Diapositiva 1 - UniNa STiDuE

L’esame emocromocitometrico (EE) è tra gli esami di laboratorio più
richiesti per valutare lo stato di salute generale di un individuo.
Esso fornisce indicazioni su numero e dimensioni di globuli bianchi,
globuli rossi, piastrine, nonché sul contenuto di emoglobina nei globuli rossi
e sul rapporto di questi con la componente liquida.
All’EE si associa di routine la formula leucocitaria che fornisce indicazioni
numeriche delle diverse popolazioni leucocitarie (neutrofili, linfociti,
monociti, eosinofili, basofili).
Attualmente l’EE viene effettuato utilizzando analizzatori ematologici
automatizzati in grado di:
1.
2.
3.
4.
Determinare il volume cellulare
Determinare il numero cellulare
Determinare la conta differenziale dei leucociti
Determinare la concentrazione di emoglobina
Metodi di conteggio ematologici
L’analisi quantitativa o conteggio degli
elementi corpuscolati del sangue può essere
effettuato :
• con
metodo
manuale,
per conteggio
diretto degli elementi al M.O., previa esatta
diluizione del campione di sangue in provetta (o
in una apposita micropipetta) con soluzioni
neutre isotoniche e successiva deposizione in
camere contaglobuli (Thoma-Zeiss, Burker,
Neuebauer, ecc..)
• con
metodo
automatico,
mediante
l’impiego di contaglobuli elettronici
Definizione di emocromo
Analisi quantitativa e qualitativa degli elementi
corpuscolati del sangue
Eritrociti
Conteggio
Leucociti
Piastrine
Determinazione
Emoglobina
Ematocrito
Analisi quantitative
Analisi qualitative
Morfologia eritrocitaria
Morfologia piastrinica
Morfologia leucocitaria
Formula leucocitaria
L’esame emocromocitometrico è anche definito emocromo che
letteralmente significa misurazione del colore del sangue e del numero
delle sue cellule. Di fatto questo esame consente di determinare:
- il numero di tutte le cellule del sangue, cioè globuli rossi
(eritrociti), globuli bianchi (leucociti) e piastrine (trombociti);
- la formula leucocitaria, ossia la percentuale dei diversi tipi di globuli
bianchi: neutrofili, linfociti, monociti, eosinofili e basofili;
- la concentrazione dell’emoglobina, la proteina dei globuli rossi che
trasporta l’ossigeno ai vari tessuti del corpo;
- l’ematocrito, che è il volume di globuli rossi contenuto in 100 ml di
sangue: per esempio, se l’ematocrito è 40 significa che ci sono 40 ml
di globuli rossi in 100 ml di sangue;
- l’analisi delle caratteristiche fisiche (forma, dimensioni) dei
globuli rossi e delle piastrine. Queste sono indicate da speciali
parametri come MCV (misura delle dimensioni medie di un globulo
rosso), MCH (indica la quantità media di emoglobina contenuta in un
globulo rosso), MCHC (indica la concentrazione di emoglobina in un
globulo rosso), RDW (indica le variazioni delle dimensioni dei globuli
rossi) e MPV (misura delle dimensioni medie di una piastrina).
Parametro
Nome
Valori di riferimento
Cause di anormalità
infezioni;
leucemie;
processi infiamm.
WBC
White Blood Cells
4-11x103/l; 60% neutr.;
30% linf.; 5% mono;
4%eosino.;1% basof.
RBC
Red Blood Cells
4.5-5.5x106/l
4-5x106/l
HGB
Hemoglobin
HCT
Hematocrit
MCV
Mean Corpuscular
Volume
MCH
Mean Corpuscular
Hemogl.
RDW
Red Cell Distribution 11-16%
Width
PLT
Platelets
MPV
Mean Platelet Vol.
