile:
l’attività anti-Xa. Lo scopo di questo lavoro è
quindi quello di verificare se questo dosaggio
è più mirato dell’aPTT, misurando entrambi i
parametri
su
campioni
di
pazienti
anticoagulati con UFH.
At the Ente Ospedaliero Cantonale (EOC),
monitoring of anticoagulation therapy with
unfractioned heparin (UFH) is carried out by
means of the activated partial thromboplastin
time test (aPTT). Recently a new test, the
anti-Xa activity has become available in
routine laboratory procedures. The aim of this
study was to determine whether this new test
is more specific than the old one. For this
purpose, samples from patients treated with
UFH were analysed for both parameters in
parallel.
MATERIALI E METODI
MATERIALS AND METHODS
I campioni di plasma citrato provenienti dai
reparti di medicina e nefrologia dell‘ Ospedale
Regionale di Lugano sono stati analizzati
tramite l’apparecchio CS 2100i (Sysmex,
Svizzera).
L’attività anti-Xa è stata dosata utilizzando i
reattivi Biophen Eparin 6 (Endotell, Svizzera).
Per la determinazione dell’aPTT sono stati
utilizzati i reattivi Dade Actin FS e cloruro
di calcio (Siemens, Svizzera).
Per l’analisi statistica dei dati sono stati
utilizzati i software Analyse-it (v. 2.24, UK) e
Gnumeric (v. 1.10.12, opensource).
Samples from the medical or nefrology
department from Ospedale Regionale di
Lugano were collected in plasma-citrate
containers and analysed on a CS 2100i
platform (Sysmex, Switzerland).
Anti-Xa determination was performed using
reactives from Biophen Eparin 6 (Endotell,
Switzerland). For the aPTT determination,
reactives Dade Actin FS and calcium
chloride solution (Siemens, Switzerland) were
used.
Analyse-it (v.2.24, UK) e Gnumeric
(v.1.10.12, opensource).software were used
for the statistical analysis.
RISULTATI
RESULTS
In totale sono stati analizzati 63 campioni, di
cui 54 con l’aPTT misurato in doppio. Il
dosaggio dell’attività anti-Xa è stato
determinato in tutti i campioni in doppio.
Questo ha permesso, attraverso analisi
statistiche di determinare la presenza o meno
di una correlazione tra i due test.
A total of 63 samples were analyzed,
including 54 with aPTT measured in
duplicate.
The
anti-Xa
activity
was
determined in all samples in duplicate.
This has allowed the determination of the
accuracy of the two methods and the possible
correlation between the two tests.
DISCUSSIONE
DISCUSSION
Grazie al test T di Student è possibile
concludere che i doppi ottenuti con il
dosaggio dell’attività anti-Xa sono migliori
rispetto all’aPTT.
Inoltre attraverso metodi di regressione si
nota che è presente una certa correlazione
tra i due metodi. Questo è confermato dal test
sulla concordanza, in cui si nota che essi
forniscono gli stessi risultati.
Per determinare se il dosaggio dell’attività
anti-Xa è migliore rispetto all’aPTT nel
monitoraggio di terapie con UFH, andrebbe
ampliata la raccolta dati effettuata in questo
studio, ponendo l’accento sul monitoraggio su
più giorni di pazienti anticoagulati con UFH.
Thanks to the Student’s t-test we can
conclude that the anti-Xa activity assay is
more reproducible than aPTT.
In addition, through various methods of
regression we see that there is a correlation
between the two methods. With different
match tests we notice that the methods
provide the same results.
For better comparison between the two tests
the statistical data obtained in this study
should be expanded, focusing on multi-day
monitoring of patients anticoagulated with
UFH.
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INDICE:
Riassunto/Abstract ..................................................................................................................... 1
1
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3
4
5
6
7
8
Abbreviazioni ........................................................................................................................ 3
Introduzione .......................................................................................................................... 4
2.1 Obiettivo del lavoro di diploma ....................................................................................... 4
2.2 Il processo di coagulazione ........................................................................................... 4
2.2.1 Emostasi primaria ................................................................................................... 4
2.2.2 Coagulazione plasmatica ........................................................................................ 5
2.2.3 Fibrinolisi ................................................................................................................. 7
2.3 Eparina .......................................................................................................................... 7
2.3.1 Eparina non frazionata ............................................................................................ 8
2.3.2 Eparina a basso peso molecolare........................................................................... 9
2.3.3 Tipi di eparine a confronto ...................................................................................... 9
2.4 Monitoraggio della terapia anticoagulante ..................................................................... 9
2.4.1 aPTT ....................................................................................................................... 9
2.4.2 Attività anti-Xa ....................................................................................................... 10
Materiale e metodi .............................................................................................................. 11
3.1 Campioni ...................................................................................................................... 11
3.1.1 Scelta e trattamento dei campioni ......................................................................... 11
3.1.2 Plasma citrato ....................................................................................................... 11
3.2 Apparecchio ................................................................................................................. 11
3.3 Metodo ......................................................................................................................... 12
3.3.1 aPTT ..................................................................................................................... 12
3.3.2 Anti-Xa .................................................................................................................. 12
Risultati ............................................................................................................................... 13
