confronto fra due procedimenti per l`esecuzione del test d

Biol. Mar. Medit. (2006), 13 (1): 1085-1089
L. Kozinkova, S. De Ranieri
Centro Interuniversitario di Biologia Marina ed Ecologia Applicata (CIBM),
Viale N. Sauro, 4 - 57128 Livorno, Italia.
[email protected]
CONFRONTO FRA DUE PROCEDIMENTI PER L’ESECUZIONE
DEL TEST D’EMBRIOTOSSICITÀ CON I GAMETI DEL RICCIO
DI MARE PARACENTROTUS LIVIDUS (LAMARCK 1835)
COMPARISON BETWEEN TWO PROCEDURES TO PERFORME
THE TEST OF EMBRYO TOXICITY WITH PARACENTROTUS
LIVIDUS (LAMARCK 1835) SEA URCHIN GAMETES
Abstract
Two procedures to perform the test of embryo-toxicity with gametes of Paracentrotus lividus (Lamarck
1835) are compared. In the first method the sperm is exposed for one hour to a reference toxicant and
to the solution wich has been tested, before its contact with eggs. In the second method, the zygotes are
exposed. In the following 48-72 hours we applied the same control procedure in both methods. The first
experimental procedure appears more sensitive than the second one.
Key-words: Paracentrotus lividus, embryo toxicity, sperm, zygotes, EC 50.
Introduzione
Il test d’embriotossicità con Paracentrotus lividus può essere eseguito seguendo
due procedure molto simili. Il primo procedimento, prevede l’esposizione dello
sperma per un intervallo di tempo stabilito al tossico di riferimento e alle sostanze
testate prima dell’aggiunta delle uova. Fecondazione e sviluppo per le 48 o 72 ore
successive avvengono quindi a contatto con tali soluzioni. Il secondo procedimento, prevede la fecondazione in acqua di mare non contaminata e la successiva
esposizione degli embrioni (zigoti) al tossico di riferimento ed alle sostanze testate
(EPA 1995, ASTM 1995).
La differenza tra queste due procedure è evidente considerando il materiale
biologico che è impiegato nell’esperimento ed esposto alle sostanze esaminate. Da
una parte lo sperma, (2 µm) rappresentato da una cellula preservata dalla sottile
membrana cellulare e dall’altra lo zigote (100-200 µm) protetto dalla membrana
di fecondazione. La sensibilità naturale dello sperma dipende da numerosi fattori
esterni ed interni. Lo sperma è ritenuto un indicatore molto sensibile alla presenza di sostanze nocive nell’ambiente marino ed è impiegato nei test di spermiotossicità.
Nel caso in cui lo sperma è esposto prima del suo contatto con le uova alle
sostanze tossiche, il risultato della fecondazione e del successivo sviluppo sarà
differente dal risultato della fecondazione e sviluppo avvenuti in un ambiente
pulito.
Nel primo procedimento viene stimato lo sviluppo che porta a termine la
fecondazione che avviene in una unica provetta contenente la soluzione tossica.
Nel secondo procedimento al contrario è valutato soltanto l’effetto sugli embrioni
ottenuti dalla fecondazione avvenuta in acqua pulita ed in seguito esposti alla
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L. Kozinkova, S. De Ranieri
soluzione tossica. Questo lavoro cerca di rintracciare le possibili differenze tra i
due procedimenti, riguardo alla loro sensibilità verso un tossico di riferimento e
alcune sostanze naturali testate (elutriati).
Materiali e metodi
Le singole prove di confronto sono state eseguite con lo stesso pool di animali. I ricci dopo la raccolta manuale e dopo il trasporto sono stati stabulati in
acquario alla temperatura di 16±1 °C in condizioni controllate per un minimo di
sette giorni. La loro alimentazione era composta da alghe provenienti dal sito di
prelievo ed inoltre da Codium sp.
L’emissione dei gameti maschili e femminili è stata provocata tramite l’iniezione di 0,5 ml di 1 M KCl nella cavità celomatica o con la stimolazione elettrica.
Lo sperma è stato recuperato a secco e conservato a 4 °C fino al suo uso entro
3-5 ore dal suo prelievo.
La raccolta delle uova è stata realizzata per ogni femmina in un becher contenente 50 ml di acqua marina naturale (NSW) filtrata, capovolgendo l’animale
con il poro anale verso l’acqua. Dopo la valutazione della maturità (mancanza
del nucleo) forma e colore, le uova sono state unite in un becher e lavate tre
volte. Alla fine, diluite ad una densità di 200 uova/ml e conservate a 18 °C per
3-5 ore.