12-15 g/dl
40-50%
35-45%
80-97 fl
25-34 pg
150-400x103/l
7-10 fL
anemie; leucemie
anemie
anemie;
emoconcentrazione
-talassemia;
sideropenia;
deficit B12/folato
Anemie ipocromiche
Anemia sideropenica e
megaloblastica
Aplasia, leucemie, CID
piastrinopatie
Emocromo e fattori a lungo termine
• Età:
– Numero dei G.R., Ht e Hb, elevati alla nascita, decrescono
progressivamente fino a raggiungere i livelli più bassi a 2 mesi. Poi
riprendono ad aumentare sino ai valori degli adulti tra i 12 e i 15
anni.
• Sesso:
– Nelle donne il numero dei G.R., l’Hb e l’Ht sono più bassi del 5 –
10% rispetto a quelli degli uomini
• Gravidanza:
– Il numero dei G.R., l’Ht e l’Hb diminuiscono anche per aumento
della massa liquida circolante. Inoltre è presente una modesta
leucocitosi con neutrofilia.
Modalità di Analisi degli analizzatori di Ematologia
• Il sangue intero viene fatto aspirare dallo
strumento, che provvede automaticamente ad
aliquotarlo con una valvola campionatrice in
quantità distinte e a diluire ciascuna quantità per
i conteggi e le analisi dei parametri ematologici
• I conteggi e le analisi dei parametri ematologici
sono effettuate in camere di lettura differenziate,
applicando metodi/principi di analisi diversi
Metodo per il conteggio di WBC, RBC e PLT
• MANUALE: effettuato a microscopio in camere di
conteggio dedicate, su campioni di sangue trattati e diluiti
manualmente.
– LIMITAZIONI:
• Scarsa precisione, per il ridotto numero di cellule contate e le
tecniche manuali di preparazione del campione.
• Tempo
• Preparazione ed Esperienza dell’operatore
• AUTOMATIZZATO: eseguito dai contaglobuli su
campioni di sangue intero trattati e diluiti
automaticamente, con Principio Impedenziometrico
– VANTAGGI
• Elevata precisione e accuratezza: alto numero di cellule contate e
automazione
• Velocità di analisi (fino a 150 emocromi/ora)
Principio Impedenziometrico
Coulter
• Principio:
Si basa sul fatto che le
cellule sono cattivi
conduttori di elettricità
mentre il diluente è
ottimo conduttore.
• Funzionamento:
1)Diluiz. sangue in soluz.
elettrolitica isotonica
tamponata
2) Aspirazione del
campione attraverso
orifizi di diametro
specifico
3) Mantenimento corrente
costante tra due
elettrodi (uno esterno ed
uno interno rispetto alle
camere di conta)
Metodo Coulter
Ogni cellula che
attraversa
l’apertura del
campo elettrico
sostituisce un
volume di diluente
pari alle sue
dimensioni.
Ogni cellula
provoca un
cambiamento di
corrente
generando un
impulso elettrico
misurabile.
Principio Impedenziometrico Coulter
75 f L
70 f L
65 f L
60 f L
55 f L
50 f L
• Il passaggio della cellula
attraverso il campo
elettrico produce un
impulso la cui ampiezza è
direttamente
proporzionale al suo
volume.
• Il numero di impulsi
registrati consente il
conteggio degli elementi
cellulari
• L’analisi della ampiezza
degli impulsi consente la
differenziazione delle
cellule che hanno prodotto
gli impulsi
Istogrammi dimensionali
Relative Number
Histogram
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38
Femtoliters
• L’analisi volumetrica
degli impulsi consente
di costruire un
istogramma
dimensionale relativo a
ciascuna popolazione
cellulare (WBC, RBC,
PLT)
• Particolari tecnologie
brevettate consentono
di garantire la massima
accuratezza di analisi
Conteggio RBC e Piastrine
• Il conteggio e il dimensionamento
volumetrico di RBC e PLT viene eseguito
nella stessa camera di lettura, con
Principio Impedenziometrico
• L’analisi dimensionale degli impulsi, con
specifiche soglie volumetriche, consente di
differenziare i RBC dalle PLT
Analisi RBC
MCV = average size of all the cells in the histogram.
