Slides prof.ssa Robotti

“La qualità delle misure nei
laboratori di analisi nel
settore alimentare ”
Dr. Elisa Robotti
Dipartimento di Scienze dell’Ambiente e della Vita
Università degli Studi del Piemonte Orientale
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Cosa vuol dire
“qualità del dato analitico”?
Le misure analitiche, in qualsiasi ambito, devono
essere affidabili e comparabili per poter essere di
aiuto nei processi decisionali
Il metodo di analisi applicato
dal laboratorio deve avere
prestazioni stabili nel tempo in
modo da garantire la
confrontabilità dei risultati,
quindi la loro “qualità”.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Importanza della qualità del dato
analitico dal punto di vista legale
Necessità di prendere decisioni in merito a
sostanze vietate (es: additivi), dannose, rischiose
per la salute, non dichiarate in etichetta:
1) Indicazione della presenza o assenza di una
certa sostanza in un campione di analisi
2) Confronto della quantità di sostanza presente
con un riferimento: presenza della sostanza al
di sopra del limite di legge previsto
Il dato analitico prodotto deve essere corredato da
opportuni parametri che ne indichino la QUALITA’
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Dal dato all’informazione
Limite di legge
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
L’errore sperimentale
Errore sperimentale: entità delle fluttuazioni tra
un risultato e l’altro
Il termine “errore” non ha
un’accezione negativa
Es: determinazione concentrazione di mercurio nel pesce
Conc Hg (ppm)
Aliquota 1
0.24
Aliquota 2
0.26
Aliquota 3
0.25
Aliquota 4
0.24
Aliquota 5
0.26
Repliche della stessa misura
sono diverse a causa
dell’errore sperimentale
VARIABILITA’
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Sorgenti di errore
Tutte le procedure che non sono “totalmente controllabili”
Fasi dell’analisi di un campione
Identificazione del problema
Es: determinazione di Hg nel pesce
Campionamento
Prelievo del campione di pesce
Analisi del campione:
-Trattamenti preliminari
-Analisi strumentale
Ogni fase dà un
suo contributo
all’errore della
misura finale,
cioè alla sua
variabilità
Determinazione della concentrazione
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Sorgenti di errore
Tutte le procedure che non sono “totalmente controllabili”
Altre fonti di errore sperimentale CASUALE:
-temperatura dell’ambiente
-addestramento del personale
-purezza e freschezza dei reagenti
-efficienza e stato dell’apparecchiatura
ATTENZIONE !!
Non confondere errore sperimentale con ERRORE
SISTEMATICO (“GROSSOLANO”) che si può eliminare:
disattenzione, reagente errato, virgola decimale posta
nel punto sbagliato
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
L’errore sperimentale
Conc Hg
(ppm)
Aliquota 1
0.24
Aliquota 2
0.26
Aliquota 3
0.25
Aliquota 4
0.24
Aliquota 5
0.26
Es: determinazione concentrazione
di mercurio nel pesce
Misura finale identificata
da due parametri:
Localizzazione
Dispersione
Definisce “dove” sono localizzate
le misure (es: concentrazione)
Definisce la variabilità
delle misure
Media delle n misure replicate
Varianza o scarto tipo
delle n misure replicate
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Localizzazione
Media delle n misure replicate
n
y
y
i 1
i
2
[ Hg ] 
0.24  0.26  0.25  0.24  0.26
n
Varianza delle
n misure replicate
n
s2 
s2 
5
 y
i 1
Dispersione
Scarto tipo delle
n misure replicate
 y
n
2
i
s2 
n 1
2(0.24  0.25) 2  2(0.26  0.25) 2  (0.25  0.25) 2
5 1
 0.25 ppm