4.1 Ripetibilità misurazioni ................................................................................................. 13
4.2 Correlazione tra i due metodi ....................................................................................... 13
Discussione ........................................................................................................................ 15
5.1 Ripetibilità misurazioni ................................................................................................. 15
5.2 Correlazione tra i due metodi ....................................................................................... 15
Conclusione ........................................................................................................................ 16
Bibliografia .......................................................................................................................... 17
Ringraziamenti .................................................................................................................... 18
Allegati ...................................................................................................................................... 19
1 Formulario........................................................................................................................... 19
2 Reagenti anti-Xa ................................................................................................................. 20
3 Controlli anti-Xa .................................................................................................................. 22
4 Calibratori anti-Xa ............................................................................................................... 23
5 Actina aPTT ........................................................................................................................ 24
6 Cloruro di calcio aPTT ........................................................................................................ 25
7 Controlli aPTT ..................................................................................................................... 26
8 Somministrazione eparine .................................................................................................. 27
9 Risultati ............................................................................................................................... 32
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1 ABBREVIAZIONI
ADP:
adenosindifosfato
aPTT:
tempo di tromboplastina parziale attivata
ATIII:
antitrombina III
ATP:
adenosintrifosfato
Da:
Dalton
DIC:
coagulazione intravasale disseminata
FDP:
prodotti di degradazione della fibrina
FP4:
fattore piastrinico 4
GP:
glicoproteina
HMWK:
chininogeno ad alto peso molecolare
LMWH:
eparina a basso peso molecolare
pNA:
para-nitroanilina
TF:
fattore tessutale
TXA:
trombossano
UFH:
eparina non frazionata
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2 INTRODUZIONE
2.1 Obiettivo del lavoro di diploma
Lo scopo di questo lavoro di diploma è quello di valutare l’introduzione del dosaggio
dell’attività anti-Xa nel monitoraggio di terapie anticoagulanti con eparine non frazionate (UFH)
presso il Dipartimento di Medicina di laboratorio dell’Ente Ospedaliero Cantonale (EOLAB). A
differenza del tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT), attualmente utilizzato presso
gli ospedali cantonali, questo dosaggio permetterebbe di rilevare direttamente la quantità di
eparina presente nel plasma del paziente. L’aPTT misura l’effetto dell’anticoagulazione con
eparina evidenziando l’aumento di tempo necessario alla formazione del coagulo e può
essere influenzato da molteplici fattori quali ad esempio una carenza di fattori della
coagulazione o un processo di flogosi 1.
L’obiettivo di questo lavoro consiste dunque nel confrontare i risultati ottenuti misurando
l’aPTT (metodo attuale) con quelli ottenuti attraverso il dosaggio dell’attività anti-Xa. Così
facendo potrò verificare la maggior specificità del nuovo parametro.
2.2 Il processo di coagulazione
La coagulazione del sangue è un processo complesso, costituito da molteplici reazioni tra loro
connesse, attraverso le quali il nostro organismo ripara un danno a livello dei vasi sanguigni.
Questo avviene grazie alla formazione di un coagulo che permette di limitare la perdita di
sangue. Inoltre alcune reazioni che costituiscono questo processo hanno il compito di
regolare la coagulazione in maniera ottimale evitando da un lato una coagulazione eccessiva
(rischio di formare trombi) o dall’altro una coagulazione troppo debole (rischio di emorragie).
La coagulazione viene solitamente suddivisa in due parti: l’emostasi primaria e la
coagulazione plasmatica (emostasi secondaria). Quest’ultima è a sua volta composta da due
vie differenti: intrinseca ed estrinseca (fig. 1).
Infine viene coinvolto un terzo processo responsabile della risoluzione del coagulo: la
fibrinolisi 2 3.
2.2.1 Emostasi primaria
Questo primo processo ha inizio quando è presente una lesione della parete di un vaso
sanguigno ed ha lo scopo di ridurre al minimo la fuoriuscita di sangue. Ciò coinvolge
l’endotelio, i trombociti ed il subendotelio.
La parete dei vasi sanguigni è costituita, a seconda del calibro, da uno o più strati interni di
cellule endoteliali (endotelio). Esse producono molte sostanze di cui alcune sono importanti
per l’emostasi primaria: il fattore von Willebrand, il fattore III e gli inibitori ed attivatori della
fibrinolisi.
Il fattore VIII è una glicoproteina composta da più subunità, due più importanti: una ad alto
peso molecolare (complesso fattore VIII von Willebrand, VIII:vWF) e l’altra a basso peso
molecolare con attività coagulativa (fattore VIIIC). La prima viene ceduta al plasma e va a
formare un complesso con il fattore VIIIC. Il fattore III (o tromboplastina tessutale) è una
fosfolipoproteina che è in grado di attivare la via estrinseca della coagulazione plasmatica.
Inoltre le cellule endoteliali servono ad impedire il contatto tra il sangue e lo strato
subendoteliale che è presente all’esterno dei vasi.
Il subendotelio è formato da collagene e da fattore III che, in caso di rottura dell’endotelio
viene liberato e viene quindi a contatto con i trombociti favorendone l’adesione.
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Per l’aggregazione dei trombociti è necessaria energia che viene prodotta attraverso il
metabolismo degli zuccheri e viene immagazzinata sottoforma di ATP (adenosina trifosfato).
Infatti quando essa viene utilizzata si trasforma nella molecola ADP (adenosina difosfato) che
è indispensabile per l’aggregazione 2.
