campylobacter - italbioforma

HPA STANDARD METHOD
RICERCA DI SPECIE
CAMPYLOBACTER
NELL'ACQUA
W8
Emesso da Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory
Centre for Infections
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL'ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 1 di 14
Riferimento no: W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD
I Metodi Nazionali Standard, che includono le procedure operative standard (POS) algoritmi e linee guida,
promuovono l’adozione di elevati livelli di qualità, contribuendo ad assicurare la possibilità di confronto delle
informazioni diagnostiche ottenute in laboratori diversi. Ciò consente la standardizzazione della
sorveglianza sostenuta dalla ricerca, sviluppo e verifica, promovendo nello stesso tempo la salute pubblica
e la fiducia del paziente nelle proprie strutture sanitarie. I metodi sono ben referenziati e rappresentano un
buon standard minimo per la microbiologia clinica e per la salute pubblica. Comunque, utilizzando i Metodi
Nazionali Standard, i laboratori dovranno tenere in considerazione le esigenze locali e potranno
intraprendere ricerche addizionali. I metodi forniscono inoltre un punto di riferimento per un loro ulteriore
sviluppo.
I Metodi Nazionali Standard sono stati sviluppati, revisionati ed aggiornati con una procedura aperta di
consenso ove le opinioni di tutti i partecipanti sono state tenute in adeguata considerazione ed i documenti
elaborati riflettono il consenso della maggior parte degli stessi.
I rappresentanti di alcune organizzazioni professionali, incluse quelle il cui logo appare sulla prima pagina,
sono membri dei gruppi di lavoro che sviluppano i Metodi Nazionali Standard. L’inclusione del logo di una
organizzazione nella prima pagina implica sostegno agli obiettivi ed al processo di preparazione dei metodi
standard. I componenti di queste organizzazioni scientifiche hanno partecipato allo sviluppo dei Metodi
Nazionali Standard ma le loro opinioni personali non rispecchiano necessariamente quelle
dell’organizzazione di cui sono membri. L’elenco attuale delle organizzazioni professionali partecipanti può
essere ottenuto tramite e-mail all’indirizzo [email protected].
Le prestazioni dei metodi standard sono condizionate dalla qualità di reagenti, strumentazione, procedure
commerciali o prove messe a punto in loco. I laboratori dovrebbero assicurare che queste siano state
validate e dimostrate idonee allo scopo prefissato. Devono essere adottate procedure di controllo di qualità
interno ed esterno.
Nonostante siano state osservate le più scrupolose attenzioni nella preparazione di questa pubblicazione,
la Health Protection Agency o qualsiasi organizzazione di sostegno non può essere ritenuta responsabile
dell’accuratezza o dell’utilizzo o di qualsiasi conseguenza derivante dall’uso o da modifiche delle
informazioni contenute in questo documento. Queste procedure sono intese solamente come una risorsa
generale per i professionisti che esercitano in questo settore, operanti nel Regno Unito, pertanto si dovrà
ricorrere ad altri consulenti quando ritenuto necessario. Se si apportano modifiche a questa pubblicazione,
si deve porre in evidenza dove sono state apportate modifiche al documento originale. La Health Protection
Agency (HPA) dovrà essere informata in ogni circostanza.
La HPA è una organizzazione indipendente che ha lo scopo di proteggere la salute della popolazione. Ad
essa confluiscono esperienze professionali già appartenenti ad organizzazioni ufficiali. Maggiori
informazioni riferibili alla HPA possono essere ottenute al sito www.hpa.org.uk
La HPA è un’organizzazione che mira ad essere completamente in accordo con le direttive Caldicott. Ciò
significa prendere ogni possibile precauzione per prevenire la diffusione non autorizzata di informazioni sui
pazienti e di garantire che le informazioni relative agli stessi siano mantenute in condizioni di sicurezza1.
Maggiori dettagli possono essere ottenuti dal sito web www.evaluations-standards.org.uk. Contributi allo
sviluppo dei documenti possono essere forniti contattando l’indirizzo [email protected].
Per cortesia prendere nota che la bibliografia è attualmente formattata con il software Reference Manager.
cortesia prendere
notail che
bibliografia
attualmente
formattatailcon
il software
Reference
SePer
si modifica
o si cancella
testolasenza
avereèinstallato
nel computer
Reference
Manager,
la bibliografia
Manager.
