Applicazioni Biomediche Sommario Lab-on-a

Applicazioni Biomediche
Sommario
❖ Lab-on-a-chip
๏Tipi di Lab on a chip
๏Lab on a chip basati su microfluidica
❖ Differenziazione cellulare guidata di neuroni
❖ Imaging avanzato di neuroni
❖ Applicazioni di singola molecola
๏Uso di Q-dots
๏Nanorulers
❖ Nanodispositivi biomedici e loro elementi costitutivi
๏Scaffold: dendrimeri
๏Intracellular specific delivery: vettori
๏Biosensori cellulari di Ca, Cl, pH, acetilazione, fosforilazione
๏Riconoscitori di specifiche molecole
๏Rilascio controllato di farmaci
๏Molecular beacons, aptameri, Riboswitch e altri dispositivi basati su
DNA/RNA
Applicazioni Biomediche
Lab on a chip
❖Dispositivo che integra in un “chip” di dimensioni da mm a cm una serie di
funzioni atte a raggiungere uno scopo, tipicamente analisi chimiche o di altro
tipo
❖Il substrato su cui questi materiali sono costruiti è di vario tipo e dipendente
dal tipo di compito che deve svolgere, cosí come il tipo e le dimensioni dei
componenti
❖L’idea è mutuata dalla microelettronica, anche se in questo caso le dimensioni
sono maggiori, i materiali generalmente diversi, e la funzione non ha niente a
che vedere di solito con l’elettronica
❖Le funzioni sono le piú svariate; un esempio sono i DNA-microarray utilizzati
per la sequenziazione, ma ci sono dispositivi per molti altri scopi analitici
(elettroforesi, analisi chimiche di vario tipo, etc)
Applicazioni Biomediche
Microfluidica
❖Questi microlaboratori devono essere in grado di gestire sostanze disciolte in
acqua, per cui una loro caratteristica essenziale è la possibilità di costruire una
rete di microcanali, micropompe, valvole, flussometri e viscosimetri, per
indirizzare quantità controllate di sostanza in specifiche locazioni dove avviene
l’analisi
❖L’insieme di nuove tecnologie sviluppate per la costruzione di questa rete di
elementi per il trattamento dei fluidi (l’equivalente dei microcircuiti elettrici nei
chip di silicio) si chiama microfluidica
❖I vantaggi dei lab on a chip a microfluidica rispetto ai “lab” normali sono
๏Portabilità
๏Controllo ottimale del flusso (di reagenti o sostanze da analizzare)
๏Quantità minime di reagenti e prodotti di scarto
๏Velocità di operazione
๏Procedure di fabbricazione facilmente automatizzabili e parallelizzabili
Applicazioni Biomediche
Microelectronics vs Microfluidics
Integrated circuit
Microfluidic Chip
Transport Quantity
Charge
Mass (fluid)
Chip Materials
Inorganic
(Semiconductors)
Organic (Polymers)
Characteristic Channel
Size
100 nm
100 µm
Transport Regime
Similar to macroscopic
circuits (classical, no
quantum)
Different to macroscopic
circuits (laminar, no
turbolence)
La microfluidica potrebbe avere in biofisica un impatto analogo a
quello della microelettronica nell’elettronica
Applicazioni Biomediche
Il numero di pubblicazioni su microfluidica è aumentato esponenzialmente
Statistica delle pubblicazioni in Italia
Sono state introdotte nuove riviste
specializzate (es. Lab-on-a-Chip i.f: 5.8)
Applicazioni Biomediche
Equazione di Navier-Stokes
(fluido incomprimibile)
Viscosità
Inerzia
Pressione
idrostatica
Forze
esterne
L’equazione è non lineare a causa della presenza del termine di
accelerazione convettiva che descrive la variazione del campo di
velocità con la posizione
Applicabilità molto generale a tutti i tipi di flussi incomprimibili oppure
con un grando di comprimibilità molto bassa
Non può descrivere la propagazione di onde sonore: per quelle infatti è
necessaria una risposta di tipo elastico, non puramente viscosa
Applicazioni Biomediche
Digressione formale
Applicazioni Biomediche
Flusso laminare
Numero di Reynolds = Re =
Inerzia
L=lunghezza caratteristica
Viscosità
❖Misura l’importanza relativa della parte inerziale
rispetto a quella viscosa
❖Viene definito in situazioni in cui un fluido scorre
entro certi limiti (tubi, superfici etc) oppure per un
oggetto che si muove in un fluido
A bassi numeri di Reynolds si trascura completamente la parte inerziale
Applicazioni Biomediche
Flusso laminare vs turbolento
WR 200 mt stile libero:
v = 1.9 mt/s
Re = 10000-100000
Poecilia ret
L ~ 5cm, v ~ 10 cm/sec
Re ~ 100 -1000
Escherichia coli
L ~ 1µm, v ~ 50 µm/sec
Re ~ 0.0001 - 0.001
Applicazioni Biomediche
In microfluidica
V ~ 0.1 µm/sec - 10 mm/sec;
L ~ 10 µm - 100 µm (larghezza dei
canali)
(H2O) v= η / ρ = 0.01 / 1 = 0.01 cm2/sec
Applicazioni Biomediche
In microfluidica
V ~ 0.1 µm/sec - 10 mm/sec;
L ~ 10 µm - 100 µm (larghezza dei
canali)
(H2O) v= η / ρ = 0.01 / 1 = 0.01 cm2/sec
Re ≈ 0.000001 - 10
LOW REYNODS
NUMBER REGIME!!!
Situazione simile al
ghiaccio che scorre in un
ghiacciaio
⇒ l’approssimazione di flusso laminare è molto buona
Applicazioni Biomediche
In microfluidica
V ~ 0.1 µm/sec - 10 mm/sec;
L ~ 10 µm - 100 µm (larghezza dei
canali)
(H2O) v= η / ρ = 0.01 / 1 = 0.01 cm2/sec
Re ≈ 0.000001 - 10
LOW REYNODS
NUMBER REGIME!!!
