biochimica del ferro - Dipartimento di Farmacia

Complessi di Coordinazione nelle
Scienze Biomediche
• Biologia
– Metalloproteine: proteine che contengono uno o più
centri metallici necessari per la loro funzione
Costituiscono circa il 25% delle proteine
• Trasporto ed immagazzinamento di ossigeno
• Trasferimento elettronico: riduzioni ossidazioni
• Enzimi: catalisi di reazioni biochimiche
• Medicina
– Diversi farmaci sono costituiti da complessi metallici
• Cisplatino ed analoghi di nuova generazione
Trasporto e immagazzinamento di
ossigeno molecolare (diossigeno)
1.
2.
3.
4.
Tipi di sistemi di trasporto ed immagazzinamento
Struttura elettronica dei complessi di Fe(III) e Fe(II)
Mioglobina
Emoglobina
Sistemi di trasporto ed immagazzinamento
di ossigeno molecolare
Gli organismi multicellulari richiedono opportuni sistemi di trasporto
e immagazzinamento dell’ossigeno molecolare.
Sono noti tre sistemi di trasporto e tutti e tre impiegano metallo
proteine di trasporto: emoglobina, emocianina, ed emeritrina.
La emoglobina Hb è una ferroproteina presente nella maggior parte
degli organismi animali
La emocianina Hc è una cuproproteina (il biometallo è Cu) che si
trova in diverse specie di artropodi e molluschi
La emeritrina Hr è una ferroproteina “non-eme” presente in alcuni
invertebrati marini.
L’ossigeno trasportato può essere immagazzinato in alcuni tessuti
come quelli muscolari grazie a metalloproteine di immagazzinamento
quali la mioglobina (Mb) che hanno centri metallici analoghi a quelli
delle metalloproteine di trasporto corrispondenti (Hb).
L’emoglobina e la mioglobina contengono uno ione ferro
coordinato da un gruppo eme (porfirina) che lega l’O2
Porfirina
Ferro porfirina
Heme
Eme
Proteina
CHIMICA DI COORDINAZIONE DEL FERRO
Configurazione: [Ar] 3d64s2.
Stati di ossidazione: -I, 0, +I, +II, +III, +IV, +V e +VI.
Fe(II): è un sistema d6
Fe(III): è un sistema d5
Formano complessi con una gran varietà di leganti, quali ad esempio il
[Fe(H2O)6]2+ o [Fe(H2O)6]3+
I complessi di Fe(III) in acqua possono dar luogo ad idrolisi:
[Fe(H2O)6 ]3+ + H2O  [Fe(OH)(H2O)5]2+ + H3O+ Ka = 1,8•10-3
Lo stesso vale per i complessi di Fe(II) :
[Fe(H2O)6 ]2+ + H2O  [Fe(OH)(H2O)5]+ + H3O+ Ka = 3,2•10-9
ma in misura molto minore
In un complesso ottaedrico lo ione Fe(II), d6, può esistere
negli stati ad alto e basso spin
E
eg
t2g
dxy
dx2-y2
dxz
dz2
D0
alto spin
(t2g)4(eg)2
dyz
Paramagnetico con 4 elettroni spaiati, S=2
eg
E
dx2-y2
dz2
D0
t2g
dxy
dxz
dyz
Diamagnetico, S=0
basso spin
(t2g)6
In un complesso ottaedrico lo ione Fe(III), d5, può esistere
negli stati ad alto e basso spin
E
eg
t2g
dxy
dx2-y2
dxz
dz2
D0
alto spin
(t2g)3(eg)2
dyz
Paramagnetico con 5 elettroni spaiati, S=5/2
eg
E
dx2-y2
dz2
D0
t2g
dxy
dxz
basso spin
(t2g)5
dyz
Paramagnetico con 1 elettrone spaiato, S=1/2
Passando da un complesso ottaedrico ad uno piramidale e a uno
quadrato planare, le energie degli orbitali d cambiano: gli orbitali
con componente z si abbassano in energia
E
dx2-y2
dx2-y2
dx2-y2
dz2
dz2
n
dxy
dz2
dxy
dxy
dxz
dyz
n
dxz
dyz
dxz
dyz
n
n
n
geometria
ottaedrica
geometria
piramidale
geometria
quadrato-planare
Complessi dell’O2
La molecola O2 può interagire con alcuni complessi di coordinazione per
dare “addotti”, in cui l’unità dinucleare O2 viene conservata e,
apparentemente, il metallo non cambia stato di ossidazione:
n [MLm] + O2 ⇄ [MLm]n(O2)
Il primo esempio (Vaska, 1963) è il complesso [Ir(O2)Cl(CO)(PPh3)2]
Dal punto di vista strutturale i
complessi di O2 possono essere
divisi in mono-, di-, fino a
tetra-nucleari. Si distinguono
inoltre in terminali o mono
dentati (1) e laterali o bi
dentati (2).
