organ on a chip

ORGAN ON A CHIP
Un promettente sostituto alla
sperimentazione animale
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1.Fasi di sviluppo di un farmaco
La ricerca e lo sviluppo di un farmaco sono indirizzate al processo
dell’identificazione di molecole dotate di efficacia terapeutica
in presenza di un accettabile sicurezza d’uso.
!
-percorso molto lungo e costoso
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• - “Lead Discovery Research” : seleziona un limitato numero di
composti che interferiscono con il bersaglio selezionato.
• - “Drug Development” : Indaga queste molecole con una serie di
studi preclinici su animali con lo scopo di valutare qual è il livello
di tossicità della molecola sull’organismo vivente nel suo
complesso, per poi proseguire con la sperimentazione clinica
sull’uomo.
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STUDI DI FASE
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Recentemente proposta, che mi determina un primo profilo farmacocinetico.
Non forniscono dati sull’efficacia, essendo condotti a dosi basse e su soggetti
sani.
Scopo di selezionare i candidati più promettenti riducendo il rischio di
fallimenti.
Dubbia predicibilità.
STUDI DI FASE I
Farmacocinetica, farmacodinamica e tollerabilità del farmaco.
Partecipazione volontaria di 20-30 soggetti sani con consenso informato.
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STUDI DI FASE II
!
Riguardano i primi studi sul paziente.
Finalizzati ad individuare l’intervallo di dose attive.
!
Si dividono in
II B:
IIA :
-Studi non comparativi
-Studi comparativi verso placebo o trattamento
-Stimare approssivamente l’entità
attivo
dell’effetto
-Modalità doppio cieco con assegnazione
!
!
randomizzata dei pazienti ai gruppi
-criteri di ammissione restrittivi
-confermare l’efficacia terapeutica e
tollerabilità del farmaco
!
!
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STUDI DI FASE III
Gruppi con un numero più alto di pazienti per una più accurata
determinazione dell’efficacia terapeutica e della tollerabilità.
Studi più costosi, i più dispendiosi in tempo e i più difficili da progettare ed
eseguire.
Sono richiesti almeno due studi di fase III con esito positivo al fine di poter
richiedere l’approvazione da parte delle autorità di regolamentazione e
quindi l’immissione in commercio.
STUDI DI FASE IV
Post-marketing: studi terapeutici e di farmacovigilanza in seguito
all’immissione in
commercio.
Permettono di venire a conoscenza della reale efficacia e sicurezza di un
farmaco e anche di nuovi impieghi terapeutici.
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Scopo della tesi
Si rivolge alla fase di sviluppo preclinico di un farmaco
al fine di indagare se sia possibile migliorare questo
processo in termini di:
- velocità
- costi
- e nello stesso tempo alleviare le problematiche etiche
sollevate dall’uso eccessivo degli animali
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Strumenti : colture in vitro di cellule e tessuti
!
non hanno contribuito significativamente alla riduzione
dell’uso di animali.
D’altra parte i pazienti hanno un urgente bisogno di nuove
terapie
!
!
Necessità di strumenti migliori e uno di questi, potrebbe
essere l’“organ-on-a-chip”.
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2. Sperimentazione animale
!
!
!
L’uso degli animali nella ricerca biomedica :
!
- Ricerca di base: che si occupa della fisiologia degli organismi,
eziologia e patologia delle malattie
!
- Ricerca applicata: sviluppo di farmaci
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Animale come modello
MODELLO: rappresentazione semplificata del vero oggetto di
studio al quale siamo spesso costretti a ricorrere per l’impossibilità
di operare direttamente su tale oggetto di studio.
-Predittivo
!
Possono essere utilizzati come modelli solo se:
!
non vi sono altre alternative,
gli obbiettivi scientifici sono validi,
possibilità di contribuire al benessere dell’uomo o dell’animale.
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Animalisti contro Scienziati
Punto di vista degli animalisti:
1) Scarsa predittività
2) Sostituibilità con metodologie alternative
3) Problematicità sotto il profilo etico
Punto di vista degli scienziati :
1) Gli esperimenti sugli animali hanno un ruolo fondamentale nella ricerca e
nello sviluppo dei moderni trattamenti clinici
2) Non ci sono differenze essenziali tra gli animali utilizzati in laboratorio e
l’uomo
3) I ricercatori sono a conoscenza delle limitazioni dei modelli animali
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Il principio delle 3 R
1. RIDURRE: diminuzione del numero di animali utilizzati in un
determinato protocollo sperimentale.
2. RIMPIAZZARE: valutare se sono disponibili metodi alternativi come
test in vitro, o in subordine su organismi inferiori.
3. RIFINIRE: modificare gli esperimenti in modo tale da ridurre la
sofferenza e il dolore degli animali.
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La sperimentazione sull'animale rimane ancora oggi
insostituibile
!
!
Tuttavia il nostro impegno a ridurre il numero e la
sofferenza degli animali deve mantenersi sempre al
massimo.
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3.Organ on a chip
Complessi sistemi in vitro che integrano la tecnologia microfluidica e
cellule umane per studiare la fisiologia e la pato-fisiologia umana,
nonché la risposta ai farmaci.
