Diapositiva 1

BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES
Colonizzazione cute
Migrazione tratto sottocutaneo
Colonizzazione punta CVC
COMMENSALI della pelle: Staphylococcus epidermidis, S.aureus
Corynebacterium spp
COMMENSALI del tratto intestinale: Escherichia coli
Klebsiella, Enterococcus
Batteri ambientali: Pseudomonas aeruginosa
Sphyngobacterium spp
Stenotrophomonas spp
COOMENSALE delle mucose: Candida albicans
5 milioni di CVC impiantati
ogni anno
250.000 infezioni associate a cateteri
12%- 25% mortalità
Aumento della spesa ospedaliera da
3000$ a 56167 $ per paziente
American College of Critical Care Medicine e
della Society for Healthcare Epidemiology of
America
Superficie di catetere sterile
Film proteico depositato sulla
superficie del CVC
Superficie di catetere
colonizzato da
Staphylococcus epidermidis
ESEMPIO:
Central Venous Catheters
greatest risk of device-related infection
infection rates of 3 to 5%.
Biofilms are universally present on CVCs
biofilm development: outside of the catheter or inner
lumen
Colonization and biofilm formation may occur within 3
days of catheterization
Metodi utilizzati per la determinazione quantitativa della
popolazione microbica adesa a superfici rigide
Metodi diretti:
Metodi indiretti:
 conta UFC di batteri eluiti
 microscopia ottica
con mezzi fisici
 elettronica (trasmissione, scansione)
 colorazione batteri adesi e
 confocale
successivo saggio del
colorante eluito
 radiomarcatura
 biologici
Svantaggi presentati dai vari metodi:







impossibilità di distinguere tra cellule vive e morte
possibile alterazione integrità cellulare
possibile morte di parte della popolazione batterica
distacco non garantito di tutte le cellule
impiego di sostanze tossiche
decadimento e diluizione dell’isotopo radioattivo
necessità di curve di correlazione per ogni microrganismo
METODI DIRETTI
•
MICROSCOPIA OTTICA
•
MICROSCOPIA ELETTRONICA
•
MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE
•
MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
•
MICROSCOPIA CONFOCALE
MICROSCOPIA OTTICA
VANTAGGI
SVANTAGGI E LIMITI
• Facilità di esecuzione
• Non distingue Vivi/Morti
• Porzioni di materiali
Mai diagnostica, mai predittiva, sempre complementare
MICROSCOPIA ELETTRONICA
VANTAGGI
•
•
•
Caratterizzazione
strutture di adesione
Localizzazione antigeni
Visualizzazione di un
fenomeno
SVANTAGGI E
•
•
•
•
•
•
•
LIMITI
Non distingue Vivi/Morti
Natura del materiale
Porzioni di materiali
Artefatti
Non facile
ANALISI QUALITATIVA
NON SU BIOMATERIALI
MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE
VANTAGGI
SVANTAGGI E
•
•
•
•
•
•
Dettegli sull’attaccamento
microbico
Osservazione anche del
materiale opaco
SOLO QUALITATIVA
LIMITI
Non distingue Vivi/Morti
Solo porzioni di materiale
Non facile
MICROSCOPIA A FLUORESCENZA
(CTC, ARANCIO DI ACRIDINA, DAPI, RODAMINA 123)
VANTAGGI
SVANTAGGI E LIMITI
•
•
Distingue Vivi/Morti con
colorazioni differenziali
(BacLight Live/Dead)
Incubazione/Preparazione del
campione
SYTO9: COLORANTE CATIONICO LIPOFILICO CHE PENETRA ATTRAVERSO LE
MEMBRANE E MARCA I BATTERI VIVENTI CON UNA FLUORESCENZA VERDE
IODURO DI PROPIDIO: COLORANTE ANIONICO CHE NON PENETRA LE
MEMBRANE. SE LE MEMBRANE SONO DANNEGGIATE O COMPROMESSE
(BATTERI UCCISI) PENETRA E MARCA CON UNA FLUORESCENZA ROSSA
MICROSCOPIA CONFOCALE
VANTAGGI
SVANTAGGI
• Illuminazione laser
• Materiale opaco e
trasparente
• Non evidenzia interazioni
Interno/Esterno materiale
• Solo porzioni di materiale
METODI INDIRETTI PER LA DETERMINAZIONE
DI MICRORGANISMI ADESI
Metodi di conta con distacco dei batteri
 METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE
 METODO DI CLERI
 METODO DI SHERETZ
Metodi di conta in situ
 MARCATURA CON ISOTOPI
 SAGGI IMMUNOENZIMATICI
 SAGGI BIOLOGICI
Qualitativo
Coltivazione in brodo di punta del catetere
Vantaggi
Grande semplicità
Grande sensibilità
Svantaggi
Non discriminante tra
contaminazione
colonizzazione
infezione
Non garantito lo sviluppo
di tutte le specie presenti
Impossibilità di determinare
se presente più di una specie
