COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU DI METILENE

MICROSCOPIA
OSSERVAZIONE MICROSCOPICA
 La maggior parte dei microrganismi è troppo piccola per
essere vista a occhio nudo (dimensioni dei batteri: 0,35μm), pertanto risulta essenziale l’uso di strumenti, quali i
microscopi, che mediante lenti permettono di ingrandire gli
oggetti.
 Nella visione microscopica, oltre all’ ingrandimento sono
importanti altri due aspetti: la risoluzione e il contrasto.

La risoluzione è la capacità di dare immagini distinte di
due punti vicini tra loro; il potere di risoluzione dell’occhio
umano, nelle migliori condizioni, è di 0,1 mm.

Il contrasto dipende dal grado di rifrazione della luce;
essendo la maggior parte delle cellule troppo trasparente
per essere distinte dallo sfondo, risulta necessario l’utilizzo
di colorazioni per aumentarne il contrasto.
MICROSCOPIO SEMPLICE
Van Leeuwenhoek
(1677)
Costituenti del microscopio
Ogni microscopio ha come costituenti
fondamentali un obiettivo ed un oculare.
La
distanza
tra
oculare
e
l’oggetto
dell'osservazione è invariabile in qualsiasi tipo
di microscopio, la messa a fuoco dell'oggetto
avviene attraverso lo spostamento del sistema
ottico utilizzato.
 L'oggetto
viene posto su un vetrino ed
illuminato dal basso tramite un condensatore
ottico (illuminazione per trasparenza o a campo
chiaro) oppure lateralmente (illuminazione in
campo scuro).
 Per ottenere una maggiore risoluzione può
essere aggiunto, tra il preparato e l'obiettivo,
un liquido rifrangente (obiettivo a immersione).

Microscopio composto a luce
trasmessa
E’ composto da:
 stativo, il supporto meccanico che
comprende anche le viti macrometrica e
micrometrica per la messa a fuoco
 apparato di illuminazione
 obiettivo
 oculare
OBIETTIVI E OCULARI
L’osservazione della morfologia (forma
e struttura) dei batteri può essere
fatta in due modi:
 con
preparati a fresco
 con preparati fissati
MICROSCOPIO A
CONTRASTO DI FASE

Dispositivo ottico capace di convertire differenze di
fase in differenze di intensità luminosa, determinando
così contrasto nell’immagine (differenze di fase:
risultato di piccole differenze nell’indice di rifrazione e
nello spessore delle diverse parti delle strutture
biologiche)

Permette l’osservazione di strutture biologiche vitali,
normalmente invisibili, senza dover ricorrere alle
colorazioni

Presenza di due nuovi elementi: diaframma anulare e
piastra di fase
Osservazione a contrasto di fase
Un batterio
(Lb. sakei)
Un lievito
(S. cerevisiae)
Una muffa
(G. candidum)
MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

Sorgente di luce ultravioletta

Condensatore con lenti di quarzo: permettono il passaggio
della luce UV

Obiettivo con lenti di vetro: trattengono le radiazioni UV
permettendo il passaggio della radiazione visibile formatasi
per fluorescenza

Fluorescenza
primaria:
preparato (clorofilla)

Fluorescenza secondaria: indotta
sostanze fluorescenti (fluorocromi)
prodotta
naturalmente
dal
trattamento
dal
con
MICROSCOPIO ELETTRONICO
A TRASMISSIONE (TEM)
Caratteristiche

Fascio di elettroni per illuminare il preparato

Presenza di lenti elettromagnetiche

Potere di risoluzione: 20Å (100 volte superiore a quello del
microscopio ottico)

Ingrandimenti diretti sino a 100.000 e con ulteriore
ingrandimento della fotografia sino a 1.000.000

Valido
mezzo
per
studiare
l’ultrastruttura
dei
microrganismi, ma non allo stato vitale: i campioni devono
essere disidratati, tagliati in sezioni ultrasottili e ricoperti
con metalli pesanti.
Fotografie di cellule batteriche al
microscopio elettronico a trasmissione
MICROSCOPIO ELETTRONICO
A SCANSIONE (SEM)
Caratteristiche

Fascio di elettroni per illuminare il preparato

Usato per l’esame
microrganismi

Ingrandimenti che vanno da
d’ingrandimento sino a 200.000

Potere di risoluzione: 200Å ( inferiore a quello del TEM)

Vantaggio principale: formare un’immagine tridimensionale
dell’oggetto
dettagliato
quelli
delle
delle
superfici
comuni
dei
lenti
Fotografie di cellule di E. coli al
microscopio elettronico a scansione
Colorazioni batteriche
Per osservare i batteri si usano i coloranti
Colorare i batteri consente di:
vedere maggiore contrasto tra l’organismo e lo
sfondo,
 differenziare vari tipi morfologici (tramite la
forma, la disposizione, la colorazione, etc.),
 osservare determinate strutture (flagelli,
capsule, endospore, etc.).