2


y

y
 i
i 1
n 1
s  s 2  1*104  0.01 ppm
 1*104 ppm 2
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Il campione statistico
Le n misure eseguite realmente sul campione in esame
rappresentano un campione statistico della popolazione
di N misure ottenibili con lo stesso metodo analitico sul
medesimo campione
Valore medio più probabile
Scarto tipo
y
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Localizzazione e dispersione
y 5
s3
Stessa dispersione
Diversa localizzazione
y  25
s  0.5
y  25
s3
Diversa dispersione
Stessa localizzazione
y  25
s3
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Dal segnale alla concentrazione
Qualsiasi tecnica strumentale permette di misurare un
“segnale”, cioè l’intensità di una proprietà chimica o fisica
della sostanza da identificare che sia in relazione con la
quantità di sostanza presente nel campione
Segnale Hg
(intensità)
Conc Hg
(ppm)
Aliquota 1
35.20
Aliquota 1
0.24
Aliquota 2
35.40
Aliquota 2
0.26
Aliquota 3
35.30
Aliquota 3
0.25
Aliquota 4
35.20
Aliquota 4
0.24
Aliquota 5
35.40
Aliquota 5
0.26
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Dal segnale alla concentrazione:
retta di calibrazione
Preparazione
campioni
standard
(conc nota)
Modello di
calibrazione
Misura
segnale
Segnale
60
?
50
40
30
20
10
Previsione
inversa
0.1
0.2
0.3
0.4
Conc
[C]=0.25
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Confronto tra una misura
sperimentale e un riferimento
Distribuzione t-Student dipende dai “gradi di libertà”
cioè dal numero di misure ripetute.
y  0
t0 
s
n
Ipotesi
H 0 : y0   0
H 1 : y0   0
y
Media misure replicate
0 Valore di riferimento
s Scarto tipo delle repliche
n Numero di repliche
tcalc  ttab;  n 1;
Ipotesi H0 rifiutata
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Confronto tra una misura
sperimentale e un riferimento
Es: Valutare se il valore medio di 5 misure della
concentrazione di Hg nel pesce (pari a 0.25 ppm) è
significativamente maggiore di 0.2 ppm. Lo scarto tipo
delle 5 misure è 0.01 ppm.
y  0 0.25  0.2
t0 

