SCREENING PER LA FIBROSI CISTICA ESEGUITO CON UN

Workshop
DIAGNOSTICHE MOLECOLARI PER
L'ANALISI DI ANEUPLOIDIE
E DI FIBROSI CISTICA
Workshop
DIAGNOSTICHE
MOLECOLARI PER
L'ANALISI DI
ANEUPLOIDIE
E DI FIBROSI CISTICA
SCREENING PER
LA FIBROSI
CISTICA ESEGUITO
CON UN NUOVO
KIT BASATO SU
PCR ALLELE
SPECIFICA
Claudia Centrone
SOD Diagnostica Genetica AOU Careggi
Test genetico ideale
Metodiche a disposizione
Screening per la fibrosi cistica eseguito con un
nuovo kit basato su PCR allele specifica
2 384 campioni di sangue adsorbito su carta
Guthrie provenienti dai nati dell’anno 2011
nelle Regioni Toscana e Umbria
 32 460 nascite in Toscana
 8 297 nascite in Umbria
Per un totale di 40 757
12 diagnosi di
Fibrosi Cistica
Laboratory setting for CFTR mutation high throughput screening
Automatic spot puncher
Automatic DNA extraction
Automatic PCR setup
PCR amplification
Automatic detection setup
Automatic detection
Data analysis
Raccolta e preparazione del campione
Per ogni neonato è stato
preparato un dischetto di
3,2 mm di diametro,
raccolto direttamente in
piastre da 96 mediante
l’utilizzo di un puncher
automatico
Digestione Over Night (ON) con
proteinasi K a temperatura
ambiente.
Le piastre così
preparate sono state
utilizzate direttamente
per l’estrazione del DNA
con biglie magnetiche
(Diasorin, Bullet PRO)
Raccolta e preparazione del campione
Devyser CFTR-Core Kit
1 provetta CFTR-Core wild type mix (48 reazioni)
1 provetta CFTR-Core mutation mix (48 reazioni)
2 provette PCR Activator
I campioni vengono amplificati usando 2,5 µL
di DNA genomico concentrato a 4 µL
Materiale di partenza
DNA estratto da sangue intero
DNA estratto da villo coriale
DNA estratto da liquido amniotico
DNA estratto da Guthrie cards
Attivazione delle mix
500 µL
50x10 µL
Reaction Mix
- Core 1
- Core 2
PCR Activator
Reaction MMx
Preparazione PCR
2,5 µL DNA
PCR allele specifica
eterozigote
PCR allele specifica
Omozigote wt
PCR allele specifica
Omozigote
mutato
Elettroforesi capillare
eletroferogramma
Signal
(label color)
product length
Il processo è stato completamente
automatizzato mediante l’utilizzo della
postazione automatizzata Biomek per la
preparazione della PCR e la risospensione
delle piastre in formammide per la corsa
elettroforetica.
I prodotti di PCR sono stati corsi su 3730
Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e i
risultati analizzati mediante software
Gene Mapper 4.0/4.1
Devyser CFTRCore Kit
Il kit permette
di analizzare 36
mutazioni del
gene CFTR
Il Core mix 2
consente anche
di rilevare la
regione dei
poly-T del gene
CFTR.