Struttura elettronica della molecola O2
E
*2p
p*2p
2p
2p
paramagnetica
2p
p2p
*2s
2s
6x2=12 elettroni di valenza
2s
2s
ord. di legame=(8—4)/2=2
La molecola di O2 può acquistare uno o due elettroni formando
gli ioni superossido O2-e perossido O22- come in KO2 e Na2O2
L’occupazione da parte di uno o due elettroni in più dell’orbitale
antilegante p2p* porta alla riduzione dell’ordine di legame
p2p*
2p
p2p
O2
O2-
O22-
La distanza di legame O-O aumenta quindi nell’ordine:
O2
O2O2-2
ossigeno
superossidi
perossidi
o.l. = 2
o.l. = 1.5
o.l. = 1
2 el. spaiati
1 el. spaiati
diamagnetico
Parallellamante si osserva una riduzione della frequenza di
stiramento (stretching) del legame O-O nello spettro IR
Addotti metallo-diossigeno
Gli addotti M-O2 possono essere caratterizzati dalla frequenza di
stiramento del legame O-O nello spettro IR e la distanza interatomica
O-O, che indicano la situazione elettronica del diossigeno coordinato.
Si parla quindi di:
Complessi tipo superossido quando tali parametri si avvicinano a quelli
dello ione superossido (O-O = 1145 cm1 e d = 1,33 Å, in KO2)
Complessi di tipo perossido quando i parametri sono vicini a quelli dello
ione perossido, O-O = 738 cm1 e d = 1,49 Å, in Na2O2).
In O2 la distanza internucleare è 1.207 Å
I complessi mononucleari terminali 1 hanno
O-O = 1130-1195 cm1 e d O-O = 1,25-1,35 Å,
e sono quindi di tipo superossido
I complessi mononucleari laterali 2 hanno
O-O = 800-932 cm1 e d O-O = 1,30-1,35 Å,
e sono quindi di tipo perossido
Natura del legame ferro-diossigeno
Il legame fra il metallo e l’O2 può
essere descritto dalla combinazione
lineare fra gli orbitali del frammento
di tipo [FeIIL5] a geometria piramidale
a base quadrata con gli orbitali della
molecola di O2 (di energia e simmetria
appropriate) che si coordina al ferro
occupando la sesta posizione di
coordinazione completando così un
contorno ottaedrico.
Se la molecola O2 viene orientata nel
piano yz, gli orbitali di simmetria
appropriata che essa utilizza sono
quelli p2p*, semioccupati, che si
combinano con gli orbitali dyz e dz2. z
O
L
Fe
L
x
L
O
L
L
y
Schema degli orbitali molecolari in FeIIL5-O2
I due MO di legame pieni (dz2-p*) e p(dxz-p*) ricevono maggior
contributo da quelli della molecola O2, suggerendo una polarizzazione
del legame Fe+-O2 e quindi una ossidazione parziale del Fe(II).
Questo accumulo di carica parziale negativa sul legante O2 spiega le
caratteristiche tipo superossido di questo tipo di complesso
Al limite, il ferro può trasferire totalmente l’elettrone passando a
Fe(III) e dando origine a un vero ione O2
Si noti che lo ione Fe(II) è ad alto spin mentre il complesso finale ha
tutti gli elettroni appaiati ed è quindi diamagnetico
Mioglobina (Mb)
E’ una metalloproteina monomera che ha la funzione di immagazzinare O2
nei tessuti muscolari dei vertebrati.
