Tecniche di biologia

Tecniche di biologia
Negli anni ’70, la scoperta degli enzimi di restrizione,
della trasformazione batterica e dell’elettroforesi su gel
di agarosio ha avviato lo sviluppo della biologia
molecolare e dell’ingegneria genetica
Tecniche di base per l’analisi dei geni:
•restrizione→ tagli specifici sul DNA e riunione di molecole
diverse
•clonaggio molecolare→ studio di singoli geni isolati
•concetto di trasformazione e metodi di trasformazione
•elettroforesi su gel→ analisi ad alta risoluzione del DNA
•blotting ed applicazioni→ rilevamento di sequenze omologhe
•purificazione del DNA
Enzimi per la manipolazione di acidi nucleici
•DNA polimerasi
DNA o RNA-dipendenti
•Ligasi
•Nucleasi
Anni ’70: scoperta degli enzimi di restrizione
→ diventa possibile tagliare il DNA in siti specifici e riunire
molecole di DNA di diversa origine
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi
che riconoscono e tagliano il DNA a livello di
una specifica sequenza nucleotidica.
Il sito riconosciuto è generalmente formato
da una sequenza di 4-8 bp.
Enzimi diversi riconoscono sequenze
nucleotidiche diverse: ogni enzima ha perciò
una sua caratteristica specificità
Gli enzimi di restrizione sono isolati dai
batteri, dove costituiscono un sistema di
difesa naturale che distrugge eventuali
molecole di DNA estraneo e quindi protegge
da infezioni virali.
1978, premio Nobel a W. Arber, D. Nathan &
H. O’Smith, per la scoperta degli enzimi di
restrizione
Esistono 3 classi di enzimi di restrizione; gli enzimi di tipo 2 sono i più usati in
ingegneria genetica: riconoscono brevi sequenze palindromiche (es GGTACC;
GGTNACC) producendo estremità coesive (sticky) o piatte (blunt)
TAGLIO
SIMMETRICO
ASIMMETRICO
La sigla degli enzimi deriva dal nome di genere, specie e ceppo del microorganismo di
origine
Applicazioni degli enzimi di restrizione
1) Mappe di restrizione
2) Creazione di molecole di DNA ricombinante e clonaggio
3) Analisi di RFLP
1) Mappe di restrizione
1)DNA “digerito” con più tipi di
endonucleasi di restrizione,
(digestioni singole e multiple)
2) i frammenti risultanti separati ed
analizzati mediante elettroforesi.
La mappa è
prima forma di
caratterizzazione di una
molecola di DNA
2) Molecole di DNA ricombinante
Le estremità coesive generate dagli enzimi di restrizione sono molto utili per le
tecniche di manipolazione genetica.
DNA di origine diversa sono legati grazie alla complementarità tra le estremità generate
dallo stesso enzima di restrizione; le estremità “sporgenti “ dei frammenti si associano
mediante legami idrogeno; l’enzima “DNA ligasi” salda le estremità, generando una
molecola di DNA chimerica o ricombinante
3) RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
Il polimorfismo genetico consiste in differenze di sequenza a livello di
cromosomi omologhi: differenze nucleotidiche, anche minime, possono
generare o eliminare specifici siti di restrizione.
La digestione di segmenti corrispondenti di cromosomi omologhi
produce differenti quadri di restrizione chiamati “RFLP”.
Wild-type allele
AGATCT
TCTAGA
Restriction site
Mutant allele
AGAGCT
TCTCGA
Not a restriction
site
Gli RFLP sono marcatori utili per
- rilevare differenze tra genomi (studi filogenetici e di popolazione)
- diagnosi di malattie ereditarie.
Un particolare RFLP può essere associato alla forma “difettosa” di un gene, tanto da
caratterizzare gli individui affetti dalla patologia.
Attualmente, gli RFLP sono usati nella diagnosi di malattie con base genetica (fibrosi
cistica, distrofia muscolare di Duchenne, fenilchetonuria, emofilia, etc.).