Mutation (Legacy name)
711+1G>T
3120+1G>A
621+1G>T
1717-1G>A
CFTRdele2,3(21kb)
3849+10kbC>T
2789+5G>A
1898+1G>A
G542X
G85E
Y1092X(C>A)
G551D
R553X
3659delC
N1303K
R560T
R117H
R1162X
L1077P
R117C
R1066C
L1065P
W1282X
R347H
R347P
I507del
T338I
F508del
I336K
1677delTA
R334W
3272-26A>G
1078delT
2183AA>G
2184insA
2143delT
5T (TG9-13)
7T
9T
cDNA name
c.579+1G>T
c.2988+1G>A
c.489+1G>T
c.1585-1G>A
c.54-5940_273+10250del21kb
c.3717+12191C>T
c.2657+5G>A
c.1766+1G>A
c.1624G>T
c.254G>A
c.3276C>A
c.1652G>A
c.1657C>T
c.3528delC
c.3909C>G
c.1679G>C
c.350G>A
c.3484C>T
c.3230T>C
c.349C>T
c.3196C>T
c.3194T>C
c.3846G>A
c.1040G>A
c.1040G>C
c.1519_1521delATC
c.1013C>T
c.1521_1523delCTT
c.1007T>A
c.1545_1546delTA
c.1000C>T
c.3140-26A>G
c.948delT
c.2051_2052delAAinsG
c.2052_2053insA
c.2012delT
c.1210-34TG[9-13]-12T[5]
c.1210-12T[7]
c.1210-12T[9]
Location
Intron 5
Intron 18
Intron 4
Intron 11
Intron 1 - Exon 3
Intron 22
Intron 16
Intron 13
Exon 12
Exon 3
Exon 20
Exon 12
Exon 12
Exon 22
Exon 24
Exon 12
Exon 4
Exon 22
Exon 20
Exon 4
Exon 20
Exon 20
Exon 23
Exon 8
Exon 8
Exon 11
Exon 8
Exon 11
Exon 8
Exon 11
Exon 8
Intron 19
Exon 8
Exon 14
Exon 14
Exon 14
intron 9
intron 9
intron 9
Devyser CFTR-Core Kit
Nel caso dell’allele 5T, può anche essere determinato
il numero dei TG repeat della regione poly-T
Il software di analisi permette di scegliere se
analizzare o meno il tratto poly-T
Core 1 e Core 2 includono l’analisi parallela di due
marcatori STR polimorfici (marcatori ID) per
consentire il confronto nelle due mix del campione
analizzato.
Visualizzazione dei risultati mix1: eterozigote composto F508del/R553X
Visualizzazione dei risultati mix2: eterozigote composto F508del/R553X
polyT ”OFF”
Visualizzazione dei risultati mix2: eterozigote composto F508del/R553X
polyT ”ON”
Visualizzazione dei risultati mix1: Omozigote 3849+10kbC>T/3849+10kbC>T
Visualizzazione dei risultati mix2: Omozigote 3849+10kbC>T/3849+10kbC>T
polyT ”ON”
Visualizzazione dei risultati mix1: wt
Visualizzazione dei risultati mix2: wt
polyT ”OFF”
Visualizzazione dei risultati mix1: wt
polyT ”on”
Visualizzazione dei risultati mix1: eterozigote W1282X
Visualizzazione dei risultati mix2: eterozigote W1282X
PolyT ”ON”
Devyser CFTR Core 1: eterozigote composto F508del/R117C
Devyser CFTR Core 2: eterozigote composto F508del/R117C
polyT OFF
Devyser CFTR Core: eterozigote composto F508del/R117C
Poly-T off
Risultati
2 384 campioni di sangue
49 mutazioni , frequenza del
2,33% nella popolazione
analizzata
Ancora pochi dati…….
c.1521_1523delCTT
(p.Phe508del, F508del): 67,3%.
Numero di campioni
2384
Determinati
2208
93%
Fallimenti
176
7%
Mutazioni
Totale
% della
% delle
popolazione
mutazioni
analizzata
49
2,22%
F508del
33
67,3%
1,49%
N1303K
4
8,2%
0,18%
G542X
3
6,1%
0,14%
621+1T
1
2,0%
0,05%
R117C
1
2,0%
0,05%
R334W
2
4,1%
0,09%
R347P
2
4,1%
0,09%
W1282X
1
2,0%
0,05%
2789+5G>A
2
4,1%
0,09%
T338I
1
2,0%
0,05%
R347H
1
2,0%
0,05%
c.1624G>T (p.Gly542* , G542X)
c.3909C>G (p.Asn1303Lys, N1303K): frequenza superiore al 5%.
Conclusioni
Work-module
(8 samples)
PCR setup
PCR amplification
Hands-on
time
Total time
10 min
10 min
5 min
2 hr 30 min
Detection
15 min
1 hr
Results analysis
30 min
30 min
Total
60 min
4 hr 10min
Processo automatizzabile
Metodica rapida
Analisi TG in caso di 5T
Bassa percentuale di fallimenti
I risultati sono di chiara ed oggettiva interpretazione.
Detection rate di circa l’80 % nella popolazione
toscana e umbra.