Situazione simile al
ghiaccio che scorre in un
ghiacciaio
⇒ l’approssimazione di flusso laminare è molto buona
Applicazioni Biomediche
Numero di Péclet: Mixing
D’altra parte il flusso turbolento serve a “rimescolare” il fluido
Convezione
Diffusione
In regime di flusso laminare il mescolamento è dovuto solo alla
diffusione fluido ed è un processo molto lento
Applicazioni Biomediche
Numero di Bond: angolo di contatto
Gravità
Tensione Superficiale
Applicazioni Biomediche
Numero di Bond: angolo di contatto
Gravità
Tensione Superficiale
Per piccole quantità di fluido la tensione superficiale domina sulla gravità
⇒le gocce assumono forma sferica (o di sezioni di sfera)
⇒la forma precisa assunta da gocce poste su superfici è determinata solo
dalle interazioni ai bordi = bilanciamento delle tensioni superficiali (=energie
libere di superficie) tra le tre differenti fasi
L’angolo si trova facendo in modo che la proiezione sul piano della risultante
dei tre vettori (a modulo fissato) sia nulla
Applicazioni Biomediche
Riassumendo, tipicamente in microfluidica:
Re << 1 → Flusso laminare
Pe >> 1 → Mixing (lento) per diffusione
Bo << 1 → Goccie sferiche
Applicazioni Biomediche
❖Microcanali per indirizzare il
flusso dei fluidi
❖Pompe per iniettare
direzionalmente i fluidi
❖Valvole per bloccare il flusso
❖Miscelatori per mescolare
Componenti Lab-on-a-chip
Microcanali
Applicazioni Biomediche
canale
Vetro
❖Polidimetilsilossano (PDMS, materiale simile a quello delle lenti
a contatto) su vetro
❖Materiali termoplastici
❖Vetro
Plasmati con tecniche litografiche non convenzionali (litografia
soffice, hot embossing, scultura ottica )
Applicazioni Biomediche
Pompe
Spinta
meccanica
dall’esterno
Effetti di capillarità dovuti alla
tensione superficiale o sue
variazioni, anche eventualmente
indotti da gradienti termici,
chimici, elettrici o ottici
Spinta
elettrostatica per
molecole polari
Gli altri tipi di pompe (magnetica, rotazione e onde
sonore) sono meno usate, almeno nei circuiti a
microfluidica standard
Applicazioni Biomediche
Valvole
Applicazioni Biomediche
Valvola di Quake (2000)
Valvola di tipo mecanico esterno: I canali ortogonali al
microcanale fluidico vengono riempiti di aria
Se questa viene compressa si ingrossano e comprimono il canale
microfluidico di materiale
elastico (PDMS) che si chiude
Applicazioni Biomediche
Esempio di lab on a chip
Applicazioni Biomediche
La regolazione concertata della pressione della valvola e dell’iniettore permette
di mantenere costanti i gradienti della sostanza iniettata
Questo dispositivo può essere facilmente fissato su un vetro di coltura
cellulare, per far crescere cellule ad esempio in ambienti a concentrazione e
gradiente controllati di certe sostanze
Applicazioni Biomediche
Miscelatori
Applicazioni Biomediche
Miscelatori passivi
Creano un flusso laminare complesso
Miscelatori
Applicazioni Biomediche
Miscelatori passivi
Creano un flusso laminare complesso
Miscelatori
Applicazioni Biomediche
Miscelatori passivi
Creano un flusso laminare complesso
Miscelatori
Applicazioni Biomediche
Applicazioni Biomediche
Miscelatori Attivi
Utilizzano fonti energetiche per rimescolare il fludo meccanicamente o
tramite l’iniezione di sostanze “disturbanti
Applicazioni Biomediche
Ma questi sistemi sono davvero micro?
I canali sono micrometrici, ma pompe, miscelatori, valvole e
serbatoi no
Applicazioni Biomediche
Tuttavia, è possibile miniaturizzare almeno alcuni di questi
elementi con tecniche SAW (surface acoustic wave)
Integrated SAW-based micropumps (eliminano le linee di
pressione esterne)
Uso di gocce direttamente sul chip, deposizione guidata dalle
SAW (eliminano i serbatoi esterni di liquidi)
Le onde acustiche superficiali agiscono meccanicamente sul
substrato del microcanale e sul fluido, inducendo spostamenti
del fluido e quindi azioni di pompaggio, oppure spostamento di
gocce
Applicazioni Biomediche
Assemblaggio del sistema con
pompa SAW
Applicazioni Biomediche
Il risultato è che la pompa funziona meglio “al contrario” cioè attira il fluido
invece che spingerlo nella direzione di propagazione
Il meccanismo è piuttosto complesso, coinvolge la formazione di goccioline
vicine al bordo dell’interfaccia
t
Applicazioni Biomediche
Comunque la pompa SAW fuziona, è micrometrica ed è
biocompatibile: il pompaggio di soluzioni contenti protein GFP non
danneggia le proteine stesse, come mostrato dalla misura degli
spettri prima, dopo e durante il pompaggio
Applicazioni Biomediche
Le pompe SAW permettono una regolazione molto fine dei tempi
di pompaggio e quindi una guida accurata dei fluidi anche
attraverso una rete di microcanali con alta precisione in un
dispositivo totalmente micrometrico
Applicazioni Biomediche
Differenziazione cellulare guidata
Può risultare estremamente utile a scopo di
ricerca far crescere cellule (soprattutto
quelle “polarizzate”, come i neuroni) in
direzioni preferenziali, in modo ad esempio
da avere gli assoni allineati lungo una
specifica direzione
Questo si ottiene trattando i vetri da coltura
cellulare con la tecnica del nanograting
Questo effetto viene ottenuto adagiando sul fondo del vetro di coltura uno
speciale fondo di coltura in TCPS (polistirene specifico biocompatibile per
fondo di coltura) opportunamente modellato con la tecnica della nanolitografia a stampo (nano-imprinting litography NIL):
Il TCPS viene riscaldato e premuto su uno stampo di silicio, e poi raffreddato
Applicazioni Biomediche
Gli assoni dei neuroni tendono a crescere allineati alle righe di TCPS, ma la
percentuale di allineamento dipende anche dalla spaziatura delle righe
500nm:
allineamento
molto efficiente
750nm:
allineamento meno
efficiente
Fondo liscio
No allineamento
Dettaglio della cellula
durante la crescita
Applicazioni Biomediche
Analisi funzionale delle
cellule: La microscopia a
fluorescenza rivela la
localizzazione della
paxillina marcata con
EGFP, che si concentra
nelle regioni terminali degli
assoni durante la crescita
La tendenza a seguire la polarità del