L’attivazione dei trombociti è costituita da quattro fasi:
1) Contatto tra il sub endotelio ed i trombociti
2) Adesione da parte del trombocita che, grazie alla presenza del fattore von Willebrand,
riesce ad aderire appiattenosi e può così iniziare la sua fase produttiva
3) Secrezione di calcio, serotonina, ADP, trombossano e prostaciclina da parte del
trombocita
4) Aggregazione dei trombociti grazie al contributo del ricettore glicoproteico GP IIb/IIIa,
ioni calcio e fibrinogeno. La produzione di ADP, come conseguenza del consumo di
energia da parte del trombocita stesso, attiva e fa aggregare ulteriori trombociti 2
I trombociti inoltre hanno il ruolo di produrre sostanze che influiscono sulla coagulazione
plasmatica, come i fattori I e V ed il fattore piastrinico 3 (FP3, responsabile dell’attivazione del
sistema intrinseco) ed altre sostanze che riducono la permeabilità dei vasi e sostanze vaso
costringenti come serotonina (neurotrasmettitore) e trombossano (TXA, una prostaglandina)
2.
2.2.2 Coagulazione plasmatica
Si tratta di un processo formato da più reazioni che coinvolgono delle proteine che prendono il
nome di fattori. Essi sono sempre presenti nel plasma in forma inattiva ed in eccesso. Lo
scopo finale di queste reazioni è la formazione di fibrina.
Per l’attivazione di questo processo è necessaria la presenza di una superficie con carica
elettrica negativa in modo da attivare sia i trombociti che le cellule tissutali.
L’attivazione della superficie trombocitaria da il via al sistema intrinseco o endogeno, mentre
l’attivazione della superficie delle cellule tissutali permette l’inizio del sistema estrinseco o
esogeno 2.
Prima di entrare nel dettaglio dei meccanismi che compongono i due sistemi, verrà descritta la
suddivisione dei diversi fattori della coagulazione:
 Fattori vitamina K dipendenti: II, VII, IX, X, proteina C e S
 Fattori di consumo, sensibili alla trombina: I, XIII, V, VIII
 Fattori di contatto: XII, XI, chininogeno ad alto peso molecolare (HMWK), precallicreina
 Fosfolipidi e ioni calcio
 Fattori cellule-associati: Fattore tessutale (TF), trombomodulina
 Inibitori della coagulazione: antitrombina III (ATIII), proteina C 4
La via intrinseca, endogena: le cariche elettriche negative attivano il fattore XII che a sua volta
attiva l’XI, con ioni calcio e fattore VIIIc si attiva il IX che andrà ad attivare il X 2.
La via estrinseca, esogena: le cariche negative fanno in modo che il fattore III (con la
partecipazione del fattore XII) attivi il VII che a sua volta attiva il X 2.
La via comune: il fattore X attiva la protrombina (fattore II) in trombina con la presenza di ioni
calcio e fattore V 2.
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Il fattore IIa (trombina) attiva il fattore XIII in fattore XIIIa che lega i monomeri di fibrina
derivanti dal fibrinogeno, formando la fibrina solubile che diventa fibrina insolubile.
L’insieme di fibrina insolubile, trombociti ed eritrociti forma il trombo 2.
Per motivi storici e pratici, la coagulazione plasmatica è stata divisa nelle tre vie sopra citate.
Oggigiorno, mediante le nuove conoscenze in questo ramo, si è potuto ridefinire le differenti
tappe del processo. Questo è stato reso possibile dagli ematologi M. Hoffman e D. Monroe
che hanno pubblicato le loro ricerche negli anni 2004-2005 5.
Le due vie (intrinseca ed estrinseca) non sono completamente autonome, infatti esse
possiedono la capacità di attivarsi in modo incrociato. Il fattore VII, oltre che dal fattore
tissutale e ioni calcio, può venire attivato dal fattore XIIa. Il fattore IX invece viene attivato
anche dal fattore VIIa oltre che dal fattore XIa ed i fattore X può essere attivato sia dal fattore
IXa che dal fattore VIIa.
Il fattore Xa risulta quindi essere il punto di incontro tra le due vie. Il fattore Xa, quindi, nella
via intrinseca è attivato dal fattore IXa e ioni calcio, mentre nella via estrinseca esso è attivato
dal fattore VIIa e Va 2.
La fase di contatto ha luogo in presenza di una superficie caricata negativamente
(rappresentata dall’endotelio in vivo e dal vetro negli esami in vitro) a cui si lega il fattore XII
che così facendo si autoattiva e mette in evidenza il punto di legame al quale si legherà la
callicreina. Il chininogeno ad alto peso molecolare (HMWK) è un polipeptide presente nel
plasma che si lega alla precallicreina ed al fattore XI. Questo complesso ne permette
l’adesione alla superficie negativa che porta, grazie al fattore XIIa, alla trasformazione della
precallicreina in callicreina, il fattore XI in XIa ed il fattore VII in VIIa 4.
Inoltre, sempre grazie all’ematologo M. Hoffman, a partire dal 2004 sono state riviste altre
reazioni all’interno del processo della coagulazione plasmatica 5. Infatti ora il TF, ricettore
tissutale e cofattore dei fattori VII e VIIa, dopo la rottura di un vaso, si lega e forma un
complesso con il fattore VIIa che a sua volta attiva i fattori IX e X in IXa e Xa. A questo punto il
fattore Xa si combina con il fattore Va formando il complesso protrombinasi che porta alla
produzione di una minima quantità di trombina nelle vicinanze della lesione. Essa è sufficiente
ad attivare i trombociti ed i fattori V, VIII e IX. Bisogna comunque ritenere che il fattore Xa
rimane attivato solo se si trova nelle vicinanze della cellula che lo ha prodotto e se esso si
allontana viene subito inattivato dall’ATIII. I fattori Va e VIIIa si legano alla membrana dei
trombociti come pure il fattore IXa formato dal complesso VIIa-TF, ciò porta all’unione dei
fattori IXa e VIIIa che andranno così a formare un complesso. Anche il fattore X si associa al
fattore Va formando un complesso. Grazie a questa serie di reazioni può iniziare il processo
che porta alla formazione del trombo 2.
