Enzimi di Restrizione

Modificazione & Restrizione del DNA
• Si tratta di un meccanismo di protezione dei batteri
contro l’invasione da parte di DNA estraneo, dovuto
all’azione specifica di particolari enzimi che tagliano
il DNA riconosciuto come estraneo (enzimi di
restrizione)
• osservato inizialmente in due ceppi di E. coli K-12 e
E. coli C che si comportavano in modo differente
rispetto all’infezione con il fago Lambda
• i fagi isolati dal ceppo C crescevano bene su ceppi C
ma pochissimo su ceppi K-12
• I pochissimi fagi sopravvissuti alla prima infezione
di fagi K-12 in seguito crescevano perfettamente su
K12 e C..
Modificazione/Restrizione in E. coli

CEPPO C

Crescita
vigorosa

CEPPO K12
CEPPO C
Crescita
vigorosa
POCHISSIMI
lambda
sopravvivono


I POCHISSIMI
lambda sopravvissuti
infettano K12 con
grande efficienza
CEPPO K12
Crescita
vigorosa
Interpretazione
•Cosa era successo ai fagi sopravvissuti alla prima infezione di E. coli
K12?
•E. coli K-12 ha un enzima di restrizione specifico (si chiama Eco K)
che degrada il DNA estraneo
•E.coli C NON possiede questo enzima di restrizione
•Il DNA dei fagi cresciuti su ceppi K-12 “sfugge” molto raramente
alla degradazione perché il sito sul DNA, riconosciuto da Eco K,
viene metilato ancor prima di essere tagliato
•In effetti ogni enzima di restrizione è una coppia di enzimi, una
endonucleasi che TAGLIA il DNA e una metilasi che METILA il
DNA.
•La metilazione IMPEDISCE il taglio del DNA, quindi il DNA
“sopravvissuto” dà origine a fagi lambda che in una successiva
infezione del ceppo di E. coli K12 sono “resistenti” al taglio perché
hanno il sito Eco K metilato.
Sistemi Restrizione/Modificazione:
Tre tipi principali
• Tipo I
•Tipo II
• Tipo III
ma anche
• Tipo IIS
• Tipo IIG
• Tipo IV
Per le tecnologie del DNA ricombinante di gran lunga i
più importanti sono il tipo II
Sistemi R/M di tipo II
• Tipo II: sono gli enzimi di restrizione per antonomasia, quelli
usati per le tecnologie del DNA ricombinante.
Sono ubiquitari nei procarioti
– Sono sempre una coppia di enzimi DISTINTI che
funzionano INDIPENDENTEMENTE
• Endonucleasi (l’enzima di restrizione che taglia il sito
riconosciuto): generalmente un omodimero con una sequenza
di riconoscimento di 4-8 bp, di norma - ma non in tutti i casi palindromica (G/AATTC = EcoRI)
• Metiltransferasi (enzima che modifica il sito riconosciuto):
monomero che riconosce la stessa sequenza della
endonucleasi, metilandola (metiltransferasi di EcoRI =
GAA*TTC)
RE (Endonucleasi di restrizione)
Tipo II
• Il DNA bersaglio può essere
– non-metilato: substrato sia per la MT che per la RE;
isolato da un ospite modificazione – emi-metilato: substrato per la MT ma non per la RE;
presente immediatamente dopo la replicazione del DNA
in un ospite modificazione +
– totalmente metilato: non è substrato né per la MT né
per la RE; presente tardivamente dopo la replicazione
del DNA in un ospite modificazione +
RE Tipo II
• Meccanismo enzimatico della
endonucleasi
– idrolizza lo scheletro dei fosfatidesossiribosi sulla catena del DNA
– l’idrolisi avviene sul “lato” 5’ del
gruppo fosfato dando origine a estremità
5’PO4 e 3’-OH
– le estremità sono saldabili ad opera
della(e) DNA ligasi
RE Tipo II
• Meccanismo enzimatico della metiltransferasi
– trasferisce un metile dalla S-adenosil Metionina
(SAM) a uno specifico nucleotide del sito di riconoscimento
– La metliazione può dare origine a N6-metA, 5-metC, N4metC
– I gruppi metilici sono posizionati sul solco maggiore della
doppia elica e non interferiscono con gli appaiamenti tra le basi
del DNA
– presumibilmente la metilazione impedisce il taglio da parte
della RE mediante ingombro sterico o ostacolando il binding