!
!
!
“chip” : principi di progettazione e alle tecniche di microfabbricazione usate,
“organ” : simulazione di una struttura di microambiente ispirata alle
funzioni dell’organo in vivo con l’utilizzo di colture cellulari.
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Colture cellulari 3D
Cellule coltivate in 2D non riescono a ricostituire il reale microambiente
cellulare esistente in vivo
sviluppo di modelli di coltura
cellulare 3D in cui le cellule vengono coltivate in un gel di ECM
( importante per la sua flessibilità).
!
Le nuove tecniche di microfabbricazione portano al raggiungimento del
microambiente in vivo.
Es. Microfluidica : scienza della manipolazione di piccole quantità di fluidi in
canali vuoti microfabbricati, usata per :
generare e regolare con precisione i flussi di fluido dinamico e i gradienti
spazio-temporali,
erogare gli elementi nutrienti e altri segnali chimici alle cellule in maniera
controllata.
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PDMS o poly(dimetilsilossano) :
Polimero siliconico caratterizzato da proprietà uniche che ne fanno la scelta
perfetta per la fabbricazione di microsistemi per la coltura di cellule e tessuti.
VANTAGGI:
- Elevata permeabilità ai
SVANTAGGI:
- Scarsa resistenza chimica a certi solventi
gas
- Propensità ad assorbire piccole molecole
- Trasparenza ottica
idrofobiche
- Elevata flessibilità
!
!
Grazie a tutto questo è stato possibile la formazione di modelli in vitro che
ricostituiscono le più complesse strutture 3D a livello di organo e di integrare
fondamentali segnali meccanici dinamici e anche chimici per meglio imitare la
fisiologia e pato-fisiologia in vivo.
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Sviluppo dell’organ on a chip: 1) da coltura di biopsie ex vivo
Più fedele rappresentazione in vitro di una risposta fisiologica in
vivo
Test funzionali a breve termine
2) da colture primarie
Sorgente più comune
Periodo medio di vita cellulare dopo isolamento: 2 settimane
Mancanza di strutture e gerarchie tissutali proprie dell’organo
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3) Da cellule staminali pluripotenti
Stadio iniziale
Il controllo del fenotipo cellulare non è compito facile
Migliore comprensione dei microambienti atti a promuovere i
fenotipi differenziati
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FEGATO on a chip
Sistema che integra l’epitelio
del fegato con reti vascolari
microfabbricate.
!
Due camere di coltura
cellulare PDMS sono state
giustapposte e separate da
una membrana di ECM.
!
All‘ interno dei canali
microfluidici sono state
costruite strutture che
somigliano all’endotelio che
separa gli epatociti dal
sinusoide, con l’obbiettivo di
avvicinarsi di più alle
proprietà di trasporto della
microcircolazione epatica.
Questo a consentito agli
epatociti umani primari di
mantenere l’attività
metabolica specifica per una
settimana.
SNC on a chip
Sistema microfluidico
compartimentalizzato
che permette la cocoltura di neuroni e
oligodendrociti
finalizzato a studiare
la comunicazione tra
neuroni e cellule gliali
durante lo sviluppo del
sistema nervoso
centrale.
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Sviluppo di modelli di malattie su chip
!
Si è potuto studiare l'adesione
intravascolare (capacità invasiva) delle
cellule da parte di cellule tumorali
metastatiche della mammella in
circolazione in risposta all'attivazione
endoteliale in condizioni di flusso
fisiologiche. Usando questo modello, è
stato dimostrato che la stimolazione
basale dell'endotelio con la citochina,
CXCL12, aumenta significativamente
l'adesione delle cellule del tumore al
seno in circolazione.
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LUNG ON A CHIP
Microsistema biomimetico che ricostituisce l’interfaccia critica
alveolo-capillare, che rappresenta di fatto l’unità morfo-funzionale
del polmone vivente.
Sistema microfuidico contenenti due canali
giustapposti tra loro di PDMS separati da
ECM.
!
!
Nell’ ECM sono state coltivate ai suoi lati opposti cellule epiteliali alveolari
umani e cellule endoteliali polmonari umane.
Dopo confluenza tra cellule, viene introdotta dell’aria nel compartimento
epiteliale per ricreare un’interfaccia aria-liquido simile al rivestimento dello
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Questo modello imita 1) L’INSPIRAZIONE con riduzione della pressione
intrapleurica ed espansione degli alveoli : portando aria nei polmoni, con
conseguente espansione dell’epitelio alveolare e dell’endotelio.
!
!
!
!
!
Quando si fa il vuoto nelle due camere laterali, si produce deformazione
elastica della parete che divide i micro canali, che contengono le cellule, dalle
camere laterali; ciò genera l’espansione della membrana di PDMS e degli strati
di tessuto aderenti. Quando il vuoto viene rilasciato, il rimbalzo elastico del
PDMS riporta la membrana e le cellule aderenti allo loro dimensione originaria.
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2) RISPOSTA INFIAMMATORIA , incorporando nel fluido che scorre cellule immunitarie.
!
!