RDW = standard deviation x 100
Mean Size
• Gli impulsi compresi tra
36 e 360 fL sono
classificati come RBC e
vengono distribuiti su un
istogramma
dimensionale suddiviso
in 256 canali volumetrici
(1,3 fL /canale)
• Dall’istogramma RBC
viene eseguita la
misurazione del MCV e
del RDW
MCV: Volume Medio dei Globuli Rossi, utile nella
classificazione delle anemie (micro-, normo- macrocitiche
RDW: Ampiezza della distribuzione dei Globuli Rossi,
Analisi RBC: parametri calcolati
• MCH = Hb x10
RBC
MCHC= Hb x 100
HCT = MCV X BC
HCT
10
• MCH = Contenuto Medio di Emoglobina nei RBC.
Particolarmente utile nella classificazione delle anemie
(ipo- o normo- cromiche) in associazione al parametro
MCHC
• MCHC= Concentrazione cellulare Media di Emoglobina.
Particolarmente utile nella classificazione delle anemie
(ipo- o normo- cromiche) in associazione al parametro
MCH
• HCT= Ematocrito, esprime la % di volume occupata dai
RBC nel volume totale di sangue intero.
Analisi Morfologia RBC
•
•
•
•
•
•
Anisocitosi +, ++, +++
Microcitosi +, ++, +++
Macrocitosi +, ++, +++
Ipocromia +, ++, +++
Poikilocitosi +, ++, +++
Doppia Popolazione
RBC
• Micro RBC/Frammenti
RBC
• Agglutinazione RBC
• L’analisi dei parametri
eritrocitari (MCV, MCH,
MCHC, HCT, RDW)
associata alla valutazione
dell’istogramma RBC
consente agli analizzatori di
fornire utili flags di
anormalità morfologiche
• Tali flag sono utili al
laboratorio nella valutazione
al microscopio degli strisci di
sangue periferico
Analisi PLT
#1 - Vengono raccolti i dati del
triplice conteggio ed
elaborato un primo
istogramma con soglie da
2fl a 20 fl.
– Limite inferiore di 2 fl.
Rimuove interferenze da noise
elettronico
– Limite superiore di 20 fl.

Assicura che non vengano
contati microciti e frammenti
RBC
Analisi PLT: parametri calcolati
• Dall’istogramma PLT vengono derivati ulteriori
parametri quali:
– PCT (ematocrito Piastrine)
– MPV (Volume Medio PLT)
– PDW (Ampiezza Distribuzione PLT, indice di Anisocitosi
Piastrinica)
• L’analisi dei parametri PLT (PCT, MPV, PDW)
associata alla valutazione dell’istogramma PLT, RBC,
WBC consente agli analizzatori di fornire utili flag di
anormalità morfologiche, quali:
– AGGREGATI PLT
– PIASTRINE GIGANTI
– TROMBOCITOPENIA, TROMBOCITOSI
ISTOGRAMMA PLT -NORMALE
Conteggiate
da 2 a 20 fL
Platelet Distribution Width
S.D. (MPV)
PDW = ------------MPV
x 100
Small Platelet MPV < 7 fL
Large Platelet MPV > 11 fL
Giant Platelet MPV > 20 fL
Valori di riferimento
PLT: 140-440 x 10^9/L
MPV: 7.4-10.4 fL
PCT:
0,150-0,320 %
PDW: 15.5-17.5
Determinazione Hb
Misura in Spettrofotometria dopo
trasformazione dell’ Hb in
Cianmetaemoglina, con reagente specifico,
dedicato
• Metodica:
– Reagente Hb Modificato, ottimizzato per
eliminare interferenze di Sulfoemoglobina
– Misura fotometrica della Assorbanza
campione. Filtro ad ampia banda, con valore
centrale @ 525nm.
