A PCR BASED SURVEY ON THE PRESENCE OF Helicobacter

A PCR BASED SURVEY ON THE PRESENCE OF Helicobacter pylori IN RAW GOAT MILK
PRODUCED IN SOUTHERN ITALY: PRELIMINARY RESULTS
Quaglia N.C.*, Dambrosio A., Normanno G., Parisi A2., Germinario G.L.1, Lorusso V., Firinu A3., Celano G.V.
Dipartimento di Sanità e Benessere Animale- Facoltà di medicina Veterinaria- Str. Prov. Per Casamassima Km
3, 70010 Valenzano (Ba), Italy
1
AUSL Bari 2- Contrada Cicchillo-Tittadegna -70051 Barletta – Bari
2
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e Basilicata, Sez. Putignano (Ba), Italy
3
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna Via F.lli Kennedy-08100- Nuoro Italy
*Corrisponding author: Tel and Fax: +390804679895; E-mail address: [email protected]
Keywords: Helicobacter pylori, latte caprino, MT-PCR, genotipizzazione.
ABSTRACT
Helicobacter pylori (Hp) is an organism widespread in the human population and sometimes responsible of
serious illnesses, such as gastric and duodenal ulcer, MALToma and gastric cancer. It has been hypothesized
that the transmission of Hp involves multiple pathways such as iatrogenic, oral-oral and fecal-oral. Hp has been
detected in Italy from an high percentage of sheep milk samples: consequently, it has been assumed that
contaminated foods, such as milk, may act as vehicle of transmission of Hp infection in humans. However, the
isolation of the microorganisms using traditional techniques is difficult and time consuming. This work gives the
preliminary results of a survey conducted on raw goat milk produced in Southern Italy, using a multiplextouchdown PCR (MT-PCR) assay for the detection and characterization of Hp. Out of the 70 goat milk samples
examined three (4.3 %) showed the presence of Hp genes and has been identified as genotype vacA +.
INTRODUZIONE
Helicobacter pylori (Hp) è una delle più comuni cause di infezioni croniche ad eziologia batterica nell’uomo;
recentemente l’infezione da Hp è stata associata allo sviluppo di adenocarcinoma gastrico e di linfoma gastrico
tipo MALT (MALToma) (Frenck et al., 2003). Le modalità di infezione non sono a tutt’oggi completamente
note e si ipotizzano diversi meccanismi di contagio anche se il più accreditato sembra essere il ciclo oro-fecale
(Dunn et al., 1997): gli alimenti contaminati potrebbero fungere da veicolo di trasmissione del microrganismo
all’uomo. Infatti, Hp è stato isolato da acqua potabile (Lu et al., 2002) e da alimenti di origine animale come latte
ovino (Dore et al., 2001) e bovino, pertanto si può ipotizzare la presenza di serbatoi animali del microrganismo
(Fujimura et al., 2002). Inoltre è stata accertata la sopravvivenza di Hp in alimenti complessi e ricchi di
microflora di backgroud come il latte pastorizzato (Poms et al., 2001; Quaglia et al., 2004).
L’isolamento di Hp dal latte è complesso e indaginoso poiché è necessario utilizzare terreni selettivi ricchi di
elementi nutritivi, supplementati con numerosi antibiotici, condizioni di microaerofilia e lunghi periodi di
incubazione (circa 7 gg.). Inoltre in condizioni ambientali avverse Hp è in grado di dare origine a forme di
resistenza, viable nonculturable forms (VNC), metabolicamente attive ma che non vanno incontro a divisione
cellulare e pertanto evidenziabili solo con tecniche di biologia molecolare o microscopia elettronica (Dunn et al.,
1997).
I ceppi di Hp che possiedono specifici markers di virulenza, come il gene vacA, che codifica per la citotossina
vacuolizzante VacA (con le varianti alleliche s1/m1, s1/m2 e s2/m2) e il gene cagA, che codifica per la proteina
CagA, sono particolarmente patogeni per l’uomo (Doorn et al., 1998). Pertanto, al fine di una corretta analisi del
rischio riferita alla presenza di Hp nel latte è necessario rilevare e genotipizzare il microrganismo.
