Nuove complessità nel laboratorio di genetica forense

5^ Giornata di Genetica Forense
Roma, 5 giugno 2013
Nuove complessità nel
laboratorio di genetica forense
Giampietro Lago
RIS Parma
AGENDA
5^ Giornata di Genetica Forense
Roma, 5 giugno 2013
• Nuove tecnologie, nuove opportunità, nuovi
problemi: quali soluzioni?
• Comuni incomprensioni e possibili approcci
di soluzione
• Riflessioni sulla direzione da prendere
come comunità scientifica per migliorare
l’interpretazione
AT = 30 RFU
ST = 150 RFU
Stutter filter off
PowerPlex ESI® 17 System
Picchi sotto la soglia stocastica
D22S1045
vWA
Steps nell’interpretazione del DNA
Picco
Allele
Genotipo
Profilo
Acquisizione del dato
(Estrazione, Quantificazione, Amplificazione, Separazione)
Interpretazione del dato
(Soglia analitica, Soglia Stutter, Soglia Stocastica, Rapporto altezze dei picchi)
Confronti
Supporto statistico
Clayton et al. (1998) ISFG (2006) Rec.#4
Misti low level DNA: impatto sui risultati
Scarsi quantitativi di DNA
Drop-out allelico probabile
Aumento dell’incertezza
(contributori / combinazioni genotipiche
Clayton et al. (1998) ISFG (2006) Rec.#4
≤ 100 pg di DNA, un circolo vi…
Low template DNA
misture
Perchè l’interpretazione è più difficile …
Lavoriamo con tracce…
Non conosciamo il numero e la
1 proporzione dei contributori prima di
analizzare il campione
2
3
Non è possibile controllare
sufficientemente la chimica della PCR
per prevenire variazioni nel prodotto
dei due alleli, anche laddove derivi da
un solo contribuente
Non conosciamo la “storia” della
traccia, il livello di degradazione, la
presenza di inibitori,…
…tuttavia…
1 Osserviamo picchi
2 Misuriamo picchi
3 Misuriamo le proporzioni fra picchi
AGENDA
5^ Giornata di Genetica Forense
Roma, 5 giugno 2013
• Nuove tecnologie, nuove opportunità, nuovi
problemi: quali soluzioni?
• Comuni incomprensioni e possibili approcci
di soluzione
• Riflessioni sulla direzione da prendere
come comunità scientifica per migliorare
l’interpretazione
Dov’è la variazione … la possiamo controllare?
1
Senza capire le basi della PCR e la variazione intrinseca
prodotta, possiamo interpretare profili complessi ?
2
Possiamo interpretare profili complessi usando la sola
“esperienza da analista”?
3
Per molti profili complessi, la nostra “esperienza” e la
validazione del kit comprendono tutte le variabili?
Incremento effetti stocastici
1 Drop-in allelici
2 Drop-out allelici
3 Sbilanciamento altezze picchi
4 Stutter-bands
5 Variabilità strumento/strumento
6 Degradazione differenziale del templato
Cosa significa stocastico?
1
Variazione intrinseca, variabilità e dropout possono
accadere ovunque in un profilo genotipico LL DNA
2
Variabilità nell’altezza dei picchi significa che
l’altezza attesa del picco per le coppie alleliche nei
loci eterozigoti non viene rispettata rendendo le
misture di più difficile interpretazione
3
La confidenza nel risultato può essere aumentata
effettuando più amplificazioni (frazionamento in
aliquote)
Drop-out / LL DNA
A 20 pg, dropout su circa il
50% degli alleli omozigoti
A 50 pg, dropout su circa il
30% degli alleli eterozigoti
Tvedebrink et al. (2011) Allelic drop-out probabilities estimated by logistic regression- Further considerations and practical
implementation.FSIGEN-761
LL DNA/misti: i documenti di riferimento
1
2
Non si possono effettuare calcoli statistici in quanto gli effetti stocastici
non consentono di stabilire se tutti gli alleli siano stati considerati …
German Stain Commission “Category C” (Schneider et al. 2006, 2009)
Non andare “outside the box” senza una validazione a supporto …
Fundamentals of Forensic DNA Typing (2010)
(Butler 3rd edition -volume 1-, chap. 18)
Gli effetti stocastici limitano l’utilità …
ISFG Recommendations #8 & #9 (Gill et al. 2006)
Raccomandazioni sull’interpretazione dei misti
6. Gli alleli della componente minoritaria non
si possono distinguere dagli stutters della
componente maggioritaria se hanno le stesse
1. Per i misti è da preferire Likelihood ratio (LR) dimensioni.
rispetto a RMNE
7. È possibile utilizzare Il dropout per spiegare
2. Gli scienziati dovrebbero essere formati
l’assenza di un picco solo se il segnale è
sull’LR ed utilizzarlo
basso
3. I metodi per calcolare LR sono pubblicati
8. Non dovrebbero essere fornite valutazioni
statistiche se gli alleli sono sotto la soglia
4. Seguire le linee guida di Clayton et al. (1998)
quando si deducono i genotipi
9. Nei misti low level DNA, gli effetti stocastici
limitano l’utilità del bilanciamento tra alleli
5. L’accusa determina Hp e la difesa Hd.
eterozigoti (h) e della stima della proporzione
Eventuali altre ipotesi devono essere valutate
tra contributori
Gill et al. (2006) DNA Commission of the International Society of Forensic Genetics:
Recommendations on the interpretation of mixtures. Forensic Sci. Int. 160: 90-101
http://www.isfg.org/Publication;Gill2006
LL DNA/misti: i documenti di riferimento
1
SWGDAM …
1. La variabilità dei campioni forensi impedisce di formulare
regole di interpretazione prefissate.