Se si modifica
o si cancella il testo senza avere installato nel computer il Reference Manager,
non
sarà aggiornata
automaticamente.
la bibliografia non sarà aggiornata automaticamente.
Riferimento suggerito per questo documento:
Health Protection Agency (2007). Detection of Campylobacter species in water. National Standard Method
W 8 Emissione 3. http://www.hpa-standardmethods.org.uk/pdf_sops.asp.
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 2 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
INDICE
STATO DEI METODI NAZIONALI STANDARD ........................................................................................ 2
.
INDICE ........................................................................................................................................................ 3
PROCEDURA DI MODIFICA ..................................................................................................................... 4
SCOPO DEL DOCUMENTO ....................................................................................................................... 5
INTRODUZIONE ......................................................................................................................................... 5
1
DEFINIZIONI ....................................................................................................................................... 6
2
PRINCIPIO .......................................................................................................................................... 6
3
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA ..........................................................................................
6
3.1 TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE ………………...………………………….……..……… 6
3.2 PROCEDURA SUL CAMPIONE …………………………………………..………………………….………. 6
4
ATTREZZATURA ............................................................................................................................... 7
5
TERRENI DI COLTURA E REAGENTI .............................................................................................. 7
6
PROCEDURA SUL CAMPIONE ........................................................................................................ 9
6.1 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE ……………….……...………………………………….………….…….. 9
6.2 ARRICCHIMENTO SELETTIVO …………….……………..………………………….…………………..….. 9
6.3 SOTTOCOLTURA IN AGAR SELETTIVO .…………………………………………………………………….… 9
6.4 IDENTIFICAZIONE DELLE COLONIE …..…..………………………………….……………………………... 9
6.5 PROVE DI CONFERMA …………...………………………………….……………………………….…….. 10
7
CALCOLO DEI RISULTATI ................................................................................................................ 11
8
REFERTO .......................................................................................................................................... 11
9
CONTROLLO DI QUALITA’ ............................................................................................................... 11
9.1 MEMBRANA DI FILTRAZIONE ...……………………………………………………………………..……... 11
9.2 PROVE DI CONFERMA ...……………………………………………………………………..……..……… 12
10
STRUTTURE DI RIFERIMENTO ........................................................................................................ 12
11
RINGRAZIAMENTI E CONTATTI ....................................................................................................... 12
DIAGRAMMA DI FLUSSO CHE ILLUSTRA LA PROCEDURA DI RICERCA DI SPECIE
CAMPYLOBACTER CON MEMBRANA DI FILTRAZIONE ..................................................................... 13
BIBLIOGRAFIA ......................................................................................................................................... 14
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 3 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
PROCEDURA DI MODIFICA
Documento di riferimento
controllato
Titolo del documento
controllato
W8
Ricerca di specie Campylobacter nell’acqua
Ciascun Metodo Nazionale Standard possiede una registrazione separata con le modifiche. Le modifiche di
questa revisione sono riportate in questa pagina. Le precedenti modifiche sono disponibili presso la
[email protected].
Qualora vi sia una revisione di pagine o vengano emesse pagine nuove il proprietario di ciascun documento
controllato dovrebbe aggiornare la copia in laboratorio
Modifica
Numero/
Data
6/
24.10.07
Pagina
Emissione no. Inserita
Scartata
Emissione no.
2.1
3
Sessione(i)
interessate
Modifica
Titolo
Modificato in titolo generico per
comprendere la filtrazione del
brodo con membrana e la semina
diretta.
Introduzione
Modificata per includere il brodo
di Preston per acque sporche
Specificata la definizione del
brodo di Bolton e di Preston.
Segnalato la possibilità di utilizzo
del metodo MPN.
Definizione
Riveduta per le specie
Campylobacter
Principio
Modificato per includere
procedure su acque pulite e
sporche
Considerazioni
sulla sicurezza
Riformulate e rivedute.
Attrezzatura
Aggiornata
Terreni di coltura e
reagenti
Modificati
Procedura sul
campione
Modificata per fornire procedure
di filtrazione su membrana e
semina diretta.