– Filtro Infrarosso per assorbimento calore
– Misura del Bianco ad ogni campione
Conteggio Globuli Bianchi
Y
X
35
50
fL
• Il campione diluito viene
trattato con un particolare
reagente che provoca la lisi
completa dei RBC
• Tutti gli impulsi registrati con
volume superiore a 35 fl.
sono classificati e contati
come Globuli Bianchi
• Tutti gli impulsi registrati con
volume inferiore a 35 fl. sono
classificati e registrati come
Piastrine o frammenti RBC
lisati ed esclusi dal conteggio
Tecnologia VCS
Analisi volumetrica
Volume
Analisi strutturale
Complessità cellulare interna
Conduttività
Studio di dispersione della luce laser
Granulazioni interne
Superificie cellulare
Scatter luce laser
Volume Cellulare (IMPEDENZIOMETRIA)
Densità
del
Nucleo,
Rapporto
Nucleo/Citoplasma
(CONDUTTIVITA’)
Granulazioni Citoplasmatiche (SCATTER DI LUCE LASER)
Tanto maggiore è la complessità cellulare tanto più elevata è la
resistenza opposta dalla cellula al passaggio di corrente, e
quindi tanto maggiore è la sua opacità.
Tra gli elementi strutturali interni della cellula, il nucleo è quello
con più bassa resistenza ed è quindi un ottimo conduttore di
corrente. Cellule con elevato rapporto N/C (Linfociti) hanno una
Opacità minore di cellule con rapporto N/C ridotto (Granulociti).
La misura dello scatter di luce laser, combinata alle misure di
Impedenza e Conduttività/Opacità, consente una classificazione
completa delle popolazioni leucocitarie in base alle peculiari
caratteristiche: volume cellulare, grandezza e densità del
nucleo, rapporto N/C, granularità e superficie cellulare.
Tecnologia VCS – Formula
Leucocitaria
– Tutte le cinque popolazioni sono contate direttamente, senza calcoli
o derivazioni matematiche
– TRE diverse tecnologie di indagine applicate simultaneamente
– Definizione delle popolazioni cellulari (cluster) con tecnologia
AccuGate
– Conservazione delle cellule allo stato NATIVO
V - VOLUME
C - CONDUTTIVITA’/OPACITA’
S - SCATTER DI LUCE LASER
Sofisticato sistema di separazione
delle popolazioni cellulari, mediante AccuGate
LINFOCITI
NEUTROFILI
BASOFILI
MONOCITI
EOSINOFILI
Visione della Parte numerica
Anomalie Quantitative dei Leucociti
Possibile definirle molto bene in funzione della estrema
precisione nel conteggio TOTALE E DIFFERENZIALE dei Leucociti e
diagnosticabili in funzione dei Valori Assoluti delle cellule
• Neutropenie
• Linfocitopenie
•
•
•
•
•
Neutrofilie
Eosinofilie
Basofilie
Linfocitosi
Monocitosi
EDTA
• La concentrazione del sale di- o tripotassico
raccomandata è di 1,5 ± 0,25 mg/mL di sangue.
• Un eccesso di EDTA altera sia gli eritrociti che i leucociti
provocando concentrazione e alterazioni degenerative.
• Una quantità di EDTA superiore a 2mg per mL di sangue
può portare ad una significativa diminuzione
dell’ematocrito e ad un aumento dell’MCHC.
• Anche le piastrine risentono dell’eccesso di EDTA
(rigonfiamento e disintegrazione, aumento artificiale del
numero delle piastrine perché i frammenti sono così
grossi
da
essere
contati
come
piastrine
morfologicamente normali).
Pseudopiastrinopenie
Sono causate da aggregazioni in vitro delle piastrine,
un artefatto
determinato da varie cause
CAUSE PREANALITICHE
•Accesso alla vena difficoltoso
•Concentrazione ridotta di anticoagulante
• Satellitismo piastrinico (Adesione delle piastrine ai
Gr. Neutrofili)
• Aggregazioni da uso di anticoagulanti EDTA-K3
Satellitismo Piastrinico
Il Satellitismo piastrinico è un
fenomeno abbastanza raro che si
osserva in alcuni campioni di sangue a
contatto con EDTA e conservato a
Temperatura ambiente. Consiste nella
formazione di rosette con al centro un
Granulocita neutrofilo circondato da
Piastrine. Al conteggio automatizzato
si osserva sempre una piastrinopenia
I lipidi nel sangue sono rappresentati
essenzialmente dai fosfolipidi, dai trigliceridi, e
dal colesterolo libero ed esterificato.
