Lezione 2 - GENETICA VIRALE

GENETICA VIRALE
La variazione del genoma virale ha un
impatto su:
•
•
•
•
•
PATOGENESI
CICLO REPLICATIVO
VIRUS EMERGENTI
SVILUPPO VACCINI
RESISTENZA AI FARMACI
• I virus sono in continua evoluzione, mediante un
processo in cui si alternano:
1) L’emergenza di nuove caratteristiche genetiche e 2) la
loro stabilizzazione nella popolazione
La prima parte di questo processo avviene, in maniera
casuale, durante la replicazione del genoma virale,
Quindi:
– Quando il cambiamento genetico NON ALTERA LA CAPACITA’
RIPRODUTTIVA del virus esso si trasmetterà alla progenie
– Le alterazioni genetiche che ledono in modo drastico la
capacità replicativa del virus sono eliminate dalla popolazione
virale,
– Le alterazioni che causano lievi danni alla capacità replicativa
tendono ad essere eliminate dalla popolazione perché il virus
originario si replica con maggiore efficienza e velocità, a meno di
una condizione esterna che conferisca vantaggio alla
popolazione mutata
Le quasi specie virali
• La stabilizzazione nella popolazione virale del cambiamento
genetico che non altera la capacità riproduttiva del virus potrà
avvenire o per fluttuazione casuale oppure in risposta ad una
pressione selettiva
• Alcune mutazioni infatti determinano cambiamenti delle strutture
superficiali che consentono al virus di sfuggire all’azione della
risposta immunitaria dell’ospite
• Queste popolazioni virali si espanderanno velocemente nell’ospite
finché il sistema immunitario di quest’ultimo non neutralizzerà i
nuovi virus, esercitando così una pressione selettiva verso
l’affermazione di nuove ulteriori varianti antigeniche virali
• Per alcuni virus (HIV e HCV) nasce così il concetto di quasi-specie,
derivato dall’osservazione che, in un individuo infettato da lungo
tempo, si ha continua evoluzione del virus, per effetto delle
mutazioni spontanee e per la pressione selettiva esercitata
dall’immunità dell’ospite, nonché dalla terapia farmacologica
GENETICA VIRALE
“IL DNA cromosomico dell’organismo
ospite generalmente richiede tempi
geologici per evolvere nel modo in
cui evolvono i virus ad RNA in una
singola generazione”
GENETICA VIRALE
• VIRUS CRESCONO RAPIDAMENTE
• UNA SINGOLA PARTICELLA PRODUCE NUMEROSE
PARTICELLE VIRALI IN UNA CELLULA
• ELEVATA PROBABILITA’ DI MUTAZIONE IN TEMPI BREVI
• I VIRUS A DNA HANNO ACCESSO A SISTEMI DI PROOFREADING, MENTRE I VIRUS A RNA NO
• LA NATURA DEL GENOMA VIRALE (RNA O DNA, SEGMENTATO
O NON-SEGMENTATO) SVOLGE UN RUOLO IMPORTANTE
NELLA GENETICA DEI VIRUS
I VIRUS POSSONO CAMBIARE
GENETICAMENTE PER:
• MUTATIONI
• RIASSORTIMENTO/RICOMBINAZIONE
ORIGINE DELLE MUTAZIONI
• SPONTANEE:
– Basi tautomeriche
–Errori della polimerasi
• INDOTTE
FORME TAUTOMERICHE
frequenti
rare
Introdotte dalle polimerasi
• I virus che usano DNA-polimerasi DNA-dipendenti
presentano una frequenza di mutazione relativamente
bassa(10-8-10-11 per nucleotide per ciclo replicativo),
simile a quella che si osserva negli organismi
cellulari(DNA-polimerasi con capacità di correzione di
bozze)
• I virus che usano RNA-polimerasi (sia DNA-che RNAdipendenti) sono privi di attività di correzione di bozze,
e pertanto sono più soggetti a errori di copiatura
• Le trascrittasi inverse (DNA-polimerasi-RNAdipendenti) diHBV e dei Retrovirus sono in natura tra gli
enzimi a maggior tasso di errore spontaneo (non
possiedono di norma attivita’ di correzione di bozze). La
frequenza di mutazioni spontanee raggiunge 1x 10-4
nucleotidi per ciclo replicativo
In generale quindi:
• I virus a DNA sono più stabili geneticamente dei
virus a RNA, perché nella cellula ci sono sistemi
di riparazione dei danni al DNA
• Alcuni virus a RNA sono abbastanza stabili in
natura.