Rimosso metodo alternativo per
prova ossidasi
Refertazione
Modificata
Controllo di qualità
Riveduto e modificato per
rimuovere controllo negativo.
Strutture di
Riferimento
Aggiornate
Ringraziamenti e
contatti
Aggiunti
Diagramma di
flusso
Aggiornato
Bibliografia
Aggiornata
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 4 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER
NELL’ACQUA
SCOPO DEL DOCUMENTO
Il presente metodo fornisce indicazioni per la ricerca delle specie termotolleranti di Campylobacter in tutti i
tipi di acqua.
INTRODUZIONE
Generalità
L’acqua rappresenta un potenziale serbatoio di campilobatteri ed è un noto veicolo di trasmissione di questi
microrganismi per l’uomo e gli animali domestici. Le epidemie di enterite di origine idrica da Campylobacter
sono state segnalate in numerosi Paesi2. Le forniture di acqua potabile possono contaminarsi con
campilobatteri, ma le acque naturali, inclusi i fiumi e quelle costiere utilizzate per fini ricreazionali, possono
rappresentare un rischio potenziale. I campilobatteri sono la causa più frequente di gastroenterite e pertanto
può essere necessario esaminare campioni idrici per ricerche epidemiologiche o come parte dei programmi di
sorveglianza dell’autorità locale.
Questo metodo è basato su quello descritto nel documento della Microbiology of Drinking Water 20023 ed
ISO/DIS 17995 – Water Quality – Detection and enumeration of thermotolerant Campylobacter species4. Sono
descritte le procedure di arricchimento con brodo Bolton e Preston in quanto gli studi condotti presso la HPA
London Food Water and Environmental Laboratory hanno dimostrato che il brodo Bolton consente
l’isolamento delle specie Campylobacter dalle acque pulite e quello Preston, maggiormente selettivo, da quelle
sporche.
Nota informativa 1: I supplementi selettivi usati in questi terreni sono stati modificati da alcuni fornitori
commerciali sostituendo la cicloeximide con amfotericina, rinominandoli come “Modificati”. Il principio dei brodi
di arricchimento non è comunque stato modificato e la dizione originale di “Brodo Bolton” e “Brodo Preston “ è
stata mantenuta in questa POS. La definizione “Brodo Preston modificato” è pure utilizzata per questo brodo
al quale è stato aggiunto cefoperazone, noto anche come brodo Exeter. La formulazione del brodo Exeter con
cefoperazone non è utilizzata in questo metodo.
Nota informativa 2: Questo metodo può essere utilizzato per ottenere risultati semi-quantitativi con semine di
volumi multipli. La ISO 8199:2005 raccomanda l’utilizzo contemporaneo di cinque o più provette (volumi di
100mL)5.
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 5 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
1
DEFINIZIONI
Nel contesto di questo metodo si applicano le seguenti definizioni:
Specie Campilobacter
Includono C. jejuni, C. coli e C. lari. Questi microrganismi crescono in condizioni microaerobiche a
41.5°C, sviluppano tipiche colonie su terreni selettivi solidi, presentano caratteristiche biochimiche,
morfologiche e fisiologiche specifiche sui terreni selettivi solidi quando le prove sono eseguite secondo
le indicazioni di questo metodo.
Ricerca di specie Campylobacter
Rilievo della presenza od assenza di questi microrganismi in un litro o in altro volume specificato, se le
prove sono eseguite secondo le indicazioni di questo metodo.
2
PRINCIPIO
Il rilievo della presenza o assenza delle specie Campylobacter nei campioni idrici può utilizzare due
procedure di arricchimento: filtrazione su membrane e semina diretta, come di seguito specificato:
a) Acque pulite – il campione è sottoposto a filtrazione su membrana (almeno 1 litro di campione
secondo il MNS W1 General technique for the detection and enumeration of bacteria by negative
pressure membrane filtration) e semina diretta. Aggiungere un volume di acqua a nove volumi di brodo
Bolton. Incubare il brodo a 37°C per 48 ore.
b) Acque sporche (elevate concentrazione di flora, ad esempio acque di fiume) – il campione è
analizzato solo con semina diretta. Aggiungere un volume di acqua a nove volumi di brodo Preston.