Allele I
Allele II
Analisi su gel
w
Taglio
C
C
G
G
G
G
C
C
z
A
C
G
G
T
G
C
C
1
–
Frammenti
più lunghi
z
x
Taglio
y
2
C
C
G
G
G
G
C
C
x
Taglio C G
y
C G
G C
G C
w
DNA prelevato dai cromosomi
Frammenti
più corti
+
y
y
Esempio di esame diagnostico basato su un polimorfismo genetico.
0.2 kb
1.2 kb
introne
Gene per la β-globina
Mst II
(mancante in HbS)
Tipo di
emoglobina
Sequenza amminoacidica e
nucleotidica nel gene per la
β-globina
A
-Pro- Glu - Glu
CCT-GAG-GAG
Sito per MstII
S
-Pro- Val - Glu
CCT-GTG-GAG
Sito non riconosciuto da
MstII
Elettroforesi dei prodotti di restrizione
A
S
A/S
1.4 kb
1.2 kb
0.2 kb
Il cambiamento di una sola base (A®T), nel gene per la β-globina, determina una
sostituzione amminoacidica nella proteina codificata (Glu®Val), che altera le proprietà
strutturali dell’emoglobina, generando l’anemia falciforme.
Il cambiamento nucleotidico, rispetto alla sequenza wild type, comporta la perdita del sito riconosciuto
dall’enzima MstII. Questo polimorfismo ha un’utilità diagnostica e può essere rilevato analizzando il
pattern di restrizione ottenuto trattando la regione genomica, precedentemente amplificata per PCR, con
l’enzima MstII: nel genotipo omozigote wild type, la digestione produrrà due frammenti (A), nel mutato un
unico frammento (S), nell’eterozigote portatore tre frammenti (A/S).
Genotipizzazione mediante analisi RFLP
L’analisi di RFLP di regioni genomiche con ripetizioni tandem (microsatelliti)
fornisce l’impronta genetica e permette di risalire a parentele
DNA-Finger print
Analisi di restrizione di zone di DNA
genomico “polimorfiche” à applicazioni
forensi
1. PCR della regione polimorfica o
digestione diretta del DNA genomico
estratto
2. Separazione frammenti
3. Evidenziazione dei frammenti con
sonde marcate
Clonaggio molecolare
Il clonaggio molecolare consente l’amplificazione e lo studio di uno specifico
frammento di DNA sfruttando un sistema cellulare
Il segmento di DNA di interesse viene inserito in una molecola di DNA in grado di
replicarsi autonomamente (: un cosiddetto veicolo o “vettore”). Il risultante vettore
chimerico (“DNA ricombinante”) è introdotto in un organismo ospite, in genere un
batterio, che viene fatto riprodurre in modo da generare una popolazione numerosa: tutti i
membri della popolazione conterranno molte copie del DNA ricombinante, ottenendo così
quantità elevate del DNA di interesse, inserito inizialmente.
Schema di clonaggio molecolare
1 Si isola il DNA da due fonti diverse
2 Si tagliano
entrambi i DNA
Cellula umana
E.coli
con un enzima di
restrizione
Plasmide
DNA
Gene V
Estremità coesive
3 Si mescolano le molecole di DNA che si
uniscono mediante
appaiamento di basi azotate
4Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con
legami covalenti
Plasmide con
DNA ricombinante
Gene V
5 Si inserisce il plasmide in un batterio tramite
trasformazione
Batterio
ricombinante
6 Si clona il batterio
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
1) isolamento e preparazione del
DNA da clonare (es tagliando
con opportuni enzimi di
restrizione)
2) scelta e preparazione del vettore
3) ligazione: il frammento è inserito
nel vettore, ad es. un plasmide
batterico
4) i vettori ricombinanti sono
introdotti mediante
trasformazione nel
microorganismo ospite
5) riproduzione del clone
trasformato e conseguente
amplificazione del numero di
copie del DNA di interesse
6) analisi del DNA clonato (es
mediante sequenziamento)
Come si fa ad introdurre DNA estraneo in una cellula
ospite?
•Il DNA è una molecola carica che attraversa difficilmente parete e
membrane cellulari→ metodi di trasformazione
•Una volta entrato, affinchè sia mantenuto nell’ospite e trasmesso
alle successive generazioni, il DNA esogeno deve essere integrato
in un’unità di replicazione funzionante→ vettore di clonaggio
•La trasformazione ha un’efficienza <100%: è necessario poter
distinguere le cellule trasformate da quelle non trasformate →
marcatori di selezione.