grafting dipende anche dal passo del
grafting stesso
Applicazioni Biomediche
Crescendo i neuroni su
griglie…
Applicazioni Biomediche
Imaging avanzato di neuroni “in vivo”
Two-photon imaging della corteccia cerebrale: mappa 3D dei neuroni
Applicazioni Biomediche
Imaging avanzato di neuroni “in vivo”
Two-photon imaging della corteccia cerebrale: mappa 3D dei neuroni
Fluorescence
Applicazioni Biomediche
Studio della fisiologia dei neuroni
Coloranti organici sensori
Sensore per il calcio (fluo-3): la
fluorescenza è finemente
dipendente dalla concentrazione
di Ca++
1.0
0.8
0.6
Kd = 390 nM
0.4
0.2
0.0
0.01
0.1
1
[Ca] (mM)
10
Applicazioni Biomediche
Variazione della concentrazione di calcio in seguito al taglio dell’assone
Il Ca, che non partecipa alla normale fisiologia della trasmissione del
segnale lungo l’assone,
entra invece in ballo nelle
segnalazioni straordinarie
Si formano potenziali
d’azione anomali
(in direzione opposta a
quella normale) e squilibri
di calcio
Applicazioni Biomediche
Variazione della concentrazione di calcio in seguito al taglio dell’assone
Il Ca, che non partecipa alla normale fisiologia della trasmissione del
segnale lungo l’assone,
entra invece in ballo nelle
segnalazioni straordinarie
Si formano potenziali
d’azione anomali
(in direzione opposta a
quella normale) e squilibri
di calcio
Applicazioni Biomediche
Applicazioni di “singola molecola”
Di seguito esploreremo alcune applicazioni delle proprietà di
singola molecola
Applicazioni Biomediche
Qdots
Qdots come reporters di localizzazione
Studio del movimento di specifici recettori marcati
lungo un assone
I recettori si muovono lungo i microtubuli e
dovrebbero dirigersi verso il soma
,.
0.
Fuori dall’assone il moto è piú di tipo browniano
Applicazioni Biomediche
Misura delle distanze: Nanorulers
Dispositivi in grado di misurare/visualizzare distanze nanometriche
Wafer di silicio ricoperto di polimetilmetacrilato, funzionalizzato con la
rodammina e “rigato” con tecniche di nanolitografia
Per estrarre informazioni utili bisogna
analizzare le point spread function
Applicazioni Biomediche
Nanocluster pairs as nanorulers
La lunghezza d’onda di
emissione dei nanocluster
dipende dal loro diametro
Au (TEM)
V. Voliani
La dispersione della lunghezza
d’onda dipende dalla distanza
tra due clusterPt (SEM)
Applicazioni Biomediche
Due cluster sferici sufficientemente separati si comportano come singoli
cluster
Due vicini hanno lunghezza d’onda d’emissione maggiore tendono a
comportarsi come un singolo cluster piú grande
L’emissione dipende anche dalla polarizzazione
del campo incidente e dal tipo di metallo
Applicazioni Biomediche
Au 88 nm
Au 88 nm
La misura dello spettro dei
nanocluster dà una misura
molto precisa della loro
distanza
Applicazioni Biomediche
Nanomedicina
Lo scopo principale della nano-medicina (e della medicina in
generale) è diagnosticare e curare in maniera meno invasiva e piú
accurata possibile
❖Nella fase di diagnosi
๏Accuratezza spaziale e temporale = localizzazione precisa
dei tessuti malati e piú precoce possibile
๏Non invasività = la diagnosi non deve ledere tessuti,
specialmente quelli sani
❖Nella fase di cura
๏Efficiacia = estirpazione radicale dei patogeni e/o dei tessuti
malati, utilizzando la minore quantità possibile di sostanze
medicanti; personalizzazione delle cure
๏Non invasività = la cura non deve ledere tessuti sani
Applicazioni Biomediche
Anche se molto avanzate, le normali tecniche di medicina
“macroscopica” hanno dei limiti intrinseci in ciascuno dei punti
precedenti (invasività, accurtezza ed efficacia limitata)
È evidente come almeno in linea di principio l’applicazione di
nano-dispositivi a scopo medico risolverebbe questi problemi
La nanomedicina si propone di diagnosticare e curare al livello di
singola cellula
L’ideale a cui si vorrebbe arrivare è
la costruzione di nano-robot che,
ingeriti o iniettati tramite una siringa,
siano in grado di identificare le
singole cellule cancerose ed
ucciderle una ad una
Ref “Viaggio allucinante” Otto Klement,
Jerome Bixby and Isaac Asimov (~1960)
Applicazioni Biomediche
Metodologie di progettazione
❖La via nanotecnologica con approccio top-down: costruzione di veri e
propri “robot” miniaturizzati interamente artificiali
๏Vantaggi: uso di materiali piú “semplici” (metalli, semiconduttori, polimeri
organici) su cui esiste già un’ampia conoscenza mutuata da altri settori
delle nanotecnologie (nanoelettronica, chimica etc)
๏Svantaggi:
✦La possibililtà di miniaturizzazione degli approcci top-down è limitata
dalle capacità di plasmare la materia con strumenti “macroscopici”
✦La biocompatibilità non è ovvia
❖Via nano-bio-tecnologica, con approccio bottom-up: progettazione di
dispositivi biomolecolari artificiali, ma basati su modifica di molecole biologiche
esistenti oppure sulla sintesi di molecole completamente artificiali ma ispirate
a quelle naturali
๏Vantaggi:
✦l’approccio bottom-up consente la miniaturizzazione estrema, fino al
livello di singola molecola funzionale
✦L’uso di molecole naturali o ad esse ispirate risolve piú facilmente il
problema della biocompatibiltà e quello strettamente correlato della
possibile tossicità
๏Svantaggi: nell’approccio bottom-up i dispositivi devono autoassemblarsi
a partire da elementi costitutivi o essere indotti a farlo
Applicazioni Biomediche
Elementi costitutivi
In ogni caso, questi nano-dispositivi devono avere, a seconda del loro scopo, i seguenti
elementi
❖Uno scheletro oppure uno scaffold esterno, biocompatibile e in grado di superare le
varie barriere per raggiungere il bersaglio; inoltre esso deve poter essere metabolizzato
ed eliminato una volta che il suo compito è terminato
❖Elementi “riconoscitori” della patologia
๏Sistemi anticorpo-antigene
๏Piccoli ligandi riconoscitori di specifiche proteine
๏Peptidi o acidi nucleici riconoscitori opportunamente progettati
๏Sensori di ambiente cellulare e chimico (misuratori di pH o della concentrazione di
altre sostanze, misuratori di temperatura, pressione etc)
