Costruzione di una libreria genomica e cDNA

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Definizione di genoteca (o library) di DNA
Collezione completa di frammenti di DNA, inseriti
singolarmente in un vettore di clonaggio.
Possono essere di DNA genomico o di cDNA.
Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto
il DNA genomico di una certa specie
Libreria di cDNA: collezione di cloni che include tutte le
specie di mRNA (trascritte in cDNA) espresse in un dato
tessuto, incluso quelle piu’ rare
2 CONCETTI GENERALI IMPORTANTI
Rappresentatività: una libreria si dice rappresentativa
quando contiene, in almeno una copia, tutte le possibili
sequenze
Ridondanza: una libreria si dice ridondante quando
contiene molte copie di alcune sequenze, complicando la
ricerca e selezione (screening) della sequenze che vogliamo
analizzare
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FASI GENERALI PER LA COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA
GENOMICA
1- Frammentazione del genoma (Digestione con
endonuclesi di restrizione, Frammentazione meccanica)
2- Ligazione con il vettore (Ligazione con estremità
coesive, estremità piatte)
3- Introduzione nella cellula ospite (Trasformazione con DNA
plasmidico ricombinante, Trasfezione con DNA fagico,
Impacchettamento in vitro capsidi fagici)
4- Screening dei cloni di interesse (Ibridazione, PCR)
Preparazione dei frammenti da clonare
a) Digestione parziale con endonucleasi
di restrizione
Se si utilizza un enzima di restrizione con un sito di
riconoscimento di 6bp (EcoRI), i frammenti generati
avrebbero dimensioni in media di 4x103 bp, se la
composizione in basi del DNA fosse casuale. In
realtà i frammenti che si ottengono sono troppo
grandi o molto piccoli e questi sarebbero più
rappresentati nella library.
Una strategia comunemente usata è quella di
digerire il genoma con un enzima che taglia siti a 4
basi (Sau3A, AluI, HaeIII), avendo cura di effettuare
la digestione in condizioni tali che la digestione sia
parziale (tempi di digestione o quantità di enzima
sub-ottimali).
Le digestioni parziali di un genoma
garantiscono la produzione di una collezione
di cloni sovrapposti.
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b) Frammentazione DNA (metodi fisici)
E’ possibile frammentare il DNA con metodi fisici, come la sonicazione, o il passaggio
attraverso un sottile ago di una siringa, oppure meccanicamente (vortex)
Questi metodi presentano il vantaggio di produrre frammentazioni casuali (maggiore
rappresentatività), ma lo svantaggio di produrre frammenti sia con estremità “blunt”
che con estremità 5’ e 3’ “sporgenti”, non adatte alla ligazione, che devono essere rese
blunt.
Adattatori!!!!
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Costruzione di librerie genomiche
Librerie cDNA
Preparazione del cDNA
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Librerie cDNA basate su PCR
Clonaggio direzionale del cDNA
Utilizzando oligonucleotidi modificati che
inseriscono siti unici di restrizione ad
entrambe le estremità del cDNA a doppio
filamento è possibile ottenere il clonaggio
direzionale nel vettore scelto
Librerie cDNA classiche
La sintesi del cDNA produce, a partire da molecole di messaggero uguali,
molecole di DNA di diversa lunghezza. Sovra-rappresentazione del 3’ se la
sintesi è innescata da oligo-dT
cDNA 1 (full-lenght)
TTTTTTTT 5’
AAAAAAAA 3’
3’
5’
mRNA
cDNA 1-2
TTTTTTTT 5’
AAAAAAAA 3’
3’
5’
cDNA 1-3
TTTTTTTT 5’
AAAAAAAA 3’
3’
5’
cDNA 1-4
3’
5’
TTTTTTTT 5’
AAAAAAAA 3’
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Questo inconveniente
può essere superato
utilizzando random
primer al posto
dell’oligo dT per la
sintesi del cDNA.
Costruzione di librerie cDNA
Per il clonaggio del cDNA sono aggiunti alle estremità piatte del
cDNA degli adattatori in modo da rendere le molecole di cDNA
compatibili con il vettore scelto.
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Vettori usati per librerie
genomiche e cDNA
Batteriofago λ
Plasmidi
Cosmidi
Cromosomi artificiali di
batteri (BAC)
Cromosomi artificiali di
lievito (YAC)
Plasmidi
Ø  Derivano da
elementi presenti in
natura
Ø  permettono di
clonare frammenti
fino a 5-10.000 bp
libreria conservata
in E.coli
APPLICAZIONI
…. Librerie cDNA e Librerie shotgun
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Batteriofago “λ” (lamda)
È costituito da 2 componenti principali che sono il
capside/parti proteiche costitutive e DNA genoma
Ciclo litico e lisogenico del batteriofago “λ”
Il batteriofago “λ” è caratterizzato dalla presenza dei siti cos estensione a
singolo filamento di 12 nucleotidi complementari tra loro che permettono
al DNA genomico di circolarizzare una volta entrato nel batterio ospite
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Il sistema lisogenico e la
ricombinazione sito specifica ….