!
Introduzione del
TNF !
nel microcanale alveolare in presenza di stress meccanico fisiologico
ed esaminare l’attivazione dell’ endotelio micro vascolare misurando l’espressione di
ICAM1.
!
•
TNF ! ha aumentato l’espressione endoteliale di ICAM 1, a differenza dello stress fisiologico
(applicato attraverso il vuoto).
•
Adesione dei neutrofili.
•
Appiattimento dei neutrofili, diapedesi e trasmigrazione attraverso la barriera alveolocapillare.
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3) RISPOSTA CELLULARE INNATA ALL’INFEZIONE POLMONARE BATTERICA:
Aggiunta al micro canale alveolare batteri viventi con GFP.
!
•
- Attivazione dell’endotelio sottostante, come indicato dalla trasmigrazione
dei neutrofili nel micro canale alveolare.
•
- Movimento direzionale dei neutrofili verso i batteri, che hanno poi
circondato e fagocitato.
4) TOSSICITA’ POLMONARE indotta da dosi elevate di IL-2 somministrate nei
protocolli di chemioterapia antimetastatica.
!
-
Extravasazione ed accumulo di fluido a livello dello spazio alveolare.
-
Attivazione della coagulazione con deposito intralveolare di fibrina.
Questo modello consente di testare l’effetto di farmaci potenzialmente capaci di modulare
l’extravasazione ( es. GlaxoSmithKline ).
!
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Modello di patologia asmatica su chip
I sintomi clinici tipi dell’asma allergica provengono da un aumento esagerato del
tono dei muscoli lisci in risposta al sistema immunitario da parte di allergeni.
I Glucocorticoidi e i beta agonisti sono le attuali terapie
molti pazienti
resistenti.
Modello di
muscolatura della via
aerea umana su chip:
attraverso BMS ed
introduzione nel sistema
di IL-13.
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HUMAN ON A CHIP
Modello integrato, ancora sotto analisi, fatto di compartimenti
interconnessi, con ciascuno di essi che contiene un tipo di cellula che
rappresenta un organo diverso, collegati attraverso un sistema
circolatorio microfluidico.
Collegamento tra gli studi pre-clini e clinici.
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Varie PIATTAFORME PRELIMINARI microfluidiche hanno dato prova dell'importanza
del human-on-chip per gli studi funzionali, per indagare gli effetti dei farmaci,
e per testarne la tossicità.
o Wagner e collaboratori
biopsie umane cutanee ed epatociti primari
umani in un dispositivo microfluidico.
!
o Van Midwoud e collaboratori
fegato e d’intestino in un dispositivo
microfluidico.
Interazione tra i due tessuti sotto la stimolazione di acido"desossicolico
biliare.
!
o Zhang e collaboratori hanno voluto definire un mezzo di coltura"adatto per le
cellule provenienti da diversi tessuti.
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•
In uno di questi studi, è stato ad esempio microingegnerizzato un “bioreattore”
con colture di cellule 2D di fegato e di polmone in diverse microcamere
interconnesse da canali microfluidici al fine di sviluppare modelli
farmacocinetici fisiologicamente rilevanti.
- metaboliti di naftalene prodotti nello compartimento del fegato portavano a
riduzione di glutatione nello compartimento cellulare epiteliale del polmone.
!
•
Questo sistema microfluidico è stato modificato in seguito per incorporare
colture 2D e 3D anche di adipociti, cellule tumorali, e cellule staminali del
midollo spinale, per studiare l'accumulo, la distribuzione, il metabolismo e la
tossicità dei farmaci .
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Requisiti fondamentali:
Validazione nel predire le risposte umane
!
Identificazione della fonte cellulare umana che meglio
imita le risposte in vivo
!
Componente strutturale non biologica del chip
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Gli organ-on-a-chip hanno molte
applicazioni:
1) Accelerare il processo di sviluppo dei farmaci e per sviluppare farmaci
che siano sempre più sicuri e più efficaci a costi inferiori.
!
2)Sviluppo di modelli di malattia di utilità per la nostra specie che possono
meglio predire l'efficacia e la tossicità dei farmaci nei pazienti e fornire
maggiore comprensione dei loro meccanismo d’azione.
!
3) Potrebbero contribuire a proteggere la salute pubblica identificando
tossine ambientali e fornendo una migliore comprensione dei loro
meccanismo d’azione.
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4) Multi-organ : potrebbero fornire metodi più perfezionati per esplorare
diversi percorsi di somministrazione dei farmaci, oltre che ai loro effetti
sull'efficacia o tossicità delle diverse formulazioni dei farmaci (prolungamento
intervallo QT di alcuni farmaci).
!
5) In futuro, potremmo utilizzare questi chip con cellule ottenute da diverse
popolazioni genetiche che "rispondono" o "non rispondono" o da persone che
esprimono o non esprimono particolari trasportatori molecolari o enzimi
metabolici così che si possano sviluppare farmaci per specifiche
sottopopolazioni umane.
!
6) Infine, in un futuro si potrebbero un giorno eseguire trial clinici umani
virtuali usando questi modelli microingegnerizzati.
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