Le applicazioni pratiche delle scoperte in biologia molecolare

Le applicazioni pratiche
delle scoperte in
biologia molecolare
Luca Mazzucchelli
Istituto cantonale di patologia
Locarno
Oncologia Lago Maggiore
Locarno 25 settembre 2008
Farmaco
Target
Indicazione
Rituximab
Alemtuzumab
Trastuzumab
Cetuximab
Panitumumab
Bevacizumab
CD20
CD52
Her2
EGFR
EGFR
VEGF
Linfoma a cellule B
CLL, Linfoma a cellule T
Carcinoma della mammella
Carcinoma del colon, della testa-collo
Carcinoma del colon
Adenocarcinoma colon
Sorafenib
Imatinib
Erlotinib
Gefitinib
Lapatinib
BRAF
c-kit
EGFR
EGFR
EGFR-Her2
Carcinoma del rene, epatocarcinoma
GIST, CML
Adenocarcinoma polmone
Adenocarcinoma polmone
Carcinoma della mammella
Ciardiello and Tortora, N Engl J Med 2008
Cellula normale
Etero-/Omo-dimeri
PI3K
PTEN
K-Ras
P
P
BRAF
Akt
MEK
mTor
ERK 1,2
Cell survival
Cell proliferation
Cellula neoplastica
PI3K
PTEN
PP
K-Ras
BRAF
Alterazioni del recettore
„ Sovraespressione
proteica (amplificazione
genica)
„ Mutazioni
Akt
MEK
mTor
ERK 1,2
Cell survival
Cell proliferation
Alterazioni di proteine di
trasduzione
„ Mutazioni
„ Perdita
Cellula neoplastica
Sovraespressione
Etero- oppure omo-dimerizzazione
senza ligando
Mutazione
Attivazione dominio TK senza
ligando e senza etero/omodimerizzazione
Attivazione della cascata di segnali
Proliferazione cellulare
Meccanismo
Tumore
Sovraespressione/amplificazione HER2
Mammella
Sovraespressione
/amplificazione EGFR
Polmone, Colon
Testa-collo
Mutazione EGFR
Polmone
Mutazioni KRAS
Colon, Pancreas, Polmone
Mutazione BRAF
Tiroide, Colon, Melanoma
„Target therapy“
„
„
„
Anticorpi monoclonali diretti
contro la parte extracellulare
del recettore
Inibitori del dominio tirosinchinasico del recettore situato
nella componente citosolica
del recettore
Inibitori di proteine di
trasduzione
Ciardiello and Tortora, N Engl J Med 2008
Meccanismi di azione degli
anticorpi monoclonali
Ciardiello and Tortora, N Engl J Med 2008
Meccanismo di azione dei TKIs
EGFR
„
ATP
Esoni
18-21
TKI
„
Stimolazione
cellulare
„
La presenza di
mutazione induce alta
affinità di legame con
piccole molecole
capaci di sostituirsi ad
ATP in maniera non
permanente
Il dominio TK viene
bloccato
La cascata di segnali
a valle viene interrotta
MoAb
TKI
Somministrazione
i.v.
p.os.
Struttura
IgG
molecole basso PM
Selettività target
alta
media
Meccanismo
blocca ligando
blocca dominio TK
Internalizzazione
si
no
Attivazione sistema si
immunitario
no
Mutazione proteina (si)
si
Sovraespressione si
(si)
„
„
„
Inibitori TK (EGFR) sono efficaci in circa il 5%
dei carcinomi polmonari
Trastuzumab (anti-HER2) è efficace solo in 1015% dei carcinomi della mammella
Cetuximab (anti-EGFR) è efficace solo nel 20%
dei carcinomi del colon
Perchè?
Come predire la risposta terapeutica?