In questa nota sono riportati i risultati ottenuti in un’indagine effettuata su campioni di latte caprino prodotto in
aziende zootecniche dell’Italia meridionale, impiegando una tecnica di multiplex-touchdown PCR (MT-PCR)
che consente di rilevare e contestualmente genotipizzare Hp direttamente dal latte.
MATERIALI E METODI
Campioni. Settanta campioni di latte caprino di massa provenienti da tre aziende zootecniche site in provincia di
Bari sono stati sono stati processati utilizzando una tecnica di MT-PCR. Ciascun campione di latte (circa 100ml)
è stato raccolto in condizioni di asepsi, trasportato presso i laboratori in regime di refrigerazione e sottoposto al
protocollo di analisi entro 2-6 ore.
Dopo omogeneizzazione del campione in stomacher per 2 min, 1ml è stato analizzato per le prove
successivamente descritte. I campioni risultati positivi in MT-PCR sono stati sottoposti ad analisi batteriologica
per l’isolamento del ceppo.
1
Estrazione del DNA batterico. Per l’estrazione del DNA batterico dai campioni di latte caprino è stato
utilizzato il Dneasy Tissue Kit (QIAGEN) seguendo le indicazioni della ditta produttrice ed apportando lievi
modifiche (Quaglia et al., 2005).
MT-PCR. Per il rilievo di Hp dai campioni di latte caprino è stata utilizzata una coppia di primer che ha come
gene target la subunità 16S rRNA e che consente di ottenere un amplicone di 521bp (Lu et al., 2002). Per la
genotipizzazione sono stati utilizzati due coppie di primers per il gene vacA (s1/m1, s1/m2 e s2/m2) e una coppia
di primer per il gene cagA (Faundez et al., 2002) (Tab. 1).
Per le prove di MT-PCR la master mix contenente 10x HotMaster Taq Buffer (10mM Tris-HCL, pH 8.5, 50mM
KCL, 25 mM MgCl2), 200µM di ciascun dNTPs, 0.5µM di ciascun primer e 1.25 U di HotMaster Taq DNA
Polymerase (Eppendorf AG, Hamburg, Germany), è stata preliminarmente incubata a 94°C per 2' e
successivamente sottoposta a 35 cicli di amplificazione come descritto altrove (Quaglia et al., 2005).
La visualizzazione degli amplificati è stata ottenuta mediante elettroforesi in gel di agarosio al 1,5%, colorato
con etidio bromuro; come marker di riferimento è stato impiegato Gene Ruler TM 100 bp DNA Ladder (MBI
Fermentas, Milano, Italia). La visualizzazione degli amplificati è stata eseguita con transilluminatore ad UV
(Fig. 1).
Isolamento di Hp. I campioni risultati positivi in MT-PCR sono stati sottoposti ad analisi batteriologica per
l’isolamento di Hp secondo il seguente protocollo: 25ml di ciascun campione è stato addizionato a 225ml di
Wilkins Chalgren Anaerobe Broth (Oxoid) supplementato con il 5% di siero di cavallo (Sigma) e colistin
methanesulfonate (30 mg/l), cycloheximide (100 mg/l), nalidixic acid (30 mg/l), trimethoprim (30 mg/l), e
vancomycin (10 mg/l) (Sigma) posto ad incubare a 37°C in condizioni di microaerofilia (Anaerocult C mini,
Merk, Darmstad, Germany) e in regime di agitazione. Dopo 5gg di incubazione, 0,1ml del brodo di
arricchimento selettivo è stato seminato su piastre di Wilkins Chalgren Anaerobe Agar supplementato con 5% di
sangue di cavallo defibrinato e colistin methanesulfonate (30 mg/l), cycloheximide (100 mg/l), nalidixic acid (30
mg/l), trimethoprim (30 mg/l), e vancomycin (10 mg/l) poste ad incubare per 7gg a 37°C in condizioni di
microaerofilia (Anaerocult C mini). Le colonie riferibili ad Hp sono state identificate mediante colorazione di
gram, test dell’ossidasi, della catalasi e dell’ureasi.