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Fig. 1: Schema della coagulazione plasmatica I.
In questo schema sono rappresentate le reazioni a cascata che compongono la via
intrinseca e la via estrinseca della coagulazione plasmatica. Inoltre viene
raffigurata la via comune, composta dall’attivazione del fattore X in Xa ed in seguito
del fattore II in IIa che porta alla formazione di fibrina.
2.2.3 Fibrinolisi
La fibrinolisi è il processo che porta allo scioglimento del coagulo formatosi dal processo di
coagulazione. L’enzima che permette questa reazione è la plasmina, che si forma a seguito
dell’attivazione del plasminogeno (glicoproteina). La sua azione ha inizio all’interno del trombo
grazie ad attivatori del plasminogeno e ad inibitori della plasmina che ne permettono
l’equilibrio.
Si possono distinguere tre diversi tipi di attivazione: endogena, esogena e terapeutica. La
prima avviene grazie ai fattori di contatto (fattore XIIa e callicreina), la seconda grazie
all’effetto degli attivatori endoteliali o tessutali e l’ultima con urochinasi e streptochinasi.
L’inibizione invece può avvenire sia fisiologicamente, grazie anti-attivatori tessutali o
antiplasmina, che attraverso una terapia.
Il fibrinogeno e la fibrina, per azione proteolitica della plasmina, vengono scomposti in prodotti
di degradazione detti FDP. Dapprima si formano dei frammenti B, poi frammenti X. Questi
ultimi vengono scissi in frammenti D e Y, i frammenti Y vengono ulteriormente scissi in D e E.
Sono i frammenti derivanti dal frammento X ad inibire l’aggregazione trombocitaria 2.
2.3 Eparina
Le eparine sono dei glicosaminoglicani la cui struttura è composta da catene lineari di
glicosamine ed acido glucuronico, con un peso molecolare che varia dai 5’000 ai 30’000
Dalton (fig. 2). Il legame con l’ATIII è permesso però da un pentasaccaride, ovvero da una
sequenza specifica di cinque zuccheri 6. Fondamentale è l’inibizione del fattore IIa che
sopprime i siti d’attivazione dei fattori V e VIII e prolunga quindi il tempo di formazione del
coagulo. L’azione anticoagulante dell’eparina è resa possibile dal legame dell’eparina con
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l’ATIII che porta ad un cambiamento conformazionale, favorendo così un legame più rapido
con i fattori IIa, Xa, IXa, XIa, XIIa e VIIa 2.
L’eparina viene utilizzata come anticoagulante sia per la prevenzione che per il trattamento
delle trombosi venose e delle embolie polmonari. Viene anche utilizzata in differenti tipi di
trombosi arteriose come adiuvante, nella coagulazione intravasale disseminata (DIC) come
terapia, nella circolazione extracorporea e nell’angioplastica per evitare l’eventuale
formazione di coaguli. Viene inoltre utilizzata come anticoagulante in certi tipi di prelievi per il
laboratorio 6.
Fig. 2: Struttura molecolare dell’eparina II.
Catena lineare di glicosamine e acido glucuronico.
2.3.1 Eparina non frazionata
Le eparine non frazionate possiedono un peso molecolare superiore ai 5’400 Da che permette
loro di legare ed inibire entrambi i fattori Xa e IIa (fig. 3) 6.
L’eparina non frazionata (UFH) viene somministrata per via intravenosa o via sottocutanea a
seconda della condizione del paziente. Solitamente la dose in caso di profilassi è di 5’000 UI e
viene somministrata da due a tre volte al giorno. L’emivita del medicamento è dosedipendente anche se non è stata riscontrata nessuna proporzionalità tra la dose iniettata e
l’effetto anticoagulante 7.
I valori di riferimento di anti-Xa nel caso di profilassi variano da 0,1 a 0,4 UI/mL, mentre in
terapia da 0,5 a 1,0 UI/mL nel caso di una sola somministrazione al giorno e da 1,0 a 1,8
UI/mL nel caso di due somministrazioni al giorno.
Questi valori fanno riferimento alle linee guida dell’ente ospedaliero cantonale (allegato 8),
che consigliano di eseguire il prelievo 4-5 ore dopo la somministrazione del medicamento 6.
Fig. 3: Legame dell’UFH con i fattori IIa e Xa II.
L’UFH si lega all’ATIII, ciò provoca un cambiamento conformazionale che
permette il legame con i fattori Xa e IIa.
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2.3.2 Eparina a basso peso molecolare
Le eparine a basso peso molecolare (LMWH) sono derivate da quelle non frazionate e ne
vengono ricavate grazie a diversi processi (depolimerizzazione chimica o enzimatica). Il loro
peso molecolare è compreso tra 2’000 e 10’000 Da, ciò permette unicamente l’inibizione del
fattore Xa. Il loro tempo di dimezzamento è mediamente due volte più lungo rispetto
all’eparina non frazionata ed è indipendente dal loro dosaggio.
Esse vengono eliminate attraverso i reni ed è quindi presente il rischio, in caso di insufficienza
renale, di un accumulo e di conseguenza di un sovradosaggio.