A causa delle loro proprietà idrofobe, i lipidi nel
sangue non sono allo stato di dispersione
molecolare, ma aggregati a specifiche proteine
di trasporto: le apolipoproteine.
Le lipoproteine derivanti dall’associazione delle
apolipoproteine e dei lipidi costituiscono un
sistema eterogeneo.
• Il colesterolo è uno steroide con 27C disposti in una
struttura a 4 anelli carbociclici condensati.
• Componente delle
membrane cellulari
• Precursore per
– Acidi biliari
– Vitamina D
– Ormoni steroidei
• trigliceridi o acilgliceroli sono molecole composte dal
glicerolo e da uno, due, o tre acidi grassi (monogliceridi,
digliceridi o trigliceridi)
Il dosaggio lipidico
• Il colesterolo ed i suoi esteri, liberati dalle lipoproteine mediante
l’azione di detergenti, vengono prima idrolizzati in una reazione
catalizzata dalla colesterolo-esterasi e poi ossidati ad opera della
colesterolo-ossidasi. Il perossido di idrogeno che si forma durante
l’ossidazione, viene misurato con l’aggiunta di una perossidasi e di un
cromogeno: la concentrazione del composto viene misurata con lo
spettrofotometro (546 nm).
• La determinazione dei trigliceridi prevede l’azione di speciali lipasi che
idrolizzano i trigliceridi in glicerolo ed acidi grassi liberi; il glicerolo viene
ulteriormente trasformato in diidrossiacetonfosfato e H2O2 ; anche in
questo caso la concentrazione di H2O2 viene misurata con lo
spettrofotometro (lunghezza d’onda 546 nm).
• Le concentrazioni sono espresse in mg/dl.
DOSAGGI
Colesterolo totale (libero e esterificato):
Metodo spettrofotometrico con reazione enzimatica (col. ossidasi) e produzione
di un prodotto colorato (Chinonimina-reazione di Trinder).
Colesterolo-HDL:
Ultracentrifugazione, precipitazione, separazione delle frazioni LDL e VLDL e
determinazione del colesterolo-HDL con il metodo spettrofotometrico.
Colesterolo-LDL:
Se i trigliceridi sono normali o 400 mg/dl non occorre dosarlo poiché il suo valore
può essere calcolato con la formula di Friedewald:
LDL = colesterolo totale – (HDL + 1/5 trigliceridi)
Quando il valore dei trigliceridi supera 400 mg/dl, la formula di Friedewald non è
attendibile ed è pertanto necessario eseguire la determinazione del colesterolo
LDL con metodiche di ultracentrifugazione.
Trigliceridi:
Idrolisi enzimatica (lipasi)  ac. grassi e glicerolo e dosaggio glicerolo con
metodo enzimatico
Apolipoproteine: immunoassay (ELISA/RIA)
Il profilo lipidico ideale
I livelli dei lipidi plasmatici variano significativamente nelle diverse popolazioni
in rapporto a fattori genetici oltre che ambientali, in particolare l’alimentazione.
È quindi difficile definire dei valori "normali"; piuttosto i grandi trials condotti
negli ultimi anni e le diverse organizzazioni e gruppi di studio internazionali
hanno individuato dei valori "accettabili" in quanto correlati ad un minor rischio
cardiovascolare e quindi "auspicabili", e valori invece al di sopra dei quali il
rischio aumenta progressivamente da moderato ad elevato. La definizione di
questi limiti è di fondamentale importanza per decidere la successiva strategia
diagnostica
e
terapeutica.
Sono "auspicabili" valori di colesterolo totale inferiori a 200 mg/dl e di
colesterolo LDL inferiori a 130 mg/dl. Sono considerati valori "limite" per il
colesterolo totale quelli compresi tra 200 e 239 mg/dl e per il colesterolo LDL
tra 130 e 159 mg/dl. Valori superiori a questi sono definiti "elevati" e si
associano ad alto rischio di sviluppare cardiopatia ischemica.