50 µl di sperma non diluito sono stati bloccati in 10 ml d’acqua dolce. La concentrazione dello sperma è stata stabilita in conformità al conteggio nella camera
di Thoma. La diluizione finale è stata preparata un istante prima dell’esposizione.
Il rapporto uovo/sperma era stabilito a 1/15000. L’esperimento prevedeva quattro
diluizioni del tossico di riferimento Cu(NO3)2·3H2O (16, 32, 46,64 µg/l) e tre diluizioni degli elutriati (EPA 1998) a diversa contaminazione (100,50 e 25%), tutto
in tre repliche. Come controllo negativo è stata usata l’acqua di mare naturale
filtrata (40 µm).
1° procedimento. Lo sperma è stato esposto per un’ora alle concentrazioni previste del tossico di riferimento, elutriati ed acqua di mare naturale filtrata (controllo negativo) in provette di vetro borosilicato in un volume di 9 ml. Le uova
(1 ml della soluzione finale/ogni provetta) sono state aggiunte dopo un’ora. Dopo
48 o 72 ore il test è stato bloccato mediante l’aggiunta di 1ml di formaldeide
(37%).
2° procedimento. Alla soluzione delle uova (200 uova/ml) è stato aggiunto lo
sperma diluito in NSW ad una concentrazione che garantiva il rapporto uovo/
sperma di 1/15000. Dopo venti minuti 1 ml della soluzione (contenente 200 uova
fecondate) è stato trasferito nelle provette contenenti 4 diluizioni del tossico di
riferimento, tre diluizioni degli elutriati (100, 50 e 25%) e controllo negativo
(NSW), il tutto in tre repliche. Il test è stato bloccato mediante l’aggiunta di 1 ml
di formaldeide (37%) dopo 48/72 ore.
Le provette sono state conservate a 5 °C fino alla loro valutazione. Al microscopio sono stati contati cento embrioni e calcolata la percentuale dei plutei in
ciascun campione ed in ciascuna replica. I risultati sono stati sottoposti a correzione dell’Abott. EC 50 è stato calcolato con metodo Trimmed Spearman-Karber
1,5 e le risposte sottoposte all’analisi statistica ANOVA.
Esecuzione del test d’embriotossicità con i gameti del riccio di mare Paracentrotus lividus
1087
Risultati
La qualità delle uova risultava buona riguardo alla loro forma, colore e maturità.
L’osservazione microscopica (42×) dello sperma aveva confermato la sua ottima
vitalità e capacità fecondativa, confermata dalle prove preliminari di fecondazione.
Nel controllo (NSW) non sono state osservate differenze significative all’interno delle singole prove tra le due metodiche applicate. Le percentuali finali dei
plutei in tutti gli esperimenti non erano significativamente differenti (p=0,3450,669 ANOVA). Da questa osservazione risulta, che in NSW pulita, la cellula di
partenza non è rilevante per il successivo sviluppo.
Valori dell'EC 50 (mg/l)
μ
45
EC 50(mg/l)
μ
40
sperma 48 ore
35
sperma 72 ore
embrio 48 ore
30
embrio 72 ore
25
Valori dell'EC 50 (mg/l)
20
45
0
1
2
3
4
5
6
numero d'esperimento
40
EC 50(mg/l)
Figura 1. Valori dell’EC 50 ottenuti durante le cinque prove di confronto.
Fig. 1 - Valori
dell’EC
50 of
ottenuti
durante le cinque prove di confronto. sperma 48 ore
35 Values
EC 50 (mg/l) obtained in five comparative experiments.
sperma 72 ore
Values of EC 50 (μg/l) obtained in five comparative experiments.
30
embrio 48 ore
embrio 72 ore
Percentuale dei plutei nel campione num.1
% dei plutei
Nel caso dell’esposizione
dello sperma (prima metodica) agli elutriati a diversa
25
contaminazione 80per 48 o 72 ore, si osserva la disuguaglianza nella percentuale
finale dei plutei.2060La durata dello sviluppo per 48/72 ore invece non influenza la
1
2 che vengono
3
4 applicati
5
6
40 0 a condizione
quantità dei plutei
gli zigoti
(seconda metonumero notare
d'esperimento
dica). Dai valori20 dell’EC 50 si può
la sensibilità superiore dello sperma
0
(48/72) verso il tossico
di riferimento (Fig. 1.) Questo evento si conferma anche
sperma
sperma72
embrio prove
48
embrio72
Figura
1. Valori
dell’EC
50 ottenuti
le
di confronto.