Oggigiorno vengono sempre più utilizzate e stanno in parte rimpiazzando le eparine non
frazionate. Il dosaggio varia a seconda del prodotto tra le 1’750 e le 3’000 UI 6.
2.3.3 Tipi di eparine a confronto
Mettendo a confronto i due tipi di eparine si può osservare come esse siano diverse nella
risposta all’anticoagulazione e nel dosaggio. Infatti l’LMWH ha un rapporto risposta
anticoagulante e dose somministrata più lineare. Questo permette di titolare più precisamente
l’effetto anti-trombotico di questo tipo di eparina. Essa è dunque anche più sicura per il
paziente in quanto il suo profilo farmacocinetico è maggiormente prevedibile. Per contro l’UFH
può dare grandi difficoltà nell’intensità dell’anticoagulazione, a causa di un piccolo errore nel
dosaggio o nelle differenze di risposta dei pazienti. Il dosaggio di questa eparina risulta essere
più difficile ed il suo monitoraggio è essenziale 8.
2.4 Monitoraggio della terapia anticoagulante
2.4.1 aPTT
Il tempo di tromboplastina parziale attivata viene utilizzato per verificare la funzionalità del
sistema endogeno. Verifica la funzionalità dei fattori XII, XI, IX, X, VIIIc, V, II, I. In questo
dosaggio i fattori della coagulazione XII e XI contenuti nel plasma del paziente vengono
attivati incubandoli con fosfolipidi ed attivatori di superficie. In una seconda fase, con
l’aggiunta di ioni calcio, viene innescata la via intrinseca del processo coagulativo. Il dosaggio
rileva il tempo, espresso in secondi, necessario alla formazione del coagulo.
Nella routine ospedaliera questo parametro viene utilizzato per la ricerca di disturbi congeniti o
acquisiti del sistema endogeno, per il monitoraggio della terapia eparinica e per il controllo
della coagulazione intravasale disseminata (DIC) (allegato 5) 9.
Inoltre la ditta produttrice dei reattivi per l’esecuzione di questo test (Siemens Svizzera)
dichiara le seguenti interferenze: diminuzioni del valore dell’aPTT (in secondi) nell’utilizzo di
terapie con estrogeni negli uomini 10 e nelle donne in terapia contraccettiva orale 11,
aumento del valore dell’aPTT (in secondi) nella somministrazione di anticoagulanti orali (i
fattori della coagulazione II, VII, IX e X vengono depressi) 12 e con l’utilizzo di mezzi di
contrasto radiografici 13.
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2.4.2 Attività anti-Xa
Il metodo di questo dosaggio è di tipo inversamente proporzionale con inibizione dell’eparina
con un substrato rilevato colorimetricamente.
Il metodo con cui viene misurata l’attività anti-Xa è composto da una serie di reazioni (fig.4):
dapprima, nel plasma del paziente, l’eparina presente nel campione va a legarsi all’ATIII
formando un complesso a cui viene aggiunto il fattore Xa (reagente 1). Questo andrà a legarsi
al complesso eparina-ATIII e il fattore Xa del paziente resterà libero nel plasma. In seguito
all’aggiunta di una sostanza cromogena (reagente 2) si forma un nuovo peptide (complesso
cromogeno-Xa), dal quale si stacca una parte (pNA, para-nitroanilina) che verrà quantificata
con un metodo colorimetrico ad una lunghezza d’onda di 405 nm 14.
Eparina + ATIII ATIII-eparina
ATIII-eparina + Xaeccesso  Xa-ATIII-eparina + Xaresiduo
Xaresiduo + cromogeno  peptide + pNA
Fig. 4: Metodo di misurazione dell'anti-Xa.
L’eparina all’interno del campione si trova legata all’antitrombina III, ad essa viene aggiunto un
determinato quantitativo di fattore Xa che andrà a legarsi al complesso già presente. Infine viene
aggiunto un cromogeno che permette di quantificare il fattore Xa presente nel campione.
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3 MATERIALE E METODI
3.1 Campioni
3.1.1 Scelta e trattamento dei campioni
I prelievi raccolti provengono dai reparti di medicina e nefrologia dell’Ospedale Regionale di
Lugano, sede Civico. Al personale di questi reparti è stato chiesto di fornire alcune
informazioni riguardanti i pazienti riempiendo un formulario (allegato 1) che comprende
domande sulla dose di eparina somministrata e l’ora di somministrazione, il peso del paziente,
il motivo della terapia ed il tipo di eparina utilizzata.
I prelievi una volta raccolti dal reparto arrivano in laboratorio accompagnati dall’apposito
formulario e centrifugati a 1’500x g per 15 minuti. Dopo la prima centrifugazione il plasma
viene trasferito in una provetta nuova che verrà nuovamente centrifugata (1’500x g, 15 minuti)
così da ottenere plasma privo di trombociti (platelets-free-plasma) 15. Questo perché i
trombociti nel tempo rilasciano fattore piastrinico 4 (FP4) che inibisce l’eparina 14. Il plasma
ottenuto verrà suddiviso in due porzioni: la prima viene immediatamente congelata a -20°C e
l’altra servirà per eseguire la misurazione in doppio dell’aPTT. Questo perché la ditta
produttrice e fornitrice dei reagenti (Siemens Svizzera) dichiara che per l’aPTT il plasma è
stabile solamente due settimane se congelato a -20°C, mentre per quanto riguarda il dosaggio
dell’attività anti-Xa la ditta fornitrice (Endotell Svizzera) dichiara stabile il plasma un mese 15.