❖Elementi segnalatori delle cellule malate e/o delle sostanze patogene
๏Sonde fluorescenti
๏Sonde magnetiche
๏Sonde radioattive (isotopi)
❖Elementi curativi
๏Rilascio di farmaci o altre molecole terapeutiche (DNA, siRNA etc)
๏Modificazione dell’ambiente patogenico
๏Eliminazione della cellula malata
Applicazioni Biomediche
Targeting Agents
Actuators
Peptides
Antibody
Small ligands
Drugs
DNA
siRNA
Modifiers
Sensing and
imaging moieties
Fluorophores
Magnetic probes
Radioactive isotopes
PEG or polymers
Acetyl groups
Surfactants
Scaffold
Nanopar'cles
Nanotubes
Dendrimers and Polymers
Applicazioni Biomediche
Dendrimeri
Applicazioni Biomediche
Le proprietà e strutture specifiche dipendono dalla chimica specifica dei
dendrimeri
Applicazioni Biomediche
Applicazioni Biomediche
+
I dendrimeri sono
facilmente funzionalizzabili
anche in maniera mista…
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
… con sonde fluorescenti di
diversi colori e/o altri
elementi funzionali
Applicazioni Biomediche
Neutral
+
+
+
+
+
+
+
+
Cationic
Misure di Internalizazione
Applicazioni Biomediche
Neutral
+
+
+
+
+
+
+
+
Cationic
Misure di Internalizazione
Applicazioni Biomediche
Una cellula può internalizzare molecole relativamente grandi come i dendrimeri
per diverse vie; alcune sono mediate da specifiche molecole (e.g. caveolina,
clatrina) che inducono la formazione di apposite vescicole
Applicazioni Biomediche
Studio delle vie di internalizzazione
La via di internalizzazione dei dendrimeri viene studiata marcando essi (in
rosso) e le molecole che mediano l’internalizzazione (e.g. clatrina, caveolina,
verde)
La colocalizzazione (giallo) indicherà quale via è seguita
Applicazioni Biomediche
Drug Delivery con Dendrimeri
Un dendrimero può trasportare carichi in due maniere
1. Al suo interno: esiste la possibilità almeno teorica di costruire
dendrimeri idrofilici con interno idrofobico, che siano quindi
solubili ma possano trasportare molecole al loro interno.
Inoltre essi devono poter cambiare conformazione una volta
all’interno della cellula, per rilasciare il carico
2. L’altra possibilità è quella di funzionalizzare le estremità con la
molecola cargo e in qualche modo indurre il rilascio una volta
all’interno della cellula
Drug
Cleavable linker
Dendrimer Core
Applicazioni Biomediche
PEG chains
(-CH2-CH2-O-)n
Doxirubicin
Applicazioni Biomediche
Selettività del dendrimero
EPR Effect: Enhanced Permeation and Retention
Molecole oltre una certa dimensione permeano i tessuti tumorali ma non quelli
sani, per un effetto di “lassità” del tessuto tumorale, dovuta al tipo di
vascolarizzazione diverso
Inoltre tendono a rimanere entro il tessuto tumorale per tempi molto lunghi
Applicazioni Biomediche
Rilascio del farmaco
Il farmaco viene rilasciato solo
nei tessuti tumorali perché il tipo
di legame chimico che lo lega al
dendrone si spezza a pH acidi
(Acid labile linkers)
Applicazioni Biomediche
Studio epidemiologico sui topi
Applicazioni Biomediche
Altro tipo di carrier:
vettori per internalizzazione
I dendrimeri seguono una via aspecifica per entrare nelle cellule, dipendente
solo dalle loro dimensioni e carica
ma si possono progettare altre molecole bio-ispirate che seguano vie piú
specifiche
therapy
Vector system
identification
diagnosis
High performance
biosensor
Drug-loaded
nanocarriers
Applicazioni Biomediche
CPP = cell penetrating peptides
Oligopeptidi a sequenza
basica caratterizzati dalla
loro abilità di traslocare
all’interno di cellule e
portarsi dietro molecole ad
essi coniugate
Coniugazione del carico
via
Sintesi chimica
Fusione genetica
++ + +
+ cargo
Applicazioni Biomediche
Uno di questi oligopeptidi è ispirato alla proteina TAT di HIV (transattivatore di
trascrizione)
In particolare, un suo frammento di circa 11 amminoacidi (YGRKKRRQRRR) è in
grado di attraversare la membrana con
Bassa tossicità
Alta resa di trasporto
Abilità di entrare in molti tipi diversi di membrane
2
È stato quindi creato il costrutto
TAT-EmGFP
Endosome
3
Nucleus
Per studiare I meccanismi di internalizzazione della tat
Applicazioni Biomediche
HIV TAT arginine-rich peptide
Uno di questi oligopeptidi è ispirato alla proteina TAT di HIV (transattivatore di
trascrizione)
In particolare, un suo frammento di circa 11 amminoacidi (YGRKKRRQRRR) è in
grado di attraversare la membrana con
Bassa tossicità
Alta resa di trasporto
Abilità di entrare in molti tipi diversi di membrane
2
È stato quindi creato il costrutto
TAT-EmGFP
Endosome
3
Nucleus
Per studiare I meccanismi di internalizzazione della tat
Applicazioni Biomediche
HIV TAT arginine-rich peptide
Uno di questi oligopeptidi è ispirato alla proteina TAT di HIV (transattivatore di
trascrizione)
In particolare, un suo frammento di circa 11 amminoacidi (YGRKKRRQRRR) è in
grado di attraversare la membrana con
Bassa tossicità
Alta resa di trasporto
Abilità di entrare in molti tipi diversi di membrane
2
È stato quindi creato il costrutto
TAT-EmGFP
Endosome
3
Nucleus
Per studiare I meccanismi di internalizzazione della tat
Applicazioni Biomediche
α-Clathrin
Tat- EGFP
merge
α- EEA1
Tat- EGFP
merge
α-caveolin
Caveolin
Tat- EGFP
merge
Con il metodo della
colocalizzazione di
TAT con proteine
legate a particolari
vie endocitotiche, si
trova che anche TAT
segue piú volentieri
la via della clatrina
Applicazioni Biomediche
Internalizzazione di sensore di pH
Un sensore di pH attaccato alla TAT cambia colore a seconda della zona della
cellula in cui si trova
OUT
Membrane
pH 7
Early sorting endosome
pH 6.5-5.5
Late endosome
pH 5.5-5
Lysosome
pH 5.0-4.5
Applicazioni Biomediche
Internalizzazione in specifici
comparti cellulari
Studio dell’internalizzazione di TAT nel nucleo
GFP(27KDa) GFP2(54 KDa)
GFP4(120KDa)
Tat -tagged
GFPcargoes
Le proprietà di
permeazione nel nucleo
dipendono dalle
dimensioni del carico:
I peptidi tat guidano la
traslocazione nel nucleo
per permeazione passiva
YGRKKRRQRRR
TatRRR-GFP4
YGRKKRRQGGG
TatGGG-GFP4
Tuttavia, a parità di carico
la permeabilità può
essere aumentata
cambiando alcune delle
arginine in glicine
