Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones

Catene Leggere Libere
e
Proteine di Bence Jones
Review
L. Massaro, R. Scaringi
New Scientific Company - Cormano (Milano)
1ª Revisione - in occasione di
I Riunione su “Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones”
Forlì, 28 maggio 1993
2ª Revisione - in occasione di
XIVè Curs de Bioquímica Clínica
Barcellona, 23 - 26 novembre 1994
3ª Revisione - in occasione di
V Riunione su “Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones”
Forlì, 26 maggio 1995
4ª Revisione - in occasione di
Incontro “Proteine Urinarie - Clinica e Diagnostica”
Pesaro, 23 giugno 1999
5ª Revisione - in occasione di
Corso CEFAR “ Le Proteine: dal Laboratorio alla Clinica”
Desenzano, 13 – 15 ottobre 1999
©New Scientific Company S.r.l.
Via Dante Alighieri, 35 - I - 20032 Cormano (MI)
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Prefazione
La prima stesura di questo scritto fu in occasione della prima riunione organizzata con il Dr. Pallotti a Forlì il 28
maggio 1993; riunione che, nel rispetto delle sollecitazioni da più parte pervenutemi, ebbe caratteristiche atipiche; volle
essere un momento di aggregazione per esprimere liberamente dubbi, problemi, opinioni, sensazioni, risultati, e
quant'altro sul tema proposto.
Sono seguite 9 riunioni sempre a Forlì fino all'ultima dello scorso 18 giugno e la “commissione” che si era
spontaneamente costituita ha lavorato alla valutazione concreta dei metodi per la determinazione delle Catene Leggere
Libere (CLL) e delle Proteine di Bence Jones (BJP) nelle urine.
I primi risultati concreti furono pubblicati su Biochimica Clinica nel 1995, vol. 19, n. 5, nella rubrica "L'angolo
dell'Elettroforesi" di F. Aguzzi col titolo "Valutazione Multicentrica di metodi e protocolli per le Catene Leggere Libere
e Proteine di Bence Jones in urine - Primi risultati".
Nel 1997 le Sezioni Liguri di SIBioC – AIPAC – SIMEL decisero di intraprendere congiuntamente un’analoga
iniziativa sempre coordinata organizzativamente dalla NSC.
Da allora la Commissione Liguria ha avuto tre riunioni, l’ultima l’ 1 luglio 1999.
Le commissioni proseguono il loro lavoro con i seguenti obiettivi: definizione di campioni di controllo per le Bence
Jones, valutazioni epidemiologiche, valutazione delle correlazioni cliniche, standardizzazione della strategia della
comunicazione refertuale.
Ho predisposto la seconda revisione in occasione della riunione organizzata a Barcellona dal Dr. Cortes che ringrazio
insieme agli intervenuti per avermi dato la possibilità di discutere intorno alle BJP e alle CLL portando anche i risultati
e le esperienze italiane.
Sull'argomento specifico delle CLL e BJP e, più in generale, in proteinologia, l'esperienza e le competenze degli addetti
nei nostri Laboratori di base si collocano, a nostro avviso, all'avanguardia internazionale.
La terza edizione è stata in occasione della riunione di Forlì del 26 maggio 1995.
La quarta edizione è in occasione della riunione di Pesaro del 23 giugno ’99 "Proteine urinarie - Clinica e Diagnostica"
e ringrazio il Dr. Marcello Acetoso per l'opportunità che ha voluto offrirci.
Questa quinta edizione è in occasione del Corso CEFAR “Le proteine: dal Laboratorio alla Clinica” VIII edizione e
ringrazio Francesco Aguzzi per aver consentito la nostra partecipazione.
Indice degli argomenti
Prefazione ..................................................................................................................................1
Indice degli argomenti ................................................................................................................1
Indice delle figure e tabelle.........................................................................................................2
Abbreviazioni ..............................................................................................................................2
Capitolo I Introduzione - Storia - Terminologia
3
Introduzione ....................................................................................................................................................... 3
Storia.................................................................................................................................................................. 3
Terminologia...................................................................................................................................................... 4
Capitolo II Immunoglobuline e Catene Leggere
7
Introduzione ....................................................................................................................................................... 7
Struttura ............................................................................................................................................................. 7
Molteplicità ed Eterogeneità .............................................................................................................................. 8
Antisieri ............................................................................................................................................................. 9
Capitolo III Catene Leggere Libere: Metabolismo e FisioPatologia
13
Introduzione ..................................................................................................................................................... 13
Metabolismo delle CLL ................................................................................................................................... 13
Sintesi delle Catene Leggere Libere................................................................................................................. 15
Eliminazione delle CLL ................................................................................................................................... 15
Concentrazioni di CLL nel soggetto normale .................................................................................................. 16
Produzione giornaliera di Ig e CLL ................................................................................................................. 16
Emivita di Ig e CLL ......................................................................................................................................... 16
Alterazioni del metabolismo delle CLL ........................................................................................................... 16
Capitolo IV Catene Leggere Libere: Patologie correlate
19
Introduzione ..................................................................................................................................................... 19
CLL monoclonali o Proteine di Bence Jones ................................................................................................... 19
Catene Leggere Libere Policlonali................................................................................................................... 19
Controindicazioni all'uso dei mezzi di contrasto.............................................................................................. 19
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Capitolo V Introduzione allo Studio delle Proteine
21
Introduzione ..................................................................................................................................................... 21
Metodologia di Studio delle Proteine............................................................................................................... 21
Variazioni e Anormalità delle Proteine - Tecniche di routine.......................................................................... 21
Tecniche di Studio delle Proteine - Generalità................................................................................................. 22
Capitolo VI Tecniche e Protocolli di Studio delle CLL
25
Introduzione ..................................................................................................................................................... 25
Procedura logica di scelta di metodi e protocolli ............................................................................................. 25
Scelta di Metodi e Protocolli alla luce della Peculiarità delle CLL:
Composizione, Distribuzione, Concentrazione ................................................................................................ 26
Termo-Test - Strisce-Test - Proteine Totali ..................................................................................................... 28
Elettroforesi zonale (EF).................................................................................................................................. 28
ImmunoFissazione (IFE).................................................................................................................................. 30
ImmunoPrecipitazione in fase liquida (IPL) Indiretta, con antisieri anti Catene Leggere Totali
Nefelometria e Turbidimetria........................................................................................................................... 31
ImmunoPrecipitazione in fase liquida (IPL) Diretta, con antisieri anti Catene Leggere Libere
Nefelometria e Turbidimetria........................................................................................................................... 33
Capitolo VII Contrastografie e BJP
35
Introduzione ..................................................................................................................................................... 35
Letteratura: analisi e riflessioni........................................................................................................................ 35
Le Circolari Ministeriali................................................................................................................................... 36
Fogli illustrativi delle specialità medicinali ..................................................................................................... 36
Protocollo PreContrastografico........................................................................................................................ 36
Ricadute accessorie .......................................................................................................................................... 37
Riferimenti Bibliografici ..................................................................................................................... 39
Rassegna Bibliografica........................................................................................................................ 41
Indice delle figure e tabelle
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
- Schema Struttura Immunoglobulina .............................................................................. 7
- Molteplicità ed Eterogeneità delle Immunoglobuline.................................................... 8
- Schema di IFE urine di campione con CM IgG-k + k libera (BJP-k).................... 10, 31
- Antisieri anti Catene Leggere - Schemi di reazione..................................................... 11
- Metabolismo delle CLL e sue alterazioni .................................................................... 14
- Anomalie quali-quantitative delle CLL in urine
Risultato analitico e Interpretazione............................................................................. 15
- Catene Leggere Libere e Patologie correlate ............................................................... 20
- Schema della Reazione di ImmunoPrecipitazione ....................................................... 23
- Confronto di tecniche per la ricerca delle BJP (e CLL) .............................................. 27
- Da Monoclonale a Policlonale - Simulazione con Elaboratore elettronico.................. 28
Abbreviazioni
Le abbreviazioni sono in ordine alfabetico; molte abbreviazioni sono "non standard".
IFE
= ImmunoFissazione
Ab
= Anticorpo
Ig
= Immunoglobuline in generale
Ag
= Antigene
IPL
= ImmunoPrecipitazione in fase Liquida
As
= Antisiero
IPS
= ImmunoPrecipitazione su Supporto
BJP
= Proteine di Bence Jones
IR
= Insufficienza Renale
BM
= Banda Monoclonale
IRA = Insufficienza Renale Acuta
CL
= Catene Leggere in generale
IRC = Insufficienza Renale Cronica
CLL
= Catene Leggere Libere
IN
= ImmunoNefelometria
CLLM = Catene Leggere Libere monoclonali
IT
= ImmunoTurbidimetria
CLLBM = Catene Leggere Libere Banda Multipla
LCR = Liquido Cefalo Rachidiano
CLLP = Catene Leggere Libere policlonali
MdC = Mezzo di Contrasto
CLLT = Catene Leggere Totali, Libere & Legate
UC
= Urine Concentrate
CM
= Componente Monoclonale
UNC = Urine Non Concentrate
EF
= Elettroforesi (zonale)
IEP
= ImmunoElettroForesi
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Capitolo I
Introduzione - Storia - Terminologia
Introduzione
Molti Laboratori in Italia e alcuni in Spagna fin dal 1988 eseguono di routine la determinazione "diretta" delle Catene
Leggere Libere (CLL) in ImmunoTurbidimetria o/e ImmunoNefelometria.
Però è Tillyer et al. [1] di Londra che nel giugno 1991 pubblicano sulla prestigiosa "Journal of Clinical Pathology" la
proposta del metodo immunoturbidimetrico "diretto" per la ricerca delle CLL e delle Proteine di Bence Jones (BJP) e la
loro quantizzazione.
L'esigenza del dibattito nasce dalle incertezze e dai dubbi che la ricerca quotidiana delle CLL e BJP ha fatto sorgere
negli ultimi anni, da quando si dispone in routine di metodi elettroforetici e immunologici molto più sensibili e specifici
rispetto al classico “Termo-Test”.
Proverò ad elencare tali incertezze:
a) Fase preanalitica - tipo di campione:
· urina delle 24 ore
· urina della prima o della seconda minzione del mattino
· urina estemporanea
b) Unità di misura:
· mg/dl (o g/l, o mg/l) - concentrazione assoluta nel campione esaminato.
· mg/24 ore - concentrazione x diuresi.
· mg / creatinina urinaria, ecc.
c) Valori di riferimento normali per le CLL policlonali (CLLP).
d) Definizione di uno standard di riferimento.
e) Sensibilità richiesta.
f) Anomalie:
· qualitative: monoclonali, oligoclonali.
· quantitative
· loro correlazioni cliniche
g) Tecniche e Protocolli di ricerca
h) Modelli Organizzativi
Questo scritto è il tentativo di formalizzare le mie riflessioni sul tema delle CLL e delle BJP.
Lo scritto è completato da una “Rassegna Bibliografica”, citazioni e abstract, di articoli inerenti.
Storia: da Henry Bence Jones ad oggi
Saturday, Nov. 1, 1845
Dear Dr. Jones,
The tube contains urine of very high specific gravity.
When boiled, it becomes slightly opaque.
On addition of nitric acid, it effervesces assumes a reddish hue, and becomes quite clear, but as it cool, assumes the
consistency and appearance which you see. Heat reliquifies it. What is it ? [2, 3]
Il primo novembre 1845 il Dr. Henry Bence Jones, noto "Patologo" a Londra (egli stesso pare amasse definirsi "The
best 'Chemical Doctor' in London" [4]), riceveva dal Dr. Thomas Watson prima e poco dopo dal Dr. William
MacIntyre, entrambi noti "Clinici", un campione di urine di un paziente (un noto e ricco commerciante di Londra)
affetto da "mollities ossium".
Il campione gli era stato inviato poiché ai test chimico-fisici dell'epoca aveva mostrato un comportamento sconosciuto.
L'autopsia del paziente evidenziò le tipiche lesioni del mieloma multiplo [5].
La lettera che il Dr. Watson invia al Dr. Jones insieme al campione di urine non ha solo valore storico ma soprattutto
evidenzia quale fosse il livello di collaborazione tra clinico e patologo e di quale portata possono essere i risultati di
tale collaborazione.
Nel 1847 H.B. Jones descriveva le particolari caratteristiche chimico-fisiche del campione, ipotizzava che fossero da
attribuire alla presenza di una proteina anomala, un deutossido idrato di albume, e, intuizione geniale, suggeriva di
ricercare tale proteina nei pazienti con sospetto clinico di "mollities ossium" [2, 3].
Jones aveva scoperto il primo marker tumorale
Nel 1955 esperimenti con plasmacellule in vitro dimostrarono che aminoacidi marcati con radioisotopi venivano
incorporati nella BJP e nelle proteine mielomatose.
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Nel 1962 Edelman e Gally dimostrarono che le CL preparate dalle proteine del siero di un mieloma IgG e la BJP dello
stesso paziente avevano identiche caratteristiche chimico-fisiche. Edelman formulò la teoria che la BJP e le CL fossero
la stessa cosa.
Nel 1963 Porter proponeva per le IgG il modello strutturale a 4 catene; due catene pesanti e due catene leggere.
Nel 1966 e 1967 Putnam et al. pubblicarono la sequenza aminoacidica completa di una BJP.
Oggi sono dimostrati i seguenti punti fondamentali:
a) Nel soggetto normale sono presenti CLL nel sangue, nelle urine e nel liquido cefalo-rachidiano ed è possibile
determinarle quantitativamente con metodi opportuni.
b) Le CLL del soggetto normale (più semplicemente CLL) e le BJP sono sintetizzate "de novo" e non sono prodotti di
degradazione delle Immunoglobuline.
c) Le BJP, le CLL e le Catene Leggere delle Immunoglobuline sono la stessa individualità molecolare in tutti i liquidi
biologici.
d) La BJP e le CLL esistono in forma di monomeri, dimeri e polimeri a più alto peso molecolare in tutti i liquidi
biologici.
e) Le BJP, le CLL e le CL delle Ig, al pari delle Ig intere e delle Catene Pesanti, costituiscono un pool estremamente
eterogeneo per le variazioni strutturali che esse presentano sia nel soggetto normale, legate a tipo, allotipo, e
ideotipo, sia, a maggior ragione, nel caso di patologie della produzione, e che determinano, nell'ambito di una
sostanziale omogeneità:
· variazioni del punto isoelettrico e quindi della mobilità elettroforetica.
· variazioni di alcuni determinanti antigenici e quindi variazioni della reattività nelle tecniche immunologiche.
· variazioni del metabolismo e della funzione.
L'eterogeneità dell'omogeneità è il filo conduttore dello studio e la chiave dell'analisi delle Ig e delle CL.
Più di 100 anni sono trascorsi tra l'individuazione di una proteina anomala e la sua caratterizzazione strutturale,
metabolica, fisiopatologica.
La storia della BJP è esempio di come la metodologia di studio tipica di una scienza o di un suo settore possa essere
stravolta da una accidentale intuizione.
Oggi, a 150 anni dalla sua identificazione, siamo ancora impegnati a discutere intorno alla BJP (e alle CLL) e vedremo
che vi sono ancora elementi non definiti a cominciare dalla metodologia di studio nella pratica quotidiana.
E poi altre domande che attendono risposta:
perché esistono due tipi di Catene Leggere ?
perché produciamo e catabolizziamo 170 mg/die di CLL [6] ?
quale è la funzione delle CLL ?
Alla geniale intuizione di H.B. Jones è da imputare almeno in parte l'aver relegato lo studio delle CLL nell'ambito del
"mollities ossium".
Terminologia
Sia in letteratura che nell'uso corrente vi è confusione; i termini "Proteine di Bence Jones", "Catene Leggere", "Catene
Leggere Libere" sono usati in modo intercambiabile, quasi fossero sinonimi, anche nell’ambito dello stesso articolo.
Data la complessità dell'argomento è invece opportuno definire una terminologia chiara e univoca.
Proprietà terminologica nell'uso corrente e in questo scritto
Di seguito cercheremo di definire i termini di uso corrente che utilizzeremo in questo scritto.
Banda Monoclonale (BM) o Componente Monoclonale (CM):
Banda elettroforetica stretta che reagisce con un solo tipo di antisiero anti Catena Pesante e/o un solo tipo di antisiero
anti Catena Leggera.
Le BM possono essere costituite da Immunoglobuline Intere, dalla sola Catena Pesante, dalla sola Catena Leggera
(Catena Leggera Libera) o da loro combinazioni.
Esempi:
BM o CM IgG-κ = Banda elettroforetica stretta che reagisce esclusivamente con gli antisieri (As) anti γ e anti κ.
BM o CM CLL-λ = Banda elettroforetica stretta che reagisce esclusivamente con l'As anti CLL-λ.
Eccezioni: una CM può essere costituita da due Ig o da una Ig e una CLL. Esempio: BM IgG-λ + CLL-κ.
In un campione possono essere presenti due e eccezionalmente tre CM dello stesso tipo o di tipi diversi.
Avvertenza: la monoclonalità non si esprime necessariamente con la tipica “banda ristretta”; un clone maligno di
cellule-B può produrre una banda larga che però reagisce solo con l'antisiero di una delle due classi di catene leggere
[7].
Proteine di Bence Jones (BJP) o Catene Leggere Libere Monoclonali (CLLM):
Banda elettroforetica stretta che reagisce esclusivamente con un tipo di antisiero anti Catena Leggera Libera o, per via
indiretta, che reagisce con un solo tipo di antisiero anti Catene Leggere Libere & Legate (Antisiero anti Catene Leggere
Totali - CLT) e non reagisce con nessuno dagli antisieri anti Catena Pesante.
In un campione possono essere presenti due o più Bande di BJP, in genere dello stesso tipo.
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Catene Leggere Libere Policlonali (CLLP):
Banda elettroforetica larga che reagisce con entrambi gli antisieri anti CLL.
Le CLLP possono coesistere con le BJP.