3.1.2 Plasma citrato
Le provette utilizzate per la raccolta dei campioni necessari per effettuare le misurazioni sono
della ditta Becton and Dickinson (BD) Vacutainer e contengono l’anticoagulante sodio citrato.
Esso è composto da una soluzione tamponata concentrata 0,109 M, ovvero il 3,2% di citrato
trisodico e acido citrico per avere un pH di 5,2 16.
Il rapporto tra anticoagulante e sangue è di 1:10, ovvero 1 parte di anticoagulante e 9 di
sangue. Questo richiede che la provetta venga riempita correttamente e che quindi la quantità
di sangue raggiunga la tacca presente sulla provetta. Il rispetto di questo rapporto è
importante in quanto, se la provetta venisse riempita meno del previsto, non si avrebbe la
giusta proporzione tra le proteine della coagulazione e chelante di ioni calcio (citrato trisodico
che sequestra gli ioni calcio e li rende insolubili sottraendoli al processo di formazione del
coagulo) che ad esempio può portare ad un allungamento dell’aPTT 15.
3.2 Apparecchio
L’apparecchio utilizzato per effettuare le misurazioni è un Sysmex modello CS 2100i (fig. 5)
(Siemens). Per le analisi aPTT e anti-Xa questo apparecchio utilizza due metodi diversi: il
metodo con coagulo e quello cromogenico. Il primo si basa sul principio della luce che passa
attraverso la cuvette di reazione ed individua la modifica della torbidità che viene trasmessa
come variazione di luce. Il secondo invece si fonda sull’individuazione della velocità di
variazione dell’assorbanza della luce dopo la reazione che avviene quando al plasma del
paziente viene aggiunto il reagente.
La modalità analitica che ho utilizzato per effettuare le analisi è quella del microcampionamento, ovvero viene aspirato solamente il volume necessario direttamente dal
campione e lo analizza. Ciò permette di utilizzare poco plasma e quindi poter effettuare le
analisi in doppio 17.
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Fig. 5: Sysmex CS 2100i III.
Quest’immagine rappresenta l’apparecchio utilizzato in
questo studio, il Sysmex CS 2100i ed il computer
(software) che ne permette la gestione.
3.3 Metodo
3.3.1 aPTT
I reattivi utilizzati per misurare il tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT) sono Dade
Actin FS (Siemens, allegato 5) e soluzione di cloruro di calcio CaCl2 0,025 mol/L (Siemens,
allegato 6).
Il reagente actina è composto da fosfolipidi di soia purificati in 0,0001 M acido ellagico con
tampone, stabilizzanti e conservanti ed è pronto all’uso 1.
La reazione avviene pipettando 50 L di plasma del paziente. Dopo un’incubazione di 60
secondi vengono aggiunti al plasma del paziente 50 L di Dade Actin FS e dopo 250
secondi (dall’inizio del test) vengono pipettati 50 L di cloruro di calcio. La lettura viene fatta
ad una lunghezza d’onda di 660 nm 18.
Questo parametro viene controllato giornalmente effettuando i controlli di qualità forniti dalla
ditta Siemens Svizzera, Dade Ci-Trol 1 e 2 (allegato 7) 9.
3.3.2 Anti-Xa
Il kit di reagenti Biophen Eparin 6 (allegato 2), controlli (allegato 3) e calibratori (allegato 4)
sono della ditta Aniara (Endotell, Svizzera).
In breve: vengono pipettati in una cuvette 20 L di plasma del paziente e 40 L di NaCl, dopo
20 secondi vengono aggiunti 100 L di reattivo 1 (composto da fattore Xa bovino) e dopo
ulteriori 250 secondi 100 L di reattivo 2 (substrato cromogenico specifico per il fattore Xa,
SXa-11) 18.
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4 RISULTATI
Per il confronto fra i due metodi utilizzati sono stati analizzati 63 campioni di pazienti dei
reparti di medicina e nefrologia in terapia anticoagulante con eparina non frazionata (UFH,
Liquemin). Tutte le misurazioni del dosaggio dell’attività anti-Xa sono state effettuate in
doppio, mentre per l’aPTT alcune sono state misurate una volta sola (9 pazienti). Questo a
causa di dimenticanze da parte dei tecnici in analisi biomediche (TAB) di svolgere l’analisi
aPTT in doppio per questo studio.
I risultati completi sono riportati nell’allegato 9.
L’analisi statistica dei dati è stata eseguita utilizzando i software Analyse-it (versione 2.24,
UK) e Gnumeric (versione 1.10.12, Opensource).
4.1 Ripetibilità misurazioni
Per quanto riguarda la ripetibilità delle misurazioni dell’aPTT, i dati sono stati analizzati
attraverso il test T di Student che permette di stabilire se le due serie di misurazioni (doppi)
mostrano o meno una differenza significativa. Lo stesso procedimento è stato applicato alle
misurazioni effettuate in doppio dell’attività anti-Xa (tab.1).
Tab.1: Test T di Student per i doppi di aPTT e attività anti-Xa.
Analisi
aPTT
Anti-Xa
No. campioni
54
63
Valore T
-2.19
-1.02
Vengono indicati il numero di campioni misurati in doppio ed il
valore T di Student ottenuto per entrambi i metodi utilizzati (aPTT
e attività anti-Xa).
4.2 Correlazione tra i due metodi
Le misurazioni ottenute con i due metodi aPTT e anti-Xa sono state messe a confronto in un
grafico a dispersione (fig. 6) eseguito con il foglio di calcolo Gnumeric (versione 1.10.12,
software opensource), fornendo una prima indicazione sulla distribuzione dei dati.