TKIs
„
„
„
„
„
Aspetti Clinici
Asiatici
Donne
Non-fumatori/trici
Adenocarcinoma
Dermatite acneiforme
„
Aspetti molecolari
Mutazione EGFR negli
esoni 18 - 21 (5-15% dei
pazienti caucasici, 2535% dei pazienti asiatici
Sequenziamento DNA
„
„
„
Estrazione DNA da tessuto fissato in formalina
ed incluso in paraffina (mutazioni somatiche)
Amplificazione degli esoni critici tramite PCR
Sequenziamento ed analisi
Her-2 Test nella mammella
Immunoistochimica
FISH
Linee guida
EGFR immunoistochimica
„
„
„
„
„
„
Fattori preanalitici
Anticorpo primario
Metodo
Dimensioni del
prelievo
Valutazione
„Scoring“
EGFR gene amplification
chrm. 7 aneusomy & EGFR gene amplification
Linee guida
FISH SCORING SYSTEM
classification
Colorado & Working Group
Locarno revised
NSCLC
mCRC
FISH
status
Monosomy
-
1 copy in ≥ 50% of cells
negative
Disomy
≤ 2 copies in 90% of cells
2 copies in > 60% of cells
negative
Low trisomy
≤ 2 copies in ≥ 40% of cells, 3 copies in
10-40% of cells, ≥ 4 copies in < 10% of
cells
-
negative
High trisomy
≤ 2 copies in ≥ 40% of cells, 3 copies in ≥
40% of cells, ≥ 4 copies in < 10% of cells
-
negative
Low
polysomy
≥ 4 copies in 10-40% of cells
3 or 4 copies in > 40% of cells
High
polysomy
≥ 4 copies in ≥ 40% of cells
> 4 copies in > 40% of cells
positive
Gene
amplification
Tight EGFR gene clusters and R ≥ 2 or ≥
15 copies of EGFR per cell in ≥ 10 of
analyzed cells
Tight EGFR gene clusters and R ≥ 2
or ≥ 15 copies of EGFR per cell in ≥
10 of analyzed cells
positive
EGFR FISH vs risposta clinica
DISOMIA
MARCATA POLISOMIA
AMPLIFICAZIONE
3/27
(11%)
16/27
(59%)
8/27
(30%)
RISPONDONO
0
4
6
NON RISPONDONO
3
12
2
EGFR FISH
EGFR & downstream signals
EGFR
outside
cytoplasm
mutated in ~30-40%
sporadic CRC
PI3K
PTEN
Akt
K-Ras
BRAF
mutated in ~5-10%
sporadic CRC
MEK
mTOR
ERK1,2
change in
gene expression
cell survival
angiogenesis
metastatisation
nucleus
cell proliferation
tumor invasion
Patients, treatment regimens and clinical response
No.
%
113
100
Colon cancer
70
62
Rectal cancer
43
38
Cetuximab
36
32
Cetuximab + Chemotherapy
51
45
Panitumumab
26
23
100
88
1
12
11
2
53
47
3
29
26
4
5
4
5
1
1
113
100
Responders
24
21
Non-responders
89
79
No. of patients with mCRC*
Site of primary disease
Anti-EGFR MoAb **
Prior adjuvant chemotherapy #
Yes
Prior lines of chemotherapy
EGFR IHC expression (≥1% cells)
Yes
Clinical response (RECIST)
* 45 patients were treated at Oncology Institute of Southern Switzerland (Bellinzona, Switzerland) and
68 were treated at Ospedale Cà Granda (Milan, Italy)
** 64 patients were enrolled in clinical trials
# 13 patients received cetuximab as frontline therapy.
K-Ras status and clinical response
K-Ras
Wild-type
Mutant
79/113 (70%)
34/113 (30%)
*
Responders
22/79 (28%)
2/34 (6%)
Non-responders
57/79 (72%)
32/34 (94%)
p<0.05, two-tailed Fisher’s exact test
?!?
KRAS
KRAS mutations
mutations correlate
correlate with
with resistance
resistance to
to anti-EGFR
anti-EGFR MoAbs
MoAbs
BRAF status and clinical response
on wild-type K-Ras patients
BRAF
Wild-type
Mutant
68/79 (86%)
11/79 (14%)
*
Responders
22/68 (32%)
0/11 (0%)
Non-responders
46/68 (68%)
11/11 (100%)
p<0.05, two-tailed Fisher’s exact test
BRAF
BRAF mutations
mutations are
are associated
associated with
with lack
lack of
of response
response
to
to MoAbs
MoAbs treatment
treatment in
in KRAS
KRAS wild-type
wild-type tumors
tumors
113 pazienti con carcinoma colorettale metastatico
trattati con Cetuximab o Panitumumab
mutazione KRAS
34/113 (30%)
48% dei
pazienti non
rispondenti
79 pazienti
mutazione BRAF
11/79 (14%)
68 pazienti
22/68 (32%) rispondono
46/68 (68%) non rispondono
K-Ras e cetuximab in mCRC: meta-analisi
Lavoro
Pazienti rispondenti
Pazienti resistenti
% di mutazione di
K-Ras
32%
Moroni et al.
Lancet Oncology
2005
Casi
10
21
K-Ras mutati
2
8
K-Ras wt
8
13
Lièvre et al.
Clin Cancer Res
2006
Casi
11
19
K-Ras mutati
0
13
K-Ras wt
11
6
Di Fiore et al.
Br J Cancer 2007
Casi
12
47
K-Ras mutati
0
16
K-Ras wt
12
31
Casi
10
17
K-Ras mutati
1
9
K-Ras wt
9
8
Casi
11
37
K-Ras mutati
1
15
K-Ras wt
10
22
Casi
8
29
K-Ras mutati
0
15
K-Ras wt
8
14
Frattini et al.