(cambiando le proprietà
elettrostatiche di TAT)
Work in progress
Applicazioni Biomediche
Il targeting a specifici comparti può curare specifiche malattie
Applicazioni Biomediche
Sequenze di localizzazione cellulare
Applicazioni Biomediche
Le sequenze di localizzazione cellulare sono specifiche sequenze di <10-20
peptidi che servono alle proteine appena prodotte ad essere indirizzate nei
corretti compartimenti cellulari
Ad esempio la sequenza RKKRR di TAT è una sequenza di localizzazione
nucleare che spiega perché in assenza di altri impedimenti TAT tende a
localizzare nel nucleo
Però TAT o altri peptidi simili possono essere funzionalizzati con altre
sequenze di localizzazione in altri comparti cellulari, che sono note
In questo modo è possibile costruire vettori specifici che si indirizzano in
specifici comparti cellulari e curano specifiche malattie
CPP
Flag
CARGO
Nucleus, mithocondria,
lysosome, ER, Golgi
Applicazioni Biomediche
Biosensori
Sensori di ambiente cellulare: segnalano la variazione di
condizioni ambientali
Ad esempio: I sensori fluorescenti della concentrazione di Calcio,
basati su GFP
Applicazioni Biomediche
Sensore per il calcio
La calmodulina è una proteina che cambia
struttura profondamente in seguito al legame con
il Ca++ ed in seguito a questo lega altre proteine
ed è coinvolta in molti processi mediati dal Ca++
Se una coppia di GFP viene fusa
alle sue estremità la sua
variazione strutturale induce il
FRET che quindi può venire usato
come segnalatore del calcio
intracellulare
Applicazioni Biomediche
Variazione dello spettro di
emissione dovuta a FRET in
presenza di Ca++
L’intensità del FRET è
proporzionale alla
concentrazione di Ca
Applicazioni Biomediche
Sensore per Cl
La variante di GFP denominata E2GFP (F64L/S65T/
T203Y) risulta avere una forte sensibilità per la
concentrazione di Cl: l’intensità di fluorescenza
diminuisce in seguito al legame con Cl che si
insinua
nel sito attivo
vicino al cromoforo
Applicazioni Biomediche
Sensore di pH
A ⇔ B- + H +
Lo spettro di eccitazione di GFPwt e di molte sue
varianti è molto sensibile al pH, perché l’equilibrio
tra gli stati A e B viene spostato al variare della
concentrazione di ioni H+
Per questo motivo
l’intensità relativa
dei picchi A e B
nello spettro di
eccitazione può
essere usata per
misurare il pH
Applicazioni Biomediche
Sensore raziometrico di Cl
Si legano tra loro due con un linker destrutturato e lungo due GFP, una
sensibile al Cl (EGFP, verde) e una non sensibile (rossa)
La misura del rapporto tra i picchi di emissione nel rosso e nel verde dà
direttamente la concentrazione di Cl senza bisogno di calibrazione
Applicazioni Biomediche
In realtà, però, anche nella E2GFP gli equilibri del Cl e di H+ sono
interdipendenti e si influenzano a vicenda, quindi in linea di principio sfruttando
bene questo fatto, è possibile misurare, con una sola proteina,
contemporaneamente la concentrazione di Cl e il pH
Le due curve corrispondono a due casi estremi in cui il trasferimento di H+ e Clsiano indipendenti, e in cui invece siano correlati
I dati sperimentali sono piú coerenti con la seconda possibilità, che ci dice che
la specie Cl E2GFP non compare mai e che l’associazione con Cl è associata
sempre con il rilascio del protone
Applicazioni Biomediche
458 nm 488 nm 543 nm
In conclusione, è
possibile misurare
contemporaneamen
te [Cl] e pH con tre
misure
contemporanee a
tre lunghezze
d’onda
R_pH
pH=4.95
pH=6.64
pH=8.32
R_Cl
Applicazioni Biomediche
Mappe della
concentrazione di Cl
risolte nel tempo in
risposta ad uno
stimolo
Applicazioni Biomediche
Mappe della
concentrazione di Cl
risolte nel tempo in
risposta ad uno
stimolo
Applicazioni Biomediche
Mappe di Cl e pH
tridimensionali
pH
Cl
Applicazioni Biomediche
Possibili miglioramenti sui sensori Cl e pH
1. Aumento della sensibilità (ad es con la mutazioni specifiche)
2. Raziometricità anche in emissione,
ovvero la possibilità di misurare
la concentrazione di Cl o pH da
un rapporto di fluorescenza a due
lunghezze d’onda specifiche
in emissione
Applicazioni Biomediche
Sensori di variazioni chimiche
Sensori di acetilazione
L’acetilazione (=inserimento di gruppo acetile) è coinvolta in
molti processi biologici, ad esempio la riorganizzazione
strutturale della cromatina, che avviene in seguito
all’acetilazione delle code delle proteine istoniche
Dato che l’acetilazione comporta di solito profondi
cambiamenti strutturali della proteina acetilata, è spesso
possibile costruire sensori di acetilazione geneticamente
codificati basati sul FRET
Normale - FRET
Acetilato - no FRET
Applicazioni Biomediche
Utilizzando un peptide acetilabile (ad es, contenente lisine) che subisce
variazioni di struttura in seguito all’acetilazione è possibile segnalare la
presenza di alte concentrazioni di agenti acetilanti
L’acetilazione cambia lo stato di
carica del peptide e quindi può
indurre transizioni strutturali che
modificano il FRET
Discorso analogo per altre
trasformazioni chimiche
come la fosforilazione e la
metilazione
Applicazioni Biomediche
Sensori di specifiche molecole
Per la diagnosi di specifiche malattie risulta però utile rilevare la presenza di
specifiche molecole “markers”
Esistono già in natura sistemi riconoscitori di molecole, che sono gli anticorpi
Dunque viene spontanea l’idea di sviluppare sistemi basati sugli anticorpi per
riconoscere specifiche molecole di interesse
Immunoglobulina
Applicazioni Biomediche
Antigene
Antigen
Anticorpo
La parte riconoscitrice dell’antigene è un insieme di loop molto flessibili ed
estremamente mutabili (la Complementarity Determining Region, CDR)
Questa parte viene mutata nella fase di reazione immunitaria, il resto serve
da sostegno e catalisi
Applicazioni Biomediche
Per progettare molecole riconscitrici di determinati antigeni ci sono diverse
strategie
Strategia totalmente sperimentale
maturazione “in vivo”: l’anticorpo viene
fatto maturare per vie naturali da un
organismo esposto all’antigene
“in vitro” l’anticorpo viene fatto maturare