Incubare il brodo a 37°C per 24 ore e poi a 41,5°C per altre 24 ore.
Seminare le colture di arricchimento su agar sangue privo di sostanze selettive, incubare in
microaerofilia a 41,5 °C per 48 ore e ricercare le caratteristiche colonie. Confermare quelle sospette per
specie Campylobacter con prove biochimiche, caratteristiche morfologiche e fisiologiche.
NB: La semina diretta può essere utilizzata con il metodo del MPN.
CONSIDERAZIONI SULLA SICUREZZA6-15
3
Adottare le normali precauzioni del laboratorio di microbiologia.
3.1
TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
N/D
3.2
PROCEDURA SUL CAMPIONE
Alcune specie Campylobacter sono patogene per l’uomo e pertanto il loro isolamento ed identificazione
devono essere eseguiti da personale esperto in un laboratorio adeguatamente attrezzato e sotto la
supervisione di un microbiologo qualificato. Deve essere posta attenzione durante lo smaltimento e la
sterilizzazione di tutti i materiali di prova. Le procedure che prevedono sottocolture dei brodi di prearricchimento e di arricchimento e la manipolazione delle colture delle specie Campylobacter devono
essere eseguite in un’area dedicata del laboratorio.
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 6 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
4
ATTREZZATURA
Normale attrezzatura di laboratorio ed aggiungere:
x
Giare con atmosfera modificata e confezioni per sviluppo di gas per condizioni microaerobiche
(circa 10% di anidride carbonica e 5–7% di ossigeno) o equivalenti, quali cabine con atmosfera
modificata
x
Termostati: 37°C ± 1°C
41.5°C ± 1°C
Termostati a ciclo 37°C / 41.5°C (opzionale)
x
Microscopio: contrasto di fase (opzionale)
Illuminazione campo oscuro (opzionale)
luce (opzionale)
5
x
Filtri di estere di cellulosa, 47 mm, pori da 0.2 µm
x
Contenitori sterili con tappo a vite (volume 100 mL)
x
Apparato di filtrazione su membrana per acque pulite (come specificato nel: NSM – W1 – General
technique for the detection and enumeration of bacteria by negative pressure membrane filtration)
TERRENI DI COLTURA
Si possono usare terreni commerciali disidratati equivalenti; seguire le indicazioni del produttore.
Brodi di arricchimento per Campylobacter
Brodo Bolton (utilizzare supplemento brodo selettivo modificato Oxoid No. SR0208E)
Nota: possono essere usati supplementi di altri produttori verificando la loro formulazione.
Digerito enzimatico di tessuto
animale
Idrolisato di lattoalbumina
Estratto di lievito
Cloruro di sodio
Acido alfa-chetoglutarico
Piruvato di sodio
Metasolfito di sodio
Carbonato di sodio
Emina
Cefoperazone
Vancomicina
Trimetoprim
Amfotericina B
o Cicloexamide
Sangue lisato
Acqua
pH 7.4 ± 0.2 a 25°C
10.0 g
5.0 g
5.0 g
5.0 g
1.0
0.5 g
0.5 g
0.6 g
0.01 g
20 mg
20 mg
20 mg
10 mg
50 mL
1L
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 7 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
Brodo Preston (utilizzare supplemento brodo selettivo modificato Oxoid No. SR0204E)
Brodo nutriente No. 2
Lisato di sangue di cavallo
Solfato ferrico
Metasolfito di sodio
Piruvato di sodio
Trimetoprim
Polimixina B
Rifampicina
Amfotericina B
Acqua
pH 7.0 ± 0.2 a 25°C
25.0 g
50 mL
0.25 g
0.25 g
0.25 g
10 mg
5000 UI
10 mg
10 mg
1L
Agar selettivo per Campylobacter (modificato Cefoperazone Carbone Desossicolato Agar
(mCCDA) o equivalente)
Digerito enzimatico di tessuto
animale
Estratto di carne
Cloruro di sodio
Carbone batteriologico
Idrolisato di caseina