Ciascuna molecola di Mb può legare una molecola di O2:
- nella forma deossigenata è denominata deossiMb
- quando contiene O2 è denominata ossiMb.
Entrambe le forme devono essere distinte dalla forma metaMb,
(metamioglobina), che riguarda una mioglobina che è stata ossidata e
contiene pertanto Fe(III) e non è capace di legare diossigeno
La molecola ha MM di circa 17,8 kDa. La sua struttura fu risolta per
diffrazione di raggi X (1960) lavorando con un campione di sperma di
balena.
La molecola è formata da una catena polipeptidica chiamata globina,
costituita da 153 residui aminoacidici che sono disposti in 8 eliche ,
(identificate con le lettere comprese fra A e H) e in 7 segmenti di
congiunzione fra le eliche “anse” (p. es. l’ “ansa” AB unisce le eliche A e B).
Struttura della deossimioglobina
Struttura della mioglobina con in
evidenza il gruppo FeII-porfirina e
le istidine prossimale (F8 = His-93)
e distale (E7 = His-64)
La catena proteica si lega, per
mezzo di un atomo N di un anello
imidazolico di un residuo istidinico
(la cosiddetta istidina prossimale,
F8 = His-93), a un atomo di Fe(II)
che è già coordinato da 4 atomi di
N dell’anello porfirinico della
protoporfirina o heme
istidina
Struttura della deossimioglobina
Protoporfirina IX e il gruppo eme
L’anello profirinico presente nella Mioglobina ed in altri metalloenzimi è noto
come protoporfirina IX
Il corrispondente complesso con il ferro(II) è denominato Fe-protoporfirina
IX o anche gruppo eme
Protoporfirina IX
Fe-protoporfirina IX o eme
Aspetti strutturali della deossimioglobina
Lo scheletro ciclico aromatico di 24 atomi dell’anione porfirinato
delimita una cavità centrale che è adatta ad coordinare cationi
metallici di dimensioni compatibili con distanze di legame Np-M di 2,04
Å, anche se l’anello è flessibile e permette legami stabili leggermente
più lunghi o più corti.
Tale cavità risulta particolarmente adatta ad alloggiare Fe(II) a basso
spin, Fe(III) a basso spin, Co(II) o Co(III)
Nella struttura della deossimioglobina è presente un altro anello
imidazolico che fa parte di una istidina situata nella elica E (istidina
distale, E7 = His-64), che non è legato al metallo, ma è in prossimità
della sesta posizione di coordinazione del ferro, quella occupata dalla
molecola di diossigeno nella forma ossiMb.
Nella deossiMb il Fe è pentacoordinato; essendo ad alto spin e quindi più
grande della cavità lo ione Fe(II) non riesce a coordinarsi nel piano della
della protoporfirina IX, ma fuoriesce
di circa 0,6 Å verso l’azoto imidazolico
della istidina prossimale.
Ossimioglobina
Legandosi a O2 per dare la forma
ossiMb, il ferro si sposta verso il
piano del macrociclo. Si ottiene un
complesso di diossigeno terminale, con
un angolo Fe-O-O di 115°.
Nella deossiMb lo ione Fe(II) è in uno
stato fondamentale ad alto spin con 4
elettroni spaiati
Quando viene legato il diossigeno, lo
stato di ossidazione del metallo è più
ambiguo
a
causa
di
possibili
trasferimenti elettronici fra ossigeno
e centro metallico
Sono stati ipotizzati due modelli:
(i) uno in cui si assume un parziale trasferimento elettronico
dal metallo al legante per formare Fe(III) e O2 (superossido);
(ii) uno in cui si assume che lo ione resti Fe(II) ma passi in uno
stato di basso spin per l’aumento di campo cristallino
Ossimioglobina
Nella deossiMb lo ione Fe(II) è in uno
stato fondamentale ad alto spin con 4
elettroni spaiati: la forma deossi è
pertanto paramanetica con S=2
Quando viene legato il diossigeno, la
forma ossi è diamagnetica e, se si
considera il metallo ancora nello stato
di ossidazione (II), si può parlare che
nella ossiMb lo ione Fe(II) sia a basso
spin con S=0 (diamagnetico)
E
dx2-y2
dz2
dxy
dxz
dyz
Ciò riduce la dimensione effettiva dello ione e, di conseguenza, ne permette
lo spostamento verso la cavità della porfirina trascinando la istidina
prossima ad esso mentre il macrociclo recupera approssimativamente la sua
forma piana.