Ø  DNA del virus ingegnerizzato
(vengono utilizzati batteriofagi che attuano il ciclo litico e non quello lisogenico)
Mappa del genoma di λ
Ø  Sono costituiti da DNA double-stranded lineare della lunghezza di 45 kb con un
braccio dx ed uno sx sui quali sono presenti i geni per il ciclo litico
Braccio sx
DNA dispensabile
Braccio dx
Ø  Hanno siti di taglio per l’inserimento del DNA
Ø  Si riescono a clonare frammenti di 15-20.000 bp
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Digestione del DNA fagico
Sito cos
Sito di taglio
15-20.000 bp
DNA dispensabile
Braccio sx
DNA dispensabile eliminato
Sito di taglio
Sito cos
Braccio dx
40-45 kb
Ligazione del DNA esogeno
15-20.000 bp
DNA da clonare
40-45 kb
Vettore ricombinante da usare per la fase successiva di packaging
Struttura di due vettori di sostituzione λ
EMBL3 e EMBL4 in commercio
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Impacchettamento DNA λ (Packaging)
Naturale processo di
impacchettamento (packaging)
del DNA genomico di λ
Impacchettamento (packaging) in
vitro dei concatameri di λ in presenza
della miscela di 2 estratti di E.coli
I concatameri da circa 45 kb (braccio dx + DNA genomico/
cDNA + braccio sx) con a monte e a valle i siti cos vengono
efficacemente impacchetati nella struttura fagica
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Packaging in vitro
Infezione e recupero lisato
Sito cos
libreria conservata in fagi λ
Sito cos
ospite
APPLICAZIONI
….. Librerie cDNA e
Librerie genomiche
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Cosmidi
Ø  Non derivano da elementi presenti
in natura
a differenza dei plasmidi e dei fagi,
ma derivano dalla combinazione delle
caratteristiche dei plasmidi e dei fagi
Ø  Plasmidi che contengono un
frammento di DNA del fago λ con
all’interno il sito Cos
Ø  permettono di clonare
frammenti fino a 40-45.000 bp
Ø  Plasmidi è piccolo rispetto alle ospite
braccia del fago
libreria conservata in E.coli
APPLICAZIONI
….. Librerie genomiche
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Cromosomi Artificiali Batterici (BAC)
Struttura di un BAC (geni oriS e repE
garantiscono la replicazione
unidirezionale, parA e parB controllano
il n° di copie del vettore, CmR
marcatore per resistenza al
cloranfenicolo, cosN e loxP siti di
taglio per terminasi λ e proteina cre,
HindIII e BamHI
Sono dei cromosomi artificiali costituiti da:
Gene lacZ (7
8) siti di restrizione
Promotore T7/SP6 (6
multipli
sito lox p (5
sito cos N (4
3) parA, B, C
controllo del
numero di copie
9) marcatore selettivo per la
resistenza ad un antibiotico
1) ori per i batteri
2) repE controllo della replicazione
Ø  possono essere clonati frammenti di DNA da 100-300.000 bp
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ospite
libreria conservata in E.coli
APPLICAZIONI
….. Librerie genomiche
Cromosomi Artificiali di Lievito (YAC)
Sono dei cromosomi artificiali costituiti da:
marcatore selettivo
indipendenza da
triptofano ed uracile
TEL
TRP1
ARS
BRACCIO SX
ori per i
batteri
siti di
sequenza restrizione
centromerica multipli
CEN
telomeri
URA3
TEL
BRACCIO DX
ori per i
lieviti
Ø  possono essere clonati frammenti di DNA da 1.000.000 bp
Ø  La loro stabilità è tanto maggiore quanto più grandi sono gli inserti clonati
(contrariamente a quanto succede per fago, cosmidi e BAC)
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ospite
libreria conservata in S. cerevisiae
Screening di una genoteca
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Una volta che si sono collezionati centinaia di migliaia
di frammenti di DNA in una biblioteca genomica o a
cDNA, come si fa a trovare il gene che si vuole
studiare?
È come cercare un ago in un pagliaio
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Risultati attesi dallo screening di librerie cDNA/genomiche
Applicazioni
ü  Librerie cDNA: sequenza dell’mRNA (5’ e 3’ UTR), possibili varianti di splicing
ü  Librerie genomiche: introni, esoni, regioni regolative (promotore/enhancer)
ü  Librerie genomiche: associazione del nostro gene con altri nella stessa regione
cromosomica
ü  Mappatura fisica dei cloni genomici sui cromosomi (in situ)
ü  Correlare il clone isolato con regioni cromosomiche associate a caratteri di
interesse per il miglioramento genetico (resistenze, controllo fenomeni
biologici importanti es. fioritura, produttività etc)
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