Desossicolato di sodio
Solfato ferroso
Piruvato di sodio
Cefoperazone
Amfotericina B
Agar
Acqua
pH 7.4 ± 0.2 a 25°C
10.0 g
10.0 g
5.0 g
4.0 g
3.0 g
1.0 g
0.25 g
0.25 g
32 mg
10 mg
12.0 g
1L
Agar sangue
Agar Columbia o qualsiasi altra base idonea con 5% di sangue di cavallo
Infuso brodo cuore cervello
Infuso disidratato di cervello di vitello
Infuso disidratato di cuore di bue
Peptone della proteosi
Glucosio
Cloruro di sodio
Fosfato acido disodico
Acqua
pH 7.4 r0.2 a 25°C
12.5 g
5.0 g
10.0 g
2.0 g
5.0 g
2.5 g
1L
Reagente per ossidasi (Preparazione recente come richiesto o utilizzo di un equivalente commerciale)
Tetrametil-p-fenilendiamina cloridrato
Acqua
0.1 g
10 mL
Reagenti per colorazione Gram (opzionale)
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 8 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
Confezione lattice per agglutinazione Campylobacter
6
PROCEDURA SUL CAMPIONE
6.1
PREPARAZIONE E DILUIZIONI DEL CAMPIONE
I campioni idrici devono essere ricevuti e manipolati secondo le indicazioni descritte nel MNS W1
Sezione 5. All’arrivo devono essere registrate la tipologia della richiesta e le condizioni del campione. I
campioni devono essere protetti dall’esposizione alla luce diretta e trasportati a temperatura ambiente in
contenitore isolato. I campioni devono essere analizzati il più presto possibile nel giorno del prelievo. In
circostanze eccezionali, in caso di ritardo, la conservazione non deve protrarsi oltre le 24 ore prima
dell’inizio delle analisi.
6.1.1
ACQUE PULITE
Portare il brodo di arricchimento per Campylobacter a temperatura ambiente per entrambi i seguenti
metodi.
Filtrare una quota dei campioni di acque pulite con membrana filtrante da 0.2µm e seminare un secondo
volume direttamente in brodo Bolton.
a) membrana di filtrazione – filtrare almeno 1 litro di acqua con membrana filtrante secondo le
procedure descritte nel MNS 1 Sezione 6. Trasferire il filtro/i in 90 mL di brodo Bolton. Se richiesto,
aggiungere altro brodo per non lasciare più di 20 mm di spazio aereo nella parte superiore, richiudere
saldamente.
b) semina diretta – seminare il campione di acqua in brodo Bolton. Aggiungere 10 mL di acqua a 90 mL
di brodo d’arricchimento (o più replicati se richiesto il MPN) lasciando non più di 20 mm di spazio aereo
nella parte superiore, richiudere saldamente.
6.1.2
ACQUE SPORCHE
Acque sporche (flora a concentrazione basale elevata, ad esempio acque di fiume) – seminare
direttamente il campione di acqua in brodo Preston. Aggiungere 10 mL di acqua a 90 mL di brodo di
arricchimento (o preparare più replicati se è richiesto il MPN) lasciando non più di 20 mm di spazio
aereo nella parte superiore, richiudere saldamente. Il metodo di filtrazione su membrana non può essere
eseguito su acque sporche.
6.2
ARRICCHIMENTO SELETTIVO
Brodo Bolton (per acqua pulita)
Miscelare in modo adeguato il brodo seminato ed inserirlo in termostato a 37°C ± 1°C per 44 ± 4 ore.
Brodo Preston (per acqua sporca)
Miscelare in modo adeguato il brodo seminato ed inserirlo in termostato a 37°C ± 1°C per 22 ± 2 ore, poi
a 41.5°C ± 1°C per altre 22 ± 2 ore.
6.3
SUB-CULTURE IN AGAR SELETTIVO
Eseguire sottocoltura da brodo su mCCDA. Incubare le piastre in termostato a 41.5°C per 44 ± 4 ore in
condizioni di microaerobiche (80% N2, 10% H2 ,10% CO2).
Nota: se richiesto, come in corso di epidemia, le piastre possono essere controllate dopo 18 - 24 ore ed,
in assenza di crescita, incubate di nuovo.