In altre parole, il legame di O2 con Fe induce un cambiamento della
coordinazione (da penta- a esa-coordinato) e di stato di spin del metallo
(HS → LS).
Questo determina una diminuzione delle dimensioni del metallo e quindi
un suo migliore assestamento nell’anello porfirinico.
Lo ione Fe(II) spostandosi verso l’anello porfirinico tira con se l’istidina
prossimale ad esso coordinata e ciò comporta un lieve aggiustamento
della struttura terziaria della globina, uno spostamento dell’elica F a cui
l’istidina è ancorata, che non ha però alcuna conseguenza funzionale
Ruolo della proteina nelle funzioni biologiche della Mb.
Nella proteina alcuni residui amminoacidici sono in prossimità del centro
metallico. In particolare istidina distale (His-64) chiude una angusta tasca
idrofobica che è anche delimitata da un residuo Valina ed uno Fenilalanina
L’analisi ai raggi-X dimostra che His-64 può
bloccare l’entrata in questa tasca e
pertanto O2 non può accedere ad essa a
meno che la istidina distale si muova verso
l’esterno, lasciandogli il passaggio grazie alla
flessibilità della globina.
L’ O2 che penetra nella tasca idrofobica
oltre a coordinarsi al Fe interagisce con la
istidina distale attraverso un legame a
idrogeno che coinvolge il gruppo N-H.
Questo
legame
idrogeno
stabilizza
ulteriormente l’unione di O2 al metallo.
hh
hh
Coordinazione del CO
L’istidina-64 ha l’ulteriore funzione di rendere difficile l’entrata di altri
substrati capaci di legarsi al Fe occupando il posto dell’O2 (es. CO).
In particolare il monossido di carbonio è prodotto in modo naturale nel corso
della degradazione metabolica dei gruppi eme e per questo può essere un
legante competitivo in sistemi biologici.
La sua affinità per i gruppi eme, quando questi sono liberi in soluzione
acquosa, è circa 20.000 volte più grande di quella di O2. Tuttavia i gruppi eme
di Mb (e di Hb) legano il CO soltanto circa 250 volte più fortemente che l’O2.
L’effetto discriminante della proteina è stato messo in relazione con ragioni
steriche.
Nella carbossimioglobina (complesso con CO), per permettere la formazione
di un legame quasi lineare (Fe-C-O devia dalla linearità soltanto di 6-9°), la
proteina deve spostare qualcuno dei suoi residui aminoacidici implicando una
spesa addizionale di energia e, pertanto, un effetto di discriminazione
positiva a favore dell’O2 che non ha bisogno di questi spostamenti.
Infatti:
O2 adotta una geometria piegata piuttosto che lineare, preferita da CO
(ibrido sp2 in O2, sp in CO).
O2 legato è stabilizzato da legami H con la His distale, mentre la
coordinazione di CO è inibita dall’ingombro sterico di residui aa in
prossimità del metallo
Ruolo della globina e ossidazione delle Fe-porfirine
La globina ha un altro ruolo: impedire che Mb si ossidi irreversibilmente
a metaMb con formazione dell’anione superossido.
O2 è un potente ossidante e dovrebbe reagire facilmente con la forma
ridotta dell’eme. Perciò la stabilità dei complessi eme-O2 nelle proteine
deve essere attribuita a fattori cinetici e non termodinamici.