stesso della RE al sito
Hsd, mcr e mrr
I sistemi di restrizione in E. coli sono integrati in una “immigration control
region” di circa 14 Kb
mcrC mcrB hsdS
hsdM
hsdR
mrr
DH1 e DH5 sono mutanti hsdR (EcoKI- ma mk+) DP50 è hsdS (quindi è EcoKIsia rk- che mk-). Nota Bene: mutanti hsdS aboliscono sia la endonucleasi che la
metilasi, mutanti hsdR solo la metilasi
Alcuni ceppi come E coli C e HB101 (E coli B) sono (mcrC-mrr)
Hsd = Host Specificity for DNA
Mcr/mrr = methylation dependent restriction endonucleases
Nomenclatura degli enzimi di restrizione
http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html
•Per convenzione viene usato un acronimo di 3
lettere basato sul nome dell’organismo di
provenienza. 1a lettera = genere, 2a e 3a = specie
•Dopo l’acronimo seguono una lettera che denota il
ceppo e un numero romano che fa riferimento
all’ordine cronologico di scoperta
es. EcoRV (“eco erre cinque”) = Escherichia coli,
ceppo R, 5° enzima scoperto
Esempi di nomi di RE
• BamHI =Bacillus amyloliquefaciens H, 1° enz
• DpnI = Diplococcus pneumoniae, 1° enz
• SphI = Streptomyces phaeochromogenes, 1° enz
• HindIII = Haemophilus influenzae Rd, 3° enz
• BglII = Bacillus globigii, 2° enz
• PstI = Providencia stuartii 164, 1° enz
• Sau3A = Staphylococcus aureus 3A
• KpnI =Klebsiella pneumoniae OK8, 1° enz
Enzimi tipo II e siti di riconoscimento con
simmetria
I siti di restrizione degli enzimi tipo II sono
generalmente palindromici
“I TOPI NON AVEVANO NIPOTI”
“O MORDO TUA NUORA O ARO UN AUTODROMO”
Una palindrome è una sequenza con un DOPPIO asse di
simmetria:
Bam H1 site:
5’-GGATCC-3’
3’-CCTAGG-5’
Isoschizomeri - Neoschizomeri
•Enzimi di restrizione differenti che riconoscono la
stessa sequenza e la tagliano allo stesso modo
•Stesso sito riconosciuto: es. Sau3A, MboI, DpnI
riconoscono tutti la seq /GATC
•Esistono però anche enzimi (neoschizomeri) che
riconoscono lo stesso sito ma fanno un taglio
diverso tra di loro:
SmaI CCC/GGG = estremità piatte
XmaI C/CCGGG = estremità 5’ sporgenti
Siti di riconoscimento e estremità compatibili
BglII
5’A-G-A-T-C-T
T-C-T-A-G-A 5’
Sau3A
BamHI
5’G-A-T-C
C-T-A-G 5’
5’
Tutte queste estremità
“appiccicose” sono
compatibili tra di loro
G-G-A-T-C-C
C-C-T-A-G-G 5’
Isoschizomeri: due o più enzimi differenti riconoscono lo stesso sito. (es. MboI
taglia GATC, quindi è un isoschizomero di Sau3A)
Temperatura e attività degli enzimi RE
tipo II
Frequenza di taglio degli enzimi RE tipo II
Sau 3A (GATC) taglia (1/4)(1/4)(1/4)(1/4) = ogni 256 bp (assumendo G/C
= A/T, cosa generalmente non vera)
BamH1 (GGATCC) taglia (1/4)(1/4)(1/4)(1/4)(1/4)(1/4) = ogni 4096 bp
HindII (GTPyPuAC) taglia (1/4)(1/4)(1/2)(1/2)(1/4)(1/4) = ogni ~1Kb
NotI (GC/GGCCGC) taglia (1/4)8 = ogni ~66Kbb
I-CeuI (CGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAA –9/-13) taglia …..
ogni qualche cromosoma …..
Esempio: il batterio Wolbachia ha un DNA con il 70% circa di A/T. Con
che frequenza taglierà EcoRI?
Frequenza di taglio degli enzimi RE tipo II
Il batterio Wolbachia ha un DNA con il 70% circa di A/T. Ogni quanto taglierà
EcoRI in media?
Il sito di EcoRI è G/AATTC
In Wolbachia A = T = 35% e C = G = 15%
La possibilità che in prima base ci sia G non è più il 25% (1/4) ma 15%, cioè
0.15.
Analogamente che ci sia A in seconda base ha una probabilità del 35%, cioè
0.35
Considerato che queste probabilità sono indipendenti il calcolo è in conclusione
0.15 x 0.35 x 0.35 x 0.35 x 0.35 x 0.15 = 3.3764 10-4
Che equivale a 1/2961, UN TAGLIO OGNI 2961 bp
Estremità “adesive” o “sticky ends”
5’ sporgente (EcoRI)
5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’
3’ sporgente (PstI)
5’-CTGCAG-3’
3’-GACGTC-5’
5’-G-OH
3’-CTTAA-PO4