Catene Leggere Libere Bande Multiple (CLLBM) e Ladders:
Molteplici Bande elettroforetiche strette che reagiscono con uno o con entrambi i tipi di As anti CLL; possono assumere
un pattern caratteristico detto “ladder” (scala a pioli) [4, 8]. Possono coesistere con una BJP.
L'opinione personale
Oggi è nota la struttura, anche come sequenza aminoacidica, il metabolismo e la fisiologia delle CLL e delle Ig, ed è
pure nota e sistematizzata un'ampia patologia e meccanismi patogenetici legati a queste proteine; e sono disponibili e
utilizzati anche in routine metodi e procedure di indagine enormemente più sofisticate del "TermoTest" di Bence Jones
e successive modificazioni.
Perciò, a mio avviso, senza con ciò nulla togliere alla geniale intuizione di H.B. Jones, ma prendendo atto
dell'evoluzione delle conoscenze in oltre 150 anni da allora, il termine "Proteine di Bence Jones" andrebbe sostituito
con “Catene Leggere Libere" seguito, se necessario, dall'attributo "monoclonale" ,"oligoclonale" e "policlonale"
secondo l'aspetto dopo separazione elettroforetica.
A proposito di questi attributi mi sia consentita una riflessione.
La scienza medica raramente consente procedure sperimentali rigorose, positive e prospettiche, tipiche delle "scienze
esatte", (per esempio, non potremo sottoporre all'iniezione di mezzo di contrasto un numero statisticamente sufficiente
di pazienti affetti da mieloma al fine di stabilire con sicurezza se il mieloma è un fattore di rischio per le
contrastografie) ma solo l'associazione logica di osservazioni che inducono deduzioni probabili.
Il Laboratorio non è in grado di accertare la relazione tra l'aspetto elettroforetico delle Ig e la "clonalità" della loro
produzione; quindi sarebbe forse prudente limitarsi a descrivere ciò che si vede, sostituendo il termine “banda
monoclonale” o “componente monoclonale” con “banda anomala ristretta” e il termine “policlonale” con “macchia
diffusa”; o termini analoghi.
Si consideri che, come già detto, la monoclonalità non si esprime necessariamente con la tipica “banda ristretta”; un
clone maligno di cellule-B può produrre una banda larga che però reagisce solo con l'antisiero di una delle due classi di
catene leggere [7].
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Capitolo II
Immunoglobuline e Catene Leggere
Introduzione - Struttura - Molteplicità ed Eterogeneità - Antisieri
Introduzione
Le Immunoglobuline differiscono dalle altre proteine per un insieme di peculiari caratteristiche sintetizzabile in:
ƒ molteplicità: Classi, Tipi, SottoTipi.
ƒ eterogeneità: nell'ambito della stessa Classe, Tipo e SottoTipo.
ƒ specificità anticorpale.
In effetti, un'intera scienza, l'Immunochimica, si è sviluppata sulle interazioni tra antigene e anticorpo, sul meccanismo
della biosintesi degli anticorpi, sulla natura della specificità dell'anticorpo, e sulla identificazione e quantizzazione di
proteine e altre sostanze sia ad alto sia a basso peso molecolare con metodi immunologici.
Le Immunoglobuline (Ig) sono definite come proteine di origine animale con riconosciuta attività anticorpale; nel
termine di Ig vengono anche incluse alcune proteine correlate con gli anticorpi per la struttura chimica e la specificità
antigenica tra cui particolare dignità hanno le Catene Leggere Libere (CLL).
Tutte queste proteine sono prodotte dal sistema delle cellule linfoidi dei vertebrati, circolano nel sangue, ma si ritrovano
anche in molti altri liquidi biologici.
Le Ig migrano elettroforeticamente in zona γ fino alla zona β.
La caratteristica chimica più importante è la loro eterogeneità.
Le Ig del plasma normale e la maggior parte degli anticorpi purificati mostrano caratteristiche eterogenee per i diversi
parametri testati: fisico-chimici, biologici, strutturali.
Una eterogeneità così spinta avrebbe reso molto difficile lo studio delle Ig; i reali progressi delle conoscenze sulle Ig e
le CLL si sono basati sullo studio e l'analisi delle BJP e delle Ig mielomatose, e ciò grazie alla loro omogeneità.
Possiamo dire che i pazienti mielomatosi, uno sfortunato esperimento della natura, hanno permesso il progresso
delle conoscenze sulla struttura e le altre caratteristiche delle Ig.
Rimandando ai trattati per l'approfondimento, ci preme qui sottolineare, e continueremo a farlo in questo scritto, la
molteplicità e l'eterogeneità delle Ig e dei loro componenti.
Basti pensare che Putnam, tra le molte BJP e Ig Monoclonali studiate, non ha mai trovato due strutture identiche.
Struttura
L'unità strutturale monomerica delle Figura: 1
Schema Struttura Immunoglobulina
Immunoglobuline è composta da:
ƒ due Catene Pesanti (Catena H = Heavy)
(CP) identiche, dello stesso tipo
ƒ due Catene Leggere (Catena L = Light)
(CL) identiche, dello stesso tipo.
Sono noti cinque tipi di Catena Pesante
(CP) convenzionalmente denominati: γ, α,
µ, δ, ε, e alcuni SottoTipi.
Le Catene Pesanti caratterizzano le cinque
Classi di Immunoglobuline: IgG, IgA,
IgM, IgD, IgE.
Sono noti due tipi di Catena Leggera (CL)
convenzionalmente denominati: κ e λ.
Le Catene Leggere caratterizzano i due
Tipi di Immunoglobuline: Ig-κ e Ig-λ.
Le IgG sono tipicamente monomere.
Le IgA sono presenti come monomeri,
dimeri o polimeri a più alto coefficiente di
sedimentazione.
Le IgM sono presenti come pentameri o
polimeri a più alto coefficiente di sedimentazione.
Le CL legate alle Catene Pesanti a formare l'Immunoglobulina hanno alcuni determinanti antigenici “nascosti”
("hidden"), cioè determinanti che non sono in grado, perché stericamente mascherati, di reagire con l'antisiero.
Le Catene Leggere Libere (CLL) hanno esposti, cioè in grado di reagire con l'antisiero, anche i determinanti che sono
“nascosti” quando esse sono legate alla Catena Pesante.
Questa caratteristica consente di ottenere antisieri che reagiscono solo con i determinanti "nascosti" ("hidden") della
Catena Leggera e quindi evidenziano direttamente e specificamente le Catene Leggere Libere.
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Molteplicità ed Eterogeneità
La molteplicità ed eterogeneità delle Immunoglobuline è formalizzabile come segue:
A) Classe, SottoClasse e Tipo
I tipi e sottotipi delle Catene Pesanti caratterizzano la Classe e SottoClasse dell'Immunoglobulina mentre le Catene
Leggere ne caratterizzano il Tipo.
Per esempio con "IgG1-κ" intendiamo una Ig che monta Catene Pesanti tipo "γ", SottoTipo "γ1" e Catene Leggere di
Tipo "κ".
B) Isotipo
Con questo termine si intendono quei determinanti antigenici che caratterizzano i tipi e sottotipi delle Catene Pesanti e
delle Catene Leggere e che sono comuni a tutti gli individui della stessa specie e di questa specifici ed esclusivi.
I determinanti isotipici consentono di ottenere gli antisieri commerciali utilizzati nelle tecniche immunologiche di
routine per lo studio qualitativo e quantitativo delle Ig e delle CL.
C) Allotipo
Le Catene Pesanti e le Catene Leggere degli individui di una stessa specie hanno, oltre a gruppi antigenici comuni,
anche gruppi antigenici che non sono comuni a tutta la specie ma solo ad un gruppo di individui della specie.
D) Ideotipo
Le Immunoglobuline della stessa Classe e Tipo e dello stesso individuo hanno, oltre ai gruppi antigenici comuni a tutti
gli individui della stessa specie e ai gruppi antigenici comuni agli individui con identico allotipo, anche gruppi
antigenici specifici del "sito combinatorio anticorpale".
Il sito combinatorio è costituito dalla parte terminale della Catena Pesante e della Catena Leggera accoppiate.
La specificità anticorpale viene realizzata dalla variabilità della struttura di questa parte terminale
dell'Immunoglobulina.
Un clone plasmacellulare è competente a produrre Immunoglobuline con una sola specificità anticorpale e comunque
con il sito combinatorio uguale.
Se è vero che la caratteristica centrale sotto ogni punto di vista delle Ig è l'eterogeneità risulta ovvio che l'alterazione di
tale caratteristica, la presenza di Ig omogenee, corrisponda ad una situazione anomala, patologica.
Figura: 2
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Molteplicità ed Eterogeneità delle Immunoglobuline - Putnam, Vol. III, pag. 36
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Effetti della Eterogeneità
Gli effetti della eterogeneità delle Immunoglobuline sono molteplici e complessi ma qui interessa ricordarne due:
ƒ possibilità di ottenere antisieri specifici a diversi livelli di cui i più utilizzati sfruttano l'Isotipo.
ƒ effetti sulle tecniche di laboratorio.
Di seguito accenneremo al secondo punto mentre degli antisieri si dirà nel prossimo capitolo.
Effetti sulle tecniche si laboratorio
Elettroforesi Zonale (EF)
La tipica macchia diffusa che caratterizza la "zona gamma" dell'EF delle sieroproteine del soggetto normale è
espressione della eterogeneità delle Immunoglobuline e più precisamente esprime:
ƒ Classi, SottoClassi e Tipi
ƒ Ideotipi.
Poiché tale eterogeneità esprime la molteplicità dei cloni plasmacellulari, le Immunoglobuline che costituiscono la zona
gamma di un'elettroforesi normale vengono chiamate "Immunoglobuline Policlonali", termine che si contrappone a
"Immunoglobuline Monoclonali", cioè Ig con eterogeneità ristretta prodotte da un solo clone la cui espressione
elettroforetica assume il termine "Banda Monoclonale" (BM) o “Componente Monoclonale” (CM).
La Banda Monoclonale, caratteristica peculiare ma non esclusiva dei mielomi e della Macroglobulinemia di
Waldenström, è l'espressione elettroforetica della prevalenza di un clone rispetto agli altri.
L'EF e le tecniche che su di essa si basano quali la IFE sono le sole disponibili in routine per valutare la eterogeneità
delle Immunoglobuline; d'altra parte esse forniscono informazioni solo semiquantitative e la sensibilità decresce dalla
distribuzione monoclonale a quella policlonale (vedi in seguito).
ImmunoPrecipitazione in fase liquida (IPL) - nefelometria e turbidimetria
Queste tecniche che in prima analisi possono essere considerate “precise” e “accurate” non danno alcuna informazione
sulla eterogeneità delle Ig o danno informazioni solo indirette, per esempio nel caso di importante aumento quantitativo
di una Ig e contemporanea diminuzione delle altre.
Inoltre, nel caso di ridotta eterogeneità delle Ig, diventano inaccurate per la mancanza di parallelismo tra l'eterogeneità
di composizione del campione e quella del calibratore.
Antisieri
La possibilità di ottenere antisieri contro le diverse classi e sottoclassi di Ig e di CL è legata ai determinanti antigenici
isotipici delle Catene Pesanti, delle Catene Leggere e dei frammenti di Ig: Fc, Fab, ecc.
Gli animali più utilizzati sono la capra, la pecora e il coniglio.
Gli antisieri sono disponibili in commercio in varie “preparazioni”, le più comuni sono:
ƒ Antisiero Standard o Totale: è il siero intero, solo delipidizzato, dell'animale immunizzato.
ƒ Antisiero Frazione Ig o IgG: è la frazione Ig o IgG ottenuta dal siero dell'animale immunizzato; per esempio,
Antisiero IgG da capra anti IgG umane.
Questi antisieri, per essere costituiti dalla sola frazione Ig o IgG del siero animale, danno un “fondo” inferiore
rispetto agli antisieri Totali, vantaggio soprattutto evidente nelle tecniche di immunoprecipitazione nei gel seguite da
colorazione: IFE, ecc.
Antisieri anti Immunoglobuline
Gli antisieri anti classi e sottoclassi delle Immunoglobuline si ottengono immunizzando l'animale con la Catena Pesante
delle Ig umane. Pertanto un antisiero anti IgG si ottiene immunizzando con la Catena Pesante γ umana e reagirà con
tutte le IgG sia κ che λ.
Oltre ad antisieri specifici per le diverse classi e sottoclassi di Ig sono disponibili antisieri polivalenti:
ƒ trivalenti per le tre classi principali di Ig: IgA+IgG+IgM
ƒ pentavalenti per le cinque classi di Ig: IgA+IgG+IgM+IgD+IgE.
Antisieri anti Catene Leggere
La possibilità di ottenere antisieri contro i due Tipi di Catene Leggere umane è legata ai loro determinanti antigenici
isotipici. Con opportuni procedimenti sono realizzabili due tipi di antisiero anti Catena Leggera:
ƒ Antisiero anti Catene Leggere Libere & Legate o Catene Leggere Totali (CLT) - κ e λ
ƒ Antisiero anti Catene Leggere Libere (CLL) - κ e λ.
Vediamo più in dettaglio con l'ausilio della Figura: 4.
Antisiero anti Catene Leggere Libere & Legate o Catene Leggere Totali (CLT)
Sono due antisieri, anti κ e anti λ, che si ottengono immunizzando l'animale con le CLL umane κ e λ.
L'animale produrrà anticorpi verso tutti i determinanti antigenici della CLL, sia quelli "nascosti" che quelli "non
nascosti".
Questi antisieri reagiscono indifferentemente con:
ƒ le Ig intere poiché reagiscono con i siti antigenici "non nascosti" delle CL che le costituiscono
ƒ le CLL poiché reagiscono con i loro determinanti "non nascosti" e "nascosti".
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Antisiero anti Catene Leggere Libere
Si ottiene allontanando dal precedente gli anticorpi rivolti verso i siti antigenici "non nascosti" della CL; cioè si fa
reagire l'As anti CLT con Ig intere e si recuperano gli anticorpi che non hanno reagito; questi anticorpi sono
evidentemente rivolti verso i siti antigenici "nascosti" della CL.
Un tale antisiero reagisce con le CL solo se sono Libere (CLL) poiché solo in questo caso sono esposti i determinanti
"nascosti".
Confronto tra As anti CLT e As anti CLL
Per la ricerca immunologica delle CLL spesso si preferisce utilizzare As anti CLT e procedure indirette invece che As
anti CLL e procedure dirette.
Le critiche agli antisieri anti CLL sono:
ƒ bassa reattività
ƒ reattività aspecifica con le CL delle Ig
ƒ costo più elevato rispetto agli As anti CLT
Per quanto riguarda i primi due punti già da alcuni anni vi è più di un produttore in grado di fornire Antisieri anti CLL
che utilizzati per la IEF e la IFE hanno reattività molto buona e non evidenziano reazione aspecifica con le CL delle Ig.
Eccezionalmente capita che tali antisieri con la IFE diano reazioni sfumate (ma comunque visibili) e ciò è in relazione
al fatto che una BJP può avere un numero molto piccolo di epitopi riconosciuti dall'antisiero.
Per l'Immunoprecipitazione in Fase Liquida (IPL), turbidimetria e nefelometria, sono necessari opportuni accorgimenti
per ottenere risultati soddisfacenti con gli As anti CLL sia in termini di specificità sia in termini di reattività.
Per quanto riguarda il costo, vedremo anche più avanti che, ove si consideri non la "Economia di Cassa", cioè il costo di
un ml di antisiero, ma la "Economia di Gestione", cioè il costo complessivo della ricerca delle CLL o delle BJP, la
convenienza dell'uso degli As anti CLT rispetto agli As anti CLL può risultare a favore di questi, senza contare che il
risultato è più attendibile.
Anticipando quanto diremo meglio in seguito, non possiamo condividere l'opinione che, per la ricerca delle BJP nelle
urine con la IFE, sia sufficiente l'uso degli As anti CLT.
Questa opinione poggia sull'ipotesi che, nel caso non infrequente di eliminazione urinaria sia della Ig Monoclonale sia
della CLL Monoclonale (BJP), questa migri in modo diverso rispetto alla Ig e pertanto si renda evidente come banda
separata, autonoma, che reagisce solo con l'As anti CLT, ben distinta dalla banda che reagisce sia con l'As anti CLT sia
con l'As anti Catena Pesante.
Invece, capita frequentemente che la BJP sia perfettamente sovrapposta alla Ig monoclonale e perciò indistinguibile
con l'As anti CLT mentre è chiaramente evidenziabile con l'As anti CLL (Figura: 3).
In Figura 4 è schematizzata la reazione dei due tipi di antisieri anti CL.
Figura: 3
Schema di IFE urine di campione con CM IgG-k + k libera (BJP k)
Rif
IgG
IgA
IgM
CLT- κ
CLT- λ
A sinistra
IFE "tipo siero" con Antisieri anti CLT, senza Antisieri anti
CLL.
Referto:
CM IgG-k - BJP assente
Rif
Ig
CLT- κ
CLT- λ
CLL- κ
CLL- λ
A destra
IFE con Antisiero anti Ig (polivalente Catene Pesanti) e
antisieri anti CLT e CLL.
Referto: CM IgG-k + BJP-k
La BJP presente nel cam pione ha la stessa velocità di m igrazione della Im m unoglobulina intera è pertanto
non si evidenzia se non con l'uso degli antisieri anti Catena Leggera Libera.
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Figura: 4
Antisieri anti Catene Leggere - Schemi di reazione
E` schematizzata la diversa reazione dei due tipi di antisiero anti Catene Leggere: As anti Catene Leggere Totali e As
anti Catene Leggere Libere.
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Capitolo III
Catene Leggere Libere: Metabolismo e FisioPatologia
Introduzione
Il riferimento bibliografico fondamentale per questo capitolo è la Revisione di Sølling [6].