 11.18
s
0.01
n
5
Confrontato con valore di
riferimento tabulato per un
livello di confidenza del 95%:
t  4; 0.05  2.132
tcalc  ttab
0.25 ppm è significativamente
maggiore di 0.2 ppm
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
P > 50%
P = 50%
P < 50%
Confronto tra una misura
sperimentale e un riferimento
Superiore al
limite di legge
Limite di legge
Inferiore al
limite di legge
Casi dubbi: è fornita una probabilità di
superamento del limite di legge
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Utilizzo del dato analitico in
ambito legale
1 Valutazione
presenza/assenza
di una sostanza
2 Valutazione di
“quanta” sostanza
è presente
Metodo di analisi
di tipo qualitativo
Metodo di analisi
di tipo quantitativo
Dato analitico prodotto da un laboratorio di analisi
ACCREDITATO UNI CEI EN ISO/IEC 17025
(norma accreditamento laboratori di misura)
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
ISO/IEC 17025:2005
Definisce le regole per la gestione del laboratorio (sez. 4) e per
assicurare la competenza tecnica del laboratorio ad eseguire le
prove (sez. 5). Nella sez. 5 sono dettate regole per:
Qualificare il personale addetto all’esecuzione delle prove;
Fare in modo che la strumentazione utilizzata sia riferibile a
campioni primari;
Definire l’incertezza di misura del laboratorio;
Stabilire le regole per la gestione del campione in laboratorio,
affinché esso non venga deteriorato o danneggiato;
Presentare i risultati secondo precise regole stabilite dalla
norma
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
ISO/IEC 17025:2005
La 17025 garantisce che i metodi applicati dal
laboratorio in questione abbiano le prestazioni
indicate e siano stabili nel tempo
L’adeguamento del laboratorio alla norma è
volontario.
È il laboratorio a decidere se richiedere
l’accreditamento e quante e quali prove
accreditare.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
UN EN ISO 17025
In base alla 17025, i metodi di analisi devono essere “validati”
La validazione è la conferma attraverso l’esame e
l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti
particolari per l’utilizzazione prevista siano
soddisfatti [ISO 8402:1994]
La validazione di un metodo analitico è il processo
con il quale è stabilito, attraverso opportuna
evidenza sperimentale, che le prestazioni del
metodo soddisfano i requisiti per l’utilizzazione
prevista.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
(dalla UNI CEI EN ISO/IEC 17025)
5.4.5.2 Il laboratorio deve validare i metodi normati,
i metodi sviluppati/progettati dal laboratorio, i metodi
normati utilizzati al di fuori del proprio scopo e campo
di applicazione prefissato, come pure estensioni e
modifiche di metodi normati per confermare che i
metodi siano adatti all’utilizzazione prevista. La
validazione deve essere estesa in modo da soddisfare
le esigenze di una data applicazione o di un campo di
applicazione. Il laboratorio deve registrare i risultati
ottenuti, le procedure utilizzate per la validazione,
così pure una dichiarazione circa l’idoneità del metodo
per l’utilizzo previsto.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Il processo di validazione richiede quindi di
esplicitare le caratteristiche di prestazione del
metodo attraverso opportuni parametri.
La validazione definisce i parametri di qualità del
metodo di analisi e quindi del dato da esso prodotto
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
La validazione di un metodo analitico serve inoltre a
garantire
che,
indipendentemente
dal
tipo
di
cambiamenti che si possono verificare in un dato
laboratorio, o in più laboratori, le prestazioni del
metodo
stesse.
analitico
rimangono
sostanzialmente
 Materie prime:
 Parti strumentali;
 Tarature;
 Operatori;
 Campioni;
 Tempo
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
le
Validazione dei
metodi di analisi
Requisiti di qualità del dato analitico (ISO 17025):
Precisione, accuratezza, linearità, LOD e LOQ
Selettività e specificità, incertezza di misura, recupero
Validazione secondaria (robustezza del metodo)
Valutazione della trasferibilità del metodo
(System Suitability Test)
Controllo di qualità del metodo nelle analisi di
routine (QC e QA) e Proficiency Test
CorsoThe
di Alta
Formazione
in Legislazione
AlimentareMethods
- Acqui Terme - 4 Giugno 2010
EURACHEM:
Fitness
for Purpose
of Analytical
Validazione dei metodi analitici
Più vasto è il campo di applicazione del metodo, più
estesa deve essere la validazione.
Parametri di interesse
Impurezze
Accuratezza
Precisione
Linearità
Selettività e specificità
Limite di rivelazione
Limite di quantificazione
Robustezza
Recupero
Qualitativa
√
√
√
Quantitativa
√
√
√
√
√
√
√
√
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Campo di applicazione
E’ l’intervallo tra il più alto ed il più basso livello
dell’analita o della proprietà determinabili con precisione
ed accuratezza.
Il campo di applicazione definisce anche il tipo di
matrice in cui l’analita (o gli analiti) viene determinato
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Accuratezza
Grado di accordo tra il risultato di una misura e il valore
vero o di riferimento accettato del misurando
Bias
Valore
di rif.
Metodo
Media
della pop.
Precisione
Risultato
singolo
Laboratorio
Esattezza
Accuratezza
Valore di riferimento:
a. Certificato (risultati di organizzazioni nazionali o internazionali)
b. Di consenso, basato su lavoro sperimentale in collaborazione
(sotto la guida di organismi scientifici)
c. Quantità misurata sperimentalmente (media di serie ampia di
misure)
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Esattezza (trueness)
Grado di accordo tra il valore medio dei risultati di
una misura e il valore di riferimento del misurando
Bias
Valore
di rif.
Metodo
Media
della pop.
Precisione
Risultato
singolo
Laboratorio
Esattezza
Accuratezza
L’esattezza è misurata attraverso il bias (errore sistematico)
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Esattezza (trueness)
L’esattezza viene verificata ad esempio
mediante:
Analisi di materiali di riferimento aventi una
composizione il più possibile simile a quella
dei campioni reali in esame;
Confronto con i risultati ottenuti analizzando
una serie di campioni reali con il metodo in
esame e con un metodo di riferimento.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Metodo A
5
0
10
5
5
Metodo B
10
0
Teorico
5
10
Metodo B
0
15
Errore sistematico
costante positivo
10
5
0
0
5
Metodo B
10
Errore sistematico
costante positivo più
errore sistematico
proporzionale negativo
10
10
Metodo A
Metodo A
0
5
Metodo B
Errore sistematico
proporzionale negativo
10
5
5
0
0
0
Metodo A
10
15
Metodo A
Metodo A
10
Esattezza
0
5
Metodo B
10
Deviazione dalla linearità
5
0
0
5
Metodo B
10
Problemi di speciazione
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Precisione
Grado di accordo fra i risultati indipendenti ottenuti con un
procedimento di misura in condizioni specificate
Tre tipi di precisione: ripetibilità, precisione intermedia e
riproducibilità. Normalmente, i principali fattori che
influenzano la precisione sono:
 differenze in temperatura e umidità ambientali
 operatori con diversa manualità ed esperienza
 strumentazioni con caratteristiche diverse
 variazioni della qualità dei materiali (pH, composizione…)
 strumentazioni e materiali di consumo di diversa età
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
RIPETIBILITA’
stesso laboratorio;
stesso operatore;
stessa apparecchiatura;
nessuna taratura tra le misure;
misure vicine nel tempo.
PRECISIONE INTERMEDIA
stesso laboratorio;
operatori diversi;
apparecchiature diverse;
RIPRODUCIBILITA’:
laboratori diversi;
taratura tra le misure;
misure in tempi differenti.
operatori diversi;
apparecchiature diverse;
misure in tempi differenti.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Precisione ed esattezza
Gli errori casuali influenzano la precisione, quelli
sistematici l’esattezza
Né esatto
né preciso
Esatto ma
non preciso
 