6.4
IDENTIFICAZIONE DELLE COLONIE
Esaminare le piastre al termine dell’incubazione per la ricerca di colonie di Campylobacter che
presentano caratteristiche tipiche. C. jejuni e C. lari formano colonie appiattite, brillanti, espanse, con
tendenza a diffondere lungo la linea di semina. Le colonie ben isolate assomigliano a gocce di liquido.
Su agar umido si può formare una sottile pellicola che diffonde. Le colonie incubate a lungo diventano
basse e convesse con superficie opaca. Può eventualmente comparire lucentezza metallica. C. coli
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 9 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
diffonde meno, spesso le colonie sono convesse con superficie di solito brillante La morfologia è
variabile e le colonie sulla stessa piastra possono presentare aspetto diverso.
Nota: All’aria le colture si deteriorano rapidamente; le piastre devono essere esaminate subito dopo la
loro rimozione dall’ambiente microaerobico e le successive prove sulle colonie sospette devono essere
eseguite subito dopo la lettura delle piastre.
6.5
PROVE DI CONFERMA
Ossidasi
Inumidire un pezzo di carta da filtro inserito in una piastra di Petri con 2 – 3 gocce di reagente
dell’ossidasi di preparazione recente o con reattivo equivalente. Utilizzando un bastoncino di legno,
vetro o ansa di platino/plastica, (non nichelcromo) trasferire una colonia del microrganismo ricercato
sulla carta da filtro e strofinarla sull’area inumidita. La reazione positiva è indicata dalla comparsa di un
colore porpora scuro entro 10 secondi. L’assenza di cambiamento del colore o sviluppo ritardato del
color porpora indicano reazioni negative.
Nota: Le colonie ossidasi negative non richiedono ulteriori accertamenti.
Le colonie di Campylobacter sono ossidasi positive.
Sviluppo microaerobico
Eseguire sottocolture delle colonie sospette dall’agar selettivo Campylobacter su due piastre di agar
sangue. Incubarne una in microaerobiosi e l’altra in aerobiosi in termostato a 41.5°C ± 1°C per 22 ± 2
ore.
Le specie Campylobacter crescono in condizione microaerobiche, ma non in quelle aerobiche.
Morfologia cellulare e motilità
Subito dopo la rimozione dalle condizioni microaerobiche, prepararee una sospensione in fase liquida
emulsionando alcune colonie sospette in una goccia di brodo infuso cuore cervello posto su vetrino,
coprire con coprioggetto. Osservare immediatamente al microscopio con contrasto di fase o campo
scuro; prendere le opportune precauzioni per evitare la propria contaminazione e quella del microscopio.
Le specie Campylobacter sono bastoncini molto mobili, sottili, spiraliformi. La motilità è caratterizzata da
movimenti rapidi o a cavatappi. Registrare la morfologia ed i risultati della motilità.
Nota: La motilità può anche essere determinata con il metodo della goccia pendente e microscopio a
luce normale16.
Un isolato ossidasi positivo, che si sviluppa in condizioni microaerobiche, ma non in condizioni
aerobiche, con aspetto di bastoncino sottile, ricurvo o spiraliforme e dotato della caratteristica motilità è
confermato come specie Campylobacter e come tale è refertato.
Colorazione Gram
Eseguire la colorazione Gram se la morfologia cellulare non può essere determinata con la prova della
motilità. Le colture recenti sono costituite da piccoli bacilli ricurvi Gram negativi, che in quelle meno
recenti assumono forma coccoide.
Oltre alle prove descritte in precedenza può essere eseguita quelle di seguito specificata.
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 10 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
Prova di agglutinazione con Lattice (opzionale)
Verificare che la confezione rilevi i ceppi di C. jejuni, C. coli e C. lari.
Eseguire la prova di agglutinazione con lattice per Campylobacter secondo le indicazioni del produttore.
I ceppi di Campylobacter evidenziano risultato positivo.
Nota: Per motivi di sicurezza e di prevenzione della contaminazione crociata, evitare l’utilizzo di anse
convenzionali lunghe. Utilizzare dispositivi presenti nella confezione o di misure contenute.
7
CALCOLO DEI RISULTATI
Se si utilizza il metodo MPN seguire le procedure descritte nel National Standard Method: W 1 Section
717; calcolare il numero confermato di specie Campylobacter presenti in un determinato volume del
campione originale.