Per capire come funziona un colorante, è bene
capire la natura fisica e chimica dei coloranti
 Sono
generalmente sali (un sale è un
composto costituito da uno ione carico
positivamente
ed
uno
carico
negativamente) nei quali uno dei due ioni è
colorato.
 Ad esempio il blu di metilene è il sale
cloruro di metilene che in acqua si
dissocerà nello ione blu metilene carico
positivamente e lo ione cloruro incolore
carico negativamente.
I coloranti possono essere divisi in due
gruppi: quelli basici e quelli acidi
 Se
la parte colorata del colorante è uno
ione positivo viene detto basico (ad
esempio: il blu di metilene, il cristal
violetto, la safranina).
 Se la parte colorata è lo ione carico
negativamente esso è acido (ad esempio:
la nigrosina, il rosso congo).
A causa della loro natura chimica, i citoplasmi
di tutte le cellule batteriche hanno una debole
carica negativa se fatte crescere in un mezzo
a pH neutro. Perciò, quando si usa un colorante
basico, l’organismo si colorerà direttamente.
Un colorante acido, invece, forma un deposito
attorno all’organismo, lasciando l’organismo
incolore. Dal momento che l’organismo viene
visto
indirettamente
questo
tipo
di
colorazione è detta indiretta o negativa, ed è
usata per ottenere una più accurata visione
della dimensione, della forma e della
disposizione dei batteri.
Come is colorano i batteri
Molti batteri mancano di colore o di
strutture interne contrastanti.
Dal momento che la densità di molti
batteri è solo un po’ più alta di quella
dell’ acqua, i batteri is vedono
difficilmente in sospensione liquida
usando un microscopio a campo luminoso
perché sono quasi trasparenti.
Allestimento di un vetrino
La preparazione di uno striscio è
richiesto nella maggior parte dei
procedimenti di laboratorio, prima della
colorazione. Ha come finalità di fissare i
batteri a un vetrino, evitando che esse
siano perse durante il processo di
colorazione propriamente detto. Lo
striscio può essere preparato a partire
dalle colonie cresciute in mezzi solidi o a
partire da un mezzo liquido.
METODICA

Prelevare con un ansa sterile un po’ di
materiale batterico da una colonia
isolata.

Distendere il materiale su un vetrino
dove era stata precedentemente
messa una goccia di acqua distillata.

Essiccamento: lasciare asciugare a
temperatura ambiente fino a completa
evaporazione dell’acqua.

Fissazione: passare velocemente il
vetrino, tenuto con una pinza, sulla
zona più calda della fiamma del becco
bunsen, per almeno tre volte.
Le colorazioni possono
essere semplici
monocromatiche
o differenziate
Colorazioni semplici
Rendono le cellule meglio evidenziabili
all'osservazione
microscopica.
Richiedono
l'uso di un solo colorante (es. blu di metilene,
cristal violetto, fucsina basica).
 La colorazione semplice è utilizzata per la
valutazione della forma, della disposizione e
delle dimensioni dei batteri, non consente
però di evidenziare i dettagli della struttura
interna.

COLORAZIONE SEMPLICE CON BLU
DI METILENE
OBIETTIVO:
Osservare la forma di diversi
utilizzando una colorazione semplice.
microrganismi
PRINCIPIO:
I coloranti usati in microbiologia sono sostanze
organiche nelle quali sono presenti gruppi funzionali
detti “cromofori” associati alla produzione di
colore. Si distinguono in coloranti basici (blu di
metilene, violetto di genziana, safranina) e acidi
(nigrosina, fucsina acida). La colorazione aumenta il
contrasto con l’ambiente rendendo più visibili le
cellule. Poiché i batteri sono ricchi di acidi
nucleici, si colorano molto bene con coloranti basici
come il blu di metilene.
COLORAZIONE SEMPLICE
CON BLU DI METILENE
METODICA

Dopo aver appoggiato il vetrino su
una vaschetta per la colorazione,
aggiungere qualche goccia di blu
di metilene.
Attendere circa 3 minuti, quindi
lavare con acqua mediante una
spruzzetta.
Eliminare buona parte dell’acqua
di lavaggio inclinando il vetrino;
asciugare delicatamente, prima
con carta da filtro, poi all’aria.
COLORAZIONE SEMPLICE
CON BLU DI METILENE
RISULTATO
Colorazioni complesse

Richiedono l'uso di più coloranti. Mettono in
evidenza non solo la morfologia, ma anche
determinate
caratteristiche
di
gruppi
di
microrganismi (colorazioni differenziali).

In generale, i batteri hanno una affinità per un
grande numero di coloranti principalmente si tratta
dei derivati basici dell’anilina (blu di metilene,
cristal violetto, fucsina basica, ecc.).