Infatti i complessi porfirinici di
Fe(II) liberi si ossidano facilmente
in soluzione acquosa, probabilmente
con il seguente meccanismo:
Fe(II) + O2 ⇄ Fe(II)O2
Fe(II)O2 + Fe(II) ⇄ Fe(III)-O-OFe(III)
dove O-O rappresenta la forma
perossido. In più, il dimero perossido può essere a sua volta
trasformato in un dimero -ossido
attraverso l’intermedio FeIV=O.
L’ossidazione irreversibile di Fe(II) a Fe(III) è prevenuta se esistono
barriere strutturali che inibiscono la riduzione bi-elettronica di O2, come
dimostrato da Collman per modelli puramente inorganici (1974).
Emoglobina (Hb)
La emoglobina (Hb) è una molecola più
complessa della Mb. Nei mammiferi è
formata da quattro subunità (1, 2, 1,
2), ciascuna contenente un gruppo eme.
Dal punto di vista strutturale ciascuna
delle quattro subunità somiglia a una
molecola Mb
Le subunità di tipo  sono costituite da
141 residui mentre quelle di tipo  da 146
e la molecola ha in totale un PM di 64,5
kDa circa il quadruplo della Mb.
Le subunità 1, 2, 1, 2 sono disposte
attorno a una cavità centrale occupata da
molecole di acqua. Ciascuna di esse è unita
alle altre tramite interazioni elettro
statiche (“ponti salini”) che legano più
strettamente due “dimeri” 11 e 22
Struttura dell’emoglobina
2
1
1
2
Heme
22
11
Deossiemoglobina e ossiemoglobina
Poiché l’emoglobina contiene quattro subunità, ciascuna con un gruppo eme
e quindi uno ione Fe(II), essa può legare fino quattro molecole di O2.
L’ossigenazione dell’emoglobina altera la struttura di tutta la proteina:
L’Hb può esistere in due conformazioni distinte note come stati T(deossi
Hb) e R(ossiHb) che differiscono per la struttura quaternaria cioè per la
disposizione delle quattro subunità 1, 2, 1 e 2
Le differenze fra i due stati sono così grandi che i cristalli di deossiHb
possono spaccarsi quando assorbono ossigeno e si trasformano in ossiHb
La transizione da stato T a R avviene in seguito all’assorbimento di una o più
molecole di O2 ed è innescata dallo spostamento dello ione Fe(II) verso
l’anello porfirinico che tira con se l’istidina prossimale con un conseguente
aggiustamento della struttura terziaria della globina (in particolare dell’
elica F a cui l’istidina è ancorata). Questo aggiustamento all’interno di ogni
singola subunità, seppur lieve, comporta la rottura di una serie di ponti
salini (interazioni elettrostatiche) fra le quattro subunità stesse. Poiché
queste interazioni determinano la struttura quaternaria dell’emoglobina,
questa viene a subire una significativa alterazione conformazionale.
Variazione strutturale
a livello di eme
Spostamento dell’istidina
prossimale e dell’elica F
elica F
La coordinazione dell’O2 provoca lo
spostamento verso l’anello porfirinico
dello ione Fe(II) che tira con se
l’istidina prossimale con un conseguente
aggiustamento della struttura terziaria
della globina e in particolare dell’ elica
F a cui l’istidina è ancorata.
deossi
ossi
Piano della porfirina
Passando dallo stato T (deossi) a quello R (ossi) si hanno le seguenti
variazioni della struttura quaternaria:
- le catene  si avvicinano di circa 0.8 Å
- il dimero 11 ruota, come unità rigida, di 15° rispetto al dimero 22
- i contatti tra le subunità alle interfacce 12 e 21 si spostano
T
R
Effetto cooperativo
La transizione dell’emoglobina dallo stato T a quello R avviene
gradualmente quando i gruppi heme delle sue quattro subunità
hanno coordinato da una a tre molecole di ossigeno.
Lo stato R ha una maggiore affinità della forma T verso l’O2.
Di conseguenza, la coordinazione di una molecola di O2 ad una sub
unità dell’emoglobina favorisce la coordinazione di una seconda
molecola di O2 ad un’altra subunità e così via fino all’assorbimento
di quattro molecole di O2. Tale effetto è noto come cooperativo.