TRASFORMAZIONE
La trasformazione consiste nel trasferimento di DNA esogeno all’interno di una
cellula ospite.
Sono state sviluppate diverse tecniche che permettono di trasformare cellule
sia batteriche che eucariotiche, incluse di mammifero.
-a)Trattamento con una combinazione di cationi bivalenti e successivo shock termico.
-b) Elettroporazione
-c) Gene gun
-Infezione con virus i cui genomi sono stati modificati in modo da contenere il DNA esogeno
(metodo usato per eucarioti e batteri).
- Microiniezione (cellule di mammifero).
L’ospite per il clonaggio varia secondo le esigenze
E. coli
B. subtilis
S. cerevisiae
Si prepara un terreno di coltura selettivo
in cui solo i batteri/microorganismi
trasformati sono in grado di crescere
Condizioni di sterilità
Incubazione delle piastre alla T ottimale
per la crescita del microorganismo
ELETTROFORESI SU GEL
L’elettroforesi su gel consente di separare ed analizzare molecole di DNA di
dimensioni diverse.
Molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, possono essere separate mediante
elettroforesi: migrazione in un campo elettrico. Essendo cariche negativamente, le molecole
di DNA migrano verso il polo positivo.
In una matrice porosa la velocità di migrazione del DNA è inversamente proporzionale al
LOG10 della sua lunghezza.
Al termine dell’elettroforesi, DNA di lunghezza diversa sono risolti in bande distinte.
Fasi di preparazione di un gel per elettroforesi
1
2
4
5
7
8
3
6
9
Dopo la “corsa”, il gel è posto su una lampada di luce UV per
visualizzare il pattern di migrazione del DNA
In un gel di elettroforesi, il DNA si può
visualizzare con coloranti fluorescenti,
come il bromuro di etidio, un potente
agente intercalante del DNA.
Il bromuro di etidio emette una luce
rosa-arancio quando è intercalato nel
DNA e sottoposto a radiazione UV
All’interno del gel la velocità di migrazione del DNA è influenzata
dalla dimensione della molecola e dallo stato strutturale
Su gel di agarosio analisi di DNA e RNA
Applicazioni della gel elettroforesi:
indagine sui tratti morfologici tipici dell’apoptosi
Schwartz & Cantor, 1984
La gel-elettroforesi in campo pulsato (PFGE) permette di separare
molecole di DNA molto lunghe, fino a 10000Kb (10Mb)
•Matrice di agarosio
•La direzione del campo elettrico è invertita di 180° (FIGE)
o variata con contorno bloccato (CHEF) a intervalli di tempo definiti (0,5-2 min)
•Consente analisi di cromosomi interi
Tecniche di ibridazione
Southern, 1975
Southern Blotting permette individuare frammenti di DNA specifici in una popolazione
eterogenea
si basa su:1) la produzione di una replica del gel su membrana;
2) la complementarità tra DNA “sonda”e DNA fissato su membrana
La sonda è un segmento di DNAss marcato
Sonda radioattiva
(DNA)
DNA a filamento singolo
Durante la fase di ibridazione riconosce e
lega il DNA bersaglio presente sulla
membrana
Mediante l’appaiamento
delle basi azotate
si individua il gene prescelto
Analoghi al southern blotting, in quanto basati sul trasferimento di molecole da gel di
elettroforesi a membrana (e successiva “ibridazione”) sono:
-Northern blottingà trasferim. di RNA; rilevamento per ibridazione con sonde di DNAss
-Western blotting àtrasferim. di proteine separate mediante PAGE; rilevamento con
anticorpi marcati
-South-Western blotting à trasferim. di proteine; rilevamento con sonde di DNAds;
consente l’identificazione di proteine in grado di legare DNA
Sul principio dell’ibridazione si basano anche tecniche come le
ibridazioni in situ (su cellule o tessuti integri) e i chip a DNA (microarray)