PO4-AATTC-3’
HO-G-5’
+
5’-CTGCA-OH
3’-G-PO4
+
PO4-G-3’
HO-ACGTC-5’
Estremità “piatte” o “blunt ends”
SmaI
5’-CCC|GGG-3’
3’-GGG|CCC-5’

5’-CCC-OH
+ 4
3’-GGG-PO
PO4-GGG-3’
HO-CCC-5’
RE tipo II - Utilizzi
Elettroforesi su gel di agarosio
_
Gel di
agarosio
+
Il DNA ha una carica
netta negativa che gli
deriva dai fosfati e che lo
fa “migrare” verso il
polo positivo in un
campo elettrico
Il DNA si visualizza grazie
all’intercalante Bromuro di
Etidio che assorbe UV e
restituisce una fluorescenza
nell’arancio (solo se è legato al
DNA)
Figure 3.15 Partial unwinding of the DNA double helix by EtBr intercalation between
adjacent base pairs. The normal DNA molecule shown on the left is partially unwound
by taking up four EtBr molecules, resulting in the ‘stretched’ structure on the right.
Gene Cloning and DNA Analysis by T.A. Brown. © 2006 T.A. Brown.
La velocità di migrazione del DNA è inversamente
proporzionale al log delle dimensioni della molecola
• La quantità di carica negativa su
una molecola di DNA è
proporzionale alla sua lunghezza,
MA il rapporto carica/massa è
costante
•Dato che la densità di carica di un
qualunque DNA è sempre la stessa,
la separazione dei DNA in
elettroforesi avviene in base alle loro
dimensioni
• Le dimensioni di un DNA ignoto si
possono ricavare confrontandone la
migrazione su gel rispetto a quella
di un DNA a dimensione nota
Le estremità compatibili sono saldabili
con la DNA ligasi
DNA umano tagliato con EcoRI
5’-C-G-G-T-A-C-T-A-G-OH
3’-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-PO4
DNA batterico tagliato con EcoRI
+
PO4-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
HO-G-T-C-G-A-T-G-C-5’
Le estremità si associano
grazie alla complementarietà
5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A-G A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A G-T-C-G-A-T-G-C-5’
+ DNA Ligasi, + ATP
5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-T-C-G-A-T-G-C-5’
Molecola di DNA ricombinante
Saldatura
mediante ligasi
Fagi - ATP
E.Coli/Eucar - NAD
Nicotinamide adenin
dinucleotide
T4 DNA ligasi