8
REFERTAZIONE
Refertare i risultati secondo la procedura descritta nel Metodo Nazionale Standard: W 1 Section 9.
Se non sono isolate specie Campylobacter refertare nel modo seguente:
‘Non rilevate specie Campylobacter in v di acqua’
ove v è il volume specificato
Se sono isolate specie Campylobacter refertare nel modo seguente:
‘Rilevate specie Campylobacter in v di acqua’
ove v è il volume specificato
‘Segue successiva identificazione’.
9
CONTROLLO DI QUALITA’
9.1
MEMBRANA DI
FILTRAZIONE
Eseguire il controllo di qualità interno con sospensioni di microrganismi noti positivi e negativi con
concentrazione inferiore a 100 unità formanti colonia nel volume filtrato.
Controllo positivo
Preparare una sospensione diluita di C. jejuni NCTC 11322
Bianco di controllo
Filtrare 1 L di acqua distillata sterile utilizzando lo stesso imbuto del controllo positivo dopo
disinfezione
Incubare tutte le prove ed eseguire tutte le procedure contemporaneamente a quelle dei campioni
di routine.
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 11 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
9.2
PROVE DI CONFERMA
Morfologia, motilità e crescita microaerobica
Utilizzare C. jejuni per controllare le caratteristiche relative all’aspetto delle colonie, motilità, morfologia
microscopica e sviluppo microaerobico.
Prova Oxidase
P. aeruginosa NCTC 10662
E. coli NCTC 9001
+ (Porpora)
- (Incolore)
10 STRUTTURE DI RIFERIMENTO
In alcune circostanze, come durante un’epidemia o indagini a carattere nazionale, può essere
necessario eseguire ulteriori ricerche. Sono disponibili Strutture di Riferimento per la biotipizzazione,
sierotipizzazione e tipizzazione fagica presso il Laboratory of Enteric Pathogens, Centre for Infections,
Health Protection Agency, 61 Colindale Avenue, London, NW9 5EQ. Gli isolati devono essere inviati
solo dopo colloquio ed accordo con il laboratorio di riferimento.
Selezionare due colonie dalla coltura diretta per verificare la loro purezza. La loro crescita recente,
sviluppata sulla superficie di ciascuna delle due piastre per la verifica della purezza, è inviato con un
tampone inserito nel terreno di trasporto Amies carbone.
Centro per le Infezioni: tel: 0208 200 4400 or 0870 084 2000
N/D
11 RINGRAZIAMENTI E CONTATTI
Questi Metodi Nazionali Standard sono stati iniziati e sviluppati, riveduti e revisionati dal Water
Working Group for Standard Methods (http://www.hpa.-standardmethods.org.uk/wg_water.asp). Si
ringraziano le numerose persone appartenenti a laboratori di microbiologia Alimentare, Idrica ed
Ambientale, a laboratori di riferimento ed organizzazioni specialistiche che hanno fornito
informazioni e commenti nel corso della preparazione di questo documento.
I Metodi Nazionali Standard sono emessi dalla Standards Unit, Evaluations and Standards
Laboratory, Centre for Infections, Health Protection Agency London.
Per ulteriori informazioni contattare:
Standards Unit
Evaluations and Standards Laboratory
Centre for Infections
Health Protection Agency
Colindale
London
NW9 5EQ
E-mail: [email protected]
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL’ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 12 di 14
Riferimento W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
ALLEGATO: DIAGRAMMA DI FLUSSO PER RICERCA
DI SPECIE CAMPYLOBACTER CON MEMBRANE DI
FILTRAZIONE
Trasportare in laboratorio in contenitore idoneo a temperatura ambiente senza esporre alla luce solare diretta
Ø
Esaminare i campioni il più presto possibile nel giorno del prelievo
Ø
miscelare in modo accurato
Ø
Ø
Acque pulite: Membrana di filtrazione
Acque pulite: Semina diretta
Trasferire il filtro/i in 90 mL di brodo
Bolton
Ø
Acque sporche: Semina diretta
Aggiungere 10 mL di acqua a 90 mL Aggiungere 10 mL di acqua a 90 mL
di brodo Bolton
di brodo Preston
Ø
Ø
Ø
37qC r 1qC per 44 r 4ore
37qC r 1qC per 44 r 4 ore
Incubare a 37°C r 1°C per 22
r 2 ore, poi a 41.5°C r 1°C per
altre 22 r 2 ore
Ø
Sottocoltura del brodo(i) su agar selettivo per Campylobacter
Ø
Incubazione microaerobica a 41.5°C per 44 ± 4 ore
Ø
Identificare le colonie di Campylobacter con prove per produzione di ossidasi,
presenza di crescita microaerobica e non in atmosfera aerobica, morfologia cellulare e motilità. Se richiesta,
confarma successiva con prova di agglutinazione all lattice
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL'ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 13 di 14
Riferimento no: W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]
BIBLIOGRAFIA
1. Department of Health NHS Executive: The Caldicott Committee. Report on the review of patientidentifiable information. London. December 1997.