Il western blotting differisce dal southern per due aspetti principali:
1. Il trasferimento di proteine avviene per passaggio di corrente elettrica (e non
per capillarità)
2. Il rilevamento si basa sul legame di anticorpi e non sull’ibridazione tra acidi
nucleici ss
Applicazioni del Southern blotting
Medicina legale: DNA fingerprint (RFLP rivelati mediante sonde)
Gli RFLP di particolari marcatori sono evidenziati e confrontati mediante
southern blotting
Sangue
dell’imputato
Sangue rinvenuto
sui vestiti dell’imputato
Sangue
della vittima
Purificazione del DNA
Purificazione del DNA genomico
1. Lisi cellulare con metodi vari secondo il tipo cellulare
2. Rimozione dei frammenti cellulari mediante centrifugazione
3. La parte solubile è trattata con solventi organici (fenolo e cloroformio) per
denaturare e allontanare le proteine
4. Precipitazione e concentrazione degli acidi nucleici rimasti nella fase
acquosa (etanolo o PEG)
5. Rimozione dell’RNA: trattamento con enzima RNAsi
6. (Centrifugazione in gradiente di densità per separare diversi tipi di DNA)
Kit commerciali rapidi ed efficaci
Resa di DNA genomico → 0.5-3 μg per mg di tessuto,
5-15 μg da 300 μl di sangue intero.
Vettori
I vettori assicurano la propagazione e replicazione del DNA esogeno
nell’ospite. I vettori sono molecole di DNA costruite combinando e
modificando sequenze naturali.
1)Vettori di clonaggio→ amplificazione del DNA inserito
2) Vettori di espressione → traduzione in proteina del DNA inserito
Le caratteristiche di un vettore di clonaggio sono:
-capacità autoreplicativa nell’organismo ospite
-presenza di un gene marker per la selezione dei trasformanti (es gene di
resistenza ad un antibiotico)
-presenza di una regione polylinker contenente siti riconosciuti da diversi
enzimi di restrizione, utilizzabili per l’inserimento del frammento di interesse
- presenza di un gene marker per la selezione dei vettori ricombinanti (: la
sequenza di tale gene è sovrapposta al polylinker, peciò l’inserimento del
frammento clonato la interrompe con conseguente perdita della funzione
corrispondente).
Esistono vari vettori di origine diversa; la scelta del vettore dipende
dall’applicazione e dalla dimensione del frammento da clonare
VETTORE
OSPITE
TIPO DI CLONAGGIO,
applicazioni
Dimensione MAX
dell’inserto
Plasmide
batteri,
lieviti
genomico, cDNA
Manipolazione generale
10-20 kb
Batteriofago λ
e M13
batteri
genomico, cDNA
Librerie, mutagenesi e
sequenziamento
20 kb
Cosmidi
batteri
Genomico librerie
45 kb
BAC
batteri
genomico librerie
100-300 kb
YAC
Lieviti
genomico librerie
100-2000kb
I plasmidi sono molecole di DNA circolari extra-cromosomali.
TEM 2000´
•Naturalmente diffusi in procarioti e alcuni eucarioti (lievito).
•Conferiscono un fenotipo caratteristico: es resistenza ad antibiotici o metalli
pesanti.
•Basso N° copie 1-2/cellula (stringente)
•alto N° copie 10-200/cellula (rilassato)
•Dimensione standard→1-20kb
Esempio di vettore plasmidico
regione di inserimento
del DNA di interesse
Gene marker per selezionare trasformanti:
resistenza ad antibiotico (ampicillina)
origine di
replicazione
Esempio di vettore di espressione plasmidico
LIBRERIE di DNA
Le librerie sono insiemi di molecole di DNA ricombinanti: raccolte di
frammenti di DNA provenienti da un certo organismo o tessuto
La libreria è costruita clonando in opportuni vettori i vari frammenti di DNA
ottenuti dalla fonte (tessuto o coltura cellulare); il vettore puo’ essere
plasmidico, fagico, cosmidico.
