Come si clona un gene

Come si clona un gene
Corso di Genetica per la Facoltà
di Medicina e Chirurgia
dell’Università di Torino
Alberto Piazza
Base biochimica
nota
Gene
ignoto
Localizzazione
cromosomica
nota
Clonaggio
per posizione
Prodotto Test
Idea patogenesi
genico funzionale Modelli animali
Clonaggio
funzionale
Clonaggio
per geni candidati
Clonaggio
per posizione
e per candidati
Clonaggio funzionale
A) Purificazione parziale di un prodotto genico
B) Saggio di complementazione (test funzionale)
Clonaggio funzionale
Purificazione parziale di un prodotto genico
A) Frammenti di geni (oligonucleotidi) ottenuti
mediante sequenziamento proteico dopo isolamento
di consistenti quantità di proteina
Esempio: clonaggio del gene dell’Emofilia A (FVIII)
B) Anticorpi specifici
Esempio: clonaggio del gene fenilalanina idrossilasi
(fenilchetonuria, 1982)
Clonaggio funzionale
Saggio di complementazione (test funzionale)
Complementazione di un fenotipo cellulare patologico
con frammenti di DNA o di cromosomi umani normale
Esempio: Anemia di Fanconi (1992), AR-1/350000
Saggio di complementazione
FA-A
FA-A
FA-B
Fusione
Fusione
FA
fenotipo
wt
fenotipo
Clonaggio funzionale
Libreria di
cDNA
Trasfezione
Selezione con
Mitomicina C
Cellule FA-C
Isolamento del
cDNA che complementa
Gene FAC, 9q22.3
Clonaggio per posizione
Localizzazione iniziale
Analisi di linkage
Perdita di eterozigosità
Anomalie cromosomiche
Clonaggio per posizione
Analisi di linkage: definizione della regione critica
Saturazione della regione con nuovi marcatori
Identificazione dei ricombinanti (cross-over)
Linkage disequilibrium
cM
D10S548
15
1.4
D10S595
14
13
5.6
12
11.2
D10S572
D10S197
0.1
2.2
D10S1775
D10S593
D10S1639
0.2
0.2
2.8
D10S1732
0.9
D10S213
3.3
D10S208
Trombocitopenia
D22S277
D22S1142
D22S683
D22S283
D22S1177
D22S445
D22S272
Clonaggio per posizione
Identificazione dei geni nella regione critica
Mappe di trascrizione
Isole CpG
Zoo Blotting
cDNA selection
Exon trapping
Sequenziamento del DNA
Assemblaggio di EST
Progetto Genoma
e relativi database
Clonaggio per posizione:
Progetto Genoma
Clonaggio per posizione:
Progetto Genoma
Clonaggio per posizione:
Progetto Genoma
Clonaggio per posizione
Anomalie cromosomiche
Traslocazioni e inversioni
Duplicazioni e delezioni
Clonaggio per posizione
Anomalie cromosomiche
Traslocazioni e inversioni
Clonaggio del punto di rottura
Fluorescent In Situ Hybridization
Clonaggio per posizione
Anomalie cromosomiche
Duplicazioni e delezioni
Microdelezioni evidenziabili molecolarmente
133
202
160
244
183
170
217
164
228
127
169
Crom 15
D15S210
D15S128
D15S122
D15S11
GABR3
D15S97
D15S156
D15S219
D15S165
D15S98
D15S87
135
194
150
250
179
170
219
164
228
127
169
133
202
154
252
185
170
217
164
224
120
167
135
194
150
250
179
170
219
164
234
120
157
133
202
154
252
185
170
217
164
224
120
167
133
204
156
244
195
170
229
164
234
114
153
133
202
160
244
183
170
217
164
228
127
169
133
164
234
114
153
Clonaggio per posizione
Esempi:
Mediante linkage e traslocazioni X-autosoma:
Distrofia di Duchenne (DMD)
Mediante linkage e traslocazioni bilanciate:
Neurofibromatosi (NF1)
Mediante mappatura e linkage disequilibrium:
Fibrosi cistica (FC)
Identificazione di un gene malattia
Funzione
proteica
(proteomica)
Terapia
Farmacologica
Identificazione
di mutazioni
Espressione
genica
Diagnosi
molecolare
Terapia genica