Cromatografia per Scambio Ionico

Cromatografia per Scambio Ionico
Nella cromatografia per scambio ionico, la ritenzione si basa sull’attrazione
tra gli ioni del soluto e i siti carichi legati alla fase stazionaria.
La fase stazionaria è costituita da una resina a scambio ionico, ossia un supporto
organico al quale sono legati dei gruppi ionici o ionizzabili (ad esempio –SO3-,
-COO-, -NR3+).
I gruppi ionici della resina trattengono per mezzo di interazioni
elettrostatiche, controioni di carica opposta che possono essere
scambiati con gli ioni presenti nella fase mobile.
Il meccanismo di separazione è basato perciò sulla diversa affinità che i diversi
soluti (ionici) presentano nei confronti dei gruppi attivi della resina.
In generale le resine a scambio ionico e complessanti sono costituite da un reticolo
irregolare tridimensionale di catene di natura organica unite tra loro da legami incrociati.
Su questa matrice sono fissati dei raggruppamenti ionici (quali –SO3-, -COO-, -NR3+) in
grado di interagire con uno ione metallico o per semplice scambio ionico o mediante
formazione di legami di coordinazione (resine complessanti o chelanti).
Lo scambiatore si dice cationico quando contiene delle
cariche negative e i cationi sono attratti elettrostaticamente
da questi siti di carica opposta.
Lo scambiatore si dice anionico quando contiene dei gruppi
carichi positivamente in grado cioè di legare degli ioni di
carica negativa.
solitamente uno scheletro
polistirenico ottenuto per
copolimerizzazione
dello
stirene con il divinilbenzene.
Il contenuto di divinilbenzene
può variare dall’ 1 al 16% e
determina
il
grado
di
reticolazione (cross-linking).
Gli anelli benzenici possono venire modificati per produrre una resina a
scambio cationico contente gruppi solfonato (-SO3-) oppure una resina
anionica contenente gruppi ammonici (-NR3+).
Se al posto dello stirene si usa acido metacrilico si ottiene una resina con
gruppi attivi carbossilici e scheletro acrilico divinilbenzenico (-COO-).
Ampio intervallo di pH di utilizzo
La comune definizione delle
resine ioniche è fatte sulla
base della acidità del loro
gruppo attivo
Cationico
Anionico
Forte
-SO3- H+
-N+(CH3)3 OH-
Debole
-COO- H+
-N+H3 OH-
Ridotto intervallo di pH di utilizzo
Il grado di reticolazione nelle resine a scambio ionico è variabile ed è scelto
in funzione delle caratteristiche che deve presentare lo scambiatore.
Resine con alto grado di reticolazione sono rigide e poco porose, lente
nel raggiungere l’equilibrio, anche se la selettività e la capacità sono maggiori,
rispetto alle resine con basso grado di reticolazione (dette anche
macroporose) sono più veloci ad equilibrarsi, ma che si rigonfiano
d’acqua.
L’affinità maggiore per la fase resina è per ioni:
• a carica elevata,
• a piccolo raggio di idratazione,
• molto polarizzabili (polarizzabilità è capacità della nuvola elettronica di uno
ione a venire deformata da cariche vicine e a formare un dipolo).
I difetti dei polimeri PS/DVB sono:
 Microporosità della matrice
dell’analita nel loro interno
con
conseguente
lenta
diffusione
 Compressibilità
 Tendenza al rigonfiamento al cambio di eluente
Attualmente si utilizzano:
 Granuli Pellicolari, particelle di vetro non poroso (o polimero) ricoperte
di un sottile strato di scambiatore
 Microparticelle di Silice porosa ricoperte con una sottile pellicola di
scambiatore, più economiche
Diffusione molto veloce ma capacità ridotta
In generale le specie che presentano più
cariche tenderanno a legarsi più fortemente
alla resina
È necessario l’impiego di uno ione
competitore perché gli analiti vengano
rilasciati: ELUENTE
Cromatografia Ionica
 È la variante ad alta pressione (prestazioni) della
cromatografia per scambio ionico
 Serve per separare e quantificare ioni, in particolare
inorganici, utilizzando resine a scambio ionico
Il cromatografo ionico è sostanzialmente un HPLC ed è composto da:
Riserva di eluente
Valvola Iniezione
Pompa tipo HPLC
Colonna
Soppressore
Integratore
Rivelatore a Conducibilità
Colonne
Sono il cuore dello strumento.