nelle prove eseguite
con
gli48elutriati
adidurante
tutte
lecinque
loro
concentrazioni
(Figg. 2, 3, 4 e 5).
cellule
partenza/tempo
di sviluppo
Values of EC 50 (mg/l)
obtained
in five comparative
experiments.
contr
campione 1.(100%)
campione 1. (50%)
campione 1.(25%)
Percentuale dei plutei nel campione num.1
% dei plutei
Figura 2. Percentuale dei plutei nel campione 1.
Percentage of pluteus in sample 1.
80
60
40
20
0
sperma 48
sperma72
embrio 48
embrio72
cellule di partenza/tempo di sviluppo
contr
campione 1.(100%)
Fig. 2 - Percentuale dei plutei nel campione 1.
campione 1. (50%)
Figura 2. Percentuale dei plutei nel campione 1.
Percentage of pluteus in sample 1.
Percentage of pluteus in sample 1.
campione 1.(25%)
Percentuale dei plutei nel campione num. 2
1088
L. Kozinkova, S. De Ranieri
% dei plutei% dei plutei
80
Percentuale dei plutei nel campione num. 2
60
40
80
20
60
0
40
sperma 48
sperma72
embrio 48
embrio72
cellule di partenza/tempo di sviluppo
20
controllo
0
campione 2.(100%)
sperma 48
campione 2.(50%)
sperma72
campione 2.(25%)
embrio 48
embrio72
Figura3. Percentuale dei plutei nel campione 2.
di partenza/tempo
di sviluppo
Percentage of pluteuscellule
in sample
2.
controllo
campione 2.(100%)
campione 2.(50%)
campione 2.(25%)
Figura3. Percentuale
plutei
nel campione
Fig. 3 - Percentuale
dei pluteideinel
campione
2. 2.
Percentage
of pluteus
Percentage of
pluteus in
sample in2.sample 2.
Pe rce ntuale de i plute i ne l campione num.3
80
60
Pe rce ntuale de i plute i ne l campione num.3
40
80
20
60
0
40
20
controllo
0
sperma 48
sperma72
embrio 48
embrio72
ce llule di partenz a/durata di sviluppo
campione 3.(100%)
sperma 48
campione 3.(50%)
sperma72
embrio 48
campione 3.(25%)
embrio72
Fig. 4 - Percentuale
dei pluteidei
nel
campione
3. 3. di sviluppo
ce
llule
dinel
partenz
a/durata
Figura 4. Percentuale
plutei
campione
Percentagecontrollo
of
pluteus inof
sample
3. sample 3.
Percentage
pluteus3.(100%)
in
campione
campione 3.(50%)
campione 3.(25%)
Figura 4. Percentuale dei plutei nel campione 3.
Percentage of pluteus in sample 3.
% dei plutei
Percentuale dei plutei in campione num.4.
95
90
85
80
75
70
65
60
sperma
embrio
cellule di partenza /durata di sviluppo
controllo
campione 4(100%)
campione 4(50%)
Figura5. Percentuale
deinel
plutei
nel campione
Fig. 5 - Percentuale
dei plutei
campione
4. 4.
Percentage of pluteus in sample 4.
Percentage of pluteus in sample 4.
campione 4(25%)
Esecuzione del test d’embriotossicità con i gameti del riccio di mare Paracentrotus lividus
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In un lavoro separato saranno riportati e confrontati i risultati ottenuti nelle
prove successive e sarà approfondita la significatività delle differenze riscontrate
tra le due metodiche, riguardo alla loro sensibilità verso il tossico di riferimento
e le sostanze naturali.
Conclusioni
La sensibilità al tossico di riferimento dimostrata dal primo metodo è leggermente maggiore di quella evidenziata dal secondo metodo. Le prove effettuate con
gli elutriati confermano quest’osservazione.
Bibliografia
ASTM (1995) - Standard Guide for Conducting Static Acute Toxicity Tests with Echinoid
Embryos. American Standard testing Materials. E 1563-95: 1029-1046.
EPA (1995) - Short-term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to West Coast Marine and Estuarine Organisms. 600/R-95: 136.
EPA (1998) - Evaluation of Dredged Material Proposed for Discharge in Waters of the U.S.
Testing Manual 823-B-98-004.