  





Non esatto
ma preciso

Esatto e
preciso
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Incertezza di misura
Associata al risultato di una misura, caratterizza la
dispersione dei valori che possono essere assegnati al
misurando qualora siano state considerate tutte le
sorgenti d’errore associabili a tutti gli stadi della
procedura analitica.
L’incertezza di misura deve comprendere i contributi
dovuti al campionamento ed ai pretrattamenti del
campione (determinata con metodi bottom-up, top-down,
NMKL…).
La stima dell’incertezza di misura è lo stadio più
difficile dell’intera procedura di validazione.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Incertezza di misura
Senza l’incertezza i risultati non possono essere
confrontati né tra loro, né con valori di riferimento
(specifiche o norme)
Es: Verificare se la concentrazione di un analita è conforme
al valore limite stabilito in una norma, VLA: 2,0 mg/kg
Risultato dell’analisi: Canalita = 1,80 mg/kg
Il materiale è conforme? La risposta dipende dalla UOM
UOM = 0,19 mg/kg ( = 0,05;  = 3)
Cmax = 1,99 mg/kg
UOM = 0,33 mg/kg ( = 0,05;  = 3)
Cmax = 2,13 mg/kg
CONFORME!
NON CONFORME?
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Incertezza di misura
Perché il punto interrogativo?
Il secondo risultato indica che esiste una probabilità del
95% che la concentrazione dell’analita sia compresa
nell’intervallo
C = 1,80  0,33 mg/kg (1-: 0,95;  = 3)
Dato che la concentrazione può essere maggiore del VLA, il
test non è decisivo.
Converrebbe diminuire l’UOM (come?) in modo da
verificare se è possibile dimostrare, al livello di confidenza
scelto, che l’intervallo di confidenza giace completamente
al di sotto del VLA.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
A causa della presenza di errori casuali, ogni serie di
misure produrrà un set di misure più o meno disperse.
Dopo eliminazione degli errori sistematici, l’operatore
può definire un intervallo in cui poter assumere
ragionevolmente che sia compreso il valore vero.
Intervallo di confidenza (o fiducia) (CI), i cui limiti
estremi sono detti limiti dell'intervallo di confidenza.
Livello di confidenza (P o 1-): probabilità che il valore
atteso di un parametro stimato sia incluso in un
intervallo stimato del parametro stesso. È un numero
tra 0 e 1, o in percento. La quantità complementare ()
si chiama livello di significatività.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Nel caso di una media di misure, l’intervallo di
confidenza è definito come segue:
I .C. : y  t
s

1 ,
2
n
y : media delle n misurazioni
s: scarto tipo delle misure
t: t–Student tabulato (2 code 
/2) in funzione del numero di
gradi di libertà,  = n-1, e del
livello di confidenza prescelto
/2
y
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Esempio: Quattro repliche della determinazione del
potassio nelle ceneri di un campione di latte.
I risultati sono i seguenti (mg/100 g): 148; 145; 151; 152
Riportare correttamente il risultato (P = 95%).
Media e deviazione standard sono
149.0000 mg/100g e 3.16228 mg/100 g.
rispettivamente
Il valore critico del t-Student è t0,95;3 = 3.18. Si ottiene:
t
s
n
 3.18 
3.16228
2
 5.02802
Il risultato è: CK = 149,0  5,0 mg/100 g (P=0,95;  = 3)!
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Il risultato deve essere arrotondato alla prima o
seconda cifra significativa dell’incertezza. Es:

34.0967182736

0.2703660271
= 34.100.27 ……

La prima (seconda) cifra significativa dell’incertezza
corrisponde alla prima (seconda) cifra incerta della
media.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Selettività e specificità
Stabiliscono l’affidabilità delle misurazioni in presenza
di interferenti.
Valutare la selettività implica l’analisi di campioni
(standard o meno) fortificati con i possibili interferenti
ed il confronto dei risultati relativi all’analita in
presenza o meno degli interferenti.
Risultato: massima concentrazione di interferente
accettabile per poter applicare il metodo.
Specificità: metodo che dà una sola risposta
Selettività: metodo che dà più risposte (metodo separativo)
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Range dinamico e range lineare
Sano valutati mediante esecuzione di calibrazioni
specifiche implicanti l’uso di tecniche statistiche di
regressione.
Range dinamico
Segnale
Range lineare
Attenzione:
Ogni tecnica di regressione si basa
su condizioni specifiche che devono
essere verificate al fine di evitare
errori sistematici.
Conc
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Linearità
La relazione di linearità tra segnale misurato e
concentrazione di analita è una caratteristica che
può esistere o meno nell’ambito del campo di
validità del metodo
Segnale
60
Richiesti almeno 5 livelli di
50
concentrazione e 3-6 misure
40
replicate per definire il campo
di misura lineare
30
20
10
0.1
0.2
0.3
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
0.4
Conc
Validazione dei metodi analitici
Sensibilità
E’ la variazione della risposta di un dato strumento di
misura diviso per la corrispondente variazione di
concentrazione dell’analita
Se la relazione tra segnale e
concentrazione è lineare, la
sensibilità coincide con la
pendenza della retta di
taratura: y = a + b*X
Sensibilità = b
Segnale
60
50
40
30
20
10
Se relazione non lineare: sensibilità
varia con la concentrazione
0.1
0.2
0.3
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
0.4
Conc
Validazione dei metodi analitici
Limiti di rivelazione e quantificazione
Limite di
Capacità di affermare la presenza
rivelazione
o l’assenza dell’ analita
Limite di
Capacità di eseguire una
quantificazione
misurazione quantitativa
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Limiti di rivelazione e quantificazione
Limite di rivelazione
(LOD)
La più piccola concentrazione di
analita che può essere rivelata
Limite di quantificazione
(LOQ)
La minore concentrazione di analita
che può essere quantificata
Segnale del Bianco
Segnale del Campione
Distinguere tra segnale del bianco e dell’analita
tenendo conto dell’errore sperimentale
Se si ottiene valore diverso da zero:
 Campione non contiene analita (errore sperimentale)
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare
- Acqui Terme
- 4 Giugnoanalita
2010
 Campione
contiene
Validazione dei metodi analitici
Limiti di rivelazione e quantificazione
Confronto del segnale del campione con la
distribuzione del bianco
Errore di I specie
(errore )
Falso POSITIVO (affermare che
l’analita è presente quando è
assente)
Errore di II
specie (errore )
Falso NEGATIVO (affermare che
l’analita è assente quando è
presente)
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Limite critico
yC = Segnale minimo per cui α= 5% e β= 50%
Si attribuisce il segnale
del bianco all’analita con
un rischio del 5%
ybB
yLCc
Si attribuisce il segnale
dell’analita al bianco con
un rischio del 50%
yC = yB+ t⋅sB
 = 50%
 = 5%
t = t-Student ad una coda; sB = scarto tipo del bianco
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Limite di rivelazione
yD = Segnale minimo per cui α= 5% e β= 5%
yD = Limite di rivelazione
Si attribuisce il segnale del
bianco all’analita con un
rischio del 5%.
Si attribuisce il segnale
dell’analita al bianco con un
rischio del 5%.
yD = yB+ 2 * t⋅sB