Sono "auspicabili" valori di colesterolo HDL compresi tra 40 e 60 mg/dl; per i
trigliceridi sono "auspicabili" valori inferiori a 200 mg/dl, "limite" valori tra 200 e
400 mg/dl ed "elevati" valori sopra i 400 mg/dl.
VALORI IDEALI/DESIDERABILI
Colesterolemia
inferiore a 200 mg/dl
HDL-colesterolo
non inferiore a 40 mg/dl
LDL-colesterolo
non superiore a 130 mg/dl
Trigliceridemia
inferiore a 200 mg/dl
Lipoproteine
Complessi lipoproteici circolanti, formati da trigliceridi,
colesterolo, fosfolipidi e proteine
Si classificano:
- in base alla migrazione elettroforetica, in -lipoproteine
(HDL), pre-lipoproteine (VLDL) e -lipoproteine (LDL)
- in base alla densità, mediante l’ultracentrifugazione
preparativa, in chilomicroni, VLDL, LDL e HDL
Lo studio delle lipoproteine consiste nella definizione del valore percentuale delle
diverse frazioni lipoproteiche ed eventualmente dei lori reciproci rapporti
quantitativi. La separazione tra le diverse classi viene effettuata sulla base delle
diverse caratteristiche chimico-fisiche.
Ultracentrifugazione: Il contenuto lipidico conferisce alle lipoproteine una densità
più bassa rispetto a quella delle altre proteine plasmatiche, inoltre ogni classe di
lipoproteine ha una diversa densità.
Elettroforesi: È una tecnica di separazione basata sulla diversa velocità di
migrazione delle lipoproteine sottoposte ad un campo elettrico. La mobilità
elettroforetica, in base alla quale le lipoproteine possono essere separate e
classificate, è influenzata dalla natura del mezzo in cui avviene la migrazione,
dalle caratteristiche del campo elettrico applicato, dalla massa, dalle dimensioni,
dalla carica e dalla forma delle varie lipoproteine: i chilomicroni, se presenti,
rimangono all’origine, le altre lipoproteine migrano a velocità che aumentano
secondo il seguente ordine: LDL <VLDL < HDL. Il mezzo di supporto più
comunemente utilizzato è il gel di agarosio. Le lipoproteine sono rese visibili
mediante coloranti lipofili (Oil Red O, Fat Red 7B, Sudan Black B).
Misura della concentrazione delle apoproteine: Le apoproteine possono essere
analizzate con metodiche quantitative o qualitative di tipo immunometrico.
FENOTIPO
LIPOPROTEINE
AUMENTATE
I
CHILOMICRONI
IIA
LDL
IIB
LDL E VLDL
III
BETA-VLDL
IV
VLDL
V
CHILOMICRONI
VLDL
E
Il lipidogramma elettroforetico consente di diagnosticare i vari tipi di
Fredrickson
Deficienze familiari di lipoproteine
Morbo di Tangier, viene trasmesso come carattere autosomico
recessivo. E’ sostenuto da un deficit strutturale dell’apolipoproteina
AI e da una difettosa rimozione del colesterolo dai tessuti periferici.
Il morbo di Tangier è riconoscibile dai seguenti rilievi:
Colesterolemia inferiore a 100 mg/dl e trigliceridemia normale;
Assenza delle lipoproteine HDL (apo AI).
La abetalipoproteinemia, viene trasmessa come carattere
autosomico recessivo. La mancata sintesi epatica ed intestinale di
apolipoproteine B condiziona una sindrome da malassorbimento
con gravi effetti secondari.
Esami di laboratorio tipici:
Colesterolemia inferiore a 100 mg/dl e trigliceridemia inferiore a 30
mg/dl;
Totale assenza delle lipoproteine contenenti apolipoproteina B
(Chilomicroni, VLDL, LDL).
E ora mi tocca studiare…!
A proposito….
Quando vi sono gli
esami…?!?
Lunedi 5 Luglio e Martedi 27 Luglio
Ore 9 a Caserta
Grazie per la Vostra Attenzione
e…..Arrivederci agli Esami…..!!!!