2. Bolton FJ, Coates D, Hutchinson DN, Godfree AF. A study of thermophilic campylobacters in a
river system. J Appl Bacteriol 1987;62:167-76.
3. Standing Committee of Analysts. Environment Agency. The Microbiology of Drinking Water (2002).
Methods for the Examination of Waters and Associated Materials - Part 10: Methods for the
isolation of Yersinia, Vibrio and Campylobacter by selective enrichment. London.
http://www.environmentagency.gov.uk/commondata/acrobat/mdwpart10.pdf#search='the%20microbiology%20of%20drinki
ng%20water%20%20part%2010'. p. 1-32.
4. ISO 17995:2005 Water quality - Detection and enumeration of thermotolerant Campylobacter
species. International Organization for Standardization; 2005.
5.
BS ISO 8199:2005 Water quality - General guidance on the enumeration of micro-organisms by
culture. International Organisation for Standardisation; 2005.
6. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. 2004 Approved List of Biological Agents.
http://www.hse.gov.uk/pubns/misc208.pdf. p. 1-17.
7. Public Health Laboratory Service Standing Advisory Committee on Laboratory Safety. Safety
Precautions: Notes for Guidance. 4th ed. London: Public Health Laboratory Service (PHLS); 1993.
8. Control of Substances Hazardous to Health Regulations 2002. General COSHH. Approved Code
of Practice and Guidance, L5. Suffolk: HSE Books; 2002.
9. Health and Safety Executive. 5 steps to risk assessment: a step by step guide to a safer and
healthier workplace, IND (G) 163 (REVL). Suffolk: HSE Books; 2002.
10. Health and Safety Executive. A guide to risk assessment requirements: common provisions in
health and safety law, IND (G) 218 (L). Suffolk: HSE Books; 2002.
11. NHS Estates. Health Building Note 15. Facilities for pathology services. 2nd ed. London: The
Stationary Office; 2005.
12. BS EN 12469: 2000. Biotechnology - performance criteria for microbiological safety cabinets.
London: British Standards Institution (BSI); 2000.
13. BS 5726: 1992. Microbiological safety cabinets. Part 2. Recommendations for information to be
exchanged between purchaser, vendor and installer and recommendations for installation.
London: British Standards Institution (BSI); 1992.
14. BS 5726: 1992. Microbiological safety cabinets. Part 4. Recommendations for selection, use and
maintenance. London: British Standards Institution (BSI); 1992.
15. Advisory Committee on Dangerous Pathogens. The management, design and operation of
microbiological containment laboratories. Suffolk: HSE Books; 2001.
16. National Standard Method BSOP TP21 - Motility test. Health Protection Agency; 2005.
17. National Standard Method W 1 - General technique for the detection of bacteria by membrane
filtration. London: Health Protection Agency; 2007.
RICERCA DI SPECIE CAMPYLOBACTER NELL'ACQUA
Revisione no: 3 Data di revisione 24.10.07 Emesso da: Standard Unit, Evaluations & Standards Laboratory in collaborazione con il
Regional Food, Water and Environmental Coordinators Forum
Pagina 14 di 14
Riferimento no: W 8i3
Questa POS deve essere usata congiuntamente con le altre POS emesse dalla Health Protection Agency
www.evaluations-standards.org.uk
Email: [email protected]