– E’ probabile che questi virus abbiano la stessa
elevata frequenza di mutazione degli altri virus a RNA
ma essendosi adattati finemente bastano solo
minimi cambiamenti per eliminare eventuali
vantaggi competitivi rispetto al virus parentale (wildtype). SELEZIONE NEGATIVA!
ORIGINE DELLE MUTAZIONI
• INDOTTE DA AGENTI FISICI
– Raggi UV
– Raggi X
• INDOTTE DA AGENTI CHIMICI
– Agenti che agiscono direttamente sulle basi (es. Acido nitroso)
– Agenti che agiscono indirettamente (es. Analoghi delle basi)
TIPO DI MUTAZIONI
• PUNTIFORMI
•INSERZIONI
•DELEZIONI
Le mutazioni inducono
• Mutanti LETALI CONDIZIONALI
– il virus mutato si moltiplica solo in certe condizioni ma
non in altre
– il virus wild-type (wt) cresce in entrambe le
condizioni
• Mutanti sensibili alla temperatura (ts) non crescono a
temperature elevate (es. Crescono bene a 31°C ma non a
39°C, mentre il virus parentale cresce bene ad entrambe l e
temperature)
• Mutanti host-range non crescono in tutti i tipi cellulari in cui
cresce il virus wild-type (utili per studiare il ruolo della cellula
nell’infezione virale)
Esempi di cambiamenti fenotipici in
mutanti virali
Mutanti di PLACCA
– La dimensione della placca può essere più grande o più piccola
di quella del virus parentale.
– A volte questi mutanti hanno una alterata patogenicità
Mutanti RESISTENTI AI FARMACI
- Importante nello sviluppo dei farmaci antivirali
Mutanti ENZIMA-DEFICIENTI
– Alcuni geni possono essere “opzionali” in certe circostanze (es.
Timidina Chinasi di HSV non è necessaria per crescita in coltura
cellulare ma è necessaria per l’infezione dei neuroni)
Esempi di cambiamenti fenotipici in
mutanti virali
• “HOT MUTANTS”
– Crescono meglio ad elevate temperature rispetto al
wt
– Più virulenti perchè meno suscettibili alla febbre e
possono rallentare la crescita del virus wt
• Mutanti ATTENUATI
– Sintomi attenuati (o assenza di sintomi)
– Sviluppo di vaccini
– Patogenesi
CAMBIAMENTI GENETICI
• MUTAZIONI
• RIASSORTIMENTO/RICOMBINAZIONE
RICOMBINAZIONE
SCAMBIO DI INFORMAZIONE TRA DUE
GENOMI
RICOMBINAZIONE
Classica
‘classic’ recombination
Comune nei virus a DNA e retrovirus
durante la fase nucleare
Rottura dei legami covalenti, scambio materiale genetico, riformazione legami covalenti
RECOMBINAZIONE
COPY CHOICE
Virus a RNA non usano ricombinazione classica (mancanza di enzimi nella
cellula ospite per ricombinare l’RNA)
Picornavirus ricombinano con bassa efficienza mediante copy choice (la
polimerasi salta da uno stampo all’altro durante la sintesi dell’RNA).
RECOMBINAZIONE
COPY CHOICE
CONSEGUENZE DELLA
RICOMBINAZIONE
• La ricombinazione favorisce l’acquisizione
di nuove informazioni genetiche da parte
di virus dello stesso tipo e
occasionalmente da virus diversi o anche
dal genoma cellulare (es. alcuni
retrovirus).
