Inattivazione del cromosoma X L`inattivazione del cromosoma X

Eredita’ X-linked
Lezione 9
By NA
 Affetti entrambi i
sessi, piu’ spesso le
femmine anche se meno
gravemente dei maschi per
effetto dell’inattivazione
X-linked
dominante
 I figli di una donna affetta hanno il 50%
di essere affetti, indipendentemente dal sesso
 Un maschio affetto avra’ tutte le figlie affette e tutti
i figli sani
By NA
X-linked
recessiva
?
 Lo stato di portatrice
della madre e’ certo se
ha fratelli o parenti
maschi affetti
Affetti quasi esclusivamente
maschi
 I genitori di solito sono
sani,la madre anche se
portatrice puo’ essere
asintomatica
?
?
By NA
?
?
?
 Mosaicismo germinale
Le femmine possono essere affette:
1. se il padre e’ affetto e la madre eterozigote
2. se l’inattivazione del cromosoma X non e’ casuale
X inattivo
By NA
Inattivazione del cromosoma
X
 Nel 1966 Mary Lyon formulo’ l’ipotesi che oggi
porta il suo nome (lyonizzazione), per spiegare alcuni
fenomeni osservati nelle cellule di mammifero di sesso
femminile
 Si erano accumulate alcune osservazioni:
 Nei nuclei delle femmine e’ presente una masserella
condensata che corrisponde al numero delle X meno 1
 Lo stesso fenomeno si osserva nei maschi XXY, ma non
nelle femmine X0
 Marcando con timidina triziata nella tarda fase S si
osserva la presenza di un cromosoma fortemente marcato che
per dimensioni ed aspetto corrisponde al cromosoma X solo
nelle cellule con almeno 2 cromosomi X.
By NA
Inattivazione del
cromosoma X
 Altre osservazioni ottenute da Mary Lyon
nei sui esperimenti sui topi:
 Femmine eterozigoti per 2 loci che determinano il colore
del pelo e che mappano sul cromosoma X presentano mantello a
chiazze (anche il gatto ha questo tipo di fenotipo) e non un
colore uniforme anche se intermedio rispetto ai due colori.
 Il fenotipo e’ diverso se si osserva una eterozigote in cis o
in trans:
 in cis: le macchie sono composte dei due colori
 in trans: le macchie sono o di un colore o
dell’altro.
By NA
Esperimenti di Mary Lyon nei topi
Femmine omozigoti
BrBr/GrGr pelo a macchie
Femmine
doppio eterozigoti
BrC/GrC in trans
pelo a macchie
By NA
Femmine
doppio eterozigoti
BrC/GrC in cis
macchie di due
colori
Mary Lyon
Ipotesi di Mary Lyon:
Uno dei due cromosomi X presenti
nella linea somatica femminile, viene
precocemente inattivato durante lo
sviluppo embrionale. L’inattivazione e’
casuale. Come risultato la femmina e’
un mosaico di cellule funzionalmente
emizigoti per uno o l’altro dei
cromosomi X.
By NA
G6PD-HPRT
Donna eterozigote G6PD+/-
By NA
Donna eterozigote HPRT+/-
Cellule di donna eterozigote G6PD+/Coltura
originaria
Coltura
di singolo
clone
Coltura
di singolo
clone
Direzione
migrazione
Lenta
Veloce
By NA
G6PD
Inattivazione del cromosoma
X
L’inattivazione del cromosoma X avviene intorno al
15mo-16mo giorno dell’embriogenesi (l’embrione e’
composto di circa 5000 cellule). Una volta che un
cromosoma X (materno o paterno) e’ stato inattivato
lo sara’ in tutte le popolazioni cellulari che derivano da
quella cellula.
La casualita’ dell’inattivazione e’ tipica dei mammiferi:
nei marsupiali viene inattivato preferenzialmente il cromosoma
paterno. Nel topo le cellule del trofoblasto inattivano il
cromosoma X paterno per una ragione tuttora ignota.
 La casualita’ viene meno in presenza di X riarrangiate
By NA
Zigote
15mo-16mo
giorno
Xmat
Xpat
Inattivazione del
cromosoma X
schema
Inattivazione
casuale
Come avviene l’inattivazione e come viene mantenuta?
By NA
L’ inattivazione
domande
Vengono inattivati tutti i geni della X?