per selezione “artificiale”, mutandolo
geneticamente in cellule in coltura, in
maniera casuale, e ad ogni
“generazione” di mutagenesi vengono
selezionati gli anticorpi con maggiore
affinità. Oppure per mezzo dei fagi
Queste strategie sono abbastanza poco
efficienti ma possono venire coadiuvate
dal compure modeling con una strategia
o totalmente modellistica o mista,
modellistica sperimentale
Applicazioni Biomediche
La via modellistica consiste nel mutare “in silico” l’anticorpo e per ogni
mutazione valutare l’affinità con l’antigene, sempre al livello teorico
Strutture di partenza di
anticorpo e antigene
Mutazione
delle CDR
Docking→
generazione
della struttura
del complesso
(generazione
gelle pose,
ottimizzazione)
Valutazione di affinità
(ΔG di legame)
Campi di forze empirici
Set di sequenze/strutture di anticorpi con alta affinità
da testare sperimentalmente
Applicazioni Biomediche
Problemi specifici di questo approccio:
Valutazione completamente teorica: il calcolo dell’affinità si basa
sull’accuratezza dei campi di forze empirici usati per la valutazione
⇒ studiati appositi campi di forze per questi tipi di calcoli
n. di possibili configurazioni e combinazioni di mutazioni estremamente alto
⇒ necessari specifici algoritmi per l’esplorazione efficace di spazio di
configurazioni e delle mutazioni
Sequenze selezionate solo sulla base dell’affinità e comunque da controllare
sperimentalmente
Quindi di solito gli approcci teorico e sperimentale si usano in cascata
La valutazione teorica può selezionare un set di sequenze che tra le valutate
piú affini, che poi vanno controllate in laboratorio
Applicazioni Biomediche
Rilascio controllato di farmaci
Drug Delivery Systems DDS
La parte dell’attuatore è quella piú complicata
Si tratta di compiere una qualche azione terapeutica in
maniera controllata
Rilascio controllato dei farmaci
Link pH labili
Matrici nanoporose: il farmaco,
intrappolato durante la sintesi
della matrice, viene rilasciato
per via diffusiva
Il tempo di rilascio è controllato
dalle proprietà della matrice
Applicazioni Biomediche
NanoParticelle Polimeriche PNP
Particelle polimeriche (polimeri organici di vario genere,
nanoporosi, eg Polylactides (PLA), Polyglycolides
(PGA), Poly(lactide-co-glycolides) (PLGA))
Il principio è lo stesso, ma il rilascio può avvenire o per
diffusione o per degradazione, e può anche essere
controllato da stimoli esterni ricoprendo la particella con
specifiche sostanze che si degradano in particolari
ambienti cellulari
Questi materiali sono anche scelti in modo da essere
biodegradabili e biocompatibili e sono funzionalizzabili in
molti modi diversi, cosí da poter rilasciare il farmaco in
specifiche situazioni diverse
I problemi da risolvere riguardano specificamene
l’inserimento del farmaco nella matrice, e il fatto che
comunque sono sitemi micro-metrici piú che nanometrici
Applicazioni Biomediche
Stimulus
Hydrogel
Mechanism
pH
Acidic or basic hydrogel
Change in pH — swelling — release of drug
Ionic strength
Ionic hydrogel
Change in ionic strength — change in
concentration of ions inside gel — change in
swelling — release of drug
Chemical species
Hydrogel containing electronaccepting groups
Electron-donating compounds — formation of
charge/transfer complex — change in
swelling — release of drug
Enzyme-substrate
Hydrogel containing
immobilized enzymes
Substrate present — enzymatic conversion
— product changes swelling of gel — release
of drug
Magnetic
Magnetic particles dispersed in
alginate microshperes
Applied magnetic field — change in pores in
gel — change in swelling — release of drug
Thermal
Thermoresponsive hrydrogel
poly(N-isopro-pylacrylamide)
Electrical
Polyelectrolyte hydrogel
Change in temperature — change in
polymer-polymer and water-polymer
interactions — change in swelling — release
of drug
Applied electric field — membrane charging
— electrophoresis of charged drug — change
in swelling — release of drug
Ultrasound irradiation
Ethylene-vinyl alcohol hydrogel
Ultrasound irradiation — temperature
increase — release of drug
Applicazioni Biomediche
Particelle polimeriche come riconoscitori: molecular imprinting
MIP
I monomeri vengono
polimerizzati attorno al
target, che poi viene
lavato via
Le MIP sono l’analogo polimerico degli anticorpi, anche se
generalmente hanno minore affinità e selettività
Applicazioni Biomediche
Altre possibilità esplorate per il drug delivery sulla nanoscala
Particelle colloidali polielettrolitiche
Nanoparticelle icosaedriche di DNA
Capsidi virali
Virus Like
Particles
(VLP)
Gabbie proteiche
Applicazioni Biomediche
Chaperonine:
Complessi proteici che
aiutano il folding di altre
proteine
Clatrina:
Normalmente sono coinvolte nella
formazione di vescicole per
l’internalizzazione di molecole nella cellula
Altamente biocompatibili e mofidicabili, ma il
problema con questi tipi di strutture è
controllare il rilascio del farmaco
Applicazioni Biomediche
Apoferritina
Forma gabbie
Viene spontaneamente internalizzata dai tessuti tumorali
Si disgrega a ph bassi
Applicazioni Biomediche
Un altro sistema naturale per il drug delivery sono i liposomi
Biocompatibili
Facilmente costruibili in diverse dimensioni e “caricabili” con diversi tipi di
molecole
Il problema qui è la aspecificità dell’internalizzazione
Tuttavia il processo può
essere controllato e
indirizzato agendo sulle
dimensioni del liposoma
che controllano la via
preferenziale con cui
l’oggetto viene
internalizzato, o
funzionalizzando la
superficie con specifiche
molecole che attivino
specifiche vie di
internalizzazione
Sono allo studio anche lipidi ingegnerizzati o funzionalizzati per superare piú
facilmente il sistema immunitario e riconoscere specifiche cellule target
Applicazioni Biomediche Dispositivi basati su acidi nucleici
Abbiamo fin qui visto per lo piú nanodispositivi biomedici basati
su elementi di origine proteica o ispirati a sistemi proteici
Il motivo è quello ripetuto piú volte: i sistemi proteici
rappresentano l’apice dell’evoluzione dei macchinari cellulari in