RICOMBINAZIONE – ALCUNI
UTILIZZI
• Mappaggio mediante frequenza di
ricombinazione
• Mappaggio tramite “marker rescue”
• Sviluppo di virus ricombinanti a scopo
vaccinale o per ragioni terapeutiche
RICOMBINAZIONE -ALCUNI
UTILIZZI
marker
rescue
RICOMBINAZIONE - ALCUNI
UTILIZZI
• Mappaggio tramite frequenza di
ricombinazione
• Mappaggio tramite marker rescue
• Sviluppo di virus ricombinanti a scopo
vaccinale o per ragioni terapeutiche
RICOMBINAZIONE – ALCUNI
UTILIZZI
RIASSORTIMENTO GENICO
si verifica esclusivamente nei virus a RNA segmentato
(orthomyxovirus, reovirus, arenavirus, bunyavirus)
RIASSORTIMENTO GENICO
• forma di ricombinazione NON classica
• molto importante in natura per generare nuove
varianti
• molto importante in laboratorio per assegnare
funzioni ai vari segmenti
• solo virus segmentati (es. Se un segmento
deriva dal virus influenzale A e uno dal B
possiamo capire quali proprietà appartengono a
d A e a B)
• usata in alcuni nuovi approcci vaccinali
APPLICAZIONI DELLA GENETICA
Il vaccino antiinfluenzale Flumist (LAIV, approvato nel giugno 2003) è stato
generato sfruttando i principi discussi.
Riassortimento genico tra un ceppo attenuato ed un nuovo ceppo virulento del
virus influenzale per produrre un vaccino antinfluenzale attenuato
APPLICAZIONI DELLA GENETICA
Il ceppo attenuato è adattato al freddo (tratto respiratorio superiore)
ma termo-sensibile (crescita scarsa a livello del tratto respiratorio
inferiore). E’ meno patogeno del virus wt (a causa di diverse
mutazioni)
Gli anticorpi contro le proteine di superficie (HA e NA) sono importanti
per la protezione. Tuttavia le proteine HA e NA mutano ogni anno.
La tecnologia sfrutta il riassortimento per generare virus riassortanti
che hanno 6 segmenti genici del virus attenuato adattato al freddo e i
segmenti codificanti HA e NA di un virus verosimilmente responsabile
della nuova epidemia influenzale.
E’ un vaccino vivo attenuato fornito per via intranasale come spray
che induce immunità mucosale e sistemica.
VIRUS A RNA A POLARITA’
NEGATIVA NON-SEGMENTATI
• Non presentato meccanismi copy
choice
• Non vanno incontro a riassortimento
Minore capacità di scambiare materiale
genetico
COMPLEMENTAZIONE
Interazione a livello funzionale, NON a livello
genico
I 2 mutanti ts non crescono alla temperatura non permissiva, ma se le
mutazioni sono su geni diversi si complementano
La progenie virale assemblata usa le proteine wt N e wt M
I genomi nella progenie saranno ts M o ts N
Mutanti di complementazione mappano generalemente a livello di
geni diversi
VIRUS DIFETTIVI
• Mancano gene(i) necessari per un ciclo
infettivo completo
• Virus ‘helper’ fornisce funzioni mancanti
package me!
package me! copy me!
copy me!
VIRUS DEFETTIVI
• Alcuni esempi di virus defettivi
– Alcuni retrovirus (usano virus helper
correlato)
– Il virus dell’epatite delta (usa un virus helper
non correlato)
– I virus Adeno-associati
DEFECTIVE INTERFERING (DI)
VIRUSES (PARTICLES)
• Sono particelle virali mancanti di parti più o meno consistenti del
genoma
• Diminuiscono la replicazione del virus helper
– Competono per gli stessi precursori, enzimi….
• Possono modulare l’infezione da parte del virus wt
• NON SONO UTILIZZATE IN CLINICA
• Insorgono naturalmente es. virus DI del morbillo nella panencefalite
subacuta sclerosante (SSPE)
Virus Like Particles
• Sono particelle virali prive completamente
del genoma virale
• Vengono utilizzate in approcci di
vaccinazione (HPV)
PHENOTYPIC MIXING
tra 2 virus diversi che infettano la stessa cellula
no cambiamenti nel genoma
possibile spettro d’ospite alterato
possibile resistanza ad anticorpi neutralizzanti
PHENOTYPIC MIXING
per generare uno pseudotipo