Genoma tagliato con l’enzima di restrizione
Plasmide
ricombinante
DNA fagico
ricombinante
oppure
Clone
batterico
Libreria plasmidica
Clone
fagico
Libreria fagica
Esistono 2 tipi principali di librerie
1) Libreria di DNA genomico
- Raccoglie tutti i geni espressi e non, esoni-introni, promotori e
seq. intergeniche di un genoma
- organismo-specifica
trascrizione
2) Librerie di cDNA
-Raccoglie solo sequenze codificanti
espresse da quel particolare tessuto
in particolari condizioni
-Tessuto/stadio-specifica
- L’mRNA di un certo tessuto è
convertito in DNA e clonato
Splicing
dell’mRNA
Purificazione
dell’mRNA e
retrotrascrizone
Demolizione dell’RNA
Sintesi di DNA ds
I genomi sono insiemi di molecole di DNA enormi:
le genoteche ne consentono analisi sistematica e più semplice
Screening di librerie
La ricerca del clone di interesse può basarsi sulla conoscenza di
•Sequenza di DNA del clone → screening mediante ibridazione di
sonde oligonucleotiche
•Sequenza proteica del clone → screening immunologico
•Funzione biochimica della proteina → screening funzionale
•Capacità d’interazione con altre proteine → screening per interazione
Screening basato su ibridazione di sonde oligonucleotidiche
•Si usa sonda di DNA marcata complementare a parte della sequenza ricercata
•Presuppone conoscenza minima circa la seq che si cerca
•Il metodo va bene per screening di colonie (librerie plasmidiche e cosmidiche) e di
placche di lisi (librerie fagiche)
•La marcatura radioattiva assicura la massima sensibilità
Analisi di genomi
• Mappatura
• Sequenziamento
• Analisi dei cambiamenti dell’espressione
genica (microarray)
• RNAi e KO genico
Le mappature consentono di organizzare i genomi in schemi più semplici, adatti
allo studio.
Esistono diversi metodi e tipi di mappatura:
•Mappe di restrizione
•Mappe citologiche
•Mappe genetiche
•Mappe fisiche
Mappa citologica
E’ lo schema di bandeggio caratteristico che si ottiene trattando con
coloranti specifici (es Giemsa: bande G) i cromosomi metafasici.
Sulla mappa citologica la posizione dei geni può essere localizzata
mediante FISH (fluorescence in situ hybridization)à mappa citogenetica
G-band and in situ hybridization analysis of a pleomorphic adenoma (case 3) with a t(5;8)(p13;q12–
13). (a) Representative karyotype of the case; (b) FISH analysis with painting probes for chromosome
5 (green) and chromosome 8 (red), confirming the translocation (Carmo et al., 2008)
La FISH consente diagnosi di varie patologie genetiche
Le sonde FISH sono
ibridate su cromosomi
metafasici umani
Campione osservato con
microscopion a
fluorescenza: rivela
fluorescenza della sonda
FISH: con sonde diverse si analizzano simultaneamente varie aspetti genetici
es diagnosi prenatale del sesso, trisomie, traslocazioni, etc.
Mappa genetica
E’ una rappresentazione della
distanza tra due elementi di DNA
basata sulla frequenza di
ricombinazione osservata tra di
essi. (Distanze espresse in
CMorgan)
Poco adatta per lo studio del
genoma umano. Approssimativa.