 No, inizialmente si riteneva che l’inattivazione
coinvolgesse tutto il cromosoma, oggi sappiamo che non
vengono inattivati i geni della regione pseudoautosomica :
i geni di questa regione hanno un omologo sul cromosoma Y
Non vengono inattivati geni che hanno pseudogeni sul
cromosoma Y, e altri geni per i quali non si conosce la
ragione. Comunque il cromosoma X risulta inattivato al 90%
C’e’ una regione sul cromosoma X da cui inizia
l’inattivazione ?
Come avviene e come si mantiene l’inattivazione?
By NA
Universita’ di Bari
L’ inattivazione
domande
C’e’ una regione sul cromosoma X da cui inizia
l’inattivazione ?
 Si, la regione Xq13. In questa regione e’ presente
il centro di inattivazione Xic che agisce in cis . E’ stato
individuato un locus Xist che sembra essere il gene che
controlla il processo di inattivazione.
La mappatura di Xic e il clonaggio di Xist sono stati
resi possibili grazie allo studio dei riarrangiamenti del
cromosoma X in cui l’inattivazione non casuale:
l’inattivazione dipende dal tipo di riarrangiamento
By NA
L’ inattivazione
le traslocazioni X/Autosoma
Xic agisce in cis:
il frammento fisicamente
separato non puo’ inattivarsi
due copie Xp attive
parte autosoma inattiva
morte della cellula
Inattivazione
casuale dell’X
X X/A
By NA
A/X A
un cromosoma X attivo
due autosomi attivi
questo clone e’
l’unico che si ritrova
L’ inattivazione
X(isop), X(isoq) e X(del)
Isocromosoma
X
del braccio corto
non si ritrova mai
Isocromosoma delezione del
delezione del
braccio lungo
sempre inattivato
se la delezione non
coinvolge Xq13
del braccio lungo braccio corto
sempre inattivato sempre inattivato (Sindrome di Turner)
(Sindrome di Turner) (Sindrome di Turner)
By NA
L’ inattivazione
Come avviene e si mantiene l’inattivazione?
 Il clonaggio di Xist (X-inactive specific transcript)
non ha chiarito completamente il meccanismo: il
prodotto di questo gene (15Kb) non ha ORF, si ritiene
che appartenga alla classe dei geni il cui prodotto
funzionale non e’ una proteina, ma un mRNA.
 Viene trascritto solo dal cromosoma inattivo, e’
espresso nel nucleo, promuove il processo di
inattivazione rimodellando la cromatina attraverso
l’ipoacetilazione degli istoni e la metilazione dei geni.
Dall’inattivazione deriva l’eterocromatizzazione (corpo di Barr e la
replica tardiva del cromosoma X inattivato
By NA
L’ inattivazione
Come avviene e si mantiene l’inattivazione?
 Si ritiene che l’inattivazione venga ottenuta metilando
le isole CpG. I geni presenti sul cromosoma inattivato
sono ipermetilati se confrontati con gli omologhi dell’altro
cromosoma o del cromosoma X del maschio.
 Ricordare che le isole CpG sono presenti al 5’ dei geni e si ritiene che
rappresentino il sito di inizio della trascrizione.
 Una volta che la metilazione e’ avvenuta al momento di
duplicare il DNA la citosina metilata verra’ riconosciuta
come tale dall’enzima che metilera’ la citosina dell’elica
neosintetizzata, garantendo il mantenimento
By NA
L’ inattivazione e l’eredita’ X-linked
Ipotesi di Mary Lyon:
Uno dei due cromosomi X presenti
nella linea somatica femminile, viene
precocemente inattivato durante lo
sviluppo embrionale. L’inattivazione e’
casuale. Come risultato la femmina e’
un mosaico di cellule funzionalmente
emiziogoti per uno o l’altro dei
cromosomi X.
 La femmina portatrice di una patologia X-linked e’
“protetta” dalla presenza nel 50% delle sue cellule di un
gene funzionante. L’inattivazione non casuale di un
cromosoma X per effetto di un riarrangiamento puo’
aiutare a clonare un gene malattia
By NA
La distrofia muscolare di Duchenne
DMD e di Becker BMD
By NA
DMD- RFLP
Nel 1982 venne identificato il primo RFLP associato
al locus
DMD in Xp21. Nel giro di poco tempo altri RFLP permisero di
eseguire il gene tracking. Non si trovarono pero’ polimorfismi
con ricombinazione inferiore al 5%.
Nel 1985 la mappa della regione era stata in parte
ricostruita e la situazione che si presentava era:
L1.28
10cM
OTC 754
2cM
C7
8cM
7cM
DMD
By NA
99-6
8cM
D2
5cM
DMD- X/autosomi
Nel frattempo si erano raccolti i DNA di circa 20 ragazze
affette da DMD che presentavano traslocazioni X/autosomi.