Fig. 6: Correlazione tra i risultati dell’aPTT e dell’attività anti-Xa
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Per valutare l’eventuale correlazione tra i due diversi metodi è stata effettuata un’analisi
statistica non parametrica con il software Analyse-it (versione 2.24, UK): la regressione di
Spearman.
Il metodo secondo Spearman ha lo scopo di indicare se è presente o meno uno scostamento
tra i valori ottenuti con i due metodi (aPTT e attività anti-Xa). Questa regressione fornisce il
coefficiente di correlazione tra i ranghi che in questo caso è 0.69.
Inoltre sono stati effettuati anche i test di McNemar (Analyse-it, v. 2.24, UK) ed il test di
omogeneità (Gnumeric, v. 1.10.12, software opensource) che permettono di verificare se
entrambi i test (aPTT ed attività anti-Xa) forniscono gli stessi risultati (ad esempio che un
campione abbia risultati patologici in entrambi i test) (tab.3).
Tab.3: Test sulla concordanza
secondo McNemar e test
dell’omogeneità per confrontare i metodi aPTT e anti-Xa.
Test
McNemar
Omogeneità
Valore
-0.032
1.15x10-4
Vengono indicati i valori ottenuti nei test di McNemar ed omogeneità
utilizzati per il confronto tra i metodi aPTT e attvità anti-Xa.
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5 DISCUSSIONE
Le informazioni riguardanti i pazienti anticoagulati con UFH, che hanno preso parte a questo
studio, fornite dal personale infermieristico e medico dei reparti di medicina e nefrologia, sono
state raccolte come già accennato nel capitolo 3.1.1 in un formulario (allegato 1). Queste
informazioni comprendono date ed ora del prelievo, dose di UFH somministrata ed ora della
somministrazione, peso del paziente e motivo della terapia con UFH.
Il formulario era stato previsto in vista di raccogliere più prelievi su più giorni di uno stesso
paziente, in modo da monitorare l’andamento dei due parametri aPTT e attività anti-Xa in
funzione della dose di UFH somministrata. Purtroppo i dati raccolti non sono stati utilizzati in
questo lavoro, in quanto solo di un paziente si è riusciti a raccogliere più prelievi che non
hanno comunque fornito dati statisticamente utili a questo studio data la grande variazione nel
dosaggio di UFH somministrato tra un prelievo e quello successivo.
5.1 Ripetibilità misurazioni
Confrontando i valori ottenuti con il test T di Student (tab.1) si può notare che per il dosaggio
dell’attività anti-Xa si è ottenuto un valore minore (-1.02) rispetto a quello ottenuto per le
misurazioni dell’aPTT (-2.19). Questo sta ad indicare che i valori in doppio ottenuti con il
nuovo metodo sono migliori, più simili 19.
5.2 Correlazione tra i due metodi
Nel grafico a dispersione (fig.6) in cui sono rappresentati tutti i valori ottenuti si può notare che
è presente una tendenza lineare nella distribuzione dei dati. Infatti la regressione lineare
fornisce un valore R2 di 0.52 (0 indica che non c’è alcuna correlazione e 1 indica la
correlazione massima). Si è ad ogni modo ritenuto opportuno analizzare i dati attraverso un
metodo non parametrico 19.
Il coefficiente di correlazione rs di Spearman (indicato anche con il simbolo ρ) è di 0.69 ed
indica che è presente una certa correlazione fra i due metodi comparati (aPTT e attività antiXa). Questo perché con questa regressione si ha una massima correlazione tra due metodi
quando rs è pari a ±1 e non si ha alcuna correlazione quando rs è vicino a 0. Il coefficiente di
correlazione per ranghi di Spearman serve quindi
per verificare l’ipotesi nulla
dell’indipendenza tra due variabili 19.
Il test di McNemar dimostra che i due metodi (aPTT e attività anti-Xa) sono concordanti, in
quanto il valore ottenuto è di 0.032 (tab.3). Questo perchè con questo tipo di test, che utilizza i
dati in forma binaria (è stato assegnato il valore 1 ai campioni con risultato normale e 0 ai
campioni con valori patologici), permette di verificare se è presente o meno una differenza
significativa tra i due metodi (se il valore si avvicina a 0 non si ha una differenza significativa,
mentre se il valore è vicino ad 1 la differenza tra i due metodi è presente).
Anche il test dell’omogeneità permette di dimostrare che i due metodi forniscono gli stessi
risultati, in quanto il valore ottenuto è di 1.15x10-4. Infatti questo test viene utilizzato per
verificare la probabilità che i risultati ottenuti in questo studio siano significativamente diversi.
Con un valore vicino a 0 si ha la dimostrazione che i risultati ottenuti con i due metodi, in
questo studio aPTT e attività anti-Xa, sono simili, mentre con un valore vicino ad 1 si dimostra
che i due metodi forniscono risultati differenti 19.
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6 CONCLUSIONE
Per quanto riguarda la valutazione di quale metodo sia migliore tra aPTT e anti-Xa, da un
punto di vista statistico si può dire che il dosaggio dell’attività anti-Xa fornisce delle
misurazioni in doppio migliori, più simili. Esso sembra essere soggetto ad errori minori tra una
misurazione e l’altra. Per quanto riguarda il lato clinico invece, andrebbe ampliata la raccolta
dati fatta in questo studio, mettendo l’accento su come questo parametro vari a seconda del
dosaggio e raccogliendo quindi più campioni di uno stesso paziente per meglio monitorare
l’andamento dei due parametri nel tempo.