Mappa fisica
Mappatura di marcatori genetici
ottenuta analizzando direttamente
il genoma con diverse tecniche
basate su restrizione, ibridazione
e PCR. (distanze espresse in bp)
Sequenziamento del DNA
Alla fine degli anni ’70 sono stati elaborati due
metodi alternativi per il sequenziamento
manuale del DNA
• Maxam e Gilbert, 1977: metodo chimico
Il DNA è tagliato chimicamente in
corrispondenza di basi specifiche: i
prodotti di taglio sono analizzati su gel
elettroforesi
•
Sanger, 1977: metodo terminazione di
sintesi enzimatica
Il Dna da sequenziare è replicato a partire da
un primer innesco con una polimerasi; il
filamento neosintetizzato è radiomarcato e
la reazione è interrotta per incorporazione
di dideosii -nucleotidi (ciascuno aggiunto
alle 4 diverse mix di reazione)→analisi di
elettroforesi→autoradiografia
(1980: Nobel per la chimica a Gilbert e
Sanger)
Sequenziamento automatico
Il metodo di Sanger è rimasto alla base dei protocolli di sequenziamento
automatico
•Enzima
reazione
•DNA stampo
•dNTP
•ddNTP marcati con 4
diversi fluorofori
Analisi computerizzata
dell’elettroferogramma
Con un primer si sequenzia regione
di 500-1000bp
Processo automatizzato
Separazione dei frammenti su
singolo capillare di gel
abbinato ad un rilevatore di
fluorescenza
Il sequenziamento del DNA è usato per rilevare mutazioni puntiformi
à Diagnosi molecolare
Sequenziamento di interi genomi
1) Frammentazione del genoma e clonaggio in vettori
2) Sequenziamento mediante uno dei seguenti approcci:
a) chromosome walking: identificazione di nuovi cloni sovrapposti per
ibridazione di cloni già sequenziati
b) Shot-gun totale: genoma ricostruito assemblando sequenze
sovrapposte di piccoli frammenti casuali
c) Shot-gun gerarchico: il genoma è tagliato in grossi frammenti
sovrapposti, che vengono ulteriormente tagliati e sequenziati
(+ adatto a genomi di grossa taglia)
Progetto Genoma Umano
•Inziato nel 1990 e portato avanti da HGP (consorzio di enti di ricerca
pubblici) e Celera genomics (industria biotecnologica)
•Obiettivi: sequenziare intero genoma, creare banca dati e identificare
geni
•Sequenziamento concluso nel 2003
I dati ottenuti stanno fornendo informazioni su sviluppo, evoluzione e
molte malattie.
I benefici che possono derivare dalla conoscenza del genoma umano
riguardano essenzialmente la ricerca di base.
L’enorme numero di dati raccolti è depositato in un archivio accessibile
in rete ai ricercatori di tutto il mondo.
Il genoma umano comprende circa 30 000 geni (codificanti per proteine, tRNA e
rRNA) ma la capacità codificante arriva a 96000 proteine grazie splicing
alternativo.
C’è poi un’enorme quantità di DNA non codificante (circa il 97% del totale) che
comprende seq. regolatrici (promotori, enhancer) e introni e DNA intergenico (il
cosiddetto junk DNA o “DNA spazzatura”)
Oltre a quello umano, sono stati sequenziati o in via di sequenziamneto
anche genomi di altre specie, soprattutto procarioti.
Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma è utile in particolare
ai fini dell’analisi comparativa con il genoma umano.
I problemi legati all’immagazzinamento e all’analisi dell’enorme mole di
dati relativi alle sequenze hanno portato alla nascita della
BIOINFORMATICA
La bioinformatica sviluppa algoritmi e metodi statistici per
trovare/stabilire relazioni tra i dati, fornisce strumenti per analizzare e
gestire i dati (seq di DNA e aminoacidiche, domini proteici, etc)
Databases, siti, risorse e programmi online
Il sequenziamento è solo una prima tappa dello studio dei genomi: le
sequenze ottenute devono essere studiate ed interpretate
Come si identificano i geni?
•Scansione di sequenza per ricercare ORF
•Confronto di sequenza con banca dati di cDNA (Expressed
Sequence Tag)
Come si caratterizza la funzione di un gene?