1
1
O2
O2
1
O2
1
2
…..
1
O2
4
Il trasporto dell’ossigeno
Nel sangue la solubilità dell’O2 è molto maggiore che in acqua:
- In acqua la solubilità è 6.6 cm3 in 1 dm3 a 293 K e 1 atm ovvero di 3
x 10-4 M
- Nel sangue, nelle stesse condizioni di T e P, la solubilità sale a 200
cm3 cioè 9 x 10-3 M
Questo è l’effetto della coordinazione dell’ossigeno alle molecole di
emoglobina presenti nei globuli rossi.
L’assorbimento dell’ossigeno da parte dell’emoglobina o della
mioglobina viene usualmente descritto da curve di ossigenazione in
cui si riporta la frazione di proteina ossigenata in funzione della
pressione parziale dell’ossigeno.
In queste curve il 100% corrisponde alla saturazione, cioè
all’assorbimento di una molecola di O2 da parte di tutte le molecole di
mioglobina o di quattro molecole di O2 da parte di tutte le molecole di
emoglobina.
Comportamento della mioglobina
Nel caso della mioglobina in cui i siti di legame al centro metallico M dei gruppi
eme a cui si coordinano le molecole di O2 sono indipendenti, la reazione può
essere descritta dall’equilibrio:
M + O2  MO2
Se chiamiamo  la frazione di M ossi
genata, si ricava facilmente che in
funzione della P(O2) segue una
funzione iperbolica:
 = [MO2]/([M]+[MO2])
= Kp·P(O2)/ [1+ Kp·P(O2)]
E’ conveniente esprimere l’affinità di
M per O2 come la pressione parziale
di O2 necessaria per saturare il 50%
della specie M, P1/2 (O2).
In tali condizioni, [M]= [MO2],
ottenendo: P1/2 (O2) = 1/Kp
Kp = [MO2]/[M]P(O2)
Comportamento della emoglobina
Il comportamento fisiologico della emoglobina (Hb) è diversa da quello della
mioglobina.
La curva di ossigenazione di Hb ha una forma sigmoidale invece della forma
iperbolica che si osserva per Mb (curva b a pH fisiologico di 7.2)
Questa forma indica che le 4 subunità
non si comportano come una semplice
somma di 4 Mb, ma che esse
presentano un effetto cooperativo
quando legano progressivamente le
quattro molecole di O2.
Così, le due prime subunità vengono
ossigenate peggio della Mb, ma le
ultime due mostrano praticamente la
stessa affinità per O2 di Mb.
Sistema emoglobina-mioglobina
Nei polmoni la P(O2) è circa tre volte
maggiore che nei tessuti (90-100
contro 30-35 mmHg)
Nei polmoni, dove ci sono elevate
pressioni di O2, l’Hb assorbe
efficentemente
l’O2
venendo
praticamente saturata
Nei tessuti, dove le pressioni di O2
sono basse, Hb è meno efficiente di
Mb e rilascia l’O2 alla Mb che
mantiene il 90% della saturazione
Emoglobina  trasporto di O2
Mioglobina  immagazzinamento O2
L’affinità della Hb per O2 viene diminuita da conc. crescenti di H+, Cl-, CO2 e
2,3-D-difosfoglicerato (DPG). La cavità centrale della deossiHb contiene un
certo numero di leganti positivi ai quali DPG può legarsi.
Poiché il cambiamento di conformazione conseguente alla ossigenazione
rompe questi siti di interazione, DPF stabilizza la forma deossi (inibendo
perciò la coordinazione di O2)
L’affinità per l’O2 diminuisce inoltre al diminuire del pH e si ha un’ abbassa
mento della curva di ossigenazione (pH=7.2  curva b, pH=6.8  curva c)
Ciò è dovuto al fatto che la transizione fra stato T ed R che è responsabile
dell’aumento di affinità per l’O2 all’aumentare della frazione di Hb ossigenata
(effetto cooperativo) è inibito dagli ioni H+ in quanto essi protonano alcuni
anioni responsabili di ponti salini che stabilizzano lo stato R