Genetica dei Procarioti - 3 - Dipartimento di Scienze della vita

19/03/2015
A.A. 2014-15
Dipartimento di Scienze della Vita
CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
Variabilità genetica nei batteri
Genetica dei Procarioti - 3
le due cellule figlie sono geneticamente identiche tra loro e alla cellula madre
Prof. Laura Marri
ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail
Variabilità genetica nei batteri
Come si definisce una mutazione?
un cambiamento ereditario nella sequenza delle basi nel
genoma di un organismo
Nella maggioranza dei casi le mutazioni sono deleterie…..
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Variabilità genetica nei batteri
Frequenza di mutazione
La frequenza con cui avvengono
i diversi tipi
di
mutazioni è
estremamente variabile.
…..ma in qualche caso possono conferire un vantaggio!
Come si originano le mutazioni?
Nobel Prize, 1969
Max Delbruck (1906 -1981) & Salvador Luria (1912 - 1991)
Cold Spring Harbor Laboratory, Long Island NY, Summer 1953
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L’esperimento di Salvador Luria e Max Delbruck
test di fluttuazione (1943)
coltura pura di Escherichia coli
sensibile al fago T1
colonie di E. coli
resistenti al fago
(lamarckiana)
(darwiniana)
Mutazione "tardiva": pochi batteri resistenti
Mutazione "precoce": molti batteri resistenti
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Basi molecolari delle mutazioni
Conclusione:
Mutazioni puntiformi
 Batteri sensibili al fago diventano resistenti prima di
entrare in contatto con il virus.
 Il numero di mutanti dipende dal momento in cui si
verifica ciascun evento di mutazione (e dal numero di
eventi) in ciascuna coltura.
Il cambiamento del fenotipo dipende dal punto esatto in cui la
mutazione è situata nel gene e da quale prodotto è normalmente
codificato dal gene.
 L’esposizione al virus non induce l’insorgenza della
mutazione.
 L’esposizione al virus seleziona mutanti preesistenti
Mutazioni per sostituzione di base
TRANSIZIONI:
TRASVERSIONI:
G
purina
purina
pirimidina
pirimidina
purina
pirimidina
G
T
G
C
A
T
A
C
A
C
T
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Basi molecolari delle mutazioni
The Expression of Mutations
• Base substitution (point
mutation)
• Missense mutation
Mutazioni puntiformi
• Change in one base
• Result in change in amino
acid
possono risultare per sostituzione di una base nel DNA
o per inserzione e delezione di una base (microinserzioni e
microdelezioni).
The Expression of Mutations
• Nonsense mutation
• Results in a nonsense
codon
The Expression of Mutations
• Frameshift mutation
• Insertion or deletion of
one or more nucleotide
pairs
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Basi molecolari delle mutazioni
Reversione
Mutazioni che coinvolgono molte paia di basi
Le inserzioni si verificano per aggiunta di nuove basi al DNA e
inattivano il gene in cui accadono. Molte mutazioni da inserzione
sono dovute a sequenze di DNA specifiche, lunghe 700-1400 bp,
dette sequenze di inserzione. Le mutazioni da inserzione possono
regredire per reversione.
Le delezioni possono coinvolgere la perdita di centinaia o
migliaia di paia di basi; non regrediscono per reversione se non
per ricombinazione
Agenti alchilanti
Le mutazioni possono essere:
Spontanee
Nitrosoguanidina, Acido nitroso, Idrossilamina sono
responsabili di reazioni di metilazione, deaminazione, ecc.
Indotte da mutageni
(frequenza molto bassa)
Mutageni chimici
 analoghi delle basi
 agenti alchilanti
 agenti intercalanti
Mutageni fisici
NTG
Radiazioni non ionizzanti:UV
Radiazioni ionizzanti:
raggi gamma
raggi X
raggi cosmici
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Radiazioni non ionizzanti: raggi UV
Agenti intercalanti
Acridine (arancio di acridina, bromuro di etidio): sono molecole
planari che si inseriscono tra due basi del DNA, separandole
formazione di dimeri di pirimidine (due C o T adiacenti sono legate
covalentemente tra loro).
Questa conformazione anormale può portare a microinserzioni
e microdelezioni durante la replicazione
Radiazioni ionizzanti
SOS mutagenesis
DNA replication fidelity in Escherichia coli
Sono radiazioni a lunghezza d’onda corta (raggi X, gamma,
raggi cosmici). Più potenti dei raggi UV e altamente penetranti.
Causano la ionizzazione dell’acqua e di altre sostanze con la
produzione di radicali liberi come lo ione ossidrile (OH-)
La loro azione mutagena è indiretta in quanto il danno è
prodotto dai radicali liberi.
TLS: translesion synthesis
FEMS Microbiology Reviews
Volume 36, Issue 6, pages 1105-1121, 5 APR 2012 DOI: 10.1111/j.1574-6976.2012.00338.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6976.2012.00338.x/full#fmr338-fig-0003
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Nomenclatura genetica batterica
Nomenclatura genetica batterica
wild-type strain phenotypically Arg+
mutant incapable of synthesizing arginine: phenotype will be Argand genotype arg.
arginine biosynthesis, for example, requires more than one gene.
In such cases, a fourth letter is added to the gene symbol, each
identifying a different gene: argA, argB,argC, etc.