•Mediante analisi bioinformatica →ricerca di omologia di sequenza in
banca dati
•Mediante analisi sperimentale → knock out (KO) (o silenziamento)
genico tramite ricombinazione omologa ed analisi fenotipica del
mutante
Analisi di knock out (KO genico)
Consente di individuare la funzione di un gene
Mediante ricombinazione omologa il gene target viene sostituito da una
“cassetta” contenente un gene marker selezionabile
Studi soprattutto su lievito ed eucarioti inferiori, minore applicabilità per
organismi superiori
RNA antisenso e interferenza da RNA (RNAi) à silenziamento genico
Principio comune alle due tecniche: la presenza di RNA complementare
all’mRNA endogeno destabilizza specificamente l’mRNA target
•Antisense RNA :Trasformazione di cellule con vettore di espressione inducibile
per un RNAss antisenso→ silenziamento gene target per degradazione del
corrispondente mRNA complementare
•RNAi:
Trasformazione con vettore di
espressione per un piccolo
RNAds corrispondente ad un
tratto codificante di gene target
→ silenziamento gene target per
degradazione del
corrispondente mRNA
RISC= RNA-induced silencing
complex
Tecnica con vaste possibilità
applicative nello studio di geni di
mammiferi
Silenziamento di gene codificante per proteina
necessaria a d allineare cromosomi in metafase
Dal genoma, lo studio si è spostato su:
•Trascrittoma (contenuto di mRNA di una cellula in particolari
condizioni)
•Proteoma (l’insieme di proteine prodotte da una cellula)
•Metaboloma (insieme dei metaboliti prsenti in una cellula, che cambia
in funzione del suo stato fisiologico)
PCR ed applicazioni
Amplificazione di DNA in vitro
La PCR (Polymerase Chain Reaction) ha rivoluzionato la
biologia molecolare e trovato vasta applicazione in aree di
ricerca disparate
ideata e messa a punto da Kary Mullis nel 1983
(Nobel per la chimica nel 1993).
È un metodo attraverso cui una
sequenza di DNA può essere
amplificata esponenzialmente in vitro
in modo specifico.
Consente di superare uno dei
maggiori problemi che si incontrano
nell’analisi dei geni: bersagli rari
all’interno di complessi e vasti
genomi.
Molecola
iniziale
di DNA
La PCR offre la possibilità di produrre
un enorme numero di copie di DNA
senza ricorrere al clonaggio.
1
2
4
Numero di molecole di DNA
8
“Ingredienti” e condizioni di PCR
- oligonucleotidi innesco (~20 bp) complementari alle
regioni fiancheggianti la zona da amplificare: primer per
la polimerasi
-Enzima DNA-polimerasi 5’→3’ (termostabile)
-dNTP
-DNA stampo.
sia puro che sottoforma di campioni biologici (fettine istologiche, capelli,
colonie batteriche, ecc). La quantità iniziale di DNA richiesta per la PCR è
minima, in teoria, anche una singola molecola è sufficiente
- Condizioni saline (MgCl2 cofattore) e di pH adeguate
-Alternanza di fasi a diversa temperatura
1) denaturazione del DNA stampo
2) appaiamento dei primer
3) estensione dei primer da parte della polimerasi
20-40 cicli di amplificazione
Accumulo esponenziale dei frammenti di
amplificazione→
Legge esponenziale→ x(2n)
x= n° molecole DNA stampo iniziale; n= n° di cicli
= 1 ciclo di PCR
ad ogni ciclo il DNA bersaglio
raddoppia
•Enzyme
•primers
•Template DNA
•dNTP
•Buffer
Il profilo termico è impostato
in un thermal cycler
Pcr.exe
Il prodotto di reazione è
controllato per elettroforesi
Applicazioni della PCR
Le applicazioni sono molteplici in campi diversi: genetica molecolare,
medicina, archeologia, medicina forense, analisi di popolazioni, studi di
filogenesi, etc.
•Diagnosi di malattie genetiche (mutazioni per delezioni/inserzioni o puntiformi)
•Analisi di medicina forense (es DNA finger-print)
•Clonaggio dei prodotti di PCR
•Rilevare infezioni batteriche o virali
•Analisi dell’espressione genica (RT-PCR)
•Studi di evoluzione molecolare (filogenesi)
Esempio di diagnosi di malattia genetica dovuta a delezione genica:
la sindrome di Waardenburg
Primer 1
Delezione
18bp
Gene umano
Pax3
Primer 2
PCR su DNA genomico estratto
Elettroforesi dei prodotti di PCR
selvatico
156 bp
138 bp
mutante
La sindrome è autosomica
dominante ed è caratterizzata
da sordità e pigmentazione
anomala.
Alcuni tipi di sindrome sono
causati da mutazioni per
delezione sul gene Pax-3.