La valutazione della presenza di una correlazione o meno tra i due diversi metodi analizzati in
questo lavoro, permette di notare che il test di Spearman dimostra la presenza di una certa
correlazione.
Anche che con il test di McNemar e con il test dell’omogeneità si è dimostrato che i due
parametri sono tra loro concordanti e forniscono dunque gli stessi risultati.
Studi di altri gruppi di lavoro eseguiti in precedenza non hanno fornito informazioni concrete
su quale metodo, tra aPTT ed attività anti-Xa, sia il migliore nel monitoraggio di terapie
anticoagulanti con UFH. Un primo lavoro pubblicato nel 2009 dall’istituto di patologia clinica
sperimentale di Salt Lake City (Utah, USA) conclude che il dosaggio dell’attività anti-Xa resta
una valida alternativa all’aPTT, in quanto il range terapeutico fornito per i valori dell’aPTT
viene derivato dal valore di attività anti-Xa (questo perché il range varia a seconda dello
strumento e dei reattivi utilizzati nella misurazione dell’aPTT). Questo studio solleva anche il
problema che le terapie con UFH sono in netto calo a causa della loro sostituzione con LMWH
e quindi gli studi eseguiti su questo tema sono pochi. Inoltre questo gruppo di lavoro conclude
dicendo che l’aPTT continua ad essere la prima scelta per il monitoraggio di terapie con UFH
malgrado le limitazioni di questo dosaggio (interferenze e difficoltà nel dosare l’UFH, vedi
capitolo 2.1) 20. Un secondo studio, svolto presso il dipartimento del servizio trasfusionale
ed ematologia dell’ospedale di Durham (North Carolina, USA) con a capo l’ematologo M.
Hoffman nel 2010, ha ulteriormente confermato che non sono presenti dati concreti che
dimostrino che il dosaggio dell’attività anti-Xa sia migliore rispetto all’aPTT. Inoltre l’aPTT
risulta essere un’analisi meno costosa. Come nello studio effettuato nel 2009 anche questo
lavoro sostiene che l’attività anti-Xa sia promettente e migliore nello stabilire il range
terapeutico a differenza dell’aPTT che, come già accennato in precedenza, possiede un range
terapeutico specifico in base al tipo di apparecchio ed i reattivi utilizzati 8.
Posso quindi concludere che il dosaggio dell’attività anti-Xa risulta essere un parametro
promettente per il monitoraggio della terapia anticoagulante con UFH. Questo dosaggio può
benissimo essere inserito nella routine dei laboratori dell’ente ospedaliero, tenendo però conto
che probabilmente l’aPTT rimarrà la prima scelta dei medici in quanto meno costoso e più
conosciuto. Purtroppo in questo studio non si è riuscito a determinare quale parametro sia il
migliore, a causa dei pochi campioni raccolti e del mancato monitoraggio di pazienti su più
giorni. Si consiglia dunque di ampliare la raccolta dati nel caso di un ulteriore studio in questo
ambito.
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7 BIBLIOGRAFIA
TESTO
1
2
3
4
5
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consultato il 26.02.2011 alle ore 14.30
Siemens Healthcare
http://www.medical.siemens.com
consultato il 27.02.2011 alle ore 10.00
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8 RINGRAZIAMENTI
Vorrei ringraziare tutte le persone che mi sono state d’aiuto durante lo svolgimento di questo
lavoro:
 Dr. Christian Castelli e Dr. Mauro Imperiali, per avermi aiutato nella stesura del lavoro
e nell’interpretazione dei risultati.
 Elia Cattani, per il grande aiuto nello svolgimento della parte pratica.
 Tutto il laboratorio dell’Ospedale Regionale di Lugano (Civico) ed in particolare il capo
laboratorio Giorgio Dal Bò per avermi permesso di svolgere il lavoro nella loro
struttura ed aver collaborato alla raccolta dei campioni.
 Dr. Marco Pons e tutto il team dei reparti di medicina e nefrologia per aver partecipato
al mio lavoro fornendomi i campioni e le informazioni cliniche corrispondenti
 Dr.ssa Leda Leoncini-Franscini per aver preso contatto con Dr. M. Pons ed il reparto di
medicina
 Il docente di metodologia e direttore Andrea Boffini ed i docenti di metodologia Sonja
Marci e Claudio Naiaretti, per l’aiuto nella stesura scritta e nella preparazione della
presentazione del lavoro
 La docente di inglese Susan Gilbert, per l’aiuto della stesura dell’abstract
 Il docente Giovanni Togni, per le correzioni del progetto e della bozza del lavoro
 I miei famigliari e tutti i miei compagni di classe
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ALLEGATI
1 FORMULARIO
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2 REAGENTI ANTI-XA
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3 CONTROLLI ANTI-XA
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4 CALIBRATORI ANTI-XA
23
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5 ACTINA APTT
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2010-2011
6 CLORURO DI CALCIO APTT
25
Giada Gambetta
2010-2011
7 CONTROLLI APTT
26
Giada Gambetta
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8 SOMMINISTRAZIONE EPARINE
27
Giada Gambetta
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28
Giada Gambetta
2010-2011
29
Giada Gambetta
2010-2011
30
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2010-2011
31
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2010-2011
9 RISULTATI
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2010-2011
33
Giada Gambetta
2010-2011
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