Fra i metodi esistenti, quelli piu’ importanti in un
laboratorio di microbiologia sono il metodo di GRAM
e il metodo di ZIEHL-NEELSEN.
COLORAZIONE DI GRAM
GRAM POSITIVI
GRAM NEGATIVI
FISSAZIONE
CRISTAL VIOLETTO
LIQUIDO DI LUGOL
DECOLORAZIONE
COLORAZIONE DI
CONTRASTO
(SAFRANINA)
Le cellule vengono colorate con un colorante basico quale il cristal violetto
e successivamente trattate con liquido di Lugol (iodio sciolto in una
soluzione di ioduro di potassio). Fino a questo punto tutte le forme
microbiche appaiono colorate. Se si lava con alcol, si osserva che alcune
specie si decolorano (Gram-) e altre no (Gram+). Le prime possono essere
evidenziate usando un colorante di contrasto (es. safranina o fuxina).
RISULTATO
GRAM+
GRAM-
FAMIGLIE DI BATTERI
GRAM+ E GRAMMICRORGANISMI
MICROCOCCHI
STAFILOCOCCHI
STREPTOCOCCHI
BACILLI
CLOSTRIDI
CORYNEBATTERIA
MYCOBATTERI
BRUCELLA
COLIFORMI
PSEUDOMONAS
AEROMONAS
GRAM
FORMA
+
+
+
+
+
+
+
-
AMMASSI di COCCHI
COCCHI a GRAPPOLI
COCCHI a CATENELLE
BASTONCELLARI
BASTONCELLARI
BASTONCELLARI
BASTONCELLARI
BASTONCELLARI
BASTONCELLARI
BASTONCELLARI
BASTONCELLARI
METODO DI ZIEHL-NEELSEN
si basa sulla caratteristica di alcool-acido
resistenza di determinati batteri come il
Mycobacterium tuberculosis che permette di
trattarli con una soluzione di fucsina fenicata
a caldo o a freddo. Tali batteri resistono al
trattamento posteriore con una soluzione di
alcool-acido cloridrico (HCl 3% in etanolo) e
ritengono la colorazione iniziale rossa, mentre
altri si decolorano e assumono la colorazione
di fondo , normalmente fatta con blu di
metilene 0,3% o verde malachite.
N:B: I vetrini vanno ben fissati
preferibilmente alla fiamma del becco Bunsen
o lasciati in termostato overnight.
COLORAZIONE CON
FLUOROCROMO AURAMINA-O
Procedimento:
 Coprire i preparati con una soluzione di Auramina O
e lasciare agire per 15 minuti a temperatura
ambiente;
 lavare i vetrini in acqua corrente;
 coprire i vetrini con soluzione decolorante per 2
minuti;
 lavare i vetrini in acqua corrente;
 coprire i vetrini con una soluzione di permanganato di
potassio e lasciare agire per 3 minuti;
 lavare i vetrini in acqua corrente;
 lasciare seccare a temperatura ambiente;
 osservare i preparati al microscopio a fluorescenza,
con un obiettivo di 40x , al piu’ presto possibile.

COLORAZIONE CON FLUOROCROMO
AURAMINA-O
I micobatteri appaiono colorati in verde
fluorescente, contro un fondo castano.
Colorazione spore
(secondo Schaeffer-Fulton)




Allestire e fissare un vetrino
Appoggiare il vetrino su un sostegno sopra una
vaschetta contenente acqua la quale verrà portata
all’ebollizione.
Colorare abbondantemente con verde malachite,
lasciare il vetrino esposto al vapore che si sviluppa
per 3-5’ e aggiungere ancora il colorante facendo
attenzione che il vetrino non rimanga a secco.
(per evitare che il vetrino cada nella vaschetta
trattenerlo con una pinza di legno).
Lavare con acqua e colorare con safranina per 5’.
Dopo aver lavato abbondantemente con acqua
asciugare delicatamente.
RISULTATO
Osservare al microscopio con ogni tipo di obiettivo,
procedendo per gradi, dagli obiettivi a secco a
piccolo ingrandimento, fino all’obiettivo ad
immersione e registrare i risultati ottenuti anche
mediante un disegno.
spore appariranno
colorate con
verde malachite,
le altre parti
della cellula con
safranina
COLORAZIONE STRUTTURALE
DELLA CAPSULA

OBIETTIVO:
Osservare la presenza di batteri capsulati
utilizzando una colorazione che, non
richiedendo fissazione, permette una visione
senza artefatti della morfologia batterica.

PRINCIPIO:
La capsula dei batteri non ha alcuna affinità
per i coloranti perciò per metterla in evidenza
si fa ricorso a colorazioni negative.
METODICA
Deporre una goccia di inchiostro di china
diluito al 10% su un vetrino portaoggetti.
Prelevare con un ansa sterile un po’ di
materiale batterico da una colonia isolata.
 Sospendere il materiale sull’inchiostro di
china e coprire con un vetrino coprioggetto.
 Osservare al microscopio con ogni tipo di
obiettivo, procedendo per gradi, dagli
obiettivi a secco a piccolo ingrandimento,
fino all’obiettivo ad immersione e registrare i
risultati ottenuti anche mediante un disegno.

RISULTATO
I granuli molto fini di colorante determinano uno sfondo
semiopaco nel quale spiccano le capsule chiare.