Tutte presentavano il breakpoint sulla X in Xp21 ed erano
casi sporadici.
L’ipotesi era che il riarrangiamento avesse rotto il gene
DMD e che per effetto dell’inattivazione preferenziale del
cromosoma X normale, venisse manifestato il fenotipo
Duchenne
By NA
DMDInattivazione
due copie Xp attive
parte autosoma inativa
gene DMD attivo
morte della cellula
DMD
Inattivazione
casuale dell’X
X X/A
A/X A
un cromosoma X attivo
due autosomi attivi
gene DMD non funzionante
Affetta da DMD
By NA
DMD-XJ
1985 A Toronto un gruppo di ricercatori utilizzando il Dna
di una donna DMD portatrice di una traslocazione X/21, riusci’
a clonare il breakpoint, e individuo’ una serie di cloni (XJ)che,
oltre ad essere polimorfici, evidenziavano delezioni in alcuni
pazienti DMD.
rDNA
rDNA
By NA
DMD?
DMD- Clonaggio
1986 A Boston il gruppo di Kunkel utilizzando il DNA di un
paziente, BB, portatore di un delezione citogenetica ed
affettoda DMD, retinite pigmentosa, ritardo mentale e
malattia granulomatosa cronica riesce a clonare il gene
DMD.
La loro strategia si baso’ sul clonaggio per sottrazione: il paziente era
deleto per una grossa regione genomica, il suo DNA fatto riassociare con
DNAnormale avrebbe lasciato in soluzione le sequenze normali non presenti
nel DNAdeleto.
Con quei cloni fu testata una libreria di cDNA di muscolo e vennero
clonaticirca 8 cDNA che, testati sui pazienti, misero in evidenza delezioni.
Lo zoo-blot confermo’ trattarsi di un gene conservato, la sequenza
evidenzio’ nei pazienti mutazioni puntiformi di varia natura.
By NA
DMD-Distrofina
Quale e’ il prodotto del gene DMD?
L’RNA e’ lungo 13kb, la proteina ha un peso molecolare superiore a 400kDa,
e’espresso dal muscolo, anche se costituisce solo lo 0.002% delle proteine
totali.L’estremita’ N-terminale costituisce il dominio legante l’actina, segue un
ampio dominio a bastoncello, con 24 ripetizioni di sequenze simili composte da
109 amminoacidi. Dopo questo dominio e’ presente un dominio ricco in cisteina
leganteil Calcio, infine l’estremita’ C-terminale (420AA) interagisce con le altre
proteine.
N-terminale
By NA
ripetizioni ad  elica
dominio legante Ca
C-terminale
DMD-Distrofina
Quale e’ la funzione del gene della distrofina?
Fa parte di un complesso che attraversando la membrana collega
i filamenti di actina del citoscheletro con la matrice
extracellulare (membrana basale)
Laminina
sarcoglicani
distroglicani
sintrofine
Actina
By NA
DMD-Becker
La distrofia di Becker in che
relazione e’ con DMD?
 Dall’analisi di linkage era gia’ emerso che avrebbero potuto essere alleliche
 Dopo il clonaggio del gene DMD le stesse sonde sono state testate sui
pazienti affetti da BMD: sono evidenti delezioni e mutazioni puntiformi.
tutte le evidenze sperimentali confermano che il locus e’ lo stesso.
 Non e’ stato possibile individuare una regione critica specifica per le due
forme. Lo studio a livello di proteina ha evidenziato che in BMD la distrofina e’
sempre presente anche se piu’ corta o in minore quantita’
By NA
Ricerca delle mutazione nel gene DMD
Due terzi dei casi di Distrofia Muscolare di Duchenne
sono dovuti a delezioni che coinvolgono uno o piu’ esoni
Ci sono due “hot spot” di mutazioni: 5’ esoni dal 3 all’8
e al 3’ esoni dal 44 al 60 (principalmente 44-50)
Si usa una PCR multiplex con reazioni prodotte da piu’
coppie di primer, ognuna delle quali amplifica uno specifico
esone. Se c’e’ la delezione non c’e’amplificazione
(naturalmente si sa quale e’ l’aspetto di una corsa elettroforetica di un
maschio normale.)
L’interpretazione nel caso delle femmine eterozigoti puo’
essere ambigua perche’ la X normale viene amplificata
By NA