Necessaria la rimozione
del catetere
METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE
Ampiamente utilizzato per cateteri venosi
Semina mediante striscio su opportuni terreni solidi
Semiquantitativo
Sviluppo di:
<15 colonie
Contaminazione
>15 colonie
Colonizzazione
Rotolamento di punta del catetere
su piastra per 4 volte
Vantaggi
Svantaggi
Grande semplicità
Bassa specificità
Bassa predittività
Facilità di esecuzione
Microrganismi vivi
Non garantito il distacco
dei batteri
Coltivazione della sola
porzione esterna del
catetere
Necessaria la rimozione
del catetere
METODO DELLA SONICAZIONE
Distacco dei microrganismi adesi o mediante sonicazione o
vortex
Semi-quantitativo (CRI)
Coltivazione della punta e
del segmento distale del catetere
Vantaggi
Sonicazione,
vortex
Microrganismi vivi
Sensibilità alta
Facilità di esecuzione
<102 colonie
Sviluppo di:
Contaminazione
>102 colonie
Colonizzazione
Svantaggi
Non garantita la vitalità
ed il distacco dei batteri
Non distingue tra
colonizzatori parte
esterna e lume
Necessaria la rimozione
del catetere
SAGGI IMMUNOLOGICI ELISA
VANTAGGI
•
No radioattivo
SVANTAGGI E
•
•
•
•
•
LIMITI
Conoscenza del microrganismo
Espressione dell’antigene
Semi-quantitativa
Microrganismi in superficie
Antigene nella forma plantonica è
espresso?
• Curve di riferimento
Metodi biologici
Correlazione tra un fattore batterico (ATP, consumo di O2,
produzione di CO2, ecc.) e numero di batteri
VANTAGGI
• No radioattivo
• Indipendente dallo stato
del microrganismo
(plantonico/sessile/biofilm)
• Distingue vivi da morti
• Nessuna manipolazione
del supporto abiotico
SVANTAGGI E
LIMITI
• Curve di riferimento
con metodo della
conta delle UFC
Contenuto di ATP e numero di batteri
VANTAGGI
•
Indipendente dallo stato del
microrganismo
(plantonico/sessile/biofilm)
•
Distingue vivi da morti
SVANTAGGI E
•
•
LIMITI
Curve di riferimento con
metodo della conta delle
UFC
Rottura dei batteri non
sempre efficace
Correspondence curves between log CFU-per-milliliter and log relative light unit (RLU) mean values
IL METODO BIOTIMER
 Consente di determinare il numero di batteri adesi, aggregati o in biofilm,
mediante un test biochimico e non mediante la classica determinazione del
numero delle unità formanti colonia (UFC)
 Il BioTimer utilizza un terreno di coltura contenente un indicatore di pH
(rosso fenolo), che vira dal rosso al giallo in seguito all’acidificazione del
terreno
 Il tempo richiesto per il viraggio dell’indicatore viene correlato con il numero
di cellule batteriche presenti inizialmente nel campione attraverso una curva
di correlazione specifica
 Il nuovo metodo consente di determinare il numero di batteri in situ, senza
manipolazione del campione
Ceppi utilizzati
Streptococcus sobrinus ATCC33478T
Streptococcus oralis ATCC35037T
Escherichia coli MG1655 ATCC47076
Staphylococcus aureus ATCC6538
Pseudomonas aeruginosa PAO1
Esempi di curve di correlazione tra tempo di viraggio
dell’indicatore e
numero dei batteri presenti nel campione
Log UFC
8
Streptococcus sobrinus
y = -0,3056x + 8,2608
7
6
Log UFC
5
8
Streptococcus oralis
y = -0,301x + 9,0615
7
4
4
Log UFC
5
6
7
8
8
9
10
11
12
13
14
Staphylococcus aureus
6
5
y = -0,5443x + 8,5446
7
4
6
6
7
8
9
10
11
12
13
Tempo (ore)
5
4
1
2
3
4
5
6
7
8
Tempo (ore)
14
Metodi di valutazione dell’attività
degli antibiotici in vitro
1
METODI PER DILUIZIONE in TERRRENO LIQUIDO o SOLIDO
2
METODI PER DIFFUSIONE in TERRENO SOLIDO
MIC
Concentrazione Minima Inibente
MBC
Concentrazione Minima Battericida
SOLO PER BATTERI IN FORMA PLANCTONICA
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
NON IDONEO PER BIOFILM
Calgary device
Sistema per la
determinazione della
minima concentrazione
per l’eradicazione del
biofilm (MBEC)
National Committee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS)
APPLICAZIONE DEL BIOTIMER NELLA
DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA
SUSCETTIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI DA
PARTE DI BATTERI ADESI IN BIOFILM A
CATETERI
NESSUNA MANIPOLAZIONE DEL
CAMPIONE !!!!!!!!!!!!!