La separazione avviene per una serie di equilibri di
scambio tra fase stazionaria e fase mobile (eluente)
Gli ioni con carica netta più elevata (al pH
dell’eluente) vengono trattenuti più fortemente
A parità di carica vi è un ordine di selettività che
dipende dal tipo di fase stazionaria (dipende dalle
costanti di scambio)
Forti
Deboli
Eluente
La fase eluente deve contenere elettroliti forti, composti ionici completamente
dissociati, in grado di competere con gli analiti nello scambio con la resina. Gli
analiti vengono eluiti più velocemente quanto più è alta la concentrazione di
competitori.
Può contenere solventi organici (CH3CN, MeOH, ecc.) per evitare l’adsorbimento
per interazione idrofobica su resina o gruppi funzionali di analiti organici
Se rimane costante durante tutta l’analisi -> Eluizione Isocratica
Se cambia di composizione durante l’analisi -> Gradiente di Eluizione
Forza
Ionica
pH
Concentrazione
dei costituenti
Il gradiente si può comporre:
 sotto pressione con una pompa per ogni componente (più riproducibile ma
strumentazione più costosa)
 non sotto pressione con l’ausilio di un miscelatore posto prima della pompa
Rivelatore
Dato che si determinano ioni, il rivelatore universalmente utilizzato è costituito
da una piccola cella conduttimetrica.
Applicando una piccola ddp tra i due elettrodi, fluisce
una corrente proporzionale alla conducibilità
dell’eluente + analita.
Problema: poiché i rivelatori a conducibilità
rispondono a tutti gli ioni e l’eluente è costituito da
una soluzione elettrolitica concentrata, il suo segnale
coprirebbe quello degli analiti.
Come è possibile
ovviare al problema?
La conducibilità dell’eluente viene eliminata mediante un
Soppressore
L’unità di soppressione può essere costituita da:
 Cartucce usa e getta
 Micromembrana rigenerata controcorrente
 Micromembrana rigenerata elettroliticamente
Il soppressore è uno scambiatore di ioni di segno opposto rispetto agli analiti ed ha
lo scopo di diminuire il segnale di fondo dato dagli ioni contenuti nell’eluente.
Integrazione e quantificazione
Il rivelatore produce un segnale elettrico analogico (E) che viene
digitalizzato e “contato” tramite un integratore (o un interfaccia A/D e un
computer).
L’area dei picchi del cromatogramma è proporzionale alla concentrazione
dell’analita rendendo possibile la quantificazione.
Separazione di Anioni
es. Cl-, NO3- e SO42-
La configurazione dello strumento è: colonna con resine ammonio quaternario in
forma HCO3-; soppressore in forma H+; rivelatore conduttimetrico. Gli analiti in
esame sono dissociati a qualsiasi pH quindi scegliamo come eluente una miscela
Na2CO3/NaHCO3
Tutti gli analiti, trasformati in acidi
Nella colonna gli anioni si
forti, (H+Cl-,…) danno un segnale
separano ed escono a diversi
mentre l’eluente, ora H2CO3 poco
tempi in forma Na+ (Na+Cl-,…)
dissociato, non viene rivelato
insieme ad un largo eccesso di
Na+HCO3- e Na+2CO32Nel soppressore il catione coordinato
(Na+) viene sostituito da H+.
Separazione di Cationi
es. Na+, K+ e NH4+
La configurazione dello strumento è: colonna con resine solfoniche in forma H+;
soppressore in forma OH-; rivelatore conduttimetrico. In questo caso l’eluente è
HCl
Nella colonna i cationi competono
con H+ e si separano. Escono
coordinati a Cl- (Na+Cl-,…) insieme
ad un largo eccesso di H+Cl-
Tutti gli analiti, trasformati in
idrossidi dissociati, (Na+OH-,…)
danno un segnale
Nel soppressore l’anione coordinato (Cl-) viene
sostituito da OH- e l’eccesso di H+ viene
neutralizzato ad H2O.
Separazione di
Acidi Carbossilici
AcOH (pKa=4.8)
HCOOH (pKa=3.8)
Ac Citrico (pKa1=3.1, pKa2=4.7 e pKa3=5.4)
L’esperimento sembrerebbe simile a quello dell’analisi degli anioni, ma…
In questo caso il rivelatore conduttimetrico non è la scelta migliore perché gli
analiti sono acidi deboli e quindi solo in parte dissociati. È più idoneo un rivelatore
UV o MS.
Anche la scelta del pH del tampone di eluizione è fondamentale, infatti vi sono pH
a cui non tutti gli analiti sono dissociati (anioni) e non possono entrare in equilibrio
con la resina (ad esempio a pH = 4.0 per l’AcOH).
La catena idrofobica dell’Ac Citrico potrebbe dare interazioni tipo WdW con la
resina è quindi opportuno introdurre nell’eluente una porzione di CH3CN (o MeOH).