RISULTATI
Tre (4,3%) dei 70 campioni di latte di capra provenienti dalla stessa azienda zootecnica, sono risultati positivi
per la presenza dei geni di Hp ed hanno evidenziato il genotipo vacA + con combinazione allelica s2/m2 e cagA(Fig. 1). Non è stato possibile isolare i ceppi batterici dai tre campioni di latte risultati positivi in MT-PCR.
CONCLUSIONI
Hp è un importante patogeno dell’uomo che, come riportato da numerosi autori, può contaminare il latte e
infettare l’uomo (Dore et al., 2001; Fujimura et al., 2002; Dunn et al., 1997; Wesley et al., 1997). L’isolamento e
l’identificazione di Hp dagli alimenti, utilizzando le tecniche microbiologiche convenzionali, sono indaginosi e
richiedono tempi lunghi spesso non compatibili con le analisi routinarie e con la shelf-life del latte crudo. Alcuni
autori ipotizzano inoltre la presenza di reservoirs animali, in quanto Hp è stato rilevato nella mucosa gastrica di
bovino, suino ed equino, nonché da latte bovino e da latte ovino.
In questa indagine 3 (4,3%) dei 70 campioni di latte di capra provenienti dalla stessa azienda zootecnica, hanno
mostrato la presenza dei geni relativi a Hp con genotipo vacA + e combinazione allelica s2/m2 cagA negativo;
questo dato rappresenta il primo “report” internazionale circa la presenza di Hp in latte di capra. Il genotipo di
Hp evidenziato corrisponderebbe, secondo diversi autori, a ceppi non in grado di produrre la citotossina
vacuolizzante e per questo meno aggressivi, in grado di causare infezioni asintomatiche fino a casi di gastrite
cronica (Doorn et al., 1998). Nella nostra indagine non è stato possibile isolare i ceppi di Hp dai campioni
risultati positivi; tuttavia, la metodica utilizzata si è rilevata rapida e di semplice applicazione, per cui potrebbe
essere considerata come metodo di screening dei campioni per il controllo routinario del latte o per indagini
epidemiologiche. Ulteriori studi si rendono necessari per chiarire le fonti di contaminazione del latte ed il
potenziale ruolo della capra quale serbatoio di Hp.
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Figura 1: Campioni di latte caprino positivi per il rilievo e la genotipizzazione di Hp.
Legenda: M: Ladder 100 bp; C: controllo positivo ATCC 43504; 1-2-3: campioni di latte caprino positivi
B: acqua distillata.
Tabella 1: Primer utilizzati per il rilievo e la genotipizzazione di Hp dai campioni di latte caprino.
Primer
Gene target
Sequenza nucleotidica
Amplicone
(bp)
Fonte bibliografica
16S rRNA
5’GCAATCAGCGTCAGTAATGTTC3’
5’GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC3’
521
VacAS-F
VacAS-R
vacA region s
5’ATGGAAATACAACAAACACAC3’
5’CTGCTTGAATGCGCCAAAC3’
259 ( type s1)
286 (type s2)
VacAM-F
VacAM-R
vacA region m
5’CAATCTGTCCAATCAAGCGAG3’
5’GCGTCAAAATAATTCCAAGG3’
567 (type m1)
(Faundez et al., 2002)
642 ( type m2)
CagA-F
CagA-R
cagA
5’GATAACAGGCAAGCTTTTGAGAGGGA3'
393
5'-CCATGAATTTTTGATCCGTTCGG-3'
NHP-F
NHP-R
3
(Lu et al., 2002)
(Faundez et al., 2002)
(Faundez et al., 2002)
Ricerca effettuata con fondi IZS Sardegna e MIUR ex 40% 2004.
BIBLIOGRAFIA
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