Br J Cancer 2007
Benvenuti et al.
Cancer Res 2007
De Roock et al.
Ann Oncol 2008
62 casi che rispondono, 4 hanno la mutazione di K-Ras (6.4%)
76 casi con la mutazione di K-Ras, 4 rispondono (5.2%)
43%
27%
37%
33%
41%
Cellular models of CRC
and response to anti-EGFR MoAbs
BRAF V600E mut
The
The presence
presence of
of BRAF
BRAF V600E
V600E allele
allele in
in CRC
CRC cells
cells
impairs
impairs their
their response
response to
to cetuximab
cetuximab or
or panitumumab
panitumumab
113 pazienti con carcinoma colorettale metastatico
trattati con Cetuximab o Panitumumab
mutazione KRAS
34/113 (30%)
48% dei
pazienti non
rispondenti
79 pazienti
mutazione BRAF
11/79 (14%)
68 pazienti
22/68 (32%) rispondono
46/68 (68%) non rispondono
EGFR & downstream signals
EGFR
out
cytoplasm
mutated in ~40%
of sporadic CRC
mutated in ~20-30%
of sporadic CRC
PI3K
PTEN
Akt
loss in ~30%
of sporadic CRC
K-Ras
BRAF
mutated in ~5-10%
of sporadic CRC
MEK
mTOR
ERK1,2
changes in
gene expression
cell survival
nucleus
angiogenesis
tumor metastasization
cell proliferation
tumor invasion
PIK3CA status and clinical response
PIK3CA
Wild-type
Mutant
95/110 (86%)
15/110 (14%)
*
Responders
22/95 (23%)
0/15 (0%)
Non-responders
73/95 (77%)
15/15 (100%)
p<0.001, two-tailed Fisher’s exact test
PIK3CA
PIK3CA mutations
mutations are
are associated
associated with
with lack
lack of
of response
response to
to
MoAbs
MoAbs treatment
treatment in
in KRAS
KRAS wild-type
wild-type tumors
tumors
PTEN
PTEN pos
16/27 (62%)
PR
NR (PD+SD)
PTEN neg
11/27 (38%)
PTEN pos
10
6
PTEN neg
0
11
p<0.001
Absence of PTEN expression confers
cetuximab resistance
Quale algoritmo?
mCRC
EGFR by FISH on primary tumor
disomy
chromosome 7
marked polysomy
EGFR gene
amplification
cetuximab
no cetuximab
PTEN +
K-Ras wt
response
PTEN +
K-Ras mut
PTEN K-Ras mut
resistance
PTEN K-Ras wt
mCRC
KRAS status on primary tumor
mutated
no treatment
Wild-type
BRAF mutated
PIK3CA mutated
PTEN loss
EGFR disomy
response
BRAF wt
PI3K wt
EGFR CNG
PTEN +
BRAF
PIK3CA
PTEN
EGFR
Conclusioni
„
„
„
„
Le terapie mirate sono efficaci solo in una
sottopopolazione di pazienti
L‘analisi delle molecole bersaglio sulle cellule
neoplastiche e del sistema di trasduzione del
segnale a valle puó essere utile per predire
l‘efficacia di nuovi trattamenti
Per meglio valutare l‘impatto di queste analisi
predittive sono indispensabili studi clinici
prospettici
Una gestione interdisciplinare del paziente è
indispensabile
Controlli di qualità
HER2 house internal controls
„ HER2 IHC UK NEQAS
„ HER2 FISH UK NEQAS
„ EGFR FISH reproducibility studies
„ KRAS German Ring Test
„ CH?
„
Costi
„
„
„
„
„
„
I costi di analisi di biologia molecolare in patologia sono
relativamente elevati (circa 600 CHF per analisi)
Attualmente tutte le analisi sono state rimborsate dalle
assicurazioni (Her2 FISH)
La disponibilità al rimborso potrebbe scemare a fronte di
un‘impennata dei costi
Il timore di indurre dei costi potrebbe frenare la richiesta
di queste analisi da parte del medico
I pazienti beneficiano di queste analisi (evitare terapie
inutili)
I risparmi procurati da una selezione accurata dei
pazienti che possono beneficiare di trattamenti mirati
superano nettamente i costi di terapie „inutili“.
„
„
„
„
„
„
„
Milo Frattini
Vittoria Martin
Francesca Molinari
Morena Ghisletta
Antonella Camponovo
Sara Banfi
Lara Lunghi
„
„
„
„
„
„
„
„
„
„
Piercarlo Saletti
Sara De Dosso
„
Andrea Bordoni
Alessandra Spitale
Paola Mazzola
Alberto Bardelli
Federica Di Nicolantonio
Miriam Martini
Andrea Sartore-Bianchi
Mauro Moroni
Salvatore Siena