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lacZ
LaclacY
Lac-
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Genotype
+ IPTG
lacI
Lac+
wild type
lacZ
lacP
lacO
lacI
+
+
+
Phenotype (Lac)
- IPTG
+
+
Tipi di mutanti batterici
MORFOLOGIA
delle colonie (forma , colore)
CAPACITÀ/INCAPACITÀ DI CRESCERE
delle cellule
In particolari condizioni ambientali
(temperatura, luce, terreno)
ALTRE PROPRIETÀ
motilità
patogenicità, …..
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Altri tipi di mutazioni
Mutanti condizionali: esprimono la mutazione
solamente sotto particolari condizioni ambientali
Mutazioni “neutre”
gyrA  NalR
rpsL  SmR
In seguito a mutazioni puntiformi rare:
Mutanti letali condizionali
Per Escherichia coli:
tempertura permissiva: 25-30°C
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Detection and Isolation of Mutants
Selection
mutations are generally rare
– one per 107 to 1011 cells
• Positive (direct) selection detects mutant cells
because they grow or appear different
finding mutants requires
sensitive detection methods
• Negative (indirect) selection detects mutant cells
because they do not grow
and/or methods to increase
frequency of mutations
Colture liquide
• 1010cellule/ml
Colonie in Agar
• 107 cellule/colonia
Selezione Diretta di mutanti
mutations : one per 107 to 1011 cells
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Terreni di coltura per Escherichia coli
definito
complesso
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Selezione Indiretta:
Arricchimento con penicillina
Selezione Indiretta:
Arricchimento con penicillina
Selezione Indiretta:
Arricchimento con penicillina
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Selezione Indiretta: Replica Plating
Selezione Indiretta: Replica Plating
Selezione Indiretta: Replica Plating
mutante auxotrofo
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Selezione Indiretta:
Isolamento di Mutanti
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Esther Lederberg in her home in Wisconsin (1958, the
day that the Nobel Prize of Joshua Lederberg was
announced).
Analisi dei mutanti: Crossfeeding
aa
Analisi dei mutanti: Crossfeeding
Esempio di isolamento di mutanti portatori di mutazioni
condizionali letali in geni essenziali.
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F accumulates ORNITHINE used
by E
G accumulates CITRULLINE used
by F & E
F accumulates a diffusible intermediate which is excreted and can be
used by E
G accumulates a diffusible intermediate which excreted and can be used
by F and E
Analisi dei mutanti: Complementation
Complementation tests are used to determine if two
mutations are in the same or different genes
necessary when different mutations in the same pathway yield the
same phenotype
2 mutations on different genes: trans configuration
2 mutations on same gene: cis configuration
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Brook, Biologia dei
microrganismi – 1
Microbiologia generale
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T2, T4 have been enormously useful in genetic studies because:
Viruses of two (or more) different genotypes
can simultaneously infect a single bacterium.
The DNA molecules of one of the
infecting viruses can recombine with
that of another forming recombinant
molecules.
The huge number of viruses
released from a huge number
of bacterial hosts enables even
rare recombination events to
be detected.
Genealogy of E. coli B.
Journal of Molecular Biology, Volume 394, Issue 4, 2009, 634 - 643
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rII mutants cannot complete their life cycle in a strain of E. coli
designated K. Wild-type T4 can.
rII mutants & wild-type T4 can infect and complete their life
cycle in a strain of E. coli designated B.
Phenotypic properties of T4 phage
A
B
r: rapid lysis
The rII protein consists of 2 separate polypetide chains, coded by the rIIA & rIIB
genes respectively
rIIA
rIIB
rII-
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Salmonella typhimurium
A gene as defined by the cis-trans test is called a
cistron and is equivalent to defining a structural gene
as
a
segment
of
DNA that
encodes
a
single
polypeptide chain
Cis-trans test of mutations 1 & 2
complementation occurs
Cis-trans test of mutations 2 & 3
no complementation occurs
mutations are in different genes
mutations are in the same gene
Salmonella typhimurium
1998-Bruce Ames receives the
Medal of Science from President
Clinton.
Ames Test
about 109 his- bacteria, <102 of white
colonies derived from single bacteria
that have undergone spontaneous
reversion mutations to his+.
about 109 his- bacteria, <102 of white
colonies derived from single bacteria
that have undergone spontaneous
reversion mutations to his+.
As it diffuses outward, the chemical
first kills all the bacteria (clear area),
but then at lower concentration is seen
to induce reversion mutations many
revertants (his+) colonies due to its
mutagenic effect.
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T. Zahrt isolated a strain of Salmonella typhimurium that could grow as well as the
wild-type parent on rich medium, but when transferred from rich medium to minimal
medium the strain a very long lag phase compared to the wild-type parent.
wild-type : black squares; other strain: blue triangles.
?
?
Come si potrebbe determinare se la crescita osservata dopo la fase Lag dipende:
Come si potrebbe determinare se la crescita osservata dopo la fase Lag dipende:
a) da una seconda mutazione che consente la crescita in terreno minimo
a) da una seconda mutazione che consente la crescita in terreno minimo
b) da un periodo più lungo di adattamento al terreno minimo
b) da un periodo più lungo di adattamento al terreno minimo
la soluzione sarà discussa la prossima volta
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