yb
B
 = 5%
yLCc
yyd
D
 = 5%
Retta calibrazione y  a  bx
LOD (conc)
di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Si Corso
assume
lo stesso scarto tipo per bianco e campione
Validazione dei metodi analitici
Limite di quantificazione
yq  yb  10  sb
Retta calibrazione
y  a  bx
RSD% = 10%
RSD%
Segnale minimo per il quale:
10
LOQ (conc)
LoQ
Conc.
Lo scarto tipo deve essere
trascurabile rispetto al segnale
Determinazione quantitativa
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Limite di determinazione e quantificazione
Altre definizioni
LOD
LOQ
LOD
LOQ
S/N 3
S / N  10
3
b
10
b
b
b
Rapporto
segnale / rumore
b
Scarto tipo del bianco
b
Pendenza curva
calibrazione
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Recupero
Permette di rilevare eventuali perdite di analita o
contaminazioni del campione lungo l’intera procedura
analitica. Si valuta analizzando campioni reali fortificati
con aliquote note di analita.
C1  C2
Re cupero % 
100
C3
C1: concentrazione analita determinata dopo l’aggiunta
C2: concentrazione analita determinata prima dell’aggiunta
C3: concentrazione aggiunta
Tanto più il recupero è diverso dal 100%, tanto più sono
probabili problemi. D’altra parte un recupero vicino al 100%
non indica necessariamente un risultato corretto.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Recupero
In base al manuale AOAC per il Peer Verified Methods
program, il recupero atteso ad un certo livello di
concentrazione di analita è dell’ordine sotto specificato:
Analita%
Concentrazione
Recupero medio (%)
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001
100 %
10 %
1%
0,1 %
100 ppm
10 ppm
1 ppm
100 ppb
10 ppb
1 ppb
98-102
98-102
97-103
95-105
90-107
80-110
80-110
80-110
60-115
40-120
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Robustezza – Validazione secondaria
Robustezza: valutata verificando l’effetto di piccole
(deliberate) variazioni dei parametri che possono
prevedibilmente
influenzare
i
risultati
della
determinazione su precisione ed accuratezza.
Possibilmente, conviene ordinare le variabili in base alla
loro influenza sulle prestazioni del metodo.
Conviene focalizzare l’attenzione sulle variabili più
influenti (critiche).
Permette di definire procedure di controllo di qualità
per mantenere sotto controllo le variabili critiche.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Qualifica dei sistemi analitici
System Suitability Tests (SST)
I test di System Suitability sono concepiti per
verificare che un sistema analitico inteso nel suo
complesso (costituito da elettronica, strumentazione,
operazioni analitiche, campioni ecc) sia adeguato per
l’esecuzione della specifica analisi sia prima che
durante l’analisi stessa.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Qualifica dei sistemi analitici
System Suitability Tests (SST)
Nel caso di un sistema cromatografico parametri
quali i piatti teorici, fattori di tailing, risoluzione
e ripetibilità dei tempi di ritenzione di uno o più
analiti,
sono
l’adeguatezza
utilizzati
all’analisi
del
per
verificare
sistema
stesso.
Questi parametri sono generalmente misurati
durante l’analisi di un campione appositamente
costituito.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Esercizi interlaboratorio
Esercizi di Certificazione. Obiettivo: certificazione
di una o più proprietà (ad es. analita) di un Materiale
di Riferimento;
Esercizi di Standardizzazione. Obiettivo: studio
delle prestazioni di un metodo (“test method”);
“Proficiency tests”. Obiettivo: valutazione delle
prestazioni dei laboratori partecipanti;
Studi in Collaborazione. Un gruppo di laboratori
cerca di migliorare le proprie prestazioni analitiche
o di ottimizzare un metodo analitico.
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Proficiency tests (PTs)
 Obiettivo:
valutazione
delle
prestazioni
analitiche dei laboratori partecipanti
 Parametri di Riferimento:
a. Valore di Riferimento o Assegnato
b. Unità di Deviazione
 Valutazione di una prestazione singola
 Valutazione di prestazioni combinate utilizzando
punteggi compositi
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Proficiency tests (PTs)
Valutazione laboratorio per prestazione singola
Z-scores”(punteggi Z): Z = (XLAB – XRIF) / S
Dove:
XLAB = Risultato del Laboratorio
XRIF = Valore Assegnato di riferimento
S = Scarto tipo di riferimento
Valutazione delle prestazioni:
•|Z| ≤2: Soddisfacente
•|Z| compreso tra 2 e 3: Accettabile
•|Z| >3: Insoddisfacente
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
Validazione dei metodi analitici
Proficiency tests (PTs)
x = valore laboratorio
X = valore di riferimento
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
La qualità…
“La qualità è il risultato di un ambiente e di una
cultura costruiti con molta attenzione”
PHILIP B. CROSBY
"Qualità significa fare le cose bene quando nessuno
ti sta guardando"
HENRY FORD
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010
FINE
. . . e grazie a tutti per
l’attenzione !
Corso di Alta Formazione in Legislazione Alimentare - Acqui Terme - 4 Giugno 2010