2. I laboratori devono comunque utilizzare procedure scritte
per l’interpretazione dei risultati analitici, con la
consapevolezza che la specificità degli standard operativi
incrementa notevolmente la accuratezza degli operatori.
Interpretation Guidelines for Autosomal STR Typing by
Forensic DNA Testing Laboratories. (2010)
http://www.swgdam.org
2
Supporto statistico alla compatibilità
Il laboratorio deve compiere un’analisi
statistica a supporto di qualsiasi inclusione
che sia rilevante nel contesto di un caso,
indipendentemente dal numero degli alleli
riscontrati e del valore quantitativo
dell’analisi statistica.
”… è fondamentale che una evidenza debole sia
correttamente rappresentata come debole, oppure
non sia presentata affatto”
Buckleton & Curran (2008)
quando si effettua uno studio di validazione …
1
La validazione deve stabilire i limiti
della metodica
testare in un range appropriato
PHR testato a 1 ng non è applicabile ai dati
ottenuti da <100 pg a causa della variazione
stocastica dovuta a “low level DNA”
2
3
4
quando si effettua uno studio di validazione …
1
Effettuare più analisi dello stesso estratto
aiuta a stabilire i limiti della riproducibilità, in
particolare se è presente poco DNA.
2
3
4
Da ricordare quando si effettua uno studio di validazione
1
Usare campioni noti in modo che
l’affidabilità dei genotipi può essere accertata
Nel caso di misture, pianificare specifici
criteri di valutazione
2
3
4
Da ricordare quando si effettua uno studio di validazione
1
Analizzare numerosi estratti affinché la
valutazione del singolo campione non sia ciò
che l’analista pensa possa essere
2
3
4
AGENDA
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Roma, 5 giugno 2013
• Nuove tecnologie, nuove opportunità, nuovi
problemi: quali soluzioni?
• Comuni incomprensioni e possibili approcci
di soluzione
• Riflessioni sulla direzione da prendere
come comunità scientifica per migliorare
l’interpretazione
Interpretazione LLDNA/misti: quale direzione?
Allontanarsi dalla CPI e avvicinarsi all’LR
Gill et al. (2006) ISFG DNA Commission recomendation #2
Ciò richiede software per effettuare i calcoli
-Gill e altri autori forniscono soluzioni freeware
Serve consapevolezza dei principi dietro ai
calcoli del computer
Maggiore formazione sui misti!
1
2
Interpretazione LLDNA/misti: quale direzione… 1
2
La comunità scientifica si sta muovendo verso un numero maggiore di
marcatori (da 13 a 20 STRs)
Gli studi di validazione servono per supportare SOP di interpretazione
software
Aumentare il numero di marcatori con maggiori
capacità di discriminazione aumenta la
possibilità di risolvere i misti
Ma più loci si traduce in più tempo
nell’interpretazione
Quale soglia della complessità/incertezza?
La più recente letteratura sta introducendo nuovi temi
- Applicazioni software e loro aggiornamenti
- L’impatto del dropout sulle statistiche
- Studi sul numero di contributori
Conoscere i propri limiti…
…. L’analista, in casi veramente complicati, deve
poter tirare una linea e dire “non posso effettuare
chiamate alleliche perchè il misto è troppo complesso”.
“Parte della sfida odierna è che ogni laboratorio abbia
quella linea”. La cosa più onesta da fare come
scienziati è di dire “non provo a estrapolare qualcosa
che non è affidabile”.
Articolo New Scientist (Linda Geddes - Agosto 2010)
How DNA evidence creates victims of chance
Riflessioni conclusive
“Se vuoi essere un tecnico, effettuando analisi a richiesta, allora
focalizza l’attenzione sulle politiche e le procedure del tuo laboratorio.
Se vuoi essere uno scienziato e un professionista, impara le
politiche e le procedure, ma vai anche oltre e comprendi la filosofia
della tua professione. Cogli il perché le cose sono fatte nel modo in
cui sono fatte, il metodo scientifico, il punto di vista delle critiche, il
problema degli errori sistematici e l’importanza dell’etica.”
Greg Matheson
Generalist vs Specialist: a Philosophical Approach
The CAC News – 2nd Quarter 2012 – p. 6
http://www.cacnews.org/news/2ndq12.pdf
5^ Giornata di Genetica Forense
Roma, 5 giugno 2013
Grazie
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