quanto ad efficienza e specificità
Ma non va dimenticato che molte delle funzioni espletate dalle
proteine sono presenti anche negli acidi nucleici, che hanno
dalla loro il vantaggio di essere molto piú semplici e quindi piú
facilmente modificabili per scopi specifici
Applicazioni Biomediche
Molecular beacons
Segnalatori di
presenza di specifiche
sequenze
amminoacidiche
Applicazioni Biomediche
Loop
Fluoroforo
complementare
alla sequenza
target
Quencher
Quando il beacon si trova in presenza
della sequenza target avviene
l’ibridizzazione e si forma una doppia
elica la cui struttura rigidità allontanano
tra loro il fluoroforo e il quencher, in modo
da attivare la fluorescenza e inviare un
segnale visibile
Applicazioni Biomediche
I target possono essere specifiche sequenze patogeniche
Marcando beacons complementari a target diversi con diversi
colori è possibile fare analisi contemporanee di diverse
sequenze: nella soluzione si vedrà un colore risultante che è la
somma dei colori attivati
Applicazioni Biomediche
Specificità
La specificità di riconoscimento dei molecular beacons dipende dalla lungezza
della sequenza complementare (il loop, l1) rispetto a quella autocomplementare
dello strand (l2)
l1 è mediamente leggermente maggiore di l2 in modo che in presenza del
target l’ibridizzazione con esso sia favorita rispetto all’ibridizzazione interna
l1
Ma se anche una singola base del target è
diversa l’equilibrio sarà spostato in favore
dell’ibridizzazione interna
⇒ Estrema selettività
l2
La regolazione fine dell’equilibrio è anche
dipendente dalla sequenza
Applicazioni Biomediche
Range di funzionamento in temperatura:
Al di sotto della temperatura di denaturazione, dipendente
dalla particolare sequenza
Applicazioni Biomediche
Applicazioni Biomediche
Aptameri
Gli aptameri sono elementi riconoscitori generici (il target può essere di
qualsiasi tipo) completamente artificiali (e.g. creati in vitro), originariamente
basati su acidi nucleici (DNA o RNA) ma ultimamente anche su polipeptidi
I vantaggi rispetto ai riconoscitori basati su anticorpi sono
Procedura di selezione e produzione che non necessita di organismi e può
venire fatta completamente in vitro
Maggiore semplicità, versatilità e possibilità di combinazione con altri elementi
(segnalatori, attuatori)
Svantaggi
Piú difficile raggiungere alta affinità col target
Tecnolgia e proprietà ancora non cosí note come per gli anticorpi
Comunque la tecnologia degli aptameri sta rapidamente avanzando e alcuni di
essi sono attualmente in fase di sperimentazione clinica o già approvati come
farmaci antagonisti in particolari tipi di patologie (maculopatia degenerativa o
alcune sindromi coronariche)
Applicazioni Biomediche
Una possibile procedura di produzione in vitro è la seguente
Applicazioni Biomediche
Le modalità di binding degli aptameri sono meno specializzate che di quelle
degli anticorpi, e molto dipendenti dal tipo di target
Le piccole molecole tendono a legare nei grooves della doppia elica, quelle
grandi si legano generalmente a loop dell’aptamero
Dal punto di vista modellistico quello delle interazioni degli aptameri è ancora
un campo poco battuto
Applicazioni Biomediche
Combinazione tra aptamero e molecular beacon per segnalare la presenza del
target: il quencher viene costruito in modo da avere una sequenza competitrice
con il folding dell’aptamero e quindi da quenchare la fluorescenza in assenza
del target
Applicazioni Biomediche
La semplicità con cui è possibile combinare molecular beacon e aptameri per
coniugare la funzione riconoscitrice con quella segnalatrice è una caratteristica tipica
dei sistemi basati su acidi nucleici
Un altro esempio sono i ribo-switch, ovvero elementi funzionali a base di RNA
costituiti da un aptamero specifico per una qualche molecola regolatrice e da una
piattaforma di espressione, la cui struttura viene modificata dal legame con il ligando
I riboswitch sono di molti tipi diversi, sotto ne sono riportati due che regolano
rispettivamente la trascrizione e la traslazione
Applicazioni Biomediche
In effetti, mimando i corrispondenti dispositivi a base di proteine, molti tipi di
dispositivi a base di RNA sono stati ingegnerizzati
Aptameri-segnalatori, che variano conformazione dopo il legame con il target
e quenchano la fluorescenza o producono FRET, per individuare molti tipi
diversi di molecole (ATP e varie proteine)
Aptasensori, ovvero aptameri coniugati ad elementi meccanici o
elettrosensibili per segnalare la presenza di target
Aptameri regolatori o attenuatori, coniugati con un segmento di RNA
regolatore che permette di regolare l’affinità con il target
Aptameri che legano selettivamente a fluorofori, importanti in vista di possibili
strategie di self-assembly di elementi riconoscitori e segnalatori
Applicazioni Biomediche
Considerando che esistono ribozimi con molteplici funzionalità e che DNA e
RNA possono essere manipolati in modo da creare elementi strutturali per
trasportare farmaci (gabbie), sembra che praticamente tutte le funzionalità
coperte dai dipositivi di tipo proteico, possano tranquillamente essere ricoperte
da DNA o RNA
Considerato che gli acidi nucleici sembrano essere anche superiori alle
proteine per quanto riguarda la fase di aggregazione in elementi funzionali
unici, sembra che gli acidi nucleici siano molto promettenti come elementi base
della nano-biomedicina
Il loro punto debole è la bassa efficenza rispetto ai corrispondenti elementi
proteici, che probabilmente in parte è dovuta al fatto che sono studiati da meno
tempo e che quindi non si sono ancora capiti a fondo tutti i meccanismi
molecolari che li regolano
Ma potrebbe essere solo questione di tempo…
Applicazioni Biomediche
Scheletro
Dendrimeri
Sensore
Riconoscitore
x
PNP - MIP
x
Vettore
Contenitore
x
x
x
x
Quantum dots
Organic dyes
x
x
x
Liposomi
x
CPP
GFP
x
x
IG
x
x
Prot Cages
x
VLP
x
Aptameri
x
Gabbie DNA
Riboswitches
Segnalator
e
x
x
x
x
FRET based sensors: GFP or dyes + proteina con struttura sensibile all’ambiente (e.g.