I primer sono disegnati sui
lati del sito di delezione:
la PCR produce un unico
amplicone più lungo nel wt,
due ampliconi di cui uno più
corto nel mutante eterozigote
Analisi delle delezione del gene distrofina mediante PCR
PCR e/o analisi di southern sono alla base della diagnosi molecolare
dell’anemia falciforme
Test di paternità e di compatibilità genetica basati su PCR e lunghezza
frammenti di siti polimorfici (STR, short tandem repeats: DNA microsatellite)
Colture cellulari primarie, secondarie ed
immortalizzate
Modificazioni genetiche su organismi
animali
Come si genera una coltura di cellule animali?
•Si preleva piccolo frammento di tessuto (2mm3)
•Digestione con proteasi per degradare matrice extracellulare e separare le cell.
•Trasferimento in nuove flask con fattori di crescita per stimolare proliferazione
•Colture/linee cellulari primarie: le cellule ottenute da tessuto non si dividono o
lo fanno per poche volte prima di andare incontro a senescenza e morire
•Linee cellulari secondarie: cellule ottenute da tessuto riescono a dare
numerose generazioni (10-20 divisioni), prima di invecchiare e morire
•Linee cellulari trasformate: in seguito a cambiamenti genetici, spontanei o
indotti (ad es mediante infezione virale), le cellule perdono il normale controllo su
divisione e crescita cellulare àcellule crescono indefinitamente: linee
immortalizzate (es cell HeLa: cellule tumorali derivanti da paziente morta di cancro
all’utero nel 1951; cell. CHO da ovaio porcellino d’india: Chinese Hamster Ovary)
Transfezione
NB
Per le cellule animali quindi, il termine trasformazione indica la perdita di
controllo sulla proliferazione, mentre col termine transfezione si indica
l’inserimento di DNA esogeno.
La transfezione può essere:
-transiente (il DNA esogeno è mantenuto solo per periodo limitato, raccolta
delle cellule per analisi dopo 16-24 ore)
-stabile (più difficile da ottenere; il DNA è integrato permanentemente nel
genoma mediante ricombinazione non omologa, o conservato come elemento
extracromosomico stabile, dotato di propria origine replicativa)
Modificazioni genetiche su organismi animali
La capacità di modificare specifici caratteri di un intero organismo animale
offre la possibilità di migliorare la comprensione di fenomeni biologici
complessi, come lo sviluppo e l’insorgenza di malattie.
Le tecniche per ottenere organismi transgenici si basano su conoscenze di
embriologia: gli interventi per introdurre il DNA esogeno riguardano fasi
embrionali precoci.
stadi iniziali di sviluppo embrionale
impianto
nell’utero
INIEZIONE NEL PRONUCLEO
Il DNA è iniettato nel pronucleo di uova di
topo fecondate (si usa un micromanipolatore);
àcoltivazione in vitro fino a stadio di morula e
successivo impianto in utero.
Svantaggi:
Casualità integrazione;
inadatto per knockout;
possibilità di animali a mosaico
Trasfezione di cellule staminali embrionali (ES)
Le ES sono isolate dalla blastocisti e possono
essere mantenute in coltura per varie
generazioni.
Le ES possono essere trasfettate con vari metodi
e sottoposte a selezione delle trasformate
Le ES trasformate sono introdotte in una nuova
blastocisti che viene impiantata nell’utero.
La progenie chimerica è incrociata con topi
normali per avere eterozigoti, che sono poi
incrociati tra loro per dare omozigoti
Uso di coloranti specifici per strutture/molecole cellulari
Uso di anticorpi per lo studio di strutture e proteine cellulari
Anticorpi riconoscono e legano specifiche molecole
La specificità di legame deli Ab usata per analizzare morfologia e localizzazione di
strutture cellulari
Ab coniugato a molecola fluorescenteà visione al microscopio ottico a
fluorescenza : immunofluorescenza diretta o indiretta
In microscopia elettronica l’Ab è coniugato a materiale elettrondenso (es
particelle d’oro)
Tecnica di preparazione di AB
monoclonali
iniezione di antigene nel topo
prelievo di organi linfoidi (milza )
fusione di cellule linfoidi con cell
tumorali (immortalizzazione)
selezione dei cloni cellulari che
producono anticorpi
coltivazione delle cellule selezionate
e purificazione degli anticorpi