La concentrazione delle CLL (e di qualsiasi altro metabolita) nei diversi liquidi biologici, o compartimenti, è la
risultante di:
volume del compartimento
quantità dell'elemento in entrata nel compartimento:
· perché prodotta da elementi strutturali del compartimento
· perché immessa da un altro compartimento
quantità dell'elemento in uscita dal compartimento:
· per il passaggio in altro compartimento
· per trasformazione in altro elemento nello stesso compartimento.
La contemporanea "normalità" della concentrazione nei diversi compartimenti dipende dalla "normalità" dei flussi che,
a sua volta, è funzione della normalità di:
strutture
meccanismi funzionali
interferenze
compensazioni.
Pertanto, se per comodità in genere di un analita misuriamo la sua concentrazione, essa, per la sua stessa staticità, non
può essere espressione esaustiva del complesso meccanismo dinamico che la determina, e per una migliore
interpretazione sarà necessario tenere presenti gli elementi suddetti.
Nel concreto, per interpretare la concentrazione e la qualità: mono, oligo o policlonale delle CLL nelle urine (e negli
altri liquidi biologici: sangue, Liquido cefalo-rachidiano, ecc.) dovremo tener presente:
le strutture e i meccanismi di sintesi e immissione in circolo
le strutture e i meccanismi di eliminazione nelle urine
i tempi: espressi dall'emivita
i volumi: volemia e diuresi
le interferenze e le compensazioni.
Nelle prossime pagine descriveremo schematicamente le strutture e i meccanismi interessati a determinare la
concentrazione delle CLL nel sangue e nelle urine, e di seguito è una sintesi.
Metabolismo delle Catene Leggere Libere
Le Catene Leggere Libere (CLL), al pari delle Immunoglobuline (Ig), sono prodotte e immesse in circolo dalle
plasmacellule.
La produzione di CLL (kappa + lambda), cioè di Catene Leggere non incorporate nelle Immunoglobuline complete, è di
circa 170mg/24h e costituisce il 10-20% della produzione giornaliera di Catene Leggere (CL)[6].
Il catabolismo delle CLL avviene quasi interamente nel rene.
La concentrazione di CLL nel sangue del soggetto normale è molto bassa ( ≈ 2mg/dl ) [6] pur essendo rilevante la
quantità immessa in circolo poiché, per il basso peso molecolare (22.000 per il monomero), esse passano rapidamente
nel Filtrato Glomerulare (FG).
Altrettanto bassa è la concentrazione nelle urine ( ≈ 5 mg/24h) [6] dato che le CLL presenti nel FG sono riassorbite e
catabolizzate del Tubulo Prossimale.
Dal punto di vista renale il comportamento delle CLL è sovrapponibile a quello delle altre Microglobuline: β2-micro,
α1-micro, ecc. [6].
Nel soggetto con Filtrato Glomerulare normale, l'emivita delle CLL è valutata tra 30 e 60 minuti [6] se si esclude lo
stazionamento in vescica.
Le CLL nelle urine esprimono il bilancio tra sintesi delle Cellule-B e catabolismo renale (filtrazione glomerulare e
riassorbimento tubulare) nel periodo tra l'ultima minzione e quella attuale, o nel periodo della raccolta [9].
L’aumento della concentrazione di CLL nelle urine tanto da poterle evidenziare con i metodi di routine dei Laboratori
può essere determinato da:
aumento della produzione di CLL cui segue aumento della loro concentrazione nel Filtrato Glomerulare e
superamento della capacità attuale specifica del riassorbimento tubulare.
riduzione della capacità attuale specifica del riassorbimento tubulare.
concorrenza delle due situazioni precedenti.
Le CLL nelle urine saranno policlonali (CLLP) o monoclonali (CLLM - Proteine di Bence Jones - BJP) o le due
contemporaneamente secondo la qualità della produzione delle Cellule-B.
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Alcune tecniche elettroforetiche caratterizzate da alta risoluzione e alta sensibilità mostrano le CLLP distribuite, invece
che nella tradizionale macchia diffusa, in bande strette e omogenee, da 3 fino a 7, organizzate secondo un pattern
caratteristico denominato “ladder” (scala a pioli) [4, 8].
Il fenomeno non ha per ora spiegazione sicura ma certamente crea qualche problema nella interpretazione differenziale
tra CLLP e BJP anche per la possibilità di sovrapposizione delle due situazioni [4, 8].
In Figura 5 è schematizzato il metabolismo delle CLL e le sue alterazioni; in Figura 6 il risultato quali-quantitativo della
ricerca delle CLL in urine patologiche e relativa interpretazione.
Figura: 5
Metabolismo delle CLL e sue alterazioni
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Figura: 6
Anomalie quali-quantitative delle CLL in urine - Risultato analitico e Interpretazione
Im m unoglobuline e Catene Leggere Libere in Urine
Risultato analitico
Catene Leggere Libere Monoclonali
Catene Leggere Libere "Oligoclonali"
Catene Leggere Libere Policlonali
eventuali altre informazioni
Immunoglobuline Monoclonali
Immunoglobuline Policlonali
Interpretazione
Bence Jones - Immunoproliferative
Bence Jones - Immunoproliferative
altre situazioni di significato incerto:
es. "Ladders" o "Pseudo-Oligoclonali"
Malattie Iperimmuni
Alterata Funzione Tubulare
Ig Monoclonale nel siero con
alterata Funzione Glomerulare
alterata Funzione Glomerulare
Combinazioni dei casi precedenti
Sintesi delle Catene Leggere Libere
La Plasmacellula sintetizza separatamente le Catene Leggere e le Catene Pesanti delle Immunoglobuline.
L'assemblaggio nell'unità strutturale monomerica avviene dopo la loro liberazione nelle cisterne del reticolo
endoplasmatico.
Benché la sintesi di Catene Leggere e Catene Pesanti sia un processo molto ben bilanciato, la presenza di Catene
Leggere Libere nel sangue del soggetto normale induce a ritenere che le Catene Leggere siano prodotte in leggero
eccesso rispetto alle Catene Pesanti.
Non è chiaro se questo lieve sbilanciamento sia una caratteristica di tutti i cloni o solo di alcuni cloni plasmacellulari.
Le anomalie di sintesi delle CLL riflettono le anomalie di sintesi delle Ig a cui si aggiunge il Mieloma Micromolecolare
che ha il suo equivalente nella “Malattia delle Catene Pesanti”. Possiamo così schematizzare:
riduzione della sintesi: ipo e agammaglobulinemie.
aumento della sintesi:
· monoclonale: nelle malattie immunoproliferative.
· policlonali: nelle malattie iperimmuni.
Eliminazione delle Catene Leggere Libere
Le CLL monomeriche hanno peso molecolare di circa 22.000, 44.000 i dimeri e 88.000 i tetrameri.
Pertanto, analogamente a quanto accade per le altre proteine a basso peso molecolare: beta2-microglobulina, alfa1microglobulina, ecc., le CLL filtrano facilmente attraverso il glomerulo renale e sono riassorbite dal tubulo prossimale
dove vengono catabolizzate ad aminoacidi e questi sono rimessi in circolo.
Non sembra esistere un meccanismo di trasporto dal tubulo nel sangue.
Ricordiamo che le cellule e più in generale le strutture hanno capacità di lavoro caratteristica per qualità e quantità.
Nel caso delle CLL la cellula del tubulo prossimale esegue due operazioni:
riassorbe le CLL presenti nel Filtrato Glomerulare (FG).
catabolizza le CLL riassorbite.
Riassorbimento Tubulare
La prima fase del riassorbimento tubulare delle CLL (e delle altre proteine presenti nel filtrato glomerulare) è il legame
che si formerebbe tra i gruppi amminici o guanidinici liberi della proteina (positivi) e "siti" negativi della superficie
della Cellula Tubulare.
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Questo meccanismo è confermato dall'osservazione che l'iniezione endovenosa di arginina in un soggetto normale
determina l'immediato (entro 2 minuti dall'inizio della somministrazione) e dose-dipendente incremento dell'escrezione
urinaria di albumina, beta2-microglobulina e CLL.
L'escrezione si normalizza entro 20-40 minuti dal termine della somministrazione.
Esperimenti simili condotti con una serie di altre sostanze confermano l'ipotesi suddetta.
Catabolismo Tubulare
Le CLL riassorbite sono catabolizzate dalle cellule tubulari.
L'aumento del carico in CLL e il conseguente aumento del loro riassorbimento possono determinare la saturazione della
capacità catabolica e l'accumulo di CLL nella cellula tubulare e quindi sofferenza cellulare.
La diversa nefrotossicità delle CLL potrebbe incidere a questo livello.
Concentrazioni di CLL nel soggetto normale
La concentrazione di CLL nel sangue del soggetto normale è molto bassa ( ≈ 2mg/dl ) pur essendo rilevante la quantità
immessa in circolo ( ≈ 170mg/24h ) poiché per il basso peso molecolare esse passano rapidamente nel Filtrato
Glomerulare (emivita di 30-60 minuti escluso lo stazionamento in vescica [9]).
Altrettanto bassa è la concentrazione nelle urine ( ≈ 5mg/24h ) dato che le CLL presenti nel FG sono riassorbite e
catabolizzate dal tubulo prossimale.
Possiamo concludere che sia nel sangue che nelle urine del soggetto normale:
le CLL sono presenti in quantità "minime".
le CLL presenti sono “policlonali”.
Produzione giornaliera di Ig e di CLL
Il fatto che le CLL siano presenti in piccola quantità nel siero e nelle urine non significa che la quantità prodotta dalle
plasmacellule sia ugualmente piccola.
Il metabolismo delle Ig è di 2-3 g/24 h per le IgG, 0,6-2 g/24 h per le IgA e 0,4 g/24 h per le IgM; questo significa che
in 24 h viene metabolizzato un totale di Ig pari a 3-5,4 g.
Poiché le CL costituiscono circa il 30% delle Ig si può calcolare che in 24h vengono incorporate nelle Ig 0,9-1,6 g di
CL.
E` stato calcolato che la quantità di CLL filtrata dal glomerulo è di circa 170 mg/24h: 110 mg/24h per le κ e 60
mg/24h per le λ.
Questo vuol dire che il 10-20% delle CL prodotte non viene incorporato nelle Ig.
Questa quota non è affatto trascurabile sia in termini assoluti che relativi e induce a riflettere su quale potrebbe essere la
reale funzione delle CLL.
Emivita di Ig e di CLL
L'emivita delle IgG è di 21 giorni per le IgG1, IgG2 e IgG4, e di 7-9 giorni per le IgG3; l'emivita delle IgA è 6 giorni e
quella delle IgM è di 5 giorni mentre l'emivita delle CLL è di circa 1 h.
Deriva che le Ig del siero sono l'espressione della produzione plasmacellulare di diversi giorni, diciamo 15.
Le CLL nelle urine del soggetto normale (o con filtrato glomerulare normale) sono l'espressione della produzione
plasmacellulare intervenuta durante il periodo di stazionamento in vescica dell'urina o durante il periodo della raccolta.
Sembra dimostrato che solo pochi cloni sono contemporaneamente attivi nel produrre Ig (e CLL) e pertanto nel soggetto
normale la "produzione istantanea" di Ig (e di CLL) sarebbe "oligoclonale".
Se è vera questa ipotesi, data l'emivita di Ig e di CLL, le Ig risultano policlonali all'EF del siero (e delle urine) perché
sono l'espressione della produzione dei cloni di almeno 15 giorni, mentre le CLL possono risultare oligoclonali all'EF
delle urine perché espressione della produzione avvenuta durante la raccolta.
Alterazioni del metabolismo delle CLL
Una volta definita la struttura e individuato il luogo e meccanismo di produzione e il luogo e meccanismo di
eliminazione delle CLL possiamo schematizzare cosa avviene nel caso di incremento di produzione o diminuzione di
catabolismo.
Aumento di produzione
causa: aumento del numero di cellule produttrici
effetto:
· incremento della quantità di CLL immesse in circolo
tale incremento non determina aumento della concentrazione ematica di CLL fino a quando il Filtrato Glomerulare
non scende sotto i 30ml/min. poiché le CLL passano liberamente il Filtro Glomerulare.
· incremento della quantità di CLL nel Filtrato Glomerulare
· incremento della quantità di CLL riassorbita dal Tubulo
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· se la quantità di CLL nel filtrato glomerulare supera la capacità attuale di riassorbimento del tubulo le CLL non
riassorbite verranno eliminate nell'urina definitiva.
· se la quantità di CLL riassorbite dalla Cellula Tubulare supera la capacità catabolica attuale della Cellula Tubulare
si avrà accumulo di CLL nella Cellula e conseguente sofferenza cellulare.
Il deficit tubulare secondario al sovraccarico determina la chiusura del circolo vizioso.
La nefrotossicità delle CLL sembra essere più legata alla qualità che alla quantità; vi sono pazienti che eliminano
piccole quantità di BJP e evidenziano una rapida e irreversibile compromissione renale mentre altri eliminano una
importante quantità di BJP per anni senza evidenziare danni renali.
In sintesi:
incremento della quantità di CLL in circolo
sovraccarico tubulare e conseguente proteinuria
danno tubulare.
Diminuzione del catabolismo
causa: deficit del riassorbimento tubulare delle CLL per:
· insufficienza tubulare primitiva
· insufficienza tubulare secondaria a sovraccarico di CLL o di altre sostanze: aminoacidi, farmaci, ecc.
effetto:
· normale quantità di CLL in circolo e quindi nel Filtrato Glomerulare
· riduzione della quantità di CLL riassorbite dal Tubulo e eliminazione nell'urina delle CLL non riassorbite.
Aumento delle CLL nel Sangue
Perché si possa determinare un aumento della concentrazione ematica di CLL è necessario che si determini una
insufficiente filtrazione glomerulare rispetto al carico attuale di CLL.
Infatti, prendiamo in esame alcune ipotesi:
se aumenta la sintesi di CLL, a meno che tale aumento non sia imponente, la concentrazione ematica non subirà
rilevanti variazioni finche il filtrato glomerulare è sufficiente.
poiché anche nel soggetto normale vi è una piccola quantità di CLL immessa in circolo, una riduzione del filtrato
glomerulare determinerà un aumento della concentrazione di CLL nel sangue.
In effetti, in pazienti con Filtrato Glomerulare inferiore a 5-10 ml/min. e senza presumibile aumento della sintesi di
CLL, la concentrazione di CLL nel sangue risulta dalle 5 alle 8 volte aumentata rispetto a quella del soggetto normale
[6].
Al contrario, pazienti con Mieloma Micromolecolare e BJP anche imponente, superiore a 400 mg/dl (e 4600 mg/die),
possono presentare una concentrazione sierica di CLL normale [6].
Aumento di CLL nelle Urine
Le cause che determinano l'aumento di concentrazione delle CLL nelle urine sono schematicamente:
aumento della sintesi e conseguente aumento nel filtrato glomerulare tale da superare la capacità di riassorbimento
del tubulo prossimale:
· se l'aumento di sintesi è monoclonale o oligoclonale avremo nelle urine rispettivamente CLL monoclonali o
oligoclonali.
· se l'aumento di sintesi è policlonale avremo nelle urine CLL policlonali.
riduzione del riassorbimento specifico del tubulo prossimale per:
· interferenza e competizione di altre sostanze presenti nel filtrato glomerulare; per esempio: aminoacidi tipo
arginina, lisina, ecc., farmaci, ecc.
· ridotta funzionalità a seguito di danno tubulare.
In entrambi i casi le CLL nelle urine rispecchieranno il tipo di produzione.
combinazione delle due situazioni suddette.
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Capitolo IV
Catene Leggere Libere - Patologie Correlate
Introduzione
Per questo argomento si veda l'ottima trattazione di Fang [10]; la Figura 7 riporta la sintesi schematica.
Nella pratica di Laboratorio la ricerca delle CLL assume diversa valenza se trattasi di BJP o di CLLP mentre rilievo a
parte ha nell'ambito dei protocolli precontrastografici.
Alla rilevanza, come sotto sintetizzata, della ricerca intorno alle BJP e alle CLL, non sembra, allo stato, corrispondere
una adeguata standardizzazione di metodi, protocolli, riferimenti, controlli e della comunicazione refertuale, tutte
esigenze fortemente e giustamente sentite dagli operatori.
Sarebbe infatti auspicabile che un campione risultasse almeno "BJP-positivo" o "BJP-negativo" in tutti i
Laboratori.
CLL Monoclonali o Proteine di Bence Jones (BJP)
Le Proteine di Bence Jones (BJP), cioè le CLLM in urine in corso di malattie linfoproliferative per l'aumento di
produzione delle plasmacellule di un clone cui segue e si aggiunge la nefropatia tubulare secondaria al sovraccarico,
sono storicamente il primo marker tumorale identificato e, dopo più di 150 anni dalla geniale intuizione di Henry Bence
Jones [2, 3], conservano intatto il loro valore di segno diagnostico a volte unico, precoce e di rilievo accidentale e
inatteso; non solo, ma hanno acquistato valore nella diagnostica differenziale, nella prognosi e per seguire l'andamento
della malattia.
Le BJP sono presenti nel 60-80% dei pazienti con Mieloma Multiplo e, nel 15-20% dei Mielomi sono l’unico prodotto
secreto dal clone maligno (Mieloma Micromolecolare).
BJP si trovano in corso di molte altre neoplasie delle Cellule-B: Macroglobulinemia di Waldenström, Leucemia
Linfatica Cronica, Malattia delle Catene Pesanti µ e altre neoplasie linfoproliferative.
Le BJP, causa della malattia, sono presenti in un'alta percentuale di pazienti con Amiloidosi AL e, più raramente, in
pazienti con Malattia da Deposito di Catene Leggere.
Piccole quantità di BJP si trovano nelle urine di pazienti con Componente Monoclonale nel siero non associata a
malattia (MGUS).
D'altra parte, quantità anche rilevanti di BJP possono essere presenti in pazienti che non presentano alcuna malattia
sistemica: Proteinuria di Bence Jones Idiopatica [11], anche se quasi sempre in questi casi il follow-up a lungo termine
ha evidenziato l'evoluzione in Mieloma Multiplo o Amiloidosi [12].
Quindi, con rare eccezioni, le BJP non solo indicano un processo maligno, ma sono esse stesse una “entità maligna”
(il Mieloma Micromolecolare non è di per se “più maligno” degli altri mielomi) che produce effetti patologici
soprattutto sul rene [13].
Catene Leggere Libere Policlonali
Un eccesso di CLLP in urine può essere conseguenza di un aumento della produzione policlonale o di una alterazione
della funzione tubulare.
Aumento della produzione policlonale
L’eccesso di CLLP in urine è frequente nelle malattie infiammatorie acute e croniche quali la sarcoidosi, la tubercolosi
polmonare, il Lupus Erythematosus, l'Artrite Reumatoide, ecc.
Alterazione della Funzione Tubulare
Le CLL policlonali (CLLP) in urine sono indice sensibile, al pari delle altre microglobuline, di insufficienza del
riassorbimento tubulare specifico.
Il loro riscontro nel paziente diabetico, sia adulto [14] sia bambino [15], sembra essere segno predittivo di nefropatia
anche in assenza di albuminuria.
L'insufficienza tubulare e la conseguente presenza di CLLP in urine può essere transitoria, legata, per esempio, a carico
in aminoacidi tipo lisina o arginina o all'assunzione di farmaci.
Controindicazioni all'uso dei mezzi di contrasto
Rilievo a parte ha la ricerca delle BJP nell'ambito delle controindicazioni all'uso dei mezzi di contrasto organo-jodati
per via iniettiva (e anche per Os [16]).
Per l'insorgenza dell'Insufficienza Renale Acuta, al nesso originario tra Mieloma e Mezzo di Contrasto [17, 18] si è
andato sostituendo il nesso tra BJP, altre concause e mezzo di Contrasto [10,16,19].
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I mezzi di contrasto “non ionici” e quelli a “bassa osmolarità” sembrano meno nefrotossici rispetto a quelli classici ad
“alta osmolarità” nei soggetti con alterazioni della funzione renale mentre nel soggetto normale non sarebbero rilevabili
differenze [20,21]. Pertanto il rapporto costo/beneficio non sembra al momento giustificare l'uso indiscriminato dei
mezzi “non ionici” e a “bassa osmolarità”, più costosi dei tradizionali ad “alta osmolarità” [22,23]. Benché sia
teoricamente ipotizzabile che nei pazienti con BJP l’uso dei mezzi di contrasto “non ionici” possa ridurre il rischio di
Insufficienza Renale, non vi sono, per ora, dati clinici a supporto [19].
Figura: 7 - Catene Leggere Libere e Patologie Correlate
Patologie
Proteine di Bence Jones (BJP)
Mieloma Multiplo (di cui 15-20% Mieloma Micromolecolare)
Macroglobulinemia di Waldenström
Leucemia Linfatica Cronica
Malattia delle Catene Pesanti µ
altre neoplasie linfoproliferative
Amiloidosi AL
Malattia da Deposito delle Catene Leggere
CM nel siero non associata a malattia (MGUS)
Proteinuria di Bence Jones Idiopatica
Le BJP non solo indicano un processo maligno, ma sono esse stesse una
“entità maligna” (il mieloma micromolecolare non è di per sé “più
maligno” degli altri mielomi) che produce effetti patologici soprattutto
sul rene.
Catene Leggere Libere Policlonali
Aumento della produzione Policlonale
Sarcoidosi, Tubercolosi Polmonare, Lupus Erythematosus, Artrite
Reumatoide
Alterazione della Funzione Tubulare
Sindrome di Fanconi, Nefropatia diabetica, Carico in aminoacidi
tipo lisina o arginina, assunzione di farmaci
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Capitolo V
Introduzione allo Studio delle Proteine
Introduzione
Lo studio delle proteine nel Laboratorio pratico ha avuto negli ultimi 20 anni un grande impulso e disponiamo oggi di
tecniche elettroforetiche e immunologiche sofisticate e frequentemente automatizzate.
L'uso routinario di tali tecniche ha:
ƒ effetti immediati:
· fornire alla clinica importanti elementi in ambito diagnostico, prognostico e terapeutico.
· fornire dati epidemiologici.
ƒ effetti nel medio periodo:
· consente il continuo progresso delle conoscenze fisio-patologiche
· consente e stimola il continuo affinamento delle tecniche.
Il circolo così si chiude poiché progressi in fisiopatologia e parallelo affinamento delle tecniche disponibili per la
routine offrono nuovi elementi per la clinica e l'epidemiologia.
Obbiettivo di questo capitolo è la riflessione su vantaggi, svantaggi e limiti delle singole tecniche più utilizzate in
proteinologia e dei protocolli, cioè dell'insieme articolato di tecniche che, formalizzati o non, derivano dall'esigenza di
superare i limiti della singola tecnica.
Metodologia di Studio delle Proteine
Per lo studio delle proteine i passi metodologici nella loro sequenza logica possono essere schematizzati come segue:
ƒ Identificazione: Può essere frutto di sistematiche ricerche di laboratorio o della "collaborazione" tra clinico e
laboratorista come nel caso delle BJP.
ƒ Isolamento: E` il passo fondamentale per poter produrre un antisiero specifico.
ƒ Caratterizzazione chimico-fisica.
ƒ Definizione della struttura e analisi della sequenza aminoacidica.
ƒ Definizione della funzione.
ƒ Definizione dei rapporti e correlazioni tra funzione e struttura.
ƒ Definizione del metabolismo.
ƒ Definizione dei rapporti tra funzione, struttura e metabolismo.
ƒ Definizione delle variazioni di struttura, funzione e metabolismo, cioè delle variazioni qualitative e/o quantitative, e
relazione tra tali variazioni e malattie.
Questa procedura ideale frequentemente viene sconvolta. Esempio perfettamente inerente è la "scoperta" delle BJP.
Variazioni e Anormalità delle Proteine - Tecniche di Routine
Le tecniche di routine disponibili nel Laboratorio consentono di accertare alcune delle possibili varianti e anomalie
delle proteine; per l'analisi è utile formalizzare tre elementi:
ƒ Qualità
ƒ Concentrazione
ƒ Funzione
Qualità
Nello studio delle varianti e anomalie delle proteine e in particolare delle Immunoglobuline è necessario analizzare due
elementi caratteristici:
ƒ individualità antigenica o composizione
ƒ mobilità elettroforetica o distribuzione
Infatti le proteine possono avere:
ƒ identica individualità antigenica ma diversa mobilità elettroforetica
ƒ identica mobilità elettroforetica ma diversa individualità antigenica.
Deriva che:
ƒ una tecnica solo separativa, per es. l'EF, è in grado di evidenziare se le frazioni del campione in esame sono simili
per "distribuzione" a quelle del corrispondente campione "normale", ma non è in grado di evidenziare quali sono le
proteine contenute nelle frazioni, cioè non è in grado di evidenziare se la "composizione" delle frazioni è simile a
quella del corrispondente campione "normale".
ƒ una tecnica solo immunologica, per es. l'IPL, è in grado di evidenziare se una proteina o un gruppo di proteine è
presente nel campione in esame e la sua concentrazione, cioè è in grado di evidenziare l'individualità antigenica
ricercata nel campione e la sua quantità, ma non è in grado di prevedere la "distribuzione" della proteina o del gruppo
di proteine sottoposto a tecnica separativa.
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ƒ la valutazione esaustiva di varianti e anomalie delle proteine deve prevedere l'uso combinato di tecniche separative
e tecniche immunologiche.
Concentrazione
Le considerazioni sono in certa misura analoghe a quelle relative alla "Qualità":
ƒ con una tecnica separativa, per es. l'EF, potremo valutare esclusivamente la concentrazione delle "proteine totali"
presenti nelle singole frazioni.
ƒ con una tecnica immunologica, per es. l'IPL, potremo valutare esclusivamente la concentrazione nel campione della
singola proteina, cioè della individualità antigenica.
ƒ per valutare la concentrazione delle singole proteine presenti in una frazione dovremo prevedere l'uso combinato di
tecniche separative e di tecniche immunologiche.
Funzione
Molte proteine possono presentare concentrazione e mobilità normali ma funzione alterata; per esempio le proteine
della coagulazione, le frazioni del Complemento, ecc.
Nel caso delle CLL non è ancora nota la funzione e pertanto al momento questo problema non si pone.
Tecniche di studio delle proteine - Generalità
Le tecniche di studio delle proteine possono essere divise in due grandi categorie:
ƒ tecniche separative
ƒ tecniche immunologiche
Tecniche Separative
Queste tecniche sfruttano le caratteristiche chimico-fisiche delle proteine per separare un gruppo o una singola
molecola dalle altre presenti nel liquido in esame, per esempio il siero.
Le tecniche separative consentono, tra l'altro, di "isolare" e "purificare" le proteine che serviranno ad immunizzare
l'animale per ottenere gli antisieri specifici da utilizzare nelle tecniche immunologiche.
Le tecniche più utilizzate sono:
ƒ Tecniche separative con recupero delle frazioni:
· Cromatografia a scambio ionico
· Cromatografia per gel filtrazione
· Ultracentrifuga
· Elettroforesi preparativa sui diversi supporti e nelle diverse varianti
Questi metodi consentono il recupero delle frazioni separate che potranno contenere o una singola proteina o un
insieme di proteine con caratteristiche analoghe rispetto al metodo di separazione utilizzato.
La frazione separata può essere oggetto di ulteriori analisi:
· determinazione delle proteine totali: assorbanza a 280 nm, reattivo di Folin, ecc.
· ulteriori separazioni con o senza recupero
· tecniche immunologiche
· tecniche chimico-fisiche per la caratterizzazione strutturale
ƒ Tecniche separative senza recupero delle frazioni:
· Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa o su agarosio
· Elettroforesi su Gel di Poliacrilamide
· IsoElettroFocalizzazione sui diversi supporti.
Queste tecniche utilizzano minime quantità di campione e non permettono il recupero delle frazioni isolate ma
consentono comunque di valutare alcune caratteristiche strutturali, chimico-fisiche, funzionali e immunologiche
delle singole frazioni; per esempio:
· rilevazione della componente proteica, glucidica, lipidica
· rilevazione dell'attività enzimatica: Isoenzimi
· caratterizzazione immunologica: con l'ImmunoFissazione diretta o dopo “blotting”, l'ImmunoSottrazione, ecc.
Delle tecniche suddette quelle utilizzate in routine sono l'Elettroforesi Zonale (EF) e l'ImmunoFissazione (IFE).
Tecniche Immunologiche
Le tecniche immunologiche sfruttano l'individualità antigenica delle proteine che consente di ottenere antisieri specifici
per realizzare la reazione antigene-anticorpo.
L'unione in vitro di un antigene (Ag) all'anticorpo (Ab) dà luogo ad un prodotto di reazione detto ImmunoComplesso.
La reazione immune si divide a scopi didattici e descrittivi in due stadi:
ƒ primo stadio - si attua:
· rapidissimamente
· con variazioni di energia
· senza alterazioni visibili del mezzo di reazione
· qualsiasi sia la valenza dell'antigene e quindi anche con Ag monovalenti o con As che "vedono" l'Ag come
monovalente (As monoclonali).
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· qualsiasi sia il rapporto Ag/Ab
· qualsiasi sia la salinità del mezzo
Esempi di tecniche che utilizzano il primo stadio sono:
· Tecniche ImmunoEnzimatiche
· Tecniche RadioImmunologiche
ƒ secondo stadio - si attua:
· lentamente.
· con variazioni di energia piccolissime.
· con alterazioni visibili del mezzo di reazione: ImmunoPrecipitazione (IP), ImmunoAgglutinazione
· solo con Ag polivalenti e con As che vedano l'Ag come polivalente; pertanto non si attua con As monoclonali in
senso stretto.
· solo per determinati rapporti Ag/Ab secondo la "curva di precipitazione".
· solo in presenza di sali.
Esempi di tecniche che utilizzano il secondo stadio sono:
· ImmunoPrecipitazione su Supporto (IPS): IFE, RID, ecc.
· ImmunoPrecipitazione in fase Liquida (IPL): ImmunoTurbidimetria (IT), ImmunoNefelometria (IN)
Di queste, ImmunoFissazione (IFE), ImmunoTurbidimetria (IT) e ImmunoNefelometria (IN) sono utilizzate nella
routine proteinologica.
La Figura 8 riporta il classico schema di Reazione di ImmunoPrecipitazione: da Clerici-Villa, Immunologia Generale,
III Edizione
Figura: 8 - Schema della Reazione di ImmunoPrecipitazione
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Capitolo VI
Tecniche e Protocolli di Studio delle CLL
Introduzione
Alla rilevanza, come accennata nei capitoli precedenti, della ricerca intorno alle BJP e alle CLL, non corrisponde una
adeguata standardizzazione di metodi, protocolli, riferimenti, controlli, tipo di campione da utilizzare, unità di misura e
comunicazione refertuale.
In questo capitolo analizzeremo le tecniche e i protocolli più comunemente utilizzati per lo studio delle CLL nelle urine
con particolare riferimento alle BJP; infatti attualmente le CLLP sono considerate un rilievo accessorio a meno che non
si intenda ricercarle specificamente, come indice di proteinuria tubulare, e in questo caso parrebbe metodo d'elezione la
determinazione quantitativa diretta con l'ImmunoPrecipitazione in fase Liquida (IPL), turbidimetria o nefelometria,
realizzata con Reagenti antisiero specifici per le CLL.
Sarebbe auspicabile che, anche per le BJP (e le CLLP) come per qualsiasi altra situazione, un paziente fosse
uniformemente inquadrato qualsiasi sia la struttura sanitaria cui si rivolge e quindi, anzitutto, che un campione risultasse
“BJP-positivo” o “BJP-negativo” qualsiasi sia il Laboratorio che l'esamina a prescindere dal metodo o dal protocollo,
cioè dall'insieme di metodi di screening e di approfondimento utilizzati [24].
Per far ciò dovremo definire le “caratteristiche reali” dei singoli metodi determinandone la “sensibilità” e la
“precisione” nel rilevare la “anormalità del campione” contenente BJP o CLLP. E dovremo definire un sistema di
controlli inizialmente anche imperfetto ma comunque utile per uniformare la valutazione della sensibilità e della
precisione [24].
Dovremo poi concordare il “tipo di campione”: campione da raccolta delle 24 ore, campione estemporaneo, ecc. e la
“comunicazione refertuale”: unità di misura, commenti, ecc. [24].
L'esposizione si articola nei seguenti argomenti:
Procedura Logica di scelta di Metodi e Protocolli
E` uno schema di formalizzazione degli elementi di valutazione di metodi e protocolli con particolare riferimento alle
caratteristiche peculiari delle CLL: Composizione, Distribuzione Concentrazione.
Analisi delle Tecniche e protocolli di studio delle CLL:
· Termo-Test, Strisce-Test, Proteine Totali
· Elettroforesi
· ImmunoFissazione
· ImmunoPrecipitazione in Fase Liquida (IPL) - Indici Indiretti
Esamina alcuni "Indici" di "presenza" e di "tipo" di CLL e BJP nelle urine ottenuti elaborando il risultato della
determinazione di altre proteine.
· ImmunoPrecipitazione in Fase Liquida (IPL) - Diretta
Presenta la Tecnica di determinazione diretta delle CLL con l'IPL, Turbidimetria e Nefelometria, realizzata con
antisieri specifici per le CLL.
Procedura Logica di Scelta di Metodi e Protocolli
Nella Gestione del Laboratorio la scelta di un metodo o di un protocollo operativo non può sfuggire al modello logico
generale di analisi che prevede:
a) identificazione di uno o più obbiettivi.
b) valutazione dei due parametri per raggiungere l'obbiettivo identificato:
b.1) efficacia: capacità di raggiungere l'obbiettivo
b.2) efficienza: qualità del percorso per raggiungere l'obbiettivo.
Identificazione dell'Obiettivo
L'identificazione puntuale dell'obbiettivo può sembrare cosa banale; in realtà l'analisi e la formalizzazione possono
rivelarsi anche molto complesse.
Frequentemente è necessario individuare un “obiettivo principale” e “obbiettivi accessori”.
Inoltre il metodo o il protocollo adottato possono avere “ricadute accessorie automatiche” e il Laboratorista nel refertare
dovrà scegliere tra:
· la risposta esclusiva e letterale alla specifica richiesta ricevuta.
· l'esplicitazione delle ricadute accessorie ottenute nell'eseguire la ricerca principale.
Per esempio, se la richiesta è “Ricerca delle BJP” e nel campione evidenziamo CLL policlonali potremo scegliere tra
una risposta del tipo: ”BJP negativo” e basta, o “BJP negativo - Presenza di Catene Leggere Libere Policlonali”.
Nel caso delle CLL gli obiettivi generali sono determinarne:
la presenza
la distribuzione: monoclonale, oligoclonale, policlonale
la concentrazione.
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Efficacia
L'efficacia è la “capacità di raggiungere l'obbiettivo”: obbiettivo principale, obbiettivi accessori e eventuali ricadute
automatiche.
Nel caso delle tecniche e protocolli analitici gli elementi che influenzano la valutazione di questo parametro sono:
a) Metodi qualitativi
Capacità discriminante la qualità ricercata
Sensibilità della capacità discriminante
Riproducibilità dei parametri suddetti
· intra-laboratorio: nella serie e tra le serie
· inter-laboratorio.
b) Metodi quantitativi
Agli elementi di valutazione dei metodi qualitativi si aggiungono: “precisione” e “accuratezza”.
Nel caso delle CLL dovremo ricercare la tecnica o l'insieme di tecniche (protocollo) che consentono di centrare tutti gli
obiettivi suddetti o quella loro parte che riterremo interessante in base al nostro modello operativo.
In altre parole, per le BJP e le CLL il metodo o il protocollo “perfettamente efficace” sarà quello caratterizzato da:
a) nessun “falso negativo” – Sensibilità e Precisione
E' la caratteristica principale e irrinunciabile e di conseguenza per essa si richiede la massima riproducibilità intra ed
inter-laboratorio: si dovrebbe definire la “sensibilità” e la “precisione” di ciascun metodo.
b) nessun “falso positivo” – Specificità del Segnale di Positività
L'efficacia diminuisce man mano che aumenta il numero di "falsi positivi".
c) buona informazione quantitativa - Si dovrebbe valutare oltre alla “precisione” anche la “accuratezza”.
La valenza di questo elemento dipende da quanto è sentita l'esigenza della determinazione quantitativa assoluta.
Efficienza
L'efficienza è la “qualità del percorso” per raggiungere l'obiettivo.
La sua valutazione è resa difficile dalla quantità di elementi da analizzare e dalla loro variabilità ambientale.
I principali parametri sono:
costo complessivo per raggiungere l'obbiettivo: costo dei reagenti compresi i calibratori e controlli, esecuzione su
analizzatori multiuso o analizzatori dedicati, tempo lavorativo, semilavorativo e non lavorativo di esecuzione e sua
qualità, tempo lavorativo di interpretazione del risultato e sua qualità.
possibilità di standardizzazione del metodo o del protocollo nello stesso laboratorio e tra laboratori.
trasmissibilità delle conoscenze atte a una corretta esecuzione del metodo o del protocollo e a una corretta
interpretazione dei risultati.
Scelta di Metodi e Protocolli alla luce delle Peculiarità delle CLL: Composizione Distribuzione - Concentrazione
Abbiamo già accennato al fatto che lo studio delle CLL (e delle Ig), per la loro eterogeneità, è più complesso rispetto a
quello di altre proteine. Abbiamo anche visto (Cap. V) i limiti delle tecniche separative e delle tecniche immunologiche
singolarmente utilizzate e la frequente necessità di ricorrere all'uso combinato dei due tipi di tecniche per evidenziare
varianti e anomalie delle proteine in generale e delle CLL (e delle Ig) in particolare.
Nello studio delle anomalie delle CLL si dovranno tenere in particolare considerazione gli elementi già accennati nel
Capitolo V e precisamente:
qualità:
· individualità antigenica o composizione
La presenza di CLL nel campione o nella frazione dovrà essere indagata con tecniche immunologiche.
· mobilità elettroforetica o distribuzione: monoclonali, oligoclonali, policlonali.
Questa caratteristica dovrà essere indagata con tecniche elettroforetiche o che comunque prevedano l'elettroforesi.
concentrazione: potrà essere valutata con l'EF, con l'IPL diretta o con metodi indiretti.
La verifica contemporanea di entrambe le caratteristiche qualitative è possibile solo con un metodo che sia al tempo
stesso elettroforetico e immunologico, condizione realizzata dall'ImmunoElettroforesi (IEP) e dall'ImmunoFissazione
(IFE) che in realtà sono protocolli costituiti da due tecniche:
tecnica separativa: Elettroforesi (EF)
tecnica immunologica: ImmunoPrecipitazione su Supporto (IPS).
L'alternativa è quella di scindere il problema nelle due componenti predisponendo protocolli di due o più metodi che
siano in grado di verificare "composizione" e "distribuzione" separatamente.
Il tentativo è quello di utilizzare un test che sia di screening per una delle due caratteristiche seguito, sui campioni
positivi al primo, da un test che verifichi la seconda caratteristica, disgiuntamente o congiuntamente alla prima.
A seconda di quale dei due parametri viene scelto per lo screening si possono formalizzare due tipi di protocolli:
parametro di screening: distribuzione - test di screening: ElettroForesi.
parametro di screening: composizione - test di screening: IPL diretta, IPL indiretta e “indici”.
Nelle pagine che seguono è la formalizzazione e l'analisi di alcuni dei metodi e protocolli attualmente utilizzati in
routine e in Figura 9 il confronto sintetico.
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Figura: 9 - Confronto di tecniche per la ricerca della BJP (e CLL)
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Termo Test - Strisce Test - Proteine Totali
Il termo test e le sue varianti sono test oggi ritenuti sorpassati perché non sufficientemente sensibili; in caso di quantità
rilevanti di BJP questi test possono considerarsi specifici.
Le Strisce Test sono sensibili all'albumina e, in misura minore, alle IgG e quindi non sono adatte a rilevare la presenza
di CLL e BJP.
Le Proteine Totali con i metodi attualmente in uso hanno sensibilità insufficiente [24] e quindi non sono utilizzabili
neanche come primo screening o come elemento di un “indice”.
Elettroforesi Zonale (EF)
Tratteremo dell'EF zonale di routine eseguita su acetato di cellulosa o su agarosio e con rivelazione con coloranti delle
proteine: dal Rosso Ponceau all'Oro Colloidale.
Per non essere utilizzate in routine esulano da questo scritto altre tecniche elettroforetiche quali l'Elettroforesi su Gel di
Poliacrilamide (SDS-PAGE) e l'IsoElettroFocalizzazione.
Introduzione
L'EF è una delle tecniche più utilizzate in routine per lo studio delle proteine urinarie (PU) e per la ricerca delle BJP.
L'EF è una tecnica separativa in grado di evidenziare come le proteine si distribuiscono (si separano) in un campo
elettrico in base al loro pI ma non fornisce indicazioni sicure e dirette sulle proteine che compongono una "zona";
possiamo solo dire che le proteine che compongono una zona ristretta (banda) hanno lo stesso (circa) punto
isoelettrico.
Ricordiamo che l'EF è costituita da tre fasi:
separazione: in genere in tampone a pH alcalino.
rivelazione: con un colorante delle proteine, dal Rosso Ponceau all'oro.
lettura e interpretazione:
· qualitativa : ad "occhio"
· quantitativa: con il Densitometro
Fatta eccezione per la proteina di Tamm-Horsfall che comunque dopo centrifugazione è nel sedimento, tutte le proteine
presenti nelle urine sono di derivazione ematica.
Pertanto il pattern elettroforetico delle PU rivela le modifiche che il pattern delle proteine ematiche ha subito a causa
del rene.
Nel caso della ricerca delle BJP il “segnale di anormalità” è dato dalla presenza di una “banda sospetta”.
Sensibilità e sue variazioni
La sensibilità dell'EF (e della IFE), cioè la sua capacità di rilevare la presenza di una proteina nel campione in esame,
dipende dalla capacità del sistema di rivelazione (colorante per la EF, complesso Antigene-Anticorpo + colorante per la
IFE) di evidenziare la concentrazione per mmc di supporto che la proteina ha dopo la separazione elettroforetica.
Quindi la sensibilità dell'EF varia in relazione alla distribuzione della proteina in esame; è tanto più alta quanto più
ristretta è la banda.
In altri termini, data una certa concentrazione di proteina nel campione, la sensibilità della EF (e della IFE) decresce
proporzionalmente all'aumento della superficie su cui la proteina si distribuisce: nel caso delle CLL, dalla banda
monoclonale delle BJP all'aspetto diffuso delle CLL policlonali.
La Figura 10 mostra il risultato di una simulazione al computer; si vede l'effetto della stessa quantità complessiva di
colore distribuita su una certa superficie e su una superficie 8 volte maggiore.
Figura: 10
Da Monoclonale a policlonale - Simulazione con Elaboratore Elettronico
Effetto della stessa quantità di colore distribuita su una certa superficie assimilabile alla banda omogenea della BJP e scalarmente fino ad una
superficie 8 volte maggiore assimilabile a CLL policlonali.
Si dimostra che, per la stessa concentrazione di proteine, la sensibilità della EF e della IFE decresce proporzionalmente all'aumento della
superficie su cui le proteine si distribuiscono; nel caso delle CLL, dalla banda monoclonale delle BJP all'aspetto diffuso delle CLL policlonali
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Come vedremo, analoga variabilità ha la sensibilità della IFE; al contrario, quella delle tecniche di
ImmunoPrecipitazione in fase liquida prescinde, non viene influenzata, dalla distribuzione della proteina; e quindi nel
caso delle CLL la sensibilità è la stessa per le monoclonali e le policlonali.
La ricerca delle BJP richiede una sensibilità di 1 - 10 mg/L (0.1 - 1 mg/dl) [1].
La sensibilità dell'EF nel rilevare la presenza di BJP, cioè di CLL formanti una banda ristretta, dipende dal colorante
utilizzato e, su acetato di cellulosa viene stimata come segue:
Ponceau S e amido black:
1000 mg/L
(100 mg/dl)
[1]
Coomassie brilliant blue:
75 - 300 mg/L
(7.5 - 30 mg/dl)
[1, 25, 26]
Oro colloidale:
1 - 6 mg/L (0.1 - 0.6 mg/dl)
[1, 25, 26]
Pertanto, mentre con l'Oro colloidale si può utilizzare il campione non concentrato, con gli altri coloranti è necessaria
una concentrazione più o meno spinta.
Alcuni ritengono che la concentrazione del campione può comportare la perdita di una certa quantità non precisabile di
CLL; certamente essa altera le caratteristiche del campione.
A sfavore della concentrazione vi sono due considerazioni più immediate:
il costo e la manualità
l'impossibilità di desumere dati quantitativi dal campione concentrato.
D'altra parte la colorazione con Oro colloidale non ha trovato successo nella routine [24].
Di recente è stato proposto da Beckman il kit "Protur HISI" per l'EF delle proteine di urine non concentrate.
Il kit, pur mostrando un'ottima definizione e una sensibilità stimata per le BJP di 2 - 3 mg/dl [24,27], risulta comunque
insufficiente per la ricerca delle BJP poiché evidenzia il 6% di "falsi negativi" [27].
Non vi sono dati circa la sensibilità dell'EF rispetto alle CLL oligo e policlonali, ma essa è certamente insufficiente.
Composizione delle Bande
L'EF non fornisce informazioni sulle proteine che costituiscono le zone sia omogenee sia diffuse.
Data l'eterogeneità del punto isoelettrico delle CLL, una banda omogenea costituita da CLL, cioè una BJP, può
assumere una qualsiasi posizione compresa tra la zona gamma e la zona alfa1.
Pertanto, se l'EF evidenzia una qualsiasi banda oltre l'albumina è necessario determinare la composizione della banda
con tecniche immunologiche, in genere con la IFE.
Per esempio, se l'EF evidenzia una banda in posizione beta non potremo essere certi che si tratti di Transferrina (TRF)
finché non avremo escluso che sia una BJP.
Chi può escludere che una banda attribuibile alla TRF sia, o nasconda, una BJP ?
Poiché la TRF è frequentemente presente nelle urine, se usiamo l'EF da sola per il primo screening avremo un numero
rilevante di “falsi positivi” da accertare con i test di conferma; e d'altra parte, maggiore è la sensibilità dell'EF maggiore
sarà il numero di "falsi positivi".
Determinazione Quantitativa
La validità dell'EF nel fornire dati quantitativi viene esaurientemente affrontata da Tillyer [28].
La conclusione è che l'EF è imprecisa e inaccurata e pertanto è scarsamente utilizzabile sia per una valutazione
quantitativa assoluta delle BJP, sia per seguire nel tempo le variazioni di concentrazione nell'ambito dello stesso
paziente.
L'EF non consente la valutazione quantitativa delle CLL policlonali.
Conclusioni
L'efficacia della EF si rivela piuttosto modesta e, riprendendo gli elementi di valutazione:
Qualità:
· individualità antigenica o composizione: inefficace
per le CLL monoclonali (BJP) o oligoclonali: inefficace
le informazioni sono poco precise (presenza di "banda sospetta") e possono determinare sia "falsi negativi" sia
"falsi positivi".
i "falsi positivi" aumentano con l'aumento della sensibilità.
per le CLL policlonali: inefficace, non fornisce alcuna informazione.
· mobilità elettroforetica o distribuzione: parzialmente efficace
Le informazioni sono buone nei limiti della sensibilità caratteristica.
Concentrazione: parzialmente efficace
E` piuttosto imprecisa, perciò è utilizzabile solo se la BJP del paziente mostra variazioni importanti.
Non è utilizzabile per le CLL policlonali.
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ImmunoFissazione (IFE)
Introduzione
La IFE è considerata la tecnica di riferimento per la ricerca qualitativa delle BJP nelle urine anche se è per nulla
standardizzata e presenta qualche trappola.
Si realizza combinando due tipi di tecniche:
Tecnica separativa = Elettroforesi
Tecnica immunologica = ImmunoPrecipitazione nel supporto (IPS)
Schematicamente le fasi operative sono:
Separazione Elettroforetica
ImmunoPrecipitazione
Allontanamento delle proteine non ImmunoPrecipitate
Colorazione
Alle varianti metodologiche dell'EF si aggiungono quelle legate all'IPS, in particolare gli antisieri.
Sensibilità
L'ImmunoPrecipitazione, se correttamente eseguita, amplifica notevolmente il contenuto proteico di una frazione.
Pertanto, a parità di colorante (o, più in generale, di sistema di rivelazione) si possono rendere visibili frazioni
(omogenee e non omogenee) non rilevabili con l'EF.
Come già detto per la EF a cui si rimanda, anche per la IFE la sensibilità varia in relazione alla distribuzione della
proteina in esame, essa è tanto più alta quanto più ristretta è la banda.
La sensibilità della IFE a parità di concentrazione proteica per mmc è influenzata da:
Colorante
Antisiero
Degli antisieri si parlerà nel prossimo paragrafo.
Per la ricerca delle BJP, con i coloranti tradizionali non si raggiunge una sensibilità sufficiente ad evitare la
concentrazione dell'urina; con l'Oro colloidale su acetato la sensibilità è di 0,6 mg/l (0,06 mg/dl) [25,26].
In una valutazione multicentrica condotta recentemente in Italia il kit “Protur Plus” di Beckman ha dimostrato sulle
urine non concentrate sensibilità soddisfacente [24].
Antisieri anti CLT e anti CLL
Per la ricerca immunologica delle CLL e quindi anche per la IFE spesso si preferisce utilizzare As anti CLT e procedure
indirette invece che As anti CLL e procedure dirette.
Le critiche agli antisieri anti CLL sono:
bassa reattività
reattività aspecifica con le CL delle Ig
costo più elevato rispetto agli As anti CLT
Per quanto riguarda i primi due punti già da alcuni anni vi è più di un produttore in grado di fornire Antisieri anti CLL
che utilizzati per la IEF e la IFE hanno reattività molto buona e non evidenziano reazione aspecifica con le CL delle Ig.
Eccezionalmente capita che tali antisieri con la IFE diano reazioni sfumate (ma comunque visibili) e ciò è in relazione
al fatto che una BJP può avere un numero molto piccolo di epitopi riconosciuti dall'antisiero.
Per l'ImmunoPrecipitazione in Fase Liquida (IPL), turbidimetria e nefelometria, sono necessari opportuni accorgimenti
per ottenere risultati soddisfacenti con gli As anti CLL sia in termini di specificità sia in termini di reattività.
Per quanto riguarda il costo, vedremo anche più avanti che, ove si consideri non la "Economia di Cassa", cioè il costo di
un ml di antisiero, ma la "Economia di Gestione", cioè il costo complessivo della ricerca delle CLL o delle BJP, la
convenienza dell'uso degli As anti CLT rispetto agli As anti CLL può risultare a favore di questi, senza contare che il
risultato è più attendibile.
Per quanto riguarda la capacità di rilevare le BJP, non possiamo condividere l'opinione che, per la ricerca delle BJP
nelle urine con la IFE, sia sufficiente l'uso degli As anti CLT.
Questa opinione poggia sull'ipotesi che, nel caso non infrequente di eliminazione urinaria sia della Ig Monoclonale sia
della CLL Monoclonale (BJP), questa migri in modo diverso rispetto alla Ig e pertanto si renda evidente come banda
separata, autonoma, che reagisce solo con l'As anti CLT, ben distinta dalla banda che reagisce sia con l'As anti CLT sia
con l'As anti Catena Pesante.
Invece, capita frequentemente che la BJP sia perfettamente sovrapposta alla Ig monoclonale e perciò indistinguibile
con l'As anti CLT mentre è chiaramente evidenziabile con l'As anti CLL (Figura: 3).
Quindi, per la ricerca con la IFE delle BJP nelle urine è preferibile l'uso di schemi con As anti CLL al fine di evitare
“trappole” e “complicanze interpretative” che determinano anche un incremento dei costi generali.
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Figura: 3
Schema di IFE urine di campione con CM IgG-k + k libera (BJP k)
Rif
IgG
IgA
IgM
CLT- κ
CLT- λ
A sinistra
IFE "tipo siero" con Antisieri anti CLT, senza Antisieri anti
CLL.
Referto:
CM IgG-k - BJP assente
Rif
Ig
CLT- κ
CLT- λ
CLL- κ
CLL- λ
A destra
IFE con Antisiero anti Ig (polivalente Catene Pesanti) e
antisieri anti CLT e CLL.
Referto: CM IgG-k + BJP-k
La BJP presente nel cam pione ha la stessa velocità di m igrazione della Im m unoglobulina intera è pertanto
non si evidenzia se non con l'uso degli antisieri anti Catena Leggera Libera.
Conclusioni
La IFE è la tecnica "qualitativa" più efficace in particolare se eseguita con l'As Pentavalente + As anti CLT + As anti
CLL; non fornisce alcuna informazione "quantitativa".
Vediamo il dettaglio:
Qualità:
· individualità antigenica o composizione: efficace sia per BJP sia per CLLP (a patto che si usino As anti CLL)
· mobilità elettroforetica o distribuzione: efficace sia per BJP sia per CLLP
Concentrazione: inefficace, nessuna informazione.
Limiti
Sensibilità variabile per:
· distribuzione elettroforetica variabile delle CLL; può risultare insufficiente per le CLLP.
· differenze tra antisieri
· differenze tra coloranti
Problemi di strandardizzazione intra e inter-laboratorio.
ImmunoPrecipitazione in fase Liquida (IPL) Indiretta, con
antisieri anti Catene Leggere Totali
Nefelometria - Turbidimetria
Introduzione
Sono state formulate diverse proposte per valutare la presenza di CLL per via indiretta; cioè determinando con l'IPL
alcune proteine e deducendo tramite un calcolo la presenza di CLL.
Per un corretto inquadramento è utile ricordare che:
un antisiero anti Catene Leggere Libere & Legate (As anti CLT) reagisce sia con le CLL sia con le CL legate alle
Catene Pesanti a formare l'Immunoglobulina intera; cioè reagisce indistintamente con le CLL e con le Ig.
un antisiero anti CLL reagisce esclusivamente con le Catene Leggere che non sono legate alle Catene Pesanti, cioè
non reagisce con le Immunoglobuline intere.
In alcuni calibratori e controlli commerciali costituiti da siero umano viene riportata la concentrazione di Catene
Leggere κ e λ espressa in termini di Ig-κ e Ig-λ e ottenuta per "standardizzazione interna".
In questi calibratori la somma della concentrazione dichiarata di IgG+IgA+IgM è per definizione uguale alla somma
delle concentrazioni dichiarate di Ig-κ+Ig-λ.
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Esaminiamo le diverse proposte.
Determinazione semplice delle Catene Leggere Totali
Si esegue la IPL, in genere sugli analizzatori automatici dedicati, con gli stessi Antisieri e Calibratori utilizzati per la
determinazione delle CLT nel siero e con una procedura modificata al fine di raggiungere la maggiore sensibilità che è
richiesta per le urine.
E` chiaro che tutti i campioni con Ig urinarie risulteranno positivi e, poiché le IgG sono presenti nelle urine anche per
lievi alterazioni glomerulari, avremo un'alta percentuale di "falsi positivi" da controllare successivamente per accertare
che le CL segnalate siano CLL e con quale distribuzione.
Questo metodo sembra avere problemi di sensibilità e problemi di eccesso di antigene [29].
Inoltre il metodo, nel caso di CLL monoclonali, accuserà il mancato parallelismo tra reazione del calibratore e del
campione di cui si è detto a proposito della IPL diretta.
Infine, il test misura una miscela di componenti e perciò nessuna informazione può dare sulla concentrazione di uno dei
componenti o sulle sue variazioni.
Indicatore: (IgG+IgA+IgM)-(Ig-κ+Ig-λ)
Questo indice è stato proposto per il siero [30] e potrebbe essere utilizzato anche nelle urine.
Si tratta di dosare con l'IPL le IgG, le IgA, le IgM, le CLT-κ e le CLT-λ.
E` chiaro che:
indice > 0 = presenza di Catene Pesanti Libere
indice < 0 = due possibilità:
· presenza di Catene Leggere Libere
· presenza di IgD o IgE.
Il metodo aggiunge, al problema del mancato parallelismo, la "propagazione dell'errore" da cui è affetto un risultato che
deriva da un calcolo eseguito su ben cinque altri risultati [28].
Questo indicatore è stato proposto in altre formulazioni matematiche che ovviamente non risolvono il problema di base
[31].
Indice di presenza di CLL: (CLT-κ + CLT-λ)-IgG
Indice di BJP e tipizzazione: CLT-κ - CLT-λ
Questi indicatori sono stati proposti sia sul nefelometro "QM-300" [32] sia sul nefelometro "BNA" [29] per la ricerca
delle CLL nelle urine e per determinare se trattasi di CLL policlonali o di BJP e, in questo caso, di quale tipo.
Si tratta di dosare le CLT-κ, le CLT-λ e le IgG e quindi calcolare due indicatori:
Indicatore di presenza di CLL: CLT-κ + CLT-λ - IgG > 0
= presenza di CLL.
Indicatore di presenza di BJP: CLT-κ - CLT-λ > a un certo range
= BJP e loro tipo.
L'indicatore è stato sperimentato sulle urine di 219 pazienti con gammapatia monoclonale e il primo indicatore,
Indicatore di Presenza di CLL, ha evidenziato:
su nefelometro "QM-300" [32]
su nefelometro "BNA" [29]
· "falsi negativi" BJP κ : 16%
· "falsi negativi" BJP κ : 27%
· "falsi negativi" BJP λ : 24%
· "falsi negativi" BJP λ : 20%
· "falsi negativi" CLLP : 26%.
· "falsi negativi" CLLP : 47%.
Nulla viene detto circa i "falsi positivi".
Vi è da rilevare che nei casi non "falsi negativi" l'indicatore di BJP e di tipo dimostra il 100% di concordanza con la IFE
[29] [30].
Conclusioni IPL indiretta
La IPL indiretta con As anti CLT mostra scarsa efficacia sia per lo screening sia per la quantizzazione delle BJP e delle
CLLP.
Vediamo il dettaglio:
Qualità:
· individualità antigenica o composizione: inefficace.
· mobilità elettroforetica o distribuzione: inefficace.
Concentrazione: inefficace.
Standardizzazione: buona, sia intra che inter-laboratorio [24].
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ImmunoPrecipitazione in fase Liquida (IPL) Diretta con antisieri
anti Catene Leggere Libere
Turbidimetria - Nefelometria
Introduzione
Questa linea è una esclusiva di NSC ed è il risultato di specifiche competenze interne.
Obiettivo dei kit è la determinazione qualitativa e/o quantitativa delle Catene Leggere Libere in urine e liquido cefalorachidiano non concentrati.
Il metodo si basa sulla reazione di ImmunoPrecipitazione in fase liquida con antisieri adsorbiti specifici anti Catene
Leggere Libere.
La torbidità prodotta dalla reazione può essere:
valutata visivamente, ad occhio, con idonea illuminazione:
· determinazione qualitativa non strumentale:
La torbidità prodotta dal campione è confrontata con quella del "Bianco Campione" e con quella dei Calibratori alla
diluizione scelta come minima concentrazione ritenuta significativa (cut off).
misurata strumentalmente: turbidimetria o nefelometria:
· determinazione qualitativa strumentale:
Il segnale prodotto dal campione viene confrontato con quello prodotto dai Calibratori alla diluizione scelta come
minima concentrazione significativa (cut off).
· determinazione quantitativa:
Il segnale prodotto dal campione viene interpolato sulle curve ottenute con i Calibratori.
Valenza del Test
La valenza del test di ImmunoPrecipitazione sarà diversa secondo il problema:
Proteine di Bence Jones:
· primo accertamento diagnostico: il test ha una doppia valenza:
· screening qualitativo
qualsiasi sia il motivo della ricerca, il test ha anzitutto valore di screening qualitativo, poiché la monoclonalità
dovrà comunque essere accertata con l'Elettroforesi o con l'ImmunoFissazione.
· indicazione quantitativa
la determinazione quantitativa, pur con alcuni limiti, è utile per:
· avere un orientamento su quanto concentrare il campione per le ulteriori indagini
· avere il punto di partenza per il controllo dell'evoluzione.
· controllo dell'evoluzione: il test ha prevalentemente significato quantitativo.
Catene Leggere Libere Policlonali: il test ha significato quantitativo.
Catene Leggere Libere nel liquido cefalo-rachidiano: il test ha significato quantitativo.
Applicazioni
Le applicazioni del test si possono così schematizzare:
Qualitative:
· Test di screening nel protocollo di ricerca delle "Proteine di Bence Jones".
Quantitative:
· "Proteine di Bence Jones" - Catene Leggere Libere Monoclonali in urine.
· Catene Leggere Libere Policlonali in urine.
· Catene Leggere Libere nel liquido cefalo-rachidiano.
Caratteristiche del Metodo
Specificità
Vengono utilizzati antisieri adsorbiti che reagiscono esclusivamente con i determinanti "hidden" delle Catene
Leggere Libere.
La specificità è dimostrata dall'assenza di reazione specifica quando si utilizzi come campione un siero umano
normale.
Campione non concentrato
Si usa il campione "non concentrato" e senza alcun pretrattamento.
Sensibilità
E` valutata per "standardizzazione interna" e risulta:
· kit sensibilità normale: 0.5 mg/dl
· kit sensibilità alta (HS): 0,1 mg/dl
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Automazione
Sono disponibili i kit e le procedure operative per:
· analizzatori automatici di chimica-clinica
· nefelometro "BNA" e "BNII" di Behring e simili.
· nefelometro "APS" e "Immage" di Beckman e simili.
Dosaggio quantitativo
I calibratori del kit consentono la costruzione delle curve di calibrazione per realizzare la determinazione
quantitativa.
Sensibilità
La sensibilità del kit normale, valutata per "standardizzazione interna", raggiunge e supera i limiti ritenuti "significativi"
dalla letteratura per la ricerca delle BJP.
La sensibilità del kit HS raggiunge e supera i valori di CLL ritenuti "normali" nelle urine.
Dalle valutazioni comparative eseguite si deduce che il kit normale ha una sensibilità almeno pari a quella della IFE con
kit Paragon su campione concentrato 25 volte [33].
Accuratezza
In letteratura l'ImmunoPrecipitazione in fase Liquida con antisieri specifici anti Catene Leggere Libere è stata descritta
con obbiettivi e procedure orientate alla ricerca e non alla sua applicazione routinaria.
In questo ambito il giudizio conclusivo è sostanzialmente negativo non perché la IPL non sia in grado di rilevare la
presenza delle CLL, ma perché la loro determinazione quantitativa si rivela imprecisa anche a causa delle presenza di
CLL monomeriche, dimeriche e tetrameriche [34].
Tillyer ha riproposto l'IPL per un suo utilizzo in routine con buoni risultati pur notando che esistono problemi di
accuratezza nel caso di CLL monoclonali per la mancanza di parallelismo tra il calibratore e il campione [1].
Concordiamo sulla impossibilità di una accurata quantizzazione nel caso delle BJP e ciò non solo per la presenza di
diverse forme di aggregazione ma anche e soprattutto per la caratteristica di monoclonalità delle BJP con la
conseguenza che la CLL monoclonale presente nel campione reagirà in modo quantitativamente diverso rispetto alle
CLL del Calibratore.
Questo fatto si evidenzia con la mancanza di parallelismo tra la curva di reazione del Calibratore e quella del campione.
Ciò è analogo a quanto avviene nella determinazione quantitativa di una Ig monoclonale sierica o nella determinazione
del "rapporto kappa/lambda" quale indice dalla presenza e dell'evoluzione di una Ig monoclonale.
La quantizzazione sarà certamente inaccurata.
Se la IPL nel caso di CM, sia Ig sia CLL, è in assoluto inaccurata, può invece fornire utili informazioni circa la
variazioni quantitative nell'ambito dello stesso paziente.
Eccesso di antigene
Bisogna distinguere due tipi di eccesso di antigene:
Eccesso Relativo: il test risulta positivo ma la quantità appare inaccurata per difetto.
Il kit consente la corretta misurazione del calibratore ad una concentrazione 10 volte superiore al punto più alto della
curva di calibrazione, quindi oltre i 200 mg/dl.
Non è eccezionale che le BJP raggiungano valori di 2000 mg/dl.
In questi casi per avere una misurazione più accurata sarà necessario diluire il campione.
Eccesso Assoluto: Il test risulta negativo mentre il campione è positivo.
Questa situazione non è mai stata riscontrata neppure in campioni con una enorme quantità di BJP.
Conclusioni
La IPL diretta con As specifici anti CLL mostra buona efficacia sia per lo screening sia per la quantizzazione delle BJP
e delle CLLP.
Vediamo il dettaglio:
Qualità:
· individualità antigenica o composizione: efficace.
· mobilità elettroforetica o distribuzione: inefficace, la monoclonalità deve essere confermata con EF o IFE.
Concentrazione: efficace, con il limite del potenziale mancato parallelismo nel caso delle BJP.
Standardizzazione: buona, sia intra che inter-laboratorio [24].
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Capitolo VII
Contrastografie e BJP
Introduzione
Come accennato nel Capitolo IV, rilievo a parte le BJP e le CLL assumono la ricerca nell'ambito delle controindicazioni
all'uso dei mezzi di contrasto (MdC) per via iniettiva (e anche per os [16]).
L'argomento è “difficile” per chi potrebbe essere facilmente accusato di "Cicero pro domo sua", pure riteniamo di poter
dare un contributo, non fosse altro il risultato della ricerca bibliografica e documentale specificamente condotta.
Il dibattito verte sulle analisi da inserire nel protocollo di accertamento dell'inesistenza di controindicazioni all'uso del
mezzo di contrasto.
Il radiologo chiede di sapere quali sono le condizioni del paziente da sottoporre a indagine radiografica con uso di
mezzo di contrasto, contrastografia, con particolare riferimento ai fattori di rischio conosciuti; quindi, per il nostro
discorso, il mieloma multiplo e la macroglobulinemia di Waldenström.
Letteratura: analisi e riflessioni
Frequentemente ci si chiede se esista letteratura specifica sulle controindicazioni all’uso dei MdC nei pazienti con
Mieloma; la risposta è affermativa come vedremo di seguito.
La ricerca bibliografica fu da noi condotta nel ‘93 su "tutte le Banche Dati" accessibili tramite il servizio “Magic On
Line” gestito dall'Italcable. Abbiamo eseguito una serie di interrogazioni con modalità e "insiemi di chiavi" differenti
con l'obiettivo di estrarre tutti i riferimenti disponibili nelle Banche Dati collegate.
McCarthy et al nel 1992 eseguirono una analoga ricerca che è alla base della "review" da loro pubblicata [19].
La nostra ricerca ha estratto, oltre agli articoli citati da McCarthy, altri lavori inerenti e interessanti.
Precisiamo che l'anteriorità nella ricerca è stata limitata al 1975; i riferimenti precedenti a tale data sono tratti dalla
bibliografia citata negli articoli fino al 1975.
La stessa ricerca è stata ripetuta a luglio ’99 solo su MedLine.
Nella rassegna bibliografica è un elenco di riferimenti e l'abstract di alcuni.
Analisi e Riflessioni
L'analisi della bibliografia consente di formulare le seguenti riflessioni:
Nei pazienti affetti da mieloma l'Insufficienza Renale è, per frequenza, la seconda causa di morte dopo le infezioni.
L'Insufficienza Renale Cronica (IRC) è causa di morte più frequente rispetto all'Insufficienza Renale Acuta (IRA)
che però nel mieloma ha prognosi molto spesso infausta nonostante gli intensivi interventi terapeutici.
Nei pazienti affetti da mieloma vi è stretta correlazione tra eliminazione di BJP e IRA; concause scatenanti possono
essere la deidratazione, l'ipercalcemia, i farmaci nefrotossici, le infezioni, i mezzi di contrasto per via iniettiva.
La letteratura riporta numerosi casi di pazienti che, affetti da mieloma e in assenza di altre cause note di
Insufficienza Renale, "dopo" la somministrazione di mezzi di contrasto organo-iodati hanno accusato IRA quasi
sempre irreversibile. In questi pazienti è stata spesso documentata la presenza di BJP nelle urine mentre non sono
riportati casi in cui si è ricercata la BJP ma con esito negativo.
Per l'insorgenza dell'IRA nei pazienti affetti da Mieloma e sottoposti a contrastografia, al nesso originario tra
Mieloma e Mezzo di Contrasto [17, 18] si è andato sostituendo il nesso tra BJP, altre concause e mezzo di
Contrasto [10, 16, 19, 38, 39].
L'IRA non ha una definizione precisa e pertanto i diversi studi riportati in letteratura sono difficilmente
confrontabili. E` ragionevole ritenere che un certo numero di casi di IRA senza oliguria non sia stato documentato.
La Letteratura, anche la più recente, è pressoché unanime nell’inserire il Mieloma Multiplo, e soprattutto la presenza
di BJP, tra i fattori di rischio nell’uso dei mezzi di contrasto.
L’incidenza di IRA occorsa successivamente a uso di MdC per via iniettiva in pazienti con mieloma è stata valutata
da McCarthy [19] pari allo 0.6 – 1.2%, contro 0,15% della popolazione di controllo, ed è riportato un caso occorso
dopo somministrazione di MdC per os [16].
Ovviamente non si dispone di studi prospettici circa l'incidenza nei pazienti con Mieloma dell'IRA dopo
contrastografia.
I mezzi di contrasto “non ionici” e quelli a “bassa osmolarità” mostrano minore nefrotossicità rispetto a quelli
classici ad “alta osmolarità” solo nei soggetti con alterazioni della funzione renale mentre nel soggetto normale non
sarebbero rilevabili differenze [20, 21, 41]. Pertanto il rapporto costo/beneficio non sembra al momento giustificare
l'uso indiscriminato dei mezzi “non ionici” e a “bassa osmolarità”, più costosi dei tradizionali ad “alta osmolarità”
[21, 22, 40].
Benché sia teoricamente ipotizzabile che nei pazienti con BJP l'uso dei mezzi di contrasto “non ionici” possa ridurre
il rischio di Insufficienza Renale, non vi sono, per ora, dati clinici a supporto [19, 39, 41].
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E’ interessante, ma per noi non condivisibile, l’approccio proposto da Hunter et al. [40]. Un modulo informa il
paziente sui diversi aspetti e rischi dell’indagine che gli è stata prescritta dal medico curante e lo invita ad
autodichiarare se è nella lista dei pazienti che sono ad alto rischio di reazioni avverse a seguito dell’uso di MdC.
Nella lista è incluso il Mieloma Multiplo. Il modulo informa il paziente che, in caso di dichiarazione affermativa per
una delle patologie ad alto rischio, gli verrà somministrato un MdC non ionico o a bassa osmolarità con un
sovrapprezzo di circa $100, importo che potrebbe non essere rimborsato dalla sua assicurazione.
Rimane il fatto che l’Autore afferma che il costo per ml del MdC a bassa osmolarità era, nel ’94, di circa $1.00, cioè
20 volte più caro a confronto con un MdC ad alta osmolarità e aggiunge che, se negli USA si fossero utilizzati
esclusivamente MdC a bassa osmolarità il costo complessivo a livello nazionale sarebbe stato di $ 1,5 bilioni contro
i soli $80 milioni con i MdC ad alta osmolarità.
Autodichiarazione a parte, rimane il problema di individuare i pazienti a rischio, e quindi, per quanto concerne il
nostro argomento, i pazienti con Mieloma e/o BJP in cui si raccomanda cautela: utilizzare i MdC a bassa osmolarità,
evitare la disidratazione, ecc..
Conclusioni
La letteratura anche recente è concorde nell'affermare che nei pazienti con mieloma le indagini
contrastografiche vanno eseguite con particolare cautela specie se è presente BJP [10, 19, 35, 38,
39].
Le Circolari Ministeriali
Le "Circolari Ministeriali" su questo argomento vengono frequentemente additate quale causa dell'eccesso di zelo dei
radiologi nel richiedere la ricerca della BJP per i pazienti da sottoporre a indagine radiografica con uso di MdC.
La prima è la Circolare n. 81 del 9 settembre 1975. Essa non nasce come autonoma iniziativa del Consiglio Superiore
di Sanità Italiano ma fa seguito ad analoga comunicazione dell'Organizzazione Mondiale delle Sanità (OMS).
La Circolare ha carattere dispositivo per le Ditte Farmaceutiche affinché introducano nel foglio illustrativo delle
specialità interessate le "Controindicazioni" e le "Avvertenze" indicate.
La successiva Circolare n. 64 del 28 settembre 1979 ribadisce il contenuto della precedente e ha carattere informativo
per gli operatori sanitari interessati.
L’ultima Circolare del 1997 nulla innova a questo riguardo rispetto alle precedenti.
Conclusioni
Le Circolari Ministeriali, al pari della Letteratura anche recente, indicano il Mieloma e la
Macroglobulinemia di Waldenström tra le controindicazioni all'uso dei mezzi di contrasto organo-jodati per
via endovasale.
Fogli illustrativi delle specialità medicinali
Le Ditte produttrici di mezzi di contrasto organo-iodati da usarsi per via iniettiva si adeguarono alla Circolare del 1975.
Protocollo Precontrastografico
Come già detto, le BJP sono presenti nel 60-80% dei pazienti con mieloma e nel 15-20% dei mielomi sono l'unico
prodotto secreto dal clone maligno (Mieloma Micromolecolare).
Inoltre, l'orientamento che emerge dalla Letteratura più recente, è che il rischio contrastografico sia legato più alla
BJP (e alle CLL) che al Mieloma.
Quindi, un eventuale protocollo precontrastografico dovrà mirare non tanto a rilevare la presenza di una Componente
Monoclonale (CM) nel siero quale segno di mieloma, ma soprattutto a rilevare la presenza di BJP nelle urine.
La ricerca solitaria della CM nel siero, qualsiasi sia il metodo, non è esaustiva nemmeno per uno screening
preliminare cui far seguire sui positivi la ricerca della BJP nelle urine; infatti, il Mieloma Micromolecolare
si esprime con la BJP nelle urine mentre il siero è in molti casi “normale” sia all'Elettroforesi (EF) sia ai
dosaggi quantitativi compreso il rapporto CLT-κ/CLT-λ (KLR).
In altre parole:
a) l'elettroforesi del siero molto spesso non è in grado di evidenziare i Mielomi Micromolecolari e quindi, se l'obiettivo
è quello di individuare tutti i pazienti con Mieloma, con l'EF del siero avremo il 15-20% di “falsi negativi”; e, per
giunta, sono questi i pazienti a maggior rischio.
b) la presenza di una CM all'EF del siero è reperto frequente, circa il 7% degli ultracinquantenni, ma nel 97% dei casi
si tratta di CM benigna [35] cioè di “falsi positivi”.
c) la presenza di BJP nelle urine è considerato uno degli elementi più importanti per differenziare le CM maligne dalle
benigne; BJP sono presenti nel 60-80% delle CM maligne.
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Riguardo alla sensibilità del metodo da utilizzare per la ricerca delle BJP nel controllo precontrastografico è opinione di
alcuni che essa possa essere modesta e ciò nell'ipotesi che il rischio sia legato ad alte concentrazioni di BJP. Costoro
propongono di utilizzare metodi diversi secondo il motivo della richiesta della ricerca delle BJP: un metodo poco
sensibile nel caso di richiesta per contrastografia e invece un metodo il più sensibile possibile in tutti gli altri casi.
Noi non abbiamo trovato in Letteratura studi o segnalazioni documentate che mettano in relazione la quantità di BJP
con l'entità del rischio.
D'altra parte è noto che la nefrotossicità non è tanto legata alla quantità di BJP (vi sono soggetti che ne eliminano una
notevole quantità per anni senza avere alterazioni della funzionalità renale) ma alle sue caratteristiche qualitative
strutturali.
Non sembra perciò condivisibile l'opinione che, nell'ambito della prevenzione del rischio contrastografico, la ricerca
delle BJP debba o possa essere condotta con una tecnica poco sensibile [26,29,32, 35].
Inoltre non sembra praticabile, e non solo per motivi organizzativi ma anche per motivi etici, differenziare il metodo di
ricerca delle BJP a seconda del motivo della richiesta dell'analisi.
Ricadute accessorie
Non è eccezionale che venga rilevata la presenza di BJP in Pazienti per cui tale ricerca è richiesta nell'ambito del
protocollo precontrastografico e senza che vi sia alcun sospetto clinico specifico.
Dato il valore di marker tumorale della BJP, la tendenza di questi Pazienti ad andare incontro ad insufficienza renale, i
buoni risultati che si ottengono con una tempestiva terapia, il rilievo della presenza di BJP in occasione di una
contrastografia non può che essere fatto positivo.
La ricerca delle BJP nel protocollo precontrastografico, oltre l'obbiettivo specifico, infatti accade di trovare sia BJP
sia CLLP assolutamente insospettate, ha certamente il merito di aver stimolato una maggiore attenzione per le
Catene Leggere Libere.
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Riferimenti Bibliografici
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Rassegna Bibliografica
Introduzione e Legenda
La bibliografia è stata organizzata nei Capitoli:
y Trattati (TR)
y Riferimenti specifici dei kit NSC (RS)
y Abstract (AB), Riferimenti bibliografici (RB)
a loro volta divisi in:
· Metodi e Varie
· Nefropatie
· Contrastografie
· Protinurie e Campione
Trattati (TR)
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Putnam F.W. - The Plasma Proteins - Accademic Press - (Second Edition)
Clerici E., Villa M.L. - Immunologia Generale - UTET - (Terza Edizione)
Riferimenti Specifici kit NSC (RS)
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Massaro L. - Metodo per la determinazione di catene leggere libere in campioni di urina, complesso di preparati per l' esecuzione del metodo, e
relativo reagente. Brevetto depositato.
Abate L, Martelli M, Zannini R. - Proteinuria di Bence Jones: sperimentazione di un nuovo metodo immunoturbidimetrico per la determinazione
delle Catene Leggere Libere nelle urine non concentrate. Biochimica Clinica, 12, 1988, pp. 1451 - 1457 e Biochimica Clinica, 16, 1992, pp. 1222
- 1229
Massaro L. Metodo Immunoturbidimetrico - Immunonefelometrico per la Determinazione delle Catene Leggere Libere nelle Urine. Riunione:
SIBIOC / PROTEINE - Asti, 17 - 19 ottobre 1989. Disponibile presso: New Scientific Company
Migliorati T. Uso della prova di Precipitazione in Provetta per Immunoglobuline Urinarie o loro frammenti presenti in Gammopatie Monoclonali.
Biochimica Clinica, 13, 1989, pp. 1237 - 1240
Massaro L. - Lettera a Francesco Aguzzi - Commento all' articolo di Abate L. et Al. Biochimica Clinica, 14, 1990, pp. 70 - 72
Alecci A., Brandini A. Amiloidosi AL o Amiloidosi AH ? Biochimica Clinica, 14, 1990, pp. 471 - 472
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Valenti D, Lenzi MC, Mammini P. Ricerca qualitativa e quantitativa delle Proteine di Bence Jones. Gior It Chim Clin, 16, 6, 1991, pp. 403 - 407
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Metodi e Varie - Abstracts (AB)
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Tillyer CR, Iqbal J, Raymond J, Gore M, McIlwain TJ.
Department of Chemical Pathology, Royal Marsden Hospital, Sutton, Surrey.
Immunoturbidimetric assay for estimating free light chains of immunoglobulins in urine and serum.
J Clin Pathol, 1991, 44, pp. 466 – 471
An immunoturbidimetric assay for the assessment of free kappa and lambda light chains of immunoglobulins was developed using a commercial
polyclonal antiserum with reactivity towards epitopes on the light chains, which are not expressed when they are bound to heavy chains. The
assay, on a centrifugal analyser, is simple and rapid. The limit of detection is 5 mg/l of free light chain, with an assay range of 5-120 mg/l,
intrabatch precisions from 1.5-6.4%, and interbatch precisions from 6.5-8.9%. The assay was only slightly less sensitive than colloidal gold
staining of cellulose acetate electrophoreses for the detection of Bence-Jones protein in urine. For the serial monitoring of response to
chemotherapy in patients with myeloma, the assay correlated well with serum paraprotein estimates obtained by densitometric scanning of
Ponceau stained cellulose acetate electrophoreses, but not with serum beta-2 microglobulin measurements, even after correction for the effects of
creatinine. These assays may prove to be of use for the monitoring of tumour response in the treatment of Bence-Jones myeloma.
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Tillyer CR.
Department of Chemical Pathology, Royal Marsden Hospital, London, UK.
The estimation of free light chains of immunoglobulins in biological fluids.
Int J Clin Lab Res, 1992, 22, pp. 152 - 158.
Methods for the estimation of the free light chains of immunoglobulins in serum, urine and cerebrospinal fluid are divided into two groups,
electrophoretic and immunological, and the analytical performance of each method described. The problems associated with the accurate and
precise determination of free light chains by the different methods are discussed and their complementary clinical roles emphasized. It is
proposed that an International Reference Preparation for free light chains is established.
Publication Types:
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Tillyer CR.
Department of Chemical Pathology, Royal Marsden Hospital, London, UK.
Clinical Applications of immunoglobulin free light chain estimations.
Int J Clin Lab Res, 1993, 23, pp. 25 - 29.
The relevance of free light chain assays to diagnosis, staging, treatment and prognosis assessment in B-cell disorders (including myeloma,
chronic lymphocytic leukaemia, and lymphoma), multiple sclerosis and diabetes is discussed and their actual and potential use is examined.
Comment in: Int J Clin Lab Res 1994;24(2):120-1
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Jenkins MA; O'Leary TD; Guerin MD
Department of Chemical Pathology, Heidelberg Repatriation Hospital, Vic., Australia.
Identification and quantitation of human urine proteins by capillary electrophoresis.
J Chromatogr B Biomed Appl 1994 Dec 2;662(1):108-12
Capillary electrophoresis, as a fully automatable, powerful analytical technique, has the potential for use in clinical laboratories for separation and
identification of protein types in normal and abnormal human urine specimens. Abnormal urine specimens containing previously identified
proteins, anion-exchange resin treatment and addition of known components were used to identify and determine migration times of the peaks
found in the electropherogram of human urine. The correlation coefficients between capillary electrophoresis and the currently used method of
high-resolution agarose gel electrophoresis for Bence Jones protein and albumin were found to be 0.95 and 0.93, respectively.
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Pallotti G. et al.
Valutazione Multicentrica di Metodi e Protocolli per le Catene Leggere Libere e Proteine di Bence Jones in urine - Primi Risultati.
Biochimica Clinica, 19, 1995, pp 410 425
Obbiettivo del gruppo di studio è la verifica della possibilità di uniformare la valutazione, l' interpretazione e la comunicazione refertuale delle
Proteine di Bence Jones (BJP) e, più in generale, delle Catene Leggere Libere (CLL) in urine.
In un precedente lavoro (bib) furono presentati i primi risultati ottenuti dalla valutazione multicentrica multimetodologica di diluizioni scalari di
un campione di urina con BJP lambda; in questo vengono presentati i risultati di analoga sperimentazione condotta su due campioni di urina: uno
con BJP lambda e l’ altro con BJP kappa.
Rileva, almeno nell' ambito dei campioni esaminati e dei metodi utilizzati, quanto segue:
ƒ l' inaffidabilità del dosaggio delle Proteine Totali in urine.
ƒ la relativamente bassa sensibilità dell' ElettroForesi colorata con Oro colloidale, almeno per i kit commerciali.
ƒ la discreta sensibilità dell' ElettroForesi con i kit per "urine non concentrate".
ƒ la buona sensibilità della ImmunoFissazione sia con gli antisieri anti Catene Leggere Totali sia con gli antisieri specifici anti Catene Leggere
Libere.
ƒ i buoni risultati in termini di sensibilità e di precisione (nella serie, tra serie e tra Laboratori) ottenuti con la nefelometria sia con reagenti per
le Catene Leggere Totali sia con reagenti specifici diretti per le Catene Leggere Libere.
La valutazione ha consentito di definire quali “campioni di controllo” almeno in termini di “positivo/negativo” la diluizione 1:60 del campione
BJP-kappa e 1:100 del campione BJP-lambda.
Obbiettivo futuro del gruppo di studio sarà il tentativo di uniformare il “tipo di campione” e i diversi aspetti della “comunicazione refertuale”.
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Jenkins MA
Division of Laboratory Medicine, Austin and Repatriation Medical Centre, Heidelberg, Victoria, Australia. [email protected]
Clinical application of capillary electrophoresis to unconcentrated human urine proteins.
Electrophoresis 1997 Sep;18(10):1842-6
Urine protein electrophoresis can be performed by capillary electrophoresis using spun unconcentrated urine diluted with running buffer. The
separation which utilises the excellent sensitivity of capillary electrophoresis gives electropherograms similar to those obtained by diluting
concentrated urine with buffer. A 72 cm x 50 microns internal diameter (ID) fused silica capillary was used for the analysis which took less than
15 min. Bence Jones protein can be
detected from unconcentrated urine over urine protein concentrations
ranging from 9.7 g/L to 0.04 g/L.
Other clinical patterns, such as glomerular proteinuria, the presence of intact immunoglobulin and Tamm Horsfall protein can also be detected.
The benefit of using unconcentrated urine is the time and cost saved by not concentrating the urine.
Metodi e varie - Riferimenti Bibliografici (RB)
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Bence Jones H. Papers on chemical pathology. Lecture III. Lancet, 1847, 2, 88-92
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Gasparro C, Verri A, Rovescala M, Dolce R, Bergami MR, Aguzzi F. Possibilità e limiti di una tecnica quantitativa su BNA per la ricerca della
Proteina di Bence Jones nella urine. Biochimica Clinica, 16, 1992, pp. 1233 - 1237
Gasparro C, Bergami MR, Verri A, Rovescala M, Dolce R, Aguzzi F. - Detection of Bence Jones Proteins by automated Immunonephelometric
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Marshall T; Williams KM - Electrophoretic analysis of Bence Jones proteinuria - Electrophoresis 1999 Jun;20(7):1307-24
Nefropatie - Abstract (AB)
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Teppo-A-M. Groop-L.
Fourth Department of Medicine, University Central Hospital, Helsinki, Finland.
Urinary excretion of plasma proteins in diabetic subjects. Increased excretion of kappa light chains in diabetic patients with and without
proliferative retinopathy.
Diabetes. 1985 Jun. 34(6). P 589-94.
The urinary excretion of beta2-microglobulin, albumin, kappa light chains, transferrin, and IgG as well as their concentration ratios were assessed
in 27 nondiabetic patients with proteinuria and in 72 IDDM patients, 41 with proliferative retinopathy (PR) and 31 without retinopathy, matched
for age, duration of diabetes, and treatment. The mean excretions of albumin, transferrin, and IgG were similar in patients with nondiabetic
proteinuria and in IDDM patients with PR and were significantly higher than in IDDM patients without retinopathy. Despite similar albumin
excretion, the amount of excreted kappa light chains was significantly higher in IDDM patients than in patients with nondiabetic proteinuria,
resulting in an elevated kappa chain/albumin ratio. Furthermore, diabetic subjects without microalbuminuria showed increased kappa
chain/albumin ratio, indicating that increased urinary excretion of kappa chains may be an early sign of diabetic nephropathy. Determination of
kappa light chain excretion may have clinical implications in the differentiation between proteinuria of diabetic and nondiabetic origin. The ratio
kappa chain/albumin was independent of the excretion of beta2-microglobulin in patients with PR, suggesting that the reduced ability to reabsorb
immunoglobulin light chains may occur earlier than that of beta2-microglobulin in the development of tubular dysfunction in insulin-dependent
diabetes mellitus. Author-abstract.
•
Teppo-A-M. Maury-C-P.
Fourth Department of Medicine, University Central Hospital, Helsinki, Finland.
Urinary protein excretion patterns in reactive (secondary) systemic amyloidosis.
RHEUMATOLOGY INTERNATIONAL. 1988. 8(5). P 213-7.
The urinary excretion of immunoglobulin light chains kappa and lambda, immunoglobulin G, transferrin, and beta-2-microglobulin was studied
in 21 patients with nonimmunoglobulin-related amyloid nephropathy (secondary, type AA) associated with rheumatic disease and in 39 patients
with glomerulopathy of nonamyloid origin, as well as in 22 patients with rheumatic disease without signs of nephropathy and in 15 healthy
subjects. Patients with amyloidosis were found to have a higher ratio of excreted lambda/kappa light chains than patients with diabetic
nephropathy or chronic glomerulonephritis. The increased lambda/kappa ratio was not dependent on the grade of proteinuria and was evident in
patients with mild as well as heavy proteinuria. The ratio of lambda/kappa light chains in serum of patients with amyloidosis did not differ from
that in healthy controls. The results suggest that amyloid deposition in the kidneys is associated with a selective alternation of the
immunoglobulin light chain excretion in the urine. Author-abstract.
•
Walton-C. Bodansky-H-J. Wales-J-K. Forbes-M-A. Cooper-E-H.
University Department of Medicine, General Infirmary, Leeds.
Tubular dysfunction and microalbuminuria in insulin dependent diabetes.
ARCHIVES OF DISEASE IN CHILDHOOD. 1988 Mar. 63(3). P 244-9.
The nature of microproteinuria in the early years of insulin-dependent diabetes was investigated in a cross sectional study of 80 children with
insulin-dependent diabetes and 40 normal children. Urinary excretion of three low molecular weight proteins: alpha-1-microglobulin, beta-2microglobulin and kappa light chains was used as an index of proximal renal tubular function. The first urine samples of the morning were
collected and excretion of proteins measured was expressed as ratio of protein to creatinine. There was a strong correlation between excretion of
alpha-1-microglobulin and kappa light chains and their excretion was significantly higher in diabetic children indicating decreased proximal
tubular reabsorbtion. The excretion of beta-2-microglobulin was found to be an unsatisfactory index of proximal tubular function. Urinary
albumin excretion was not significantly raised in diabetic children and did not correlate with urinary alpha-1-microglobulin or kappa light chain
excretion. Glycaemic control might influence proximal tubular function as both urinary glucose concentration and glycosylated haemoglobin
showed correlations with urinary alpha-1-microglobulin excretion and with urinary kappa light chain excretion. Author-abstract.
•
Hopper-J-E. Sequeira-W. Martellotto-J. Papagiannes-E. Perna-L. Skosey-J-L.
Section of Hematology, University of Illinois College of Medicine, Chicago 60680.
Clinical relapse in systemic lupus erythematosus: correlation with antecedent elevation of urinary free light-chain immunoglobulin.
JOURNAL OF CLINICAL IMMUNOLOGY. 1989 Jul. 9(4). P 338-50.
This paper reports preliminary evidence suggesting that measurements of free light-chain Ig (FLIg) in urine may represent quantitative markers of
in vivo polyclonal B-cell activation. Thus, longitudinal levels of urinary FLIg in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) may be used
to track or monitor the in vivo immunopathologic B-cell activity of SLE and be helpful in predicting a disease relapse. Our findings showed that
dramatic rises in urinary FLIg occurred during asymptomatic intervals that preceded by 4-8 weeks the first symptomatic signs of acute SLE
relapse. These results suggest that a sizable lead time may exist between the occurrence of immunopathologic B-cell stimulation and the resultant
symptoms and tissue damage of immune complex-induced acute inflammation. In these studies the measurement of urinary FLIg was
accomplished by an indirect method using ng-sensitive radioimmunoassays (RIAs) that measured isotypic IgG, IgA, IgM, total kappa-Ig, and
total lambda-Ig. As a control for the assessment of renal tubular function and the excretion of low molecular weight proteins in SLE patients,
longitudinal measurements of beta-2-microglobulin (B2M) and lysozyme were made using a novel solid-phase 3H-biotin RIA technique. Authorabstract.
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Groop-L. Makipernaa-A. Stenman-S. DeFronzo-R-A. Teppo-A-M.
Fourth Department of Medicine, University Central Hospital, Helsinki, Finland.
Urinary excretion of kappa light chains in patients with diabetes mellitus.
KIDNEY INTERNATIONAL. 1990 Apr. 37(4). P 1120-5.
The urinary excretion of kappa light chains, beta 2-microglobulin and albumin was examined in patients with newly diagnosed and long-standing
insulin-dependent (IDDM) and non-insulin-dependent (NIDDM) diabetes mellitus, and compared to age-matched control subjects. Patients with
IDDM diagnosed within two months, presented with normal albumin excretion, whereas the concentrations of beta 2-microglobulin and kappa
light chain in urine were higher than in control subjects. The initiation of insulin therapy reduced, but did not completely normalize, the elevated
rate of kappa light chain excretion. Patients with IDDM of long duration showed increased urine excretion of kappa light chains and albumin. In
keeping with the findings in IDDM, patients with newly diagnosed NIDDM (within one year) showed increased urinary excretion of kappa light
chains compared with control subjects. There was, however, no further increase in light chain excretion with longer duration of NIDDM. To
study the effect of short-term hyperglycemia on urinary protein excretion, 12 normal subjects participated in a three-step hyperglycemic clamp
study, during which their plasma glucose concentration was raised by +50, +125 and +300 mg/dl. The urine excretion of albumin and beta 2microglobulin rose progressively with each hyperglycemic clamp step, whereas that of kappa light chain excretion was unaffected by
hyperglycemia. We conclude that increased urinary excretion of kappa light chain is a consistent finding in all types of diabetes mellitus, and can
be observed even when the albumin excretion is normal. Since the serum concentration of kappa light chain is normal in diabetes, the increased
urinary excretion of kappa light chains must be of renal origin.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS). Author-abstract.
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Groop-L. Stenman-S. Groop-P-H. Makipernaa-A. Teppo-A-M.
Fourth Department of Medicine, Helsinki University Hospital, Finland.
The effect of exercise on urinary excretion of different size proteins in patients with insulin-dependent diabetes mellitus.
SCANDINAVIAN JOURNAL OF CLINICAL AND LABORATORY INVESTIGATION. 1990 Sep. 50(5). P 525-32.
To examine whether exercise-induced proteinuria in diabetes is dependent upon the size of the excreted protein, we measured urinary excretion of
beta 2-microglobulin, kappa light chains, albumin and IgG before and after 20 min of moderate ergometer exercise in 34 patients with insulin
dependent diabetes mellitus (IDDM) and in eight healthy control subjects. Seventeen patients with newly diagnosed IDDM and 17 patients
(seven of which had elevated albumin excretion rate) with longstanding IDDM were studied. Exercise did not significantly influence protein
excretion in control and newly diagnosed IDDM subjects. In contrast, exercise enhanced excretion of beta 2-microglobulin (p less than 0.050.01), kappa light chains (p less than 0.001), albumin (p less than 0.005-0.001) and IgG (p less than 0.01-0.001) in patients with long-standing
IDDM independently of whether the patient had proteinuria in the resting state or not. In conclusion, proteinuria induced by moderate exercise is
not observed in the early stages of IDDM, and is independent of the size of the excreted protein. Therefore, moderate exercise does not appear to
influence the size selectivity of the glomerular capillary wall in patients with longstanding IDDM. Author-abstract.
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Knudsen LM; Hippe E; Hjorth M; Holmberg E; Westin J
Renal function in newly diagnosed multiple myeloma--a demographic study of 1353 patients. The Nordic Myeloma Study Group.
Department of Internal Medicine, Herlev Hospital Copenhagen, Denmark.
Eur J Haematol 1994 Oct;53(4):207-12
This study describes the occurrence of renal failure among 1353 newly diagnosed cases of multiple myeloma. Renal function was evaluated by
serum creatinine concentration in 1353 cases, 31% of whom had renal failure at the time of diagnosis. In 1206 cases an estimation of creatinine
clearance was made. When renal failure was defined by using creatinine clearance estimation, 49% had renal failure at the time of diagnosis.
Renal failure was present in 24% of patients with an M component of IgG-, 31% of IgA- and 100% of IgD-type. 52% of patients with light chain
disease had renal failure. The frequency of renal failure was similar in lambda- and kappa-light chain disease. Patients with a high excretion of
Bence Jones protein in the urine (> 10 g/24 h) had renal failure significantly more often than patients with lower excretion. Renal failure was
related to advanced disease; 41% of patients with stage III (Durie-Salmon) disease had renal failure. Renal failure was found in 45% of patients
with hypercalcaemia. When estimated creatinine clearance was used as a predictor of renal function, the same trends were found as mentioned
above. In addition, the proportion of patients with renal failure was found to increase with advancing age.
Nefropatie - Riferimenti Bibliografici (RB)
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Contrastografie - Abstract (AB)
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Defronzo-R-A. Humphrey-R-L. Wright-J-R. Cooke-C-R.
Acute renal failure in multiple myeloma.
MEDICINE (Baltimore). 1975 May. 54(3). P 209-23.
1) The clinical manifestations, laboratory data and renal histologic features of acute renal failure occurring in 14 patients with multiple myeloma
are reviewed and contrasted with the data from 29 previously reported cases.
2) Whereas other reports have stressed the role of intravenous pyelography and dehydration in the development of acute renal failure in multiple
myeloma, the most common etiologic factor in our experience was hypercalcemia (7 patients). Other factors included potentially nephrotoxic
antibiotics (3 patients) and volume depletion (2 patients). Intravenous pyelography could be clearly implicated in ony one patient.
3) The unusually high incidence of Bence Jones proteinuria in these patients is consistent with the possibility that Bence Jones protein excretion
is associated with an increased susceptibility to renal injury. This could be due to an adverse effect of Bence Jones proteins on the renal tubules or
their tendency to precipitate in tubular lumina during periods of reduced tubular flow.
4) The prognosis of patients with multiple myeloma who develop acute renal failure is poor; only 5 of our 14 patients survived the early period of
acutely impaired renal function, and 4 of these subsequently died within 2 months. Preventive measures particularly the prompt correction of
hypercalcemia and volume depletion, are the most important aspects of patient management. Author-abstract.
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Davies-P. Roberts-M-B. Roylance-J.
Acute reactions to urographic contrast media.
BRITISH MEDICAL JOURNAL. 1975 May 24. 02(5968). P 434-7.
A prospective study of 3509 consecutive patients examined by excretion urography has been conducted to assess the incidence and significance
of the untoward effects of urographic contrast media. Four compounds were used in doses containing 160 to 500 mg iodine/kg body weight.
Toxic effects, arm pain, and allegic reactions were assessed separately, while the remainder were classified according to the influence of each
reaction on the investigation and the need for treatment. From the results and a review of the literature we conclude that when there is a clear
clinical indication for excretion urography a dose of contrast medium containing up to 600 mg iodine/kg body weight should be injected rapidly.
Prophylactic antihistamine treatment and pretesting should be abandoned. Special care is needed for small infants and the lederly and for patients
with renal or hepatic failure, myeloma, heart disease, or a history of previous major reaction. Full resuscitation facilities must always be
available. Author-abstract.
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Min-K. Cain-G-D. Gyorkey-P. Gyorkey-F.
(Department of Pathology, Department of Medicine, Veterans Administration Hospital, Houston.)
Myeloma-like lesions of the kidney. Occurrence in a case of acinic cell adenocarcinoma of the pancreas.
ARCHIVES OF INTERNAL MEDICINE. 1976 Nov. 136(11). P 1299-302.
A 54-year-old man with acinic cell adenocarcinoma of the pancreas died of oliguric renal failure associated with myeloma-like renal lesions.
Electron microscopical study of the tumor cells disclosed rich rough-surfaced endoplasmic reticulum and membrane-bound secretory granules,
which indicated active protein synthesis and suggested that abnormal proteins produced by the tumor cells were the underlying cause of the renal
lesions. Rapid deterioration of renal function ensued after intravenous pyelography, as is usual in the syndrome of myeloma-like lesions of the
kidneys. This case presents further evidence for the occurrence of "myeloma kidney" in association with tumors other than plasma cell myeloma.
Author-abstract.
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Shulman-G.
(Department of Chemical Pathology, School of Pathology, University of the Witwatersrand, Johannesburg.)
Bence Jones myelomatosis and intravenous pyelography.
SOUTH AFRICAN MEDICAL JOURNAL. 1977 Apr 23. 51(17). P 574-6.
The consequences of intravenous pyelography are described in 3 patients with unsuspected myelomatosis. One patient died, and 1 surviving
patient showed unusual solubility of Bence Jones protein to acid pH in vitro. The urine of a third patient was negative for Bence Jones protein.
Simple chemical screening of urine, to detect Bence Jones protein, is essential before patients undergo urography. Author-abstract.
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Cosio-F-G. Pence-T-V. Shapiro-F-L. Kjellstrand-C-M.
(Department of Medicine, University of Minnesota Hospital, Minneapolis.)
Severe renal failure in multiple myeloma.
CLINICAL NEPHROLOGY. 1981 Apr. 15(4). P 206-10.
Twenty-four patients with multiple myeloma and renal failure severe enough to require dialysis were retrospectively analyzed. Most patients
initially presented with renal failure and multiple myeloma was subsequently diagnosed. Intravenous pyelography precipitated irreversible renal
failure in 2 patients. Absence of light chain disease and treatment with peritoneal dialysis were associated with increased recovery of renal
fraction. The one year survival rate of myeloma patients on chronic dialysis was similar to the general myeloma population but was much worse
than a group of age matched non-myeloma chronic dialysis patients. Survival rate was diminished in patients with elevated serum calcium levels.
Author-abstract.
New Scientific Company ©
Pagina: 45
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Gassmann-W. Haferlach-T. Schmitz-N. Kayser-W. Loffler-H.
(Ii. Medizinische Klinik, Universitat Kiel.)
[Problems of intravenous urography in patients with plasmocytoma].
Zur Problematik der intravenosen Urographie bei Patienten mit Plasmozytom.
SCHWEIZERISCHE MEDIZINISCHE WOCHENSCHRIFT. JOURNAL SUISSE DE MEDECINE. 1983 Feb 26. 113(8). P 301-4.
Numerous reports refer to the development of acute renal failure following intravenous urography in patients with multiple myeloma, while other
authors consider the risk to be acceptable if abdominal compression and dehydration are avoided and alkalization of urine is carried out. The
outcome of 34 intravenous urographies with Conray 70, Conray FL, and Conray 36 has been evaluated in 26 patients with multiple myeloma. No
case of acute renal failure was observed. Two patients experienced a mild increase (greater than 0.3 mg/dl) in serum creatinine levels. Mean value
of serum creatinine was 1.28 mg/dl prior to and 1.18 mg/dl after urography. In three of four patients with preexisting azotemia serum creatinine
levels fell after urography, while in the fourth a mild increase from 2.0 mg/dl to 2.5 mg/dl five days after the examination was observed. Data
from the literature in addition to own data are presented. From all the data taken together we conclude that intravenous urography may carry a
moderately increased risk of acute renal failure in patients with multiple myeloma. It may be performed if the indication is well established.
Author-abstract.
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Taraba-I. Hering-A.
Dialysis treatment in multiple myeloma.
INTERNATIONAL UROLOGY AND NEPHROLOGY 1985. 17(4). P 373-7.
The histories of three patients suffering from acute renal failure and multiple myeloma are reviewed. In two patients oliguric acute renal failure
appeared following intravenous urography. Although renal failure was treated by dialysis, all the three patients died of pulmonary infection. It is
concluded that prevention of renal failure is still more promising than its treatment. Author-abstract.
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Fontanarosa-P-B.
(Northeast Ohio Universities College of Medicine, Akron.)
Radiologic contrast-induced renal failure.
EMERGENCY MEDICINE CLINICS OF NORTH AMERICA 1988 Aug. 6(3). P 601-16.
RCIRF is a complex syndrome resulting in acute renal dysfunction following exposure to radiologic contrast media. It accounts for 10 per cent of
all cases of acute renal failure. The pathogenesis appears multifactorial but most probably involves contrast-mediated renal ischemia and direct
tubular toxicity. Significant risk factors include preexisting renal insufficiency, diabetes mellitus, advanced age, volume depletion, and presence
of multiple myeloma. The diagnosis should be suspected with acute renal dysfunction temporally related to radiologic contrast administration.
The prognosis for recovery is good in most cases. Key preventive measures include identification of high-risk patients, ensuring adequate
hydration prior to contrast agent administration, avoiding excessive and repeated contrast exposure, and instituting prophylactic therapy in
selected cases. Author-abstract. 93 Refs.
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McCarthy CS, Becker JA.
Multiple Myeloma and Contrast Media.
Department of Radiology, State University of New York, Health Science Center at Brooklyn 11203.
Radiology, 1992, 183, pp. 519 - 521.
Contrast media administered intravenously are still thought by many to be a major cause of acute renal failure (ARF) in myeloma patients.
Recently, several authors found that the predominant risk factors of ARF in myeloma patients are hypercalcemia, dehydration, infection, and
Bence Jones proteinuria rather than contrast media. In a review of seven retrospective studies of myeloma patients receiving contrast media, 476
patients were noted to have undergone 568 contrast media studies, with an ARF prevalence of 0.6%-1.25%. One large series showed the
incidence of ARF after administration of contrast media to be 0.15% in the general population. Although the administration of contrast media to
myeloma patients is not totally risk free, it may be performed if the clinical need arises and the patient is well hydrated.
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Thatte L, Vaamonde CA
Drug-induced nephrotoxicity: the crucial role of risk factors.
University of Miami School of Medicine, Florida, USA.
Postgrad Med 1996 Dec;100(6):83-4, 87-8, 91 passim
Although the exact incidence of drug-induced nephrotoxicity is not known, it is important for clinicians to be aware of the risks in certain patients
and to know which drugs are the most commonly implicated. The latter include radiocontrast agents, aminoglycosides, nonsteroidal antiinflammatory drugs, and angiotensin-converting enzyme inhibitors. Other medications also have nephrotoxic potential when they are prescribed
in specific patient populations. Renal injury may be transient and mild in many cases, but recognition of the patient at high risk and application of
preventive measures are essential to avoid a severe and protracted course
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Rudnick MR, Berns JS, Cohen RM, Goldfarb S
Contrast media-associated nephrotoxicity.
Section of Nephrology and Hypertension, Graduate Hospital and the University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia 19146, USA.
Semin Nephrol 1997 Jan;17(1):15-26
Contrast media-associated nephrotoxicity (CM-AN) continues to be a common cause of hospital-acquired acute renal failure. This review of CMAN discusses the pathogenesis, clinical features, incidence, risk factors with an emphasis on pre-existing renal insufficiency and diabetes
mellitus, volume of contrast media, low osmolar versus high osmolar contrast media, and prophylaxis. Although the literature contains an
abundance of information concerning CM-AN, areas of uncertainty remain in respect to clinical significance, risk with modem day radiological
techniques and contrast media, optimal prophylactic regimens, and criteria for creatinine screening before contrast media administration.
Contrastografie - Riferimenti bibliografici (RB)
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