calmodulina)
Molecular beacons: FRET con dyes+DNA
Sensori di sostanze: IG o Aptameri+segnalatori
Drug Delivery Systems: Dendrimeri+cages+riconscitori
Riboswitches
Applicazioni Biomediche
www.sns.it/it/ricerca/scienze/fisica/nest/
Laboratorio NEST, Piazza San Silvestro 12, Pisa
www.nest.sns.it
www.nano.cnr.it
cni.iit.it
Applicazioni Biomediche
www.sns.it/it/ricerca/scienze/fisica/nest/
Laboratorio NEST, Piazza San Silvestro 12, Pisa
www.nest.sns.it
www.nano.cnr.it
cni.iit.it
Applicazioni Biomediche
www.sns.it/it/ricerca/scienze/fisica/nest/
Laboratorio NEST, Piazza San Silvestro 12, Pisa
❖Spettroscopia ottica-IR-UV Raman (S. Luin)
❖Quantum Dots e fluorofori inorganici (S Luin)
❖Muntanti GFP (S. Luin)
❖Sonde fluorescenti organiche (R Bizzarri)
❖Sensori di ambiente cellulare (R Bizzarri, M Cecchini)
❖Tecniche avanzate di microscopia in fluorescenza (S Luin, G
Ratto)
❖Imaging in fluorescenza (G Ratto)
❖TEM-SEM (M Gemmi)
❖Lab on a chip e microfluidica (M Cecchini)
❖Dendrimeri (S Luin)
❖Aptameri (P Mereghetti)
❖Vettori per internalizzazione (S Luin)
www.nest.sns.it
www.nano.cnr.it
❖Sviluppo di metodi multi-scala e coarse grained per
simulazioni di biomolecole (V Tozzini, R Nifosí, G Maccari)
cni.iit.it
Applicazioni Biomediche
www.sns.it/it/ricerca/scienze/fisica/nest/
Laboratorio NEST, Piazza San Silvestro 12, Pisa
❖Spettroscopia ottica-IR-UV Raman (S. Luin)
❖Quantum Dots e fluorofori inorganici (S Luin)
❖Muntanti GFP (S. Luin)
❖Sonde fluorescenti organiche (R Bizzarri)
❖Sensori di ambiente cellulare (R Bizzarri, M Cecchini)
❖Tecniche avanzate di microscopia in fluorescenza (S Luin, G
Ratto)
❖Imaging in fluorescenza (G Ratto)
❖TEM-SEM (M Gemmi)
❖Lab on a chip e microfluidica (M Cecchini)
❖Dendrimeri (S Luin)
❖Aptameri (P Mereghetti)
❖Vettori per internalizzazione (S Luin)
❖Sviluppo di metodi multi-scala e coarse grained per
simulazioni di biomolecole (V Tozzini, R Nifosí, G Maccari)
❖Applicazioni:
❖Altre applicazioni (V Tozzini, P mereghetti)
๏Proteine coinvolte nella replicazione di HIV
๏Nucleosomi, ribosomi, plasmidi, virus, aptameri
๏Proteine multistabili o destrutturate
www.nest.sns.it
www.nano.cnr.it
cni.iit.it
Applicazioni Biomediche
www.sns.it/it/ricerca/scienze/fisica/nest/
Laboratorio NEST, Piazza San Silvestro 12, Pisa
❖Spettroscopia ottica-IR-UV Raman (S. Luin)
❖Quantum Dots e fluorofori inorganici (S Luin)
❖Muntanti GFP (S. Luin)
❖Sonde fluorescenti organiche (R Bizzarri)
❖Sensori di ambiente cellulare (R Bizzarri, M Cecchini)
❖Tecniche avanzate di microscopia in fluorescenza (S Luin, G
Ratto)
❖Imaging in fluorescenza (G Ratto)
❖TEM-SEM (M Gemmi)
❖Lab on a chip e microfluidica (M Cecchini)
❖Dendrimeri (S Luin)
❖Aptameri (P Mereghetti)
❖Vettori per internalizzazione (S Luin)
❖Sviluppo di metodi multi-scala e coarse grained per
simulazioni di biomolecole (V Tozzini, R Nifosí, G Maccari)
❖Applicazioni:
❖Altre applicazioni (V Tozzini, P mereghetti)
๏Proteine coinvolte nella replicazione di HIV
๏Nucleosomi, ribosomi, plasmidi, virus, aptameri
๏Proteine multistabili o destrutturate
www.nest.sns.it